TWI580787B - 重組蛋白質、含有該重組蛋白質之醫藥組成物及該重組蛋白質之製備方法 - Google Patents
重組蛋白質、含有該重組蛋白質之醫藥組成物及該重組蛋白質之製備方法 Download PDFInfo
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Description
本發明係與重組蛋白質有關，特別是指一種含有生物活性胜肽的重組蛋白質、含有該重組蛋白質的醫藥組成物以及該重組蛋白質之製備方法。
胜肽大小是介於胺基酸和蛋白質之間。胺基酸的分子最小，蛋白質最大，兩個或以上的胺基酸脫水縮合形成若干個胜肽鍵從而組成一個胜肽，多個胜肽進行多次脫水縮合就組成一個蛋白質分子。相反的，蛋白質可以被蛋白水解酶水解為蛋白質片段，因此蛋白質也被稱為「多胜肽」，胜肽可以小至有奈米般大小，腸胃，血管及肌膚皆極容易吸收。
胜肽從功能上可以區分為營養性胜肽以及功能性胜肽，營養性胜肽可提供動物或人體所需胺基酸的來源，功能性胜肽又稱做生物活性胜肽，能夠在動物或人體內造成特定的生理效果，且應用範圍相當廣泛。
目前生物活性胜肽的生產是利用不同的食用性蛋白，透過蛋白水解酶水解而得，又或是在生產少於5個胺基酸的短鏈胜肽時，用一個胺基酸黏接另一個胺基酸的方式而成。但是這些方式所生產的生物活性胜肽產量很少，造成產量不足而拉高製備成本的現象。所以當這些生物活性胜肽被製成藥品、健康食品或化粧品原料的時候，一般廠商在考量成本及售價下，所使用的濃度也未達到最佳有效劑量，從而無法顯
示出這些生物活性胜肽在人體中的功能性，亦無法提供預防或治療疾病之用。
事實上，這些生物活性胜肽在起初篩選功能性時，是最有效的。從實驗得知，在動物試驗上也一樣顯示出最完美的功能性來，然而到了口服或應用在人體時，就無法顯示出強而有力的功能性出來。究其原因，一方面是製造廠商在產品中所下的胜肽濃度太少所致；另一方面係因口服的胜肽在人體之消化道中已經被破壞殆盡。
先前，本發明人在台灣專利第I315341號「富含降三酸甘油脂之機能性胜肽之蛋白質生成方法」曾發表以澱粉水解酵素(α-amylase)為攜帶蛋白質，在食用菌中生產，一區插入一套「VVYP」胜肽，六區僅有六套胜肽，攜帶蛋白質含有胜肽的比例很低，僅有3%，蛋白質回收純化是用Ni-NTA方法回收，回收過程含有重金屬鎳，會污染胜肽產物，並且又因為攜帶蛋白質中所攜帶的胜肽套數太少，導致產出的胜肽濃度低、生產時間長且僅能小量回收純化，又有毒性，無法供給人體使用。
是以，如何解決胜肽產量太少的問題、提高胜肽的濃度，係目前胜肽產製技術中極重要的課題。
因此，本發明之主要目的係在提供一種重組蛋白質、含有該蛋白質之醫藥組成物及該重組蛋白質之製備方法，藉以能讓生物活性胜肽被巨量表現，以生產富含高濃度、高產量
的生物活性胜肽蛋白，同時能有效降低其製備成本。
為達成上述目的，本發明提供一種重組蛋白質，包含有至少一具有連續多套生物活性胜肽之區段，其中各該生物活性胜肽係選自由GHK、SEQ ID NO：2、3、4所組成的群組中任一種。藉此，把多套生物活性胜肽放在一個蛋白質中，以大量生產富含生物活性胜肽的胜肽蛋白，達到高濃度、高產量的生產，同時降低製備成本。
於本發明之一較佳實施例中，各該生物活性胜肽之間可具有一胃蛋白酶(pepsin)或一胰蛋白酶(trypsin)或一羧肽酶B(carboxypeptidase B)切位，讓生物活性胜肽的兩端獲得保護，使其可在胃中或小腸中定點切割、釋放、被吸收，以行使其功能性出來。
為達成上述目的，本發明另提供一種醫藥組成物，包含有如前所述之重組蛋白質，藉此應用於醫藥領域。
於本發明之另一較佳實施例中，該醫藥組成物之劑型可選自由乳劑、膏劑、凝膠、塗劑、糊狀物、油劑、軟化劑、脂肪體劑型、奈米顆粒、化妝水、漱口劑、洗髮水、乳液、噴劑、塞劑、膠囊、錠劑、粉末、糖漿、顆粒、溶液、懸浮液、貼片或封閉型敷貼所組成的群組中任一種，藉此應用於醫藥領域。
