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TWI568847B - 用於１，４-丁二醇及其前驅物之生物合成的組合物及方法 - Google Patents

用於１，４-丁二醇及其前驅物之生物合成的組合物及方法 Download PDF

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TWI568847B
TWI568847B TW104111032A TW104111032A TWI568847B TW I568847 B TWI568847 B TW I568847B TW 104111032 A TW104111032 A TW 104111032A TW 104111032 A TW104111032 A TW 104111032A TW I568847 B TWI568847 B TW I568847B
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馬克 柏克
狄安 史戴芬Ｊ 凡
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奇諾麥提卡公司
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Description

用於1,4-丁二醇及其前驅物之生物合成的組合物及方法
本發明整體而言係關於生物體之電腦模擬(in silico)設計，具體而言，係關於具有1,4-丁二醇生物合成能力之生物體。
本申請案主張2007年3月16日提交之美國臨時申請案第60/918,463號之優先權，該臨時申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。
化合物4-羥基丁酸(4-羥基丁酸鹽、4-羥基丁酸酯、4-HB)係一種四碳羧酸，在工業上可作為各種大宗化學品及特用化學品之原料。具體而言，4-HB可作為合成1,4-丁二醇系列化學品(包括溶劑、樹脂、聚合物前驅物及特用化學品)之新切入點。1,4-丁二醇(BDO)係一種聚合物中間物及工業溶劑，其全球市場規模約達每年30億磅。BDO目前係由石化前驅物(主要為乙炔、順丁烯二酸酐及氧化丙烯)生產。
例如，乙炔在Reppe合成反應中與2分子之甲醛反應(Kroschwitz及Grant,Encyclopedia of Chem.Tech.,John Wiley and Sons,Inc.,New York(1999)，然後藉由催化加氫形成1,4-丁二醇。據估計，美國生產之乙炔中，約有90%用於生產丁二醇。另外，其亦可藉由源自丁烷之順丁烯二酸酐之酯化及催化加氫而形成。在下游，可對丁二醇進行進一步之轉化；例如藉由氧化成γ-丁內酯，然後再進一步轉化為吡咯啶 酮及N-甲基吡咯啶酮，或者藉由氫解形成四氫呋喃(請參閱圖1)。該等化合物之用途廣泛，如作為聚合物中間物、溶劑及添加劑，且其合計市場規模每年近20億磅。
期望開發一種藉由替代方法生產該等化學品之方法，該等替代方法不僅可用再生性資源來取代石化原料，而且亦可使用耗能更低及投資更少之製程。能源部(Department of Energy)已提議使用1,4-二酸，特別係琥珀酸來作為生產丁二醇系列產物之主要生物中間物(能源部報告(DOE Report),"Top Value-Added Chemicals from Biomass",2004)。然而，分離及純化琥珀酸之成本很高，而且要求高溫高壓才能在催化還原為丁二醇。
因此，對有效商業化生產1,4-丁二醇及其化學前驅物之替代方法存在需要。本發明滿足了此需求，亦提供相關優勢。
本發明提供一種非天然產生之微生物觸媒，其包括具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之微生物，該生物合成路徑包含至少一個編碼4-羥基丁酸脫氫酶、不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀醯-輔酶A合成酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶或麩胺酸脫羧酶之外源核酸，其中該外源核酸之表現足以生產單體4-羥基丁酸(4-HB)。還提供一種非天然產生之微生物觸媒，其包括具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑之微生物，該等生物合成路徑包含至少一個外源核酸。另外提供生產4-HB之方法。該方法包括培養具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之非天然產生之微生物。另外又提供製備4-HB之方法。該方法包括醱酵具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之非天然產生之微生物。醱酵可包括分批補料醱酵及分批萃取；分批補料醱酵及連續萃取；或者連續醱酵及連續萃取。本發明進一步提供生產γ-丁內酯(GBL)、四氫呋喃(THF)或 1,4-丁二醇(BDO)之方法。該方法包括醱酵具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑之非天然產生之微生物。
1‧‧‧琥珀醯-輔酶A合成酶
2‧‧‧不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶
3‧‧‧α-酮戊二酸脫氫酶
4‧‧‧麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶
5‧‧‧麩胺酸脫羧酶
