TWI572353B

TWI572353B - 氧化還原反應相關因子表現促進劑

Info

Publication number: TWI572353B
Application number: TW100103496A
Authority: TW
Inventors: 菅原美鄉; 勝田雄治; 仲西城太郎; 山姆Ｗ李
Original assignee: 資生堂股份有限公司; 通用醫院公司
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2017-03-01
Also published as: RU2606856C2; JPWO2011093469A1; JP5833438B2; RU2011134486A; CN102361637A; WO2011093469A1; EP2529736A1; EP2529736A4; BRPI1100012A2; KR20120119976A; TW201136587A; US20110189318A1

Description

氧化還原反應相關因子表現促進劑

本發明係關於一種含有山奈酚、槲皮素或該等之糖苷、或該等之組合作為有效成分而成的氧化還原反應相關因子表現促進劑，以及含有銀杏葉萃取物、山奈萃取物或該等之組合作為有效成分而成的氧化還原反應相關因子表現促進劑。

生物體為維持自身生存，維持恆常性而進行氧化還原調節。生物體內之氧化還原調節主要基於細胞內之蛋白質中所存在的半胱胺酸殘基上之硫醇基之可逆氧化還原反應，而控制各種細胞功能。已知氧化還原調節相關因子(氧化還原反應相關因子)使細胞內保持還原狀態，發揮對細胞之生存而言必需之作用，另一方面，對生物體內之活性氧種之消去亦發揮重要之作用。於上述氧化還原反應相關因子未正常發揮功能之情形時，生物體內之活性氧種產生過剩，而承受過度之氧化壓力。一般認為，上述過度之氧化壓力將DNA、蛋白質、脂質之生物體高分子氧化而對該等造成傷害，從而導致各種疾病或老化。因此，近年來，盛行研究作為導致氧化壓力之活性氧種之消去系統而發揮作用的氧化還原反應相關因子。

作為應對生物體之氧化壓力之防禦機構而發揮作用的氧化還原反應相關因子已知有麩胱苷肽系。有報告指出：麩胱苷肽為存在於哺乳動物體內之三肽，具有利用分子內之硫醇基之還原作用、作為輔酶之作用、參與硫醚尿酸之生成及其他解毒機構之作用、保護硫醇酶或其他細胞成分之作用、促進有害物排泄之作用、由提高膽鹼酯酶之活性而產生之抗過敏作用、酶活化作用。然而，由於麩胱苷肽於製劑中產生沈澱，並且大量細胞中無法取得麩胱苷肽，故用以促進細胞內麩胱苷肽之產生之成分變得極其有用。作為此種成分，迄今為止報告有γ-生育酚或δ-生育酚，並揭示有含有該等成分之麩胱苷肽產生促進劑(日本專利特開2007-284430(專利文獻1))。

另外，作為其他氧化還原反應相關因子，已知有硫氧化還原蛋白系，硫氧化還原蛋白系亦作為應對生物體內之氧化壓力的防禦機構而發揮作用(細胞工程學Vol.25、No.2、2006、p143-148(非專利文獻1))。另外，有報告指出：硫氧化還原蛋白之基因轉殖鼠變得長壽(Mitsui A,et al: Antioxid Redox Signal(2002) 4: 693-696(非專利文獻2))；硫氧化還原蛋白對腦梗塞、糖尿病具有抵抗性(Takagi Y,et al: Proc Natl Acad Sci USA(1999) 96:4131-4136(非專利文獻3)、Hotta M,et al: J Exp Med(1998) 188: 1445-1451(非專利文獻4))；以及對過敏性皮炎有效(日本專利特開2007-269671(專利文獻2))；並且硫氧化還原蛋白廣泛用作活性氧消去劑(日本專利特開平9-157153(專利文獻3))。然而，由於硫氧化還原蛋白系為高分子蛋白質，故即便對對象直接投予該等化合物，亦無法將該等之分子取入細胞內。因此，較理想為促進生物體內硫氧化還原蛋白系之表現，但促進該等之表現之成分迄今為止僅知有艾草萃取物及青紫蘇萃取物(國際公開編號WO 2006/033351(專利文獻4))。