為達成上述目的，本發明再提供一種重組蛋白質之製備方法，包含有下列步驟：(a)提供一蛋白質，該蛋白質具有至少一更改置換區段以及一澱粉吸附區段；(b)將該更改置換區段與一具有連續多套生物活性胜肽之區段置換，其中各
該生物活性胜肽係選自由GHK、SEQ ID NO：2、3、4所組成的群組中任一種；(c)轉殖置換後之該蛋白質至一酵母菌表現系統進行發酵；以及(d)以澱粉純化出該蛋白質。藉此，把連續多套生物活性胜肽放在一個蛋白質中，以大量生產富含生物活性胜肽的胜肽蛋白，達到高濃度、高產量的生產，同時降低製備成本。
於本發明之又一較佳實施例中，該蛋白質係為人類酪氨酸羥化酶(human tyrosine hydroxylase)，以達到安全、無毒、可食用的效果。
於本發明之再一較佳實施例中，該酵母菌係為耶式酵母菌(Yarrowia lipolytica)，以達到安全、無毒、可食用的效果。
於本發明之其他較佳實施例中，更包含有下列步驟：(e)選定在該多套生物活性胜肽區段大致中間位置的5~7個胺基酸為一重疊區段；(f)替前述5~7個胺基酸設定一不同於其它胺基酸所設定的密碼子核酸序列；(g)依此不同於其它胺基酸的密碼子核酸序列設計一正向引子與一反向引子，且該正向引子與該反向引子於該重疊區段具有約12~20個互補的核酸鹼基；(h)利用聚合酶連鎖反應把兩段引子個別複製出兩段序列；以及(i)用重疊式聚合酶連鎖反應技術，將兩段序列重疊串聯，藉此將連續多套生物活性胜肽的核酸序列複製出來，而不會造成胜肽套數的減少。
有關本發明之詳細構造、特點、組裝方式或使用方式，將於後續之詳細說明中予以描述。然而，在本發明領域中具
有通常知識者應能瞭解，該等詳細說明以及實施本發明所列舉之特定實施例或實驗例，僅用於說明本發明，並非用以限制本發明之專利申請範圍。
以下將藉由所列舉之實施例以及實驗例，配合隨附之圖式，詳細說明本發明之技術內容及特徵。
實驗一：攜帶蛋白質之篩選
首先，需挑選可供攜帶胜肽的蛋白質，該蛋白質最好是選自人體的蛋白質，因人體的蛋白質最容易在無毒性安全、可食用的酵母菌中被大量表現生產出來，再者該蛋白質的胺基酸序列要含有吸附澱粉的序列區段，供用於將食用級玉米澱粉回收純化生產胜肽蛋白。
由實驗數據顯示人類的酪氨酸羥化酶(human tyrosine hydroxylase；HTH)在無內毒素、安全可食用酵母菌內進行表現，結果最好最穩定，用澱粉回收純化1公升的發酵液，可純化出200公克以上的胜肽蛋白。相較於利用米麴菌(Aspergillus oryzae)的澱粉酶(α-amylase)當攜帶蛋白質，1公升發酵液，僅能純化出25公克的胜肽蛋白。
故本發明以人類酪氨酸羥化酶作為主要實施例，其含有497個胺基酸(NCBI註冊號：AAI43612，SEQ ID NO：1)，N端的前20個胺基酸1~20以及澱粉吸附的序列區段314~477，共有163個胺基酸不可更改，使用原有的胺基酸序列。其餘有314個胺基酸包括21~70、81~130、141~190、
201~250、261~310等五個區段，可以置換成所要表現的生物活性胜肽的胺基酸序列。
實驗二：連續多套生物活性胜肽之置換
在完成攜帶蛋白質之選取後，則將生物活性胜肽的胺基酸序列置換於前述蛋白質的胺基酸序列中。由於目前生物活性胜肽的胺基酸數目不會超過50個胺基酸，所以可將50個左右的胺基酸作為一個更改置換區段，兩個更改置換區段中間具有10個原有的胺基酸序列，利用10個原有胺基酸序列，將更改置換區段串聯起來。
314個胺基酸可區分成5個更改置換區段以及4個原有胺基酸區段，每個更改置換區段含有50個左右的胺基酸，並且每個原有胺基酸區段含有10個原有胺基酸。若以含有10個胺基酸之生物活性胜肽為例子，每個可更改置換區段就含有連續5套的胜肽，有5組更改置換區段，總共有25套的該胜肽。而生產一個胜肽蛋白就可含有25套生物活性胜肽，相較於現有以食用蛋白水解產製所得的胜肽增加了25倍的濃度。