6‧‧‧依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶
7‧‧‧4-羥基丁酸脫氫酶
8‧‧‧α-酮戊二酸脫羧酶
9‧‧‧4-羥丁醯輔酶A：乙醯輔酶A轉移酶
10‧‧‧4-羥基丁酸激酶
11‧‧‧磷酸轉羥丁醯酶
12‧‧‧醛脫氫酶
13‧‧‧醇脫氫酶
圖1係顯示4-羥基丁酸(4-HB)進入1,4-丁二醇(BDO)化合物家族生產途徑之切入點及與石化原料化學合成路徑相比較之示意圖。黑色實線箭頭表示化學合成路徑；藍色虛線箭頭表示到4-HB之生物合成路徑，及隨後到BDO家族化合物之轉化步驟。
圖2係顯示到4-羥基丁酸(4-HB)及到1,4-丁二醇生產之生化路徑之示意圖。前5步係大腸桿菌內源性的，而其餘步驟則可由異源表現。催化該等生物合成反應之酶有：(1)琥珀醯-輔酶A合成酶；(2)不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶；(3)α-酮戊二酸脫氫酶；(4)麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶；(5)麩胺酸脫羧酶；(6)依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶；(7)4-羥基丁酸脫氫酶；(8)α-酮戊二酸脫羧酶；(9)4-羥丁醯輔酶A：乙醯輔酶A轉移酶；(10)4-羥基丁酸激酶；(11)磷酸轉羥丁醯酶；(12)醛脫氫酶；(13)醇脫氫酶。
圖3係顯示大腸桿菌中高絲胺酸生物合成之示意圖。
圖4顯示從左旋高絲胺酸到4HB之預測高絲胺酸生物合成路徑之示意圖。第1步係預計△rxnG為12kJ/mol之推断解胺酶(EC類別4.3.1)。第2步係預計△rxnG為-59kJ/mol之推断氧化還原酶(EC類別1.3.1)。
圖5顯示將天門冬胺酸藉由反丁烯二酸轉化為琥珀酸之內源大腸桿菌路徑之示意圖。此路徑表現出與預測高絲胺酸生物合成路徑相似之化學反應。
圖6顯示說明(A)高絲胺酸及(B)琥珀醯-輔酶A到BDO之生物合成路徑之間平行關係之示意圖。
圖7係顯示大腸桿菌中到乙醯乙酸之生化路徑之示意圖。
圖8係顯示從乙醯乙酸藉由琥珀酸半醛到BDO之生化路徑之示意圖。
圖9係顯示D-賴胺酸-5,6-胺基變位酶反應流程之示意圖。
圖10係顯示從乙醯輔酶A到乙醯乙酸之路徑之示意圖。其中之酶包括：(1)丙酮酸甲酸裂解酶；(2)丙酮酸脫氫酶；(3)乙醯輔酶A：乙醯乙醯輔酶A轉移酶；(4)乙醯輔酶A-C-乙醯轉移酶；(5)磷酸轉乙醯酶；及(6)乙酸激酶。酶7係圖7中乙醯乙酸到BDO之路徑。
圖11係顯示1,4-丁二醇(BDO)及下游產物γ-丁內酯(GBL)、四氫呋喃(THF)及數種吡咯啶酮之化學合成之示意圖。
圖12顯示在葡萄糖基本培養基中使用含質體(表現各種4HB路徑基因組合)之大腸桿菌菌株生產4HB。(a)醱酵液中之4HB濃度；(b)醱酵液中之琥珀酸濃度；(c)在600nm下量測之醱酵液OD值。長條組代表24小時、48小時及72小時(若量測)之時間點。X軸之代碼表示使用之菌株/質體組合。第一個指數係指宿主菌株：1，MG1655 lacIQ；2，MG1655 △gabD lacIQ；3，MG1655 △gabD △aldA lacIQ。第二個指數係指使用之質體組合：1，pZE13-0004-0035及pZA33-0036；2，pZE13-0004-0035及pZA33-0010n；3，pZE13-0004-0008及pZA33-0036；4，pZE13-0004-0008及pZA33-0010n；5，對照載體pZE13及pZA33。
圖13顯示在表現來自結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之酮戊二酸脫羧酶之大腸桿菌菌株中從葡萄糖生產4HB。菌株1-3包含pZE13-0032及pZA33-0036。菌株4僅表現空載體pZE13及pZA33。宿主菌株如下：1及4，MG1655 lacIQ；2，MG1655 △gabD lacIQ；3，MG1655 △gabD △aLdA lacIQ。長條係指24及48小時下之濃度。
圖14顯示在重組大腸桿菌菌株中從10mM之4HB生產BDO。編號位置對應於使用含pZA33-0024、表現來自牙齦卟啉單胞菌(P. gingivalis)之cat2之MG1655 lacIQ之實驗，及以下表現於pZE13上之基因：1，無(對照物)；2，0002；3，0003；4，0003n；5，0011；6，0013；7，0023；8，0025；9，0008n；10，0035。對於各位置而言，長條分別代表有氧、微氧及厭氧條件。微氧條件藉由密封培養管，但不對其抽氣而建立。
圖15顯示生長於補充有4g/L未標記葡萄糖(a、c、e及g)，及均勻標記13C-葡萄糖(b、d、f、及h)之M9基本培養基中之MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036所產生之4HB及BDO之質譜。(a)及(b)，衍生BDO之質量116特徵碎片，含2個碳原子；(c)及(d)，衍生BDO之質量177特徵碎片，含1個碳原子；(e)及(f)，衍生4HB之質量117特徵碎片，含2個碳原子；(g)及(h)，衍生4HB之質量233特徵碎片，含4個碳原子。
圖16係生產γ-丁內酯之生物製程之流程示意圖。面板(a)說明使用批次分離之分批補料醱酵；而面板(b)說明使用連續分離之分批補料醱酵。