如上所述，即便對生物體直接投予麩胱苷肽系或硫氧化還原蛋白系等氧化還原反應相關因子，亦無法有效地取入細胞內，故有於生物體內無法發揮氧化還原調節功能或抗氧化功能之虞。已知藉由紫外線照射壓力可促進該等氧化還原反應相關因子之表現，但迄今為止幾乎尚未知曉安全且有效地對生物體發揮作用之化學物質，亦未詳細闡明生物體內之氧化還原反應相關因子之表現機制。因此，仍然期待發現一種用以促進生物體內氧化還原反應相關因子之表現的安全且有效之成分。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2007-284430

[專利文獻2]日本專利特開2007-269671

[專利文獻3]日本專利特開平9-157153

[專利文獻4]國際公開編號WO 2006/033351

[非專利文獻]

[非專利文獻1]　細胞工程學Vol.25、No.2、2006、p143-148

[非專利文獻2]　Mitsui A,et al: Antioxid Redox Signal(2002)4: 693-696

[非專利文獻3]　Takagi Y,et al: Proc Natl Acad Sci USA (1999) 96: 4131-4136

[非專利文獻4]　Hotta M,et al: J Exp Med(1998) 188: 1445-1451

本發明之課題在於藉由促進生物體內氧化還原反應相關因子之表現，而安全且有效地減少生物體之氧化壓力，維持健康，並防止由氧化壓力引起之各種疾病及症狀。

本發明者等人此次發現，促進作為生物體內之氧化還原反應相關因子的麩胱苷肽系及硫氧化還原蛋白系之表現及活性之成分有屬於黃酮醇類之山奈酚及槲皮素。令人意外的是，該作用僅對黃酮醇類中之山奈酚與槲皮素具有特異性，於結構類似之楊梅黃酮中未確認到上述作用。與直接使用麩胱苷肽系或硫氧化還原蛋白系之分子之情形相比，使用山奈酚或槲皮素可更有效地促進生物體內之麩胱苷肽系或硫氧化還原蛋白系等氧化還原反應相關因子之表現及活性，故而藉由本發明可更有效地減輕生物體內多種多樣之氧化壓力。山奈酚或槲皮素等黃酮醇類廣泛分佈於茶葉植物中，對生物體無毒，可安全地攝取。如此般，藉由將山奈酚及槲皮素作為用以促進生物體內之氧化還原反應相關因子之表現的有效成分，可不對所使用之生物體賦予壓力而消去生物體內過剩之活性氧種。

因此，本申請案包含以下發明：

[1]　一種氧化還原反應相關因子表現促進劑，其係含有山奈酚、槲皮素或該等之糖苷、或該等之組合作為有效成分而成。

[2]　如上述[1]之氧化還原反應相關因子表現促進劑，其中上述氧化還原反應相關因子為選自由硫氧化還原蛋白、硫氧化還原蛋白還原酶、麩胱苷肽還原酶及麩氧還蛋白所組成之群中之1種或複數種物質。

[3]　一種氧化還原反應相關因子表現促進劑，其係含有銀杏葉萃取物、山奈萃取物或該等之組合作為有效成分而成。

[4]　如上述[3]之氧化還原反應相關因子表現促進劑，其中上述氧化還原反應相關因子為選自由硫氧化還原蛋白、硫氧化還原蛋白還原酶、麩胱苷肽還原酶及麩氧還蛋白所組成之群中之1種或複數種物質。

[5]　一種山奈酚、槲皮素或該等之糖苷、或該等之組合之用途，其係用以製備氧化還原反應相關因子表現促進劑。

[6]　一種銀杏葉萃取物、山奈萃取物或該等之組合之用途，其係用以製備氧化還原反應相關因子表現促進劑。

藉由促進生物體內之氧化還原反應相關因子之表現，可安全且有效地減少生物體內之活性氧種，而防禦生物體免受氧化壓力之影響。藉此可維持生物體之健康，並可防止由氧化壓力引起之各種疾病及症狀。