1. 連續多套胜肽的製備
更改置換區段含連續多套胜肽的製備，以含有3個胺基酸之生髮胜肽「GHK」為例子，每個可更改置換區段就可設定含有連續12套的胜肽。
如第一圖所示，用連續3套、4套以及5套的製備為例，先選定大約在中間位置的5-7個胺基酸為重疊的區段，這5-7個胺基酸所設定的密碼子核酸序列，不同於其它胺基酸所
設定的密碼子核酸序列，且該正向引子與該反向引子於該重疊區段具有約12~20個互補的核酸鹼基。再把正向引子設定核酸序列合成製造出來，同樣反向引子設定核酸序列合成製造出來，最後再用聚合酶連鎖反應技術把兩段引子個別複製出來，之後用重疊式聚合酶連鎖反應技術，將兩段的序列重疊串聯起來形成連續3套、連續4套或連續5套胜肽的核酸序列。不管複製連續多少套胜肽的核酸序列，最重要的是在約中間區段的5-7個胺基酸設定為重疊區段，以上的技術就很容易將連續多套胜肽的核酸序列複製出來，不會造成胜肽套數的減少。
另以幫助睡眠胜肽「YLGYLEQLLR」(SEQ ID NO：2)的置換為例，依照上述的製備方法設計出連續5套的胜肽序列後，把胜肽的胺基酸序列轉換為核酸序列，利用重疊聚合酶鏈反應(overlap-PCR)一一將每個更改置換區段建立完成，再將兩兩更改置換區段串連起來，5個更改置換區段和4個原有胺基酸區段完整串連起來，這個過程中每一個更改置換區段建立好之後，皆用核酸定序儀檢驗核酸序列的正確性，之後將完整正確之胜肽蛋白核酸序列選殖入酵母菌之胞外分泌基因表現系統中，再轉型入無毒性安全可食用酵母菌染色體的5S-rDNA基因上，就可以進行發酵生產。
第二圖所示為幫助睡眠胜肽「YLGYLEQLLR」置換於人體酪氨酸羥化酶中的定序結果，其中共有5個區段，314個胺基酸被更改置換成幫助睡眠胜肽「YLGYLEQLLR」的胺基酸序列，亦即於最終的蛋白質產物中包含有5組連續5套，
總和為25套的幫助睡眠胜肽「YLGYLEQLLR」。其他以本方法所生產的生物活性胜肽，例如用於降低高血糖之「CDALQEIAR」(SEQ ID NO：3)及用於降低高三酸甘油脂之「VVYP」(SEQ ID NO：4)，其胜肽的核苷酸序列皆可以此方法製備出連續多套的生物活性胜肽序列。
2. 胜肽保護機制的設計
我們也發現生物活性胜肽蛋白吃進體內時，胃中的胃蛋白酶(pepsin)，切位是內切在苯丙氨酸(phenylalanine)的N端和C端，如第四圖所示之用於降低高血糖胜肽「CDALQEIAR」，其頭尾各加F，形成「FCDALQEIARF」的設計，胃蛋白酶切在F的兩端而釋出多套「CDALQEIAR」胜肽；在小腸中的胰蛋白酶(trypsin)，切位是內切在精胺酸(arginine)和離氨酸(lysine)的C端，如第五圖所示之用於降低高三酸甘油脂的「VVYP」胜肽，其頭尾各加K/R，形成「K/R VVYP K/R」的設計，胰蛋白酶切在K/R的C端而釋出多套「VVYP K/R」胜肽，以及小腸中另一內切蛋白酶是羧肽酶B(carboxypeptidase B)，切位是內切在脯氨酸(proline)的C端；再將「VVYP R/K」的R/K切掉釋出「VVYP」胜肽；如第六圖之用於幫助睡眠的「YLGYLEQLLR」胜肽，其連續多套胜肽的N端多加R，形成「RYLGYLEQLLRYL……」的設計，胰蛋白酶切在R的C端而釋出多套「YLGYLEQLLR」胜肽，以上這三種內切蛋白酶的切位最精準最為有效，可將胜肽蛋白中連續多套胜肽一一切出，最為可靠，在體內完全地釋放出該等胜肽的功能性。
實驗三：胜肽蛋白的轉殖與表現
在經過將連續多套生物活性胜肽置換於攜帶蛋白質後，使用YLEX表現套組(YLEX expression kit，益生生技，台灣)進一步將該等胜肽蛋白的基因重組轉入酵母菌中，該酵母菌係選自具生物安全性，且不會產生內毒素之耶式酵母菌(Yarrowia lipolytica)，其係將前述多組胜肽蛋白的基因重組轉入該酵母菌染色體之5S-rRNA的基因上。