本發明旨在設計及生產具有4-羥基丁酸(4-HB)、γ-丁內酯及1,4-丁二醇生物合成能力之細胞及生物體。本發明之一實施例係利用基於大腸桿菌(Escherichia coli)代謝電腦模擬化學計量模型來識別生物合成4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)之代謝設計。在此描述之結果指示，可設計及以重組方式製備代謝路徑以完成4-HB及其下游產物之生物合成，例如在大腸桿菌及其他細胞或生物體中合成1,4-丁二醇。例如，用於電腦模擬設計之4-HB之生物合成可藉由構建具有經設計代謝基因型之菌株而獲得確認。該等經代謝設計之細胞或生物體亦可進行適應性演化來進一步擴大4-HB之生物合成，包括在接近理論最大生長之條件下。
在某些實施例中，經設計菌株之4-HB生物合成特性使其在遺傳上能夠達到穩定，且在連續之生物製程中特別有用。藉由在大腸桿菌中整合不同的產生4-HB及1,4-丁二醇之非原生(non-native)或異源(heterologous)反應能力，以產生利用不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀醯-輔酶A合成酶及依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶或麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶之代謝路徑，藉此找出獨立之菌株設計策略。同時，找出利用該等代謝路徑之每一者以在大腸桿菌及酵母中完成4-HB生物合成之電腦模擬代謝設計。1,4-丁二醇之中間物γ-丁內酯可在培養物中藉由pH<7.5條件下之自發環化而產生，特別係在酸性條件下，例如低於pH 5.5，諸如pH<7、pH<6.5、pH<6，特別係在pH<5.5或以下。
藉由該平台之計算部分找到之菌株可藉由在遺傳上設計任何可能導致4-HB、1,4-丁二醇或其他中間物及/或下游產物之生物合成之預測代謝改變而投入實際生產。在另一實施例中，表現出可生物合成該等化合物之菌株可進一步經受適應性演化而繼續擴大該產物之生物合成。該系統之計算部分亦可預測適應性演化後產物生物合成之產量水準。
在其他具體實施例中，構建微生物以表現用於編碼自琥珀酸至4-HB及4-HB-輔酶A之酶促步驟的4-HB生物合成路徑。與缺乏4-HB生物合成路徑之宿主微生物相比，琥珀酸輔酶A轉移酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、依賴NAD之4-羥基丁酸脫氫酶及4-羥基丁酸輔酶A轉移酶在宿主微生物中之共同表現已導致4-HB產量之顯著增加。在另一具體實施例中，藉由引入編碼α-酮戊二酸脫羧酶及依賴NAD之4-羥基丁酸脫氫酶的核酸而產生利用α-酮戊二酸作為底物的產生4-HB之微生物。
在另一具體實施例中，構建於存在4-HB未羥化底物之環境中培 養時生物合成1,4-丁二醇(BDO)之具有BDO合成路徑之微生物。BDO生物合成路徑係由編碼多功能醛/醇脫氫酶之一個核酸，或編碼一個醛脫氫酶及一個醇脫氫酶之多個核酸組成。為了支持依靠4-HB底物之生長，該等產生BDO之微生物亦表現4-羥基丁酸輔酶A轉移酶。在另一具體實施例中，藉由編碼功能性4-HB生物合成路徑及功能性BDO生物合成路徑之核酸之外源表現而產生合成BDO之微生物。4-HB生物合成路徑係由琥珀酸輔酶A轉移酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、依賴NAD之4-羥基丁酸脫氫酶及4-羥基丁酸輔酶A轉移酶組成。BDO路徑係由多功能醛/醇脫氫酶組成。
如本文中所用，「非天然發生」一詞用於本發明之微生物時意欲指該微生物至少有一個在相關(referenced)物種天然菌株(包括此相關物種之野生型菌株)中一般找不到之基因改變。例如，基因改變包括引入編碼代謝多肽之可表現核酸之修飾、其他核酸添加、核酸缺失及/或對微生物遺傳材料之其他功能性中斷等。此種修飾包括例如相關物種異源、同源或異源及同源多肽之編碼區域及功能性片段。其他修飾包括例如修飾可改變基因或操縱子(operon)表現之非編碼調控區域。代謝多肽之範例包括4-HB生物合成路徑中之酶及BDO化合物家族生物合成路徑中之酶。
代謝修飾係指與其天然狀態對照時發生改變之生化反應。因此，非天然產生之微生物具有對編碼代謝多肽之核酸或其功能性片段之基因修飾。下面進一步描述大腸桿菌及酵母生物體之代謝修飾之範例。
如本文中所用，「分離之」一词在用於微生物時，意欲指一種實質上不含相關微生物在自然界所發現之至少一種組分之生物體。該術語包括一種去除了其在自然環境中所具有部分或全部組分之微生物。該術語亦包括一種去除了其在非自然環境中所具有部分或全部組分之 微生物。因此，分離之微生物與其在自然或在非自然環境中生長、儲存或生存時所發現之其他物質部分或完全隔離。分離之微生物之具體實例包括部分純淨之微生物、實質純淨之微生物及在非自然培養基中培養之微生物。
如本文中所用，「微生物(microbial/microbial organism/microorganism)」等術語意欲指以屬於古細菌(archaea)界、細菌(bacteria)界或真核生物(eukarya)界中之顯微細胞而存在之任何生物體。因此，此術語意欲涵蓋具有顯微大小之原核或真核細胞或生物體，並包括所有種類之細菌、古細菌及真細菌(eubacteria)以及酵母及真菌等真核微生物。該術語亦包含為生產生化產物而培養之任何物種之細胞培養物。
如本文中所用，術語「4-羥基丁酸」意欲指具有分子式C4H8O3及分子量104.11g/mol(其鈉鹽為126.09g/mol)之丁酸之4-羥基衍生物。化合物4-羥基丁酸亦在本技術領域中被稱為4-HB、4-羥基丁酸酯、γ-羥基丁酸或GHB。該術語用於本文中時意欲涵蓋該化合物之各種鹽形式，並包括例如4-羥基丁酸酯及4-羥基丁酸鹽。4-HB鹽形式之具體實例包括4-HB之鈉鹽及鉀鹽。因此，4-羥基丁酸、4-HB、4-羥基丁酸酯、4-羥基丁酸鹽、γ-羥基丁酸及GHB等術語及其他在此項技術中採用之名稱在此當成同義詞使用。