於本發明之一實施態樣中，提供一種含有山奈酚、槲皮素或該等之糖苷、或該等之組合作為有效成分而成的氧化還原反應相關因子表現促進劑。

於本說明書中，「氧化還原反應相關因子」係指與生物體例如哺乳類，較佳為人體內所存在的蛋白質中之半胱胺酸殘基上之硫醇基進行氧化或還原反應，而使細胞內保持還原狀態之因子。本發明者認為，於細胞之活化或訊息傳遞物質之處理即訊號傳遞機構中，尤其是由細胞內之蛋白質中所存在的半胱胺酸殘基上之硫醇基之氧化引起的蛋白質-蛋白質間相互作用中之修飾發揮重要作用。上述半胱胺酸殘基上之硫醇基之氧化‧還原(redox)參與基因之轉錄，蛋白質於細胞內之局部存在、合成、分解之調節，及細胞增殖或細胞死亡等各種生命現象之調節。作為此種生物體內之氧化還原反應相關物質，已知有麩胱苷肽系及硫氧化還原蛋白系，該等分別由一群分子所構成。已知該等氧化還原反應相關因子亦參與產生及存在於生物體內之活性氧種之消去。

硫氧化還原蛋白系尤其是由硫氧化還原蛋白與硫氧化還原蛋白還原酶等因子所構成。硫氧化還原蛋白(TRX)係作為向大腸桿菌之DNA合成所必需之酶即核糖核苷酸還原酶供應氫之輔酶而被發現。TRX為原核生物或人類之多種生物體內所保存之約12 kDa之蛋白質，具有包括4個β摺疊與3個α螺旋之立體結構，且具有-Cys-Gly-Pro-Cys-之活性部位。TRX存在有在其活性部位之2個半胱胺酸殘基間形成雙硫鍵之氧化型(S-S)、與還原型(-SH，SH-)，還原型係將基質蛋白質之雙硫鍵還原，自身變成氧化型。氧化型TRX藉由NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，菸醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)與硫氧化還原蛋白還原酶而還原，再生為還原型。作為基質蛋白質之一種，已知有總稱為過氧化物氧還蛋白(peroxiredoxin)之H₂O₂消去酶家族。還原型過氧化物氧還蛋白將H₂O₂還原。並且，變成氧化型之過氧化物氧還蛋白成為基質並被硫氧化還原蛋白所還原。變成氧化型之硫氧化還原蛋白被硫氧化還原蛋白還原酶所還原。硫氧化還原蛋白系對此種活性氧種之無毒化系統發揮重要之作用。

麩胱苷肽系尤其是由麩胱苷肽、麩胱苷肽還原酶及麩氧還蛋白(glutaredoxin)等因子所構成。麩胱苷肽係包含麩胺酸、半胱胺酸及甘胺酸之三肽，作為非蛋白質性之硫醇成分大量存在於細胞內，並作為細胞內之親水性組分中之主要抗氧化物質而為人所知。麩胱苷肽與活性氧種(例如超氧化物或過氧化氫)反應，形成穩定之麩胱苷肽自由基，而變為二聚物(GSSG：氧化型麩胱苷肽)，進而麩胱苷肽還原酶將來自NADPH之電子轉移至GSSG，而使該二聚物再生為GSH(還原型麩胱苷肽)。麩氧還蛋白(GRX)具有與硫氧化還原蛋白共用之-Cys-Pro-Tyr-Cys-之活性部位，根據與硫氧化還原蛋白之共用性而稱為硫氧化還原蛋白超級家族。麩氧還蛋白存在有在其活性部位之2個半胱胺酸殘基間形成雙硫鍵之氧化型(S-S)、與還原型(-SH，SH-)。與硫氧化還原蛋白同樣地，還原型將基質蛋白質之雙硫鍵還原，自身變成氧化型。關於其生物活性亦有較多不明之處，但已知其參與生物體內之氧化還原調節及氧化壓力應答。

如此般，藉由將硫氧化還原蛋白、硫氧化還原蛋白還原酶、麩胱苷肽還原酶及麩氧還蛋白等氧化還原反應相關因子活化，或者促進其表現，可減少生物體內過剩之活性氧種，而防禦生物體免受氧化壓力之影響。

如上所述，本發明者等人此次獲得了以下之驚人見解：山奈酚及槲皮素將上述氧化還原反應相關因子活化並且促進其表現。包括山奈酚及槲皮素之黃酮醇類具有以下所示之通式，該等為廣泛分佈於植物中之類黃酮化合物之一：