經實驗測定出來有82組胜肽蛋白的基因重組轉入82套酵母菌的5S-RNA基因上，因此1顆酵母菌基本上可以生產40乘82等於3280個胜肽蛋白的產量，而經發酵後，實際上1公升的酵母菌發酵液可以生產最少200克的胜肽蛋白，其中胜肽佔完整胜肽蛋白的比例為60%，因此200克的胜肽蛋白就有120克是屬於胜肽的部分。
我們將生產出來的幫助睡眠胜肽蛋白，利用胰蛋白酶將胜肽切出來，再利用中子撞擊質譜儀LC-MS-MS，將胜肽的胺基酸序列確定出來，如第三圖所示，結果顯示為「YLGYLEQLLR」，完全符合當初的設計。此一幫助睡眠的胜肽蛋白，因當初設計幫助睡眠胜肽蛋白的胜肽部分是有被保護，口服之後一直到小腸內，由胰蛋白酶將胜肽切出，緊接著胜肽就被小腸吸收，行使生物功能性。
其他以本方法所生產的胜肽蛋白，如用於降低高血糖之「CDALQEIAR」及用於降低高三酸甘油脂之「VVYP」，其胜肽的胺基酸序列皆可以此方式確定之。
據此，由本發明之蛋白質設計與製備方法，確定可以將
生物活性胜肽蛋白生產出來，實驗結果顯示1公升發酵液最少可用澱粉吸附純化回收到200克，且由於胜肽有被保護，以及連續多套胜肽的設定，一直到十二指腸或小腸吸收之前連續多套胜肽才被切開釋放出來，不像食用蛋白經由蛋白脢水解而釋出的無保護裸露胜肽一樣一天要使用到200~300毫克，也沒有立即的效果出現，理由是無保護裸露胜肽在口中或胃中甚至到小腸中就被蛋白外切酶或是酸性破壞殆盡，因此真正吸收進入十二指腸或小腸中幾乎微乎其微，這是利用本發明之製備方法設計生產的胜肽蛋白相較於前案技術優越的地方。
根據實驗，將等量的「YLGYLEQLLR」胜肽蛋白以及裸露胜肽分別由唾液分解5分鐘後，緊接著胃液分解30分鐘，再由腸液分解30分鐘，之後由SDS-PAGE電泳展開顯示，如第七圖所示，發現胜肽蛋白從唾液分解，接著胃液分解，再由腸液分解，仍然有胜肽存在，然而無保護裸露胜肽經由唾液分解，緊接著胃液分解，再由腸液分解，就被完全分解殆盡，在電泳膠上完全消失。
實驗四：生物安全性測試
經過生物安全性試驗的評估，促使胜肽蛋白取代無保護裸露胜肽成為可商品化之有效的保健食品以及蛋白性藥物。而依據世界衛生組織的指導原則，以急性(單一劑量5000mg/kg)和亞急性(單一劑量1000mg/Kg，連續給30天)的毒性試驗設計，給與Sprague-Dawley(SD)大鼠口服胜肽，來觀察對生化、造血系統，以及組織病理學的影響。
如第八圖所示，係SD大鼠經過45天口服胜肽蛋白處理的生長曲線。體重水平作為平均值，並通過單向方差分析(ANOVA)測試進行了分析。使用多重比較的Dunnett’t-test來檢驗含胜肽蛋白和對照組之間並無統計學的差異。
且由表一、表二及表三可以發現不論澱粉液化酶(α-amylase)或酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase)當作攜帶蛋白質所生產出來的胜肽，不論是固態或液態胜肽蛋白以大鼠來探討使用的劑量，急性(5g/Kg)和亞急性(1g/Kg，連續給30天)毒性試驗，在急性毒性試驗中沒有造成任何的毒性或死亡，在亞急性毒性試驗中，利用血液學、免疫學和生化學的參數檢驗並沒有造成體內臟器的傷害。由以上數據顯示，運用本發明所產出的生物活性胜肽蛋白確實無毒性無副作用，本發明之胜肽蛋白可作為醫藥組成物。
實驗五：生物功能性測試
本發明利用無毒性安全可食用酵母菌生產出來之各式各類胜肽蛋白，經過測試後發現完全無毒無過敏現象無副作用，且具有其良好生物功能性出來，如表四至表七。以本發明所生成之降三酸甘油脂胜肽蛋白含VVYP胜肽，和降血糖胜肽蛋白含「CDALQEIAR」胜肽以及幫助睡眠胜肽蛋白含「YLGYLEQLLR」胜肽，並進行功能性測試，其中降三酸甘油脂胜肽「VVYP」給17位自願者試吃1個月，三酸甘油脂減少了45.3%，體重減少了6.3%。