如本文中所用，術語「單體」在用於4-HB時意欲指非聚合或未衍生形式之4-HB。聚合4-HB之具體實例包括聚4-羥基丁酸及4-HB及3-HB之共聚物。4-HB衍生形式之一個具體實例係4-HB-輔酶A。4-HB之其他聚合及衍生形式亦在此項技術中已知。
如本文中所用，術語「γ-丁內酯」意欲指具有分子式C4H6O2及分子量86.089g/mol之內酯。化合物γ-丁內酯亦在本技術領域中被稱為GBL、丁內酯、1,4-內酯、4-丁內酯、4-羥基丁酸內酯及γ-羥基丁酸內 酯。此術語用在本文中時意欲涵蓋該化合物之各種鹽形式。
如本文中所用，「1-4丁二醇」意欲指烷烴丁烷攜帶兩個羥基之醇衍生物，其分子式為C4H10O2，分子量為90.12g/mol。化合物1-4丁二醇亦在本技術領域中被稱為BDO，且係一種化合物家族之化學中間物或前驅物，在此被稱為BDO化合物家族(部分實例見圖1)。該術語用在本文中時意欲涵蓋該化合物之各種鹽形式。
如本文中所用，術語「四氫呋喃」意欲指與芳族化合物呋喃完全氫化類似物相對應之雜環有機化合物，其分子式為C4H8O，分子量為72.11g/mol。化合物四氫呋喃亦在本技術領域中被稱為THF、四氫呋喃、1,4-環氧丁烷、氧化丁烯、環四亞甲基氧化物、氧雜環戊烷、氧化二乙烯、氧雜環戊烷(oxolane)、呋喃烷(furanidine)、氫化呋喃(hydrofuran)、四亞甲基氧化物。此術語用在本文中時意欲涵蓋該化合物之各種鹽形式。
如本文中所用，術語「CoA」或「輔酶A」意欲指形成活性酶系統之多個酶(主酶(apoenzyme)之活性所要求存在之有機輔助因數(cofactor)或輔基(prosthetic group)(酶之非蛋白部分)。輔酶A在某些縮合酶中、乙醯基或其他醯基之轉移中及在脂肪酸之合成及氧化、丙酮酸氧化及其他乙醯化中發揮作用。
如本文中所用，術語「實質厭氧」在用於培養或生長條件時意欲指氧含量低於液態培養基中飽和溶解氧濃度之約10%。該術語亦意欲涵蓋以氧含量低於約1%之氣氛維持之裝有液態或固態培養基之密封腔室。
本發明之非天然產生之微生物可包含穩定之基因改變，此係指能夠在培養五代以上後不喪失此改變之微生物。一般而言，穩定之基因改變包括持續10代以上之修飾，特別穩定之修飾會持續25代以上，而更加穩定之基因修飾會持續50代以上，包括無限繁殖。
熟悉此項技術者會瞭解基因改變，包括本文舉例之代謝修飾，係關於大腸桿菌及酵母基因及其相應之代謝反應所描述。但因多種生物體已完成基因組定序及在基因組技術上之高度發展，熟悉此項技術者可很容易地將本文之教示及指導用於幾乎所有其他生物體。例如，本文舉例之大腸桿菌代謝改變可藉由在相關物種之外的其他物種中加入相同或類似之編碼核酸，而輕易地用於其他物種。一般而言，該等基因改變包括例如物種同源物(homolog)之基因改變，具體而言包括直系同源(ortholog)、旁系同源(paralog)或非直系同源(nonorthologous)基因取代。
直系同源基因係藉由垂直遺傳傳遞(vertical descent)相關之一個或一組基因，並在不同生物體中負責實質上相同或等同之功能。例如，小鼠及人之環氧化物水解酶因水解環氧化物之生物功能而可被視為直系同源。基因係藉由垂直遺傳傳遞相關，例如，在它們共用之序列相似性足以顯示其同源時，或者係藉由共同祖先之演化而相關。若基因三維結構之相似程度(但序列不一定相似)足以在主要序列相似性不可識別之範圍內顯示他們來自同一個祖先，則亦可被認為係直系同源。直系同源之基因可編碼胺基酸序列一致性約在25%至100%之間的蛋白質。編碼胺基酸序列相似性低於25%之蛋白質之基因，若其三維結構亦顯示出相似性，則亦可被視為來自垂直遺傳傳遞。絲胺酸蛋白酶家族之成員，包括組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(tissue plasminogen activator)及彈性蛋白酶(elastase)，均被視為藉由垂直遺傳傳遞來自同一個祖先。
直系同源包括例如藉由演化而在結構或整體活性上趨異之基因或其編碼之基因產物。例如，一個物種編碼之基因產物具有兩種功能，而在第二個物種中這兩種功能由不同之基因編碼，則這三個基因及其相應之產物即被視為直系同源。對於一種生化產物之生長耦合生 產(growth-coupled production)而言，熟悉此項技術者會瞭解為了構建非天然產生之微生物，可選擇具有待中斷之代謝活性之直系同源基因。表現出可分離活性之直系同源基因之例子包括分離不同之活性至兩個或兩個以上物種間，或在一個物種內不同之基因產物中之情況。其具體實例為兩種絲胺酸蛋白酶活性(彈性蛋白酶蛋白質水解及血纖維蛋白溶酶原蛋白質水解)被分離到不同之分子中，即血纖維蛋白溶酶原活化劑及彈性蛋白酶。第二個例子係支原體(mycoplasma)5'-3'核酸外切酶及果蠅DNA聚合酶III活性之分離。來自第一個物種之DNA聚合酶可被視為來自第二個物種之核酸外切酶或聚合酶或兩者之直系同源，反之亦然。
相比之下，旁系同源係藉由例如複製後演化趨異而相關之同源基因，並擁有相似或共同但不等同之功能。旁系同源可起源於或衍生自例如同一物種或其他物種。例如，微粒體環氧化物水解酶(環氧化物水解酶I)及可溶性環氧化物水解酶(環氧化物水解酶II)可被視為旁系同源，因為其代表著兩個不同之酶，但均演化自一個共同祖先，同時在同一物種內催化不同之反應及具有不同之功能。旁系同源係同一物種內序列明顯相似之蛋白質，表明其係同源的，或者經由均演化自一個共同祖先而相關。旁系同源蛋白質家族群包括HipA同源蛋白、螢光素酶基因、肽酶及其他。