[化1]

已知該等黃酮醇類具有抗氧化作用，另外亦報告有該等黃酮醇類具有血管強化作用及抗炎症作用。然而，迄今為止尚未知曉黃酮醇類促進生物體內之氧化還原反應相關因子之表現，另外，令人極其意外的是於其化學結構極其類似之該等黃酮醇類中，僅山奈酚及槲皮素特異性地促進氧化還原反應相關因子之表現。根據上述見解，可明確山奈酚及槲皮素作為用以促進氧化還原反應相關因子之表現之活性成分而極其有用。

另外，已周知黃酮醇類可形成各種糖苷，於本發明之氧化還原反應相關因子表現促進劑中，亦可將山奈酚及槲皮素之糖苷用作活性成分。於本發明中，與該等形成糖苷之糖並無限制，作為醛糖，例如可列舉：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖，作為酮醣，例如可列舉果糖。

如上所述，山奈酚、槲皮素及該等之糖苷為廣泛分佈於植物中之成分，因此含有該等成分之植物萃取物亦對促進生物體內之氧化還原反應相關因子之表現有用。本發明者等人發現，於植物萃取物中，尤其是銀杏葉萃取物及山奈萃取物明顯促進生物體內氧化還原反應相關因子之表現。因此，於本發明之其他實施態樣中，提供一種含有銀杏葉萃取物、山奈萃取物或該等之組合作為有效成分而成之氧化還原反應相關因子表現促進劑。

於本發明之氧化還原反應相關因子表現促進劑中用作有效成分的山奈酚、槲皮素或該等之糖苷、或該等之組合之調配量並無特別限定，為0.00001~0.5質量%，較佳為0.0001~0.001質量%，並且最佳為0.0001質量%~0.0005質量%左右。另外，於本發明之氧化還原反應相關因子表現促進劑中用作有效成分的銀杏葉萃取物、山奈萃取物或該等之組合之調配量換算成萃取物乾燥後剩餘部分時，例如為0.00001~0.5質量%，較佳為0.0001~0.1質量%，並且最佳為0.0001~0.01質量%左右。

於本發明中，上述有效成分可作為含有該等之氧化還原反應相關因子表現促進劑而進行經口或非經口投予，其例如可製成經口用組合物或外用組合物。另外，藉由本發明之氧化還原反應相關因子表現促進劑，可維持生物體之健康，並可防止由氧化壓力引起之各種疾病及症狀。作為此種疾病及症狀，並無限制，可列舉：癌症；糖尿病；自體免疫疾病，例如類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、抗磷脂質抗體症候群、皮肌炎、全身性皮膚硬化症、修格蘭氏症候群(Sjogren's syndrome)、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、慢性萎縮性胃炎、主動脈炎症候群、古巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)、急速進行性絲球體腎炎、巴塞多氏病(Basedow's disease)、慢性盤狀紅斑狼瘡或習慣性流產；缺血性疾病，例如心絞痛、心肌梗塞、腦梗塞或阻塞性動脈硬化症；過敏疾病，例如支氣管哮喘、過敏性鼻炎、花粉症、過敏性胃腸炎、蕁痲疹、接觸性皮炎或異位性皮炎；皮膚老化；色素沈積；皺紋；脂溢症；曬傷；燒傷；痤瘡；皮膚鬆弛；肥胖；高血壓；新陳代謝症候群；貧血。因此，本發明之氧化還原反應相關因子表現促進劑之用途具有無限之可能性，可以治療目的或美容目的用作食品、飲料、化妝品、醫藥品、准藥品等之原料及添加物。

作為經口用組合物可採取之形態，例如除一般食品以外，可列舉：功能性食品、營養輔助食品、特定保健用食品、早產兒用調製乳、嬰兒用調製乳、嬰兒用食品、孕產婦用食品、老年人用食品、飲料、醫藥品之形態，例如亦可為錠劑、粉末、顆粒、口含錠、內服液、懸浮液、乳濁液、糖漿等加工形態。