而降血糖胜肽蛋白「CDALQEIAR」給20位自願者試吃1個月，血糖降低了35.4%，持續吃可以維持血糖在80~100mg/dl之間，有水腫患者也可利尿去水腫。
而幫助睡眠胜肽蛋白「YLGYLEQLLR」給25位自願者試吃1個月，延遲入睡的問題可以改善為正常，同時睡眠品質提升，有深沉的睡眠，隔天體力飽滿、心情愉快、正面思考、挑戰天天的精神壓力。
由此可知，生物活性胜肽要顯現出生物活性出來，有效濃度是最重要的關鍵，因此把胜肽置換到蛋白當中，不僅兩端有保護，不易被破壞分解，也能在一蛋白分子當中安排連續多套(如25套)胜肽，增加濃度，並且搭配基因表現技術
以及多組(如82組)基因插入染色體中同時表現，產量非常驚人。此一創新胜肽蛋白科技，才能促使生物活性胜肽成為有效的蛋白性藥物。
綜上，本發明係利用生物安全系統的酵母菌，也不會產生內毒素之醫藥等級之下生產胜肽蛋白，簡單講是把連續多套生物活性胜肽置換在一個蛋白質中，再由無毒性安全可食用之酵母菌大量生產富含連續多套生物活性胜肽的高濃度胜肽蛋白，除能巨量表現此胜肽蛋白外，並能使生物活性胜肽的兩端獲得保護，使其可在胃中或小腸中定點切割，完整的生物活性胜肽在十二指腸中或在小腸中被吸收，行使功能性出來。
應用在醫藥方面，劑型可為乳劑、膏劑、凝膠、塗劑、糊狀物、油劑、軟化劑、脂肪體劑型、奈米顆粒、化妝水、漱口劑、洗髮水、乳液、噴劑、塞劑、膠囊、錠劑、粉末、糖漿、顆粒、溶液、懸浮液、貼片或封閉型敷貼。
應用在化妝品、保健品或健康食品等方面時，可將巨量生產出來的生物活性胜肽蛋白，以胃蛋白酶、胰蛋白脢或羧肽酶B水解後製成液體胜肽，或者是添加適當的賦形劑、食品添加劑，可增加產品的附加價值，並提升其經濟效益。
藉此，可以理解到本發明為一創意極佳之創作，除了有效解決習知者所面臨的問題，更大幅增進功效，且在相同的技術領域中未見相同或近似的發明、創作或公開使用，同時具有功效的增進，故本發明已符合發明專利有關「新穎性」與「進步性」的要件，乃依法提出申請發明專利。
第一圖：係連續多套胜肽置換設定示意圖。
第二圖：係幫助睡眠胜肽「YLGYLEQLLR」置換於人體酪氨酸羥化酶中的定序結果。其中黃色表示可更改置換區段，共有5個可更改置換區段，而紅色表示原有胺基酸區段，淺藍色表示結合澱粉的區段。
第三圖：係利用中子撞擊質譜儀LC-MS-MS確定胜肽胺基酸序列的結果。
第四圖：係生物活性胜肽「CDALQEIAR」於胃蛋白酶(pepsin)的切位示意圖。
第五圖：係生物活性胜肽「VVYP」於胰蛋白酶(trypsin)和羧肽酶B(carboxypeptide B)的切位示意圖。
第六圖：係生物活性胜肽「YLGYLEQLLR」於胰蛋白酶(trypsin)的切位示意圖。
第七圖：係用於幫助睡眠的「YLGYLEQLLR」胜肽蛋白與無保護裸露胜肽經唾液、胃液和腸液分解後的SDS-PAGE電泳示意圖。第1和第2道是胜肽蛋白，第3和4道是無保護裸露的胜肽。第2和4道是經唾液、胃液和腸液分解。
第八圖：係本發明之製備方法所生成之生物活性胜肽蛋白給SD大鼠口服的生長曲線示意圖。大鼠體重水平以平均值表示，並通過單向方差分析(ANOVA)。使用Dunnett's t-test多重比較方式來評估胜肽蛋白實驗組與對照組之間的差異，所有P>0.05是與對照值的比較結果。
<110> 簡宏堅
<120> 重組蛋白質、含有該重組蛋白質之醫藥組成物及該重組蛋白質之製備方法
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 497
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