非直系同源基因取代係指來自一個物種之非直系同源基因可取代其他物種中相應的基因功能。取代包括例如與其他物種中的相關功能相比，能夠在原始物種中實質上執行相同或類似之功能。一般而言，雖然非直系同源基因取代被認為係在結構上與編碼相應功能之已知基因相關，但結構不太相關卻在功能上相似之基因及其相應基因產物亦在此處所用術語之含義之中。功能上之相似性要求例如在非直系同源基因之活性位點或結合區域至少有一些結構上之相似性(與編碼 欲被取代之功能之基因相比)。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源或無關基因。
因此，在識別及構建本發明中具有4-HB、GBL及/或BDO生物合成能力之非天然產生之微生物時，熟悉此項技術者會在將本文提供之教示及指導應用到一個具體物種後，瞭解對於代謝修飾之識別可包括直系同源基因之識別及包括或失活。在對催化相似或實質上相似代謝反應之酶進行編碼之相關微生物中，在存在旁系同源及/或非直系同源基因取代之範圍內，熟悉此項技術者亦可利用該等在演化上相關之基因。
直系同源、旁系同源及非直系同源基因取代可藉由熟悉此項技術者所熟知之方法判斷。例如檢查兩種多肽之核酸或胺基酸序列就會發現所比較序列之間的相似性及一致性。根據該等相似性，熟悉此項技術者可判斷該相似性是否足以指示該等蛋白質係藉由共同祖先之演化而相關。熟悉此項技術者所熟知之演算法，例如Align、BLAST、Clustal W及其他，比較及判斷出原始之序列相似性或一致性，亦判斷出序列中是否存在可加權或評分之缺口(gap)。該等演算法在此項技術中亦為人所知，並用於判斷核苷酸序列之相似性或一致性。用於充分相似性以判斷相關性之參數係根據用於計算統計相似性之已知方法，或在隨機多肽中找到相似匹配之機率及該匹配之顯著性而計算得到的。兩個或兩個以上序列之電腦比較亦可在需要時由熟悉此項技術者進行優化。相關基因產物或蛋白質之預期相似程度較高，例如25%到100%之序列一致性。若掃描足夠大之資料庫，無關之蛋白質可能擁有與預期概率(約5%)基本相同之一致性。相似程度在5%與24%之間的序列可能或不能代表可說明所比較序列相關之足夠同源性。若給定資料集之大小，則可進行確定匹配顯著性之額外統計分析來判斷該等序列之相關性。
使用BLAST演算法判斷兩個或兩個以上序列相關性之範例參數如下。簡言之，胺基酸序列之比對可使用BLASTP 2.0.8版(1999年1月5日)及以下參數進行：Matrix：0 BLOSUM62；gap open：11；gap extension：1；x_dropoff：50；expect：10.0；wordsize：3；filter：on。核酸序列之比對可使用BLASTN 2.0.6版(1998年9月16日)及以下參數進行：Match：1；mismatch：-2；gap open：5；gap extension：2；x_dropoff：50；expect：10.0；wordsize：11；filter：off。熟悉此項技術者會知道對上述參數進行哪些修改以提高或降低例如比較之嚴苛度(stringency)，並判斷兩個或兩個以上序列之相關性。
本發明提供一種非天然產生之微生物觸媒，其包括具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之微生物，該生物合成路徑包括至少一個編碼4-羥基丁酸脫氫酶、不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀醯-輔酶A合成酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶或麩胺酸脫羧酶之外源核酸，其中該外源核酸之表現足以生產單體4-羥基丁酸(4-HB)。4-羥基丁酸脫氫酶亦被稱為4-羥基丁酸脫氫酶。琥珀醯-輔酶A合成酶亦被稱為琥珀醯-輔酶A合酶或琥珀醯-輔酶A連接酶。
本發明之非天然產生之微生物觸媒包括微生物，該等微生物可利用代謝反應組合以生物合成方式產生本發明之化合物。該非天然產生之微生物所產生之化合物範例包括4-羥基丁酸、1,4-丁二醇及γ-丁內酯。該等範例化合物與化學合成或生物合成之關係在圖1中舉例說明。
在一實施例中，設計一個非天然產生之微生物以產生4-HB。該化合物係產生1,4-丁二醇化合物家族之一個有用切入點。圖2之第1-8步顯示從琥珀酸、從琥珀酸藉由琥珀醯-輔酶A或從α-酮戊二酸產生4-HB之生物化學反應。
本發明將在此一般性描述代謝反應、其反應物或產物，或者具體描述一或多個核酸或基因，其用來編碼與所介紹代謝反應、反應物或產物相關的，或催化該等反應之酶。除非在此另外明確說明，否則熟悉此項技術者會瞭解對反應之描述亦構成對該反應之反應物及產物之描述。同樣，除非在此另外明確說明，否則對反應物或產物之描述亦構成對該反應之描述，而且對任何代謝成分之描述亦構成對編碼催化所描述反應、反應物或產物之酶之一或多個基因之描述。同樣，在代謝生物化學、酶學及基因組學之已知領域下，此處對基因或編碼核酸之描述亦構成對相應編碼之酶及其催化之反應及該反應之反應物及產物之描述。
使用本發明之微生物藉由生物合成模式生產4-HB係非常有用的，因為其可產生單體4-HB。本發明之非天然產生之微生物及其對4-HB及BDO化合物家族之生物合成亦係非常有用的，因為4-HB產物係(1)被分泌出來的；(2)可完全避免輔酶A等任何衍生反應之產生；(3)避免生物合成中之熱力變化；(4)允許BDO之直接生物合成；及(5)允許在酸性pH培養基中4-HB到γ-丁內酯(GBL)之自發化學轉化。最後一個特性亦對諸如1,4-丁二醇及/或四氫呋喃(THF)等BDO化合物家族之高效化學合成或生物合成非常有用。
微生物一般缺乏合成4-HB之能力，因此，圖1中顯示之所有化合物均認為屬於1,4-丁二醇化合物家族或被熟悉此項技術者歸為1,4-丁二醇化合物家族。另外，在目前所知之範圍內，具有所有必需之代謝酶能力之生物體均無法從此處描述之酶及舉例說明之生化路徑產生4-HB。相反，可能除以下進一步描述之幾種厭氧微生物外，具有酶能力之微生物可使用4-HB作為底物來生產琥珀酸。相比之下，本發明之非天然產生之微生物將4-HB作為其產物。如上所述，4-HB單體形式之生物合成不僅在BDO化合物家族之化學合成中非常有用，而且亦 允許BDO化合物家族之進一步生物合成及完全摒棄化學合成流程。