另外，本發明之氧化還原反應相關因子表現促進劑除了本發明之有效成分以外，亦可含有一般飲食品、醫藥品或准藥品中所使用之各種載體或抗氧化劑等添加物。例如，本發明之氧化還原反應相關因子之表現促進劑除了本發明之有效成分以外，亦可作為載體而含有各種承載(carrier)載體、補充劑(extender)、稀釋劑、增量劑、分散劑、賦形劑、結合劑溶劑(例如水、乙醇、植物油)、溶解助劑、緩衝劑、溶解促進劑、膠化劑、懸浮劑、麵粉、米粉、澱粉、玉米澱粉、多糖、乳蛋白質、膠原蛋白、米糠油、卵磷脂。作為添加劑，例如可列舉：維他命類、甜味劑、有機酸、著色劑、香料、抗濕劑、纖維、電解質、礦物質、營養素、抗氧化劑、防腐劑、芳香劑、濕潤劑、天然食物萃取物、蔬菜萃取物，但並不限定於該等。另外，作為抗氧化劑，例如可列舉：生育酚類、黃酮衍生物、葉甜素類、曲酸、沒食子酸衍生物、兒茶素類、蜂鬥酸(fukiic acid)、棉籽酚(gossypol)、吡衍生物、芝麻酚、愈創木醇、愈創木酸、對香豆酸(coumaric acid)、去甲二氫愈創酸(nordihydroguaiaretic acid)、甾醇類、萜烯類、核酸鹼基類、類胡蘿蔔素類、木聚糖類之類之天然抗氧化劑，以及抗壞血酸棕櫚酸酯、抗壞血酸硬脂酸酯、丁基羥基苯甲醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、單-第三丁基對苯二酚(TBHQ)、4-羥基甲基-2,6-二-第三丁基苯酚(HMBP)所代表之合成抗氧化劑。

作為外用組合物可採取之形態，例如可製成軟膏、乳劑、防護劑(protector)、黏附劑、面膜、化妝水、乳液、洗劑、沐浴劑、洗髮劑、養髮露、整髮液、洗髮精、潤絲精等劑型，視需要可適當調配作為通常之外用劑而習慣使用之成分，例如美白劑、保濕劑、油性成分、紫外線吸收劑、界面活性劑、增黏劑、醇類、粉末成分、著色劑、水性成分、水、各種皮膚營養劑等。進而，於本發明之氧化還原反應相關因子表現促進劑中，亦可適當調配外用劑中慣用之助劑，例如乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、聚磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡萄糖酸鈉等金屬封阻劑，咖啡因、單寧、維拉帕米、傳明酸及其衍生物，甘草萃取物、光甘草啶、木瓜果實之熱水萃取物、各種生藥、生育酚乙酸酯、甘草酸及其衍生物或其鹽等藥劑，維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白劑，葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖類，視黃酸、視黃醇、視黃醇乙酸酯、視黃醇棕櫚酸酯等維生素A類。

將本發明中投予之氧化還原反應相關因子表現促進劑之代表配方例表示如下。

防腐劑A

防腐劑B

2層型乳劑

軟膏

黏附劑

離子導入劑

糖果A

錠劑C

軟膠囊B

顆粒A-B

飲料A

曲奇

一面攪拌奶油一面緩緩添加微晶砂糖後，添加雞蛋、銀杏葉萃取液、山奈萃取液、山奈酚、槲皮素及香料並進一步攪拌。充分混合後，添加經均勻振盪之低筋麵粉，低速攪拌，以塊狀置於冰箱中。其後，進行成型並於170℃下焙烤15分鐘而形成曲奇。

[實施例]

例1.　促進硫氧化還原蛋白系之表現之藥劑之探索

於高濕、5% CO₂、37℃之條件下，於限制性角質細胞(Defined Keratinocyte)-SFM培養基(10744-019，GIBCO)中培養正常人表皮角質細胞(KK-4009，KURABO)。將最終密度為100%之細胞置換至鈣濃度調整為1.5 mM之EpiLife^TM無鈣無酚紅(CalciuM-Free Phenol Red Free)培養基(M-EPICF/PRF-500，KURABO)中。24小時後，以最終濃度成為10 μM之方式於該等之中添加山奈酚(K0018，東京化成工業股份有限公司)、維生素E(95240，FULKA)及類脂酸((+/-)-α-類脂酸)(T1395，SIGMA)。