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<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 3
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<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 4
Claims (9)
- 一種重組蛋白質，包含有：一攜帶蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO：1，其中該攜帶蛋白質具有五更改置換區段以及一澱粉吸附區段，其中各該更改置換區段分別為胺基酸位置第21~70號、第81~130號、第141~190號、第201~250號、第261~310號區段；一具有連續多套生物活性胜肽之區段，置換於各該更改置換區段，其中各該更改置換區段內該生物活性胜肽之序列長度介於3至10個胺基酸之間，且該生物活性胜肽之套數為4~12套，且該生物活性胜肽係選自由GHK、SEQ ID NO：2、3、4所組成的群組中任一種。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白質，其中各該生物活性胜肽之間具有一胃蛋白酶(pepsin)切位。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白質，其中各該生物活性胜肽之間具有一胰蛋白酶(trypsin)切位。
- 如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白質，其中各該生物活性胜肽之間具有一羧肽酶B(carboxypeptidase B)切位。
- 一種醫藥組成物，包含有如申請專利範圍第1項所述之重組蛋白質。
- 如申請專利範圍第5項所述之醫藥組成物，其中該醫藥組成物之劑型為選自由乳劑、膏劑、凝膠、塗劑、糊狀物、油劑、軟化劑、脂肪體劑型、奈米顆粒、化妝水 、漱口劑、洗髮水、乳液、噴劑、塞劑、膠囊、錠劑、粉末、糖漿、顆粒、溶液、懸浮液、貼片或封閉型敷貼所組成的群組中任一種。
- 一種重組蛋白質之製備方法，包含有下列步驟：(a)提供一攜帶蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO：1，其中該攜帶蛋白質具有五更改置換區段以及一澱粉吸附區段，其中各該更改置換區段分別為胺基酸位置第21~70號、第81~130號、第141~190號、第201~250號、第261~310號區段；(b)將各該更改置換區段與一具有連續多套生物活性胜肽之區段置換，其中各該更改置換區段內該生物活性胜肽之序列長度介於3至10個胺基酸之間，且該生物活性胜肽之套數為4~12套，且該生物活性胜肽係選自由GHK、SEQ ID NO：2、3、4所組成的群組中任一種；(c)轉殖置換後之該蛋白質至一酵母菌表現系統進行發酵；以及(d)以澱粉純化出該蛋白質。
- 如申請專利範圍第7項所述之製備方法，其中該酵母菌係為耶式酵母菌(Yarrowia lipolytica)。
- 如申請專利範圍第7項所述之製備方法，更包含有下列步驟：(e)選定在該多套生物活性胜肽區段大致中間位置的5~7個胺基酸為一重疊區段；(f)替前述5~7個胺基酸設定一不同於其它胺基酸 所設定的密碼子核酸序列；(g)依此不同於其它胺基酸的密碼子核酸序列設計一正向引子與一反向引子，且該正向引子與該反向引子於該重疊區段具有約12~20個互補的核酸鹼基；(h)利用聚合酶連鎖反應把兩段引子個別複製出兩段序列；以及(i)用重疊式聚合酶連鎖反應技術，將兩段序列重疊串聯。
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