本發明中可產生4-HB之非天然產生之微生物可藉由確保宿主微生物包含本發明之至少一個4-HB生物合成路徑之完整生化合成功能而產生。確保至少一個必需之4-HB生物合成路徑可將4-HB生物合成能力賦予宿主微生物。
此處舉例說明四個必需之4-HB生物合成路徑，並在圖2中顯示出來。一個必需之4-HB生物合成路徑包括從琥珀酸生物合成4-HB(琥珀酸路徑)。參與此4-HB路徑之酶包括不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及4-羥基丁酸脫氫酶。在此路徑中，不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶催化圖2中所示箭頭之反向反應。另一個必需之4-HB生物合成路徑包括從琥珀酸藉由琥珀醯-輔酶A進行生物合成(琥珀醯-輔酶A路徑)。參與此4-HB路徑之酶包括琥珀醯-輔酶A合成酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及4-羥基丁酸脫氫酶。三個其他必需之4-HB生物合成路徑包括從α-酮戊二酸生物合成4-HB(α-酮戊二酸路徑)。因此，第三個必需之4-HB生物合成路徑係藉由麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸脫羧酶及4-羥基丁酸脫氫酶生物合成琥珀酸半醛。第四個必需之4-HB生物合成路徑亦包括從α-酮戊二酸生物合成4-HB，但係利用α-酮戊二酸脫羧酶催化琥珀酸半醛。4-羥基丁酸脫氫酶催化琥珀酸半醛轉化為4-HB。第五個必需之4-HB生物合成路徑包括從α-酮戊二酸藉由琥珀醯-輔酶A進行生物合成並利用α-酮戊二酸脫氫酶產生琥珀醯-輔酶A，然後進入上述琥珀醯-輔酶A路徑。下面之實例中進一步描述各4-HB生物合成路徑，其底物、反應物及產物。
本發明之非天然產生之微生物可藉由引入編碼參與一或多個4-HB生物合成路徑之一或多個酶之可表現核酸而產生。根據生物合成所選擇之宿主微生物，可表現用於特定4-HB生物合成路徑之部分或全部反應之核酸。例如，若選擇之宿主缺乏琥珀酸到4-HB路徑中之 兩種酶，且選擇此路徑進行4-HB之生物合成，則要在宿主中引入用於表現不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及4-羥基丁酸脫氫酶之核酸，以進行隨後之外源表現。另外，若選擇之宿主顯示內源性之不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶，但缺乏4-羥基丁酸脫氫酶，則需要此酶之編碼核酸以進行4-HB之生物合成。
同樣，在選擇藉由琥珀酸到琥珀醯-輔酶A路徑(琥珀醯-輔酶A路徑)進行4-HB之生物合成時，對於宿主所缺乏之琥珀醯-輔酶A合成酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及/或4-羥基丁酸脫氫酶之編碼核酸將在受體宿主中藉由外源方式表現。選擇藉由α-酮戊二酸到琥珀酸半醛路徑(α-酮戊二酸路徑)進行4-HB之生物合成可利用宿主缺乏之以下一或多種酶之外源表現：麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸脫羧酶及/或4-羥基丁酸脫氫酶，或者α-酮戊二酸脫羧酶及/或4-羥基丁酸脫氫酶。
根據所選擇宿主微生物之4-HB生物合成路徑之組分，本發明之非天然產生之微生物4-HB生物觸媒將包括至少一個外源表現之編碼4-HB路徑之核酸，及最多一或多個4-HB生物合成路徑之所有編碼核酸。例如，可在缺乏4-羥基丁酸脫氫酶之宿主中藉由編碼4-羥基丁酸脫氫酶之核酸之外源表現而自全部五個路徑建立4-HB之生物合成。相比之下，可在缺乏所有八個酶之宿主中藉由以下所有八個酶之外源表現而自全部五個路徑建立4-HB之生物合成：不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀醯-輔酶A合成酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸脫羧酶、α-酮戊二酸脫羧酶、α-酮戊二酸脫氫酶及4-羥基丁酸脫氫酶。
藉由本文提供之教示及指導，熟悉此項技術者將會瞭解以可表現形式引入之編碼核酸之數目將至少與所選宿主微生物之4-HB路徑缺乏數目相平行。因此，本發明之非天然產生之微生物可擁有一個、 兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個對構成一或多個4-HB生物合成路徑之上述酶進行編碼之核酸。在一些實施例中，該非天然產生之微生物亦可包括協助或優化4-HB之生物合成，或者賦予宿主微生物其他有用功能之其他基因修飾。例如，此類之其他功能性可包括例如，諸如琥珀酸、琥珀醯-輔酶A及/或α-酮戊二酸等一或多個4-HB路徑前驅物合成之擴大。
在一些實施例中，本發明之非天然產生之微生物可由具有合成4-HB之酶能力之宿主產生。在此具體實施例中，增加一種4-HB路徑產物之合成或積累非常有用，例如推動4-HB路徑反應向產生4-HB之方向進行。提高之合成或積累可例如藉由編碼一或多個上述4-HB路徑酶之核酸之過度表現而獲得。4-HB路徑酶之過度表現可例如藉由內源基因之外源表現或異源基因之外源表現而實現。因此，天然微生物可容易地藉由一個、兩個、三個、四個、五個或全部六個編碼4-HB生物合成路徑酶之核酸之過度表現而轉變為本發明之產生4-HB之非天然產生之微生物。另外，可藉由導致4-HB生物合成路徑中一種酶活性提高之內源基因之突變而產生非天然微生物。