藥劑添加後，於24小時後使用QIAZOL溶胞試劑(Lysis Reagent)(79306，QIAGEN)離析RNA，並使用RNeasy套組(74106，QIAGEN)將RNA純化。其後，使用QuantiTect SYBR Green RT-PCR套組(204243，QIAGEN)，藉由LightCycler軟體(Roche)，對硫氧化還原蛋白還原酶、硫氧化還原蛋白、麩胱苷肽還原酶、麩氧還蛋白、以及作為內部標準之核糖體蛋白(ribosomal protein)之mRNA量進行定量。所使用之引子之序列如下所示。

硫氧化還原蛋白還原酶‧前置引子：

TGCTGGCAATAGGAAGAGATGGCTTGCAC

硫氧化還原蛋白還原酶‧反置引子：

GCAATCTTCCTGCCTGCCTGGATTGCAACTGG

硫氧化還原蛋白‧前置引子：

TCGGTCCTTACAGCCGCTCGTCAGACTCCA

硫氧化還原蛋白‧反置引子：

AGGCCCACACCACGTGGCTGAGAAGTCAAC

麩胱苷肽還原酶‧前置引子：

GATCCTGTCAGCCCTGGGTTCTAAGACATC

麩胱苷肽還原酶‧反置引子：

TAACCATGCTGACTTCCAAGCCCGACAA

麩氧還蛋白‧前置引子：

ATCACAGCCACCAACCACACTAACGAGA

麩氧還蛋白‧反置引子：

GTTACTGCAGAGCTCCAATCTGCTTTAGCC

核糖體蛋白‧前置引子：

ACAGAGGAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG

核糖體蛋白‧反置引子：

CACAGACAAGGCCAGGACTCGTTTGTACC

將硫氧化還原蛋白還原酶、硫氧化還原蛋白、麩胱苷肽還原酶及麩氧還蛋白之mRNA量除以核糖體蛋白之mRNA量所得者作為mRNA表現量。

其結果，與已知具有抗氧化作用之維生素E及類脂酸相比，山奈酚明顯促進氧化還原反應相關因子之表現(圖1)。

例2.　山奈酚對皮膚等價模型中之氧化還原反應相關因子表現之作用

由正常人、正常人角質細胞(Invitrogen)、正常人纖維母細胞(ATCC)及膠原蛋白I(Sigma)製作皮膚等價模型，並且於高濕、5% CO₂、37度之條件下，將其培養於達爾伯克氏改良伊格爾(Dulbecco's Modified Eagle's)培養基(D-MEM)(Invitrogen)中。向該培養基中添加2 mM或10 mM之山奈酚，並將該模型培養24小時。其後，使用QIAGEN mRNA離析套組，自皮膚等價模型之上皮層離析RNA。繼而，藉由使用即時(Real-time)PCR套組(Bio-Rad)之q-PCR(利用Bio-Rad MyiQ單色即時PCR檢測系統之定量PCR)，對硫氧化還原蛋白還原酶及麩胱苷肽還原酶、以及作為內部標準之36B4之mRNA進行定量。引子購買自QIAGEN(TXNRD2：#QT00070371；GSR；#QT00038325)。將硫氧化還原蛋白還原酶量及麩胱苷肽還原酶量除以36B4之mRNA量，獲得mRNA表現水平。

其結果，山奈酚明顯促進皮膚等價模型中之氧化還原反應相關因子之表現(圖2)。

例3.　促進硫氧化還原蛋白系之表現之藥劑之探索-類黃酮化合物

於高濕、5% CO₂、37度之條件下，於限制性角質細胞-SFM培養基(10744-019，GIBCO)中培養正常人表皮角質細胞(KK-4009，KURABO)。將最終密度為100%之細胞置換至鈣濃度調整為1.5 mM之EpiLife^TM無鈣無酚紅培養基(M-EPICF/PRF-500，KURABO)中。24小時後，以最終濃度成為10 μM之方式添加下述藥劑。

山奈酚(K0018，東京化成工業股份有限公司)

槲皮素(173-00403，和光純藥工業股份有限公司)

楊梅黃酮(70050，FLUKA)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E4143，CIAL)

橙皮甘(086-07342，和光純藥工業股份有限公司)

芹菜素(012-18913，和光純藥工業股份有限公司)

染料木黃酮(genistein)(070-04681，和光純藥工業股份有限公司)

藥劑添加後，於24小時後藉由上述例1之方法對氧化還原反應相關因子之mRNA之表現量進行定量。

其結果，上述類黃酮化合物中，僅山奈酚與槲皮素明顯促進硫氧化還原蛋白系之表現(圖3)。

例4.　促進硫氧化還原蛋白系之表現之藥劑之探索-植物萃取物之探索

於高濕、5% CO₂、37度之條件下，於限制性角質細胞-SFM培養基(10744-019，GIBCO)中培養正常人表皮角質細胞(KK-4009，KURABO)。將最終密度為100%之細胞置換至鈣濃度調整為1.5 mM之EpiLife^TM無鈣無酚紅培養基(M-EPICF/PRF-500，KURABO)中。24小時後，以最終濃度成為0.1%之方式添加下述藥劑：山奈萃取液：藉由50%之1,3-丁二醇對山奈(Kaempferia galanga)之根莖進行萃取而獲得者；銀杏葉萃取液：將銀杏(Ginkgo biloba L.)葉之50%乙醇萃取物轉溶於1,3-丁二醇中而獲得者；甜茶萃取物：將甜茶(Rubus Suavissimus Shugan Lee.(Rosaseae))之熱水萃取物轉溶於50%之1,3-丁二醇中而獲得者。

藥劑添加後，於24小時後藉由例1之方法對氧化還原反應相關因子之mRNA之表現量進行定量。

其結果，可確認於已知含有山奈酚、槲皮素及該等之糖苷之植物萃取液中，銀杏葉萃取液或山奈萃取液尤其促進硫氧化還原蛋白系之表現(圖4)。

例5.　硫氧化還原蛋白還原酶活性促進效果

於高濕、5% CO₂、37度之條件下，於限制性角質細胞-SFM培養基(10744-019，GIBCO)中培養正常人表皮角質細胞(KK-4009，KURABO)。將最終密度為100%之細胞置換至鈣濃度調整為1.5 mM之EpiLife^TM無鈣無酚紅培養基(M-EPICF/PRF-500，KURABO)中。24小時後，以最終濃度成為10 μM之方式添加山奈酚(K0018，東京化成工業股份有限公司)或槲皮素(173-00403，和光純藥工業股份有限公司)。藥劑添加後，於24小時後使其溶解於溶解緩衝劑中，藉由15分鐘、4℃之離心分離操作，以14,000 rpm之轉速將不溶性組分去除。對可溶性組分中之總蛋白質量進行定量後，依據Arne Holmgren等人之硫氧化還原蛋白還原酶活性測定方法(METHODS IN ENZYMOLOGY,1995,252,199-)進行活性測定。

其結果，可確認山奈酚及槲皮素促進硫氧化還原蛋白還原酶之活性(圖5)。

例6.　山奈酚、山奈萃取液、銀杏葉萃取液對炎症性細胞激素(IL1β)之表現之抑制效果

於高濕、5% CO₂、37度之條件下，於限制性角質細胞-SFM培養基(10744-019，GIBCO)中培養正常人表皮角質細胞(KK-4009，KURABO)。將最終密度為100%之細胞置換至鈣濃度調整為1.5 mM之EpiLife^TM無鈣無酚紅培養基(M-EPICF/PRF-500，KURABO)中。24小時後，以最終濃度成為10 μM之方式添加山奈酚，以最終濃度成為0.1%之方式添加下述植物萃取液：山奈酚(K0018，東京化成工業股份有限公司)；山奈萃取液：藉由50%之1,3-丁二醇對山奈(Kaempferia galanga)之根莖進行萃取而獲得者；銀杏葉萃取液：將銀杏(Ginkgo biloba L.)葉之50%乙醇萃取物轉溶於1,3-丁二醇中而獲得者。