在特別有用之實施例中，會採用編碼核酸之外源表現。外源表現為宿主帶來量身訂製表現及/或調控元件之能力，並可用於取得由使用者控制之所需表現水準。但是，內源表現亦可在其他實施例中使用，例如藉由移除一個負調控效應子(effector)，或在與一個可誘導啟動子或其他調控元件關聯時引入該基因之啟動子。因此，具有天然可誘導啟動子之內源基因可藉由提供適當之誘導劑(inducing agent)而進行正調控，或者可設計一個內源基因之調控區域以結合一個可誘導之調控元件，藉此在所需之時間調控內源基因增加之表現。類似地，可將一個可誘導啟動子當成調控元件包括進一個引入非天然產生之微生物中之外源基因中(例如，請參閱實例II及IV)。
「外源」如本文中所用意欲指引入到宿主微生物中之相關分子或相關活性。因此，該術語在用於編碼核酸之表現時，係指將處於可表現形式之編碼核酸引入到微生物中。在用於生物合成活性時，該術語係指引入到相關宿主生物中之活性。其來源可例如為在引入宿主微生物後表現相關活性之同源或異源編碼核酸。因此，術語「內源」係指宿主中所存在之相關分子或活性。同樣，該術語在用於編碼核酸之表現時，係指微生物中所包含之編碼核酸之表現。術語「異源」係指來自相關物種以外來源之分子或活性，而「同源」係指來自宿主微生物之分子或活性。相應地，本發明中編碼核酸之外源表現可利用異源或同源編碼核酸或同時利用兩者。
4-HB路徑酶編碼核酸之來源包括例如其編碼基因產物能夠催化相關反應之任何物種。該等物種包括原核及真核生物，包括但不限於細菌；包括古細菌及真細菌，及真核細胞；包括酵母、植物、昆蟲、動物及哺乳動物；包括人類。該等來源之範例物種包括例如，大腸桿菌(E.coli)、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicu)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、Clostridium saccharoperbutylacetonicum、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、難辨梭菌(Clostridium difficile)、富飬羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、卡介菌(Mycobacterium bovis)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)及牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)。例如，具有4-HB生物合成能力之微生物在本文用大腸桿菌及酵母宿主舉例說明。但因現在有550多個物種(其中一半以上均在NCBI等公共資料庫中提供)之完整基因組序列可用，包括395種微生物基因組及多種酵母、真菌、植物及動物之基因組，所以在相關或不同物種之一或多個基因中識別編碼所需4-HB生物合成活性之基因， 包括例如已知基因之同源、直系同源、旁系同源及非直系同源基因取代，及生物體間基因改變之互換，已成為一般技術並廣為人知。相應地，對於特定生物體(如大腸桿菌或酵母等)允許生物合成4-HB及本發明之其他化合物之代謝改變亦可方便地應用到其他微生物，包括原核及真核生物。根據本文提供之教示及指導，熟悉此項技術者會瞭解如何將以一種微生物為例之代謝改變同樣應用到其他生物體。
在某些情況下，例如在一種不相關物種中存在替代性4-HB生物合成路徑時，4-HB生物合成能力可藉由例如此不相關物種中催化相似，但不完全相同之代謝反應以取代相關反應之一或多個旁系同源基因之外源表現，而轉移到宿主物種中。因為不同之生物體間代謝網路中存在某些差異，所以熟悉此項技術者會瞭解不同生物體間實際使用之基因可能不同。但根據本文提供之教示及指導，熟悉此項技術者亦會瞭解本發明之教示及方法可應用於所有微生物(使用對本文舉例說明之生物體進行之同源代謝改變)，以便構建能夠合成單體4-HB之相關物種中之微生物。
宿主微生物可選自細菌、酵母、真菌或任何其他適用於醱酵製程之多種微生物，而非天然產生之微生物可產生於該等微生物。細菌之範例包括選自大腸桿菌(E.coli)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、產琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、產琥珀酸曼哈米亞桿菌(Mannheimia succiniciproducens)、艾利特根瘤菌(Rhizobium etli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、穀胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)、運動醱酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)及惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)之物種。酵母或真菌之範例包括選自釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)、產乳糖酶酵母(Kluyveromyces marxianus)、土麴菌(Aspergillus terreus)、黑麴菌(Aspergillus niger)及嗜甲醇酵母菌(Pichia pastoris)之物種。