藥劑添加後，於24小時後藉由例1之方法萃取RNA，對炎症相關因子(IL1β)之mRNA表現量進行定量。所使用之引子如下所述。

IL1β‧前置引子：

GGCCATGGACAAGCTGAGGAAGATGCTG

IL1β‧反置引子：

TGCATCGTGCACATAAGCCTCGTTATCCC

將IL1β之mRNA量除以核糖體蛋白之mRNA量而獲得者作為mRNA表現量。

其結果，由於藉由山奈酚、山奈萃取液及銀杏葉萃取液可抑制炎症性細胞激素即IL1β之產生，因此可確認該等成分具有抗炎症作用(圖6)。

圖1係表示山奈酚促進生物體內之氧化還原反應表現因子之表現的圖；

圖2係表示山奈酚促進皮膚等價模型中之氧化還原反應相關因子之表現的圖；

圖3係表示類黃酮化合物對硫氧化還原蛋白系之表現之促進作用中的比較之圖；

圖4係表示銀杏葉萃取液及山奈萃取液促進硫氧化還原蛋白還原酶之表現的圖；

圖5係表示山奈酚及槲皮素對硫氧化還原蛋白還原酶之活性促進效果的圖；及

圖6係表示山奈酚、銀杏葉萃取液及山奈萃取液抑制炎症性細胞激素(IL1β)之產生之效果的圖。

<110>　日商資生堂股份有限公司

<120>　氧化還原反應相關因子表現促進劑

<130>　Y826-PCT

<140>　100103496

<141>　2011-01-28

<150>　61/299,589

<151>　2010-01-29

<160>　12

<170>　PatentIn第3.1版

<210>　1

<211>　29

<212>　DNA

<213>　Artificial

<220>

<223>　forward primer

<400>　1

<210>　2

<211>　32

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　前置引子

<400>　2

<210>　3

<211>　30

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　前置引子

<400>　3

<210>　4

<211>　30

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　反置引子

<400>　4

<210>　5

<211>　30

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　前置引子

<400>　5

<210>　6

<211>　28

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　反置引子

<400>　6

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<211>　28

<212>　DNA

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<220>

<223>　前置引子

<400>　7

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<211>　30

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　反置引子

<400>　8

<210>　9

<211>　30

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　前置引子

<400>　9

<210>　10

<211>　29

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　反置引子

<400>　10

<210>　11

<211>　28

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　前置引子

<400>　11

<210>　12

<211>　29

<212>　DNA

<213>　人工的

<220>

<223>　反置引子

<400>　12

(無元件符號說明)

Claims

一種山奈酚及/或其之糖苷的用途，其係用以製備個體皮膚中IL-1β表現之抑制劑，其中該劑含有足以促進人類表皮角質細胞中氧化還原反應相關因子表現之量的山奈酚及/或其之糖苷作為有效成分，其中上述氧化還原反應相關因子包含選自由硫氧化還原蛋白、硫氧化還原蛋白還原酶、麩胱苷肽還原酶及麩氧還蛋白所組成之群中之1種或複數種物質。
一種銀杏葉萃取物的用途，其係用以製備個體皮膚中IL-1β表現之抑制劑，其中該劑含有足以促進人類表皮角質細胞中氧化還原反應相關因子表現之量的銀杏葉萃取物作為有效成分，其中上述氧化還原反應相關因子包含選自由硫氧化還原蛋白、硫氧化還原蛋白還原酶、麩胱苷肽還原酶及麩氧還蛋白所組成之群中之1種或複數種物質。
一種山奈萃取物的用途，其係於氧化還原反應相關因子表現促進劑之製備中作為有效成分，其中上述氧化還原反應相關因子包含選自由硫氧化還原蛋白、硫氧化還原蛋白還原酶、麩胱苷肽還原酶及麩氧還蛋白所組成之群中之1種或複數種物質。
如請求項3之用途，其中將足以抑制人類表皮角質細胞中IL-1β表現之量投予至需要抑制皮膚中IL-1β表現之個體。
如請求項1至4中任一項之用途，其中上述氧化還原反應相關因子為硫氧化還原蛋白。
如請求項1至4中任一項之用途，其中上述氧化還原反應相關因子為硫氧化還原蛋白還原酶。
如請求項1至4中任一項之用途，其中上述氧化還原反應相關因子為麩胱苷肽還原酶。
如請求項1至4中任一項之用途，其中上述氧化還原反應相關因子為麩氧還蛋白。