構建及測試產生4-HB之非天然宿主之表現水準的方法例如可藉由此項技術中熟知之重組及偵測方法進行。該等方法例如請參閱Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。4-HB及GBL之分離可例如藉由使用Spherisorb 5 ODS1管柱及70% 10mM磷酸鹽緩衝液(pH=7)及30%甲醇之流動相之HPLC進行，而其偵測可使用215nm下之紫外線偵測器進行(Hennessy等人2004,J.Forensic Sci.46(6)：1-9)。BDO之偵測可藉由氣相層析法或藉由使用Aminex HPX-87H管柱及0.5mM硫酸之流動相之HPLC及折光率偵測器來偵測(Gonzalez-Pajuelo等人，Met.Eng.7：329-336(2005))。
本發明之非天然產生之微生物可使用上例說明之此項技術中所熟知之方法構建，以便以充足量外源表現至少一個編碼4-HB路徑酶之核酸以產生4-HB單體。各路徑中4-HB酶之表現水準範例將在下面之「實例」部分詳細描述。按照本文提供之教示及指導，本發明之非天然產生之微生物之單體4-HB生物合成產量可達到約0.1-25mM或以上之胞內濃度。一般而言，單體4-HB之胞內濃度係在約3-20mM之間，尤其在約5-15mM之間，更尤其在約8-12mM之間，包括約10 mM或以上。亦可由本發明之非天然產生之微生物取得在上述該等範例範圍之間及高於此範圍之胞內濃度。
如下所述，4-HB生物合成生長條件之一個範例包括厭氧培養或醱酵條件。在某些實施例中，本發明之非天然產生之微生物可在厭氧或實質上厭氧之條件下維持、培養或醱酵。簡言之，厭氧條件係指沒有氧氣之環境。實質厭氧條件包括例如培養基中溶解氧濃度在0至10%飽和度之間的培養、批次醱酵或連續醱酵。實質厭氧條件亦包括在以氧含量低於1%之氣氛維持之密封腔室內的液態培養基或固態瓊脂中生長或靜止細胞。可藉由以N2/CO2混合氣體或其他適當之非氧氣氣體噴射培養物來維持氧氣百分比含量。
本發明亦提供一種非天然產生之微生物觸媒，其包括具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑之微生物，該等生物合成路徑包括至少一個編碼4-羥基丁酸脫氫酶、不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀醯-輔酶A合成酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、4-羥基丁酸輔酶A轉移酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸脫羧酶、不依賴輔酶A之醛脫氫酶、依賴輔酶A之醛脫氫酶或醇脫氫酶之外源核酸，其中該外源核酸之表現足以生產1,4-丁二醇(BDO)。
亦可產生生物合成BDO之非天然產生之微生物。按照前述關於構建合成4-HB之微生物之教示及指導，可將額外之BDO路徑併入產生4-HB之微生物中以產生同時亦合成BDO及其他BDO家族化合物之微生物。BDO及其下游產物之化學合成於圖11中說明。本發明中具有BDO生物合成能力之非天然產生之微生物按照圖2所述使用4-HB作為進入點繞開了該等化學合成。如下所述，生產4-HB之微生物可用於以化學方式將4-HB轉化為GBL，然後再轉化為BDO或THF。另外，生產4-HB之微生物可經進一步修飾，以包含將4-HB及/或GBL轉化為BDO之生物合成能力。
可引入生產4-HB之微生物之其他BDO路徑包括例如在宿主缺乏情況下之外源表現，或不依賴輔酶A之醛脫氫酶、依賴輔酶A之醛脫氫酶或醇脫氫酶之過度表現。在缺乏能夠修飾4-HB之內源醯基輔酶A合成酶之情況下，生產BDO之非天然產生之微生物可進一步包括4-HB選擇性之外源醯基輔酶A合成酶。下面之表1中列出4-HB到BDO活體內轉化中可使用之醇及醛脫氫酶之範例。
上述舉例說明之彼等路徑以外之路徑亦可用於在非天然產生之微生物中進行BDO之生物合成。在一實施例中，可使用L-高絲胺酸進行BDO路徑之生物合成。此路徑之莫耳產量為0.90mol/mol葡萄糖，其看似受到還原當量物(reducing equivalents)之可用性(availability)之限制。第二個路徑由乙醯乙酸合成BDO，能夠取得1.091mol/mol葡萄糖之最大理論產量。這兩個路徑之實施均可藉由引入兩個外源酶完成，而且均可藉由乙醯輔酶A額外補充BDO之生產。下面進一步描述路徑酶、熱力學、理論產量及總體可行性。
高絲胺酸路徑亦可被設計為產生可生產BDO之微生物。高絲胺酸係蘇胺酸及甲硫胺酸代謝中之中間物，由草醯乙酸藉由天門冬胺酸形成。草醯乙酸到高絲胺酸之轉化要求一個NADH、兩個NADPH及一個ATP(圖3)。一旦形成，高絲胺酸會進入生物合成路徑用於蘇胺酸及甲硫胺酸。在大多數生物體中，大量之蘇胺酸或甲硫胺酸會形成負反饋抑制高絲胺酸生物合成路徑(Caspi等人，Nucleic Acids Res.24：D511-D516(2006)。
高絲胺酸到4-羥基丁酸(4HB)之轉化可藉由如圖4中所示之兩個酶反應步驟完成。此路徑之第1步係藉由推定解胺酶(ammonia lyase)對高絲胺酸去胺。此反應之估計熱障(thermodynamic barrier)係12kJ/mol，但有可能被濃度梯度推向正向。在第2步中，烯烴產物4-羥基丁-2-烯酸由推定還原酶以一個NADH之代價還原為4-HB。此反應步驟在熱力學上非常有利於4-HB合成方向，其估計△rxnG為-59kJ/mol。4-HB然後可被轉化為BDO，如圖2所示。
圖5顯示催化上述轉化之酶。例如該路徑第1步中之解胺酶與天門冬胺酸解胺酶(天門冬胺酸酶)之化學性質十分相似。天門冬胺酸酶係廣泛存在於微生物中之酶，且已被廣泛研究(Viola,R.,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.74：295-341(2008)。大腸桿菌天門冬胺酸酶之晶體結構已確立(Shi等人，Biochemistry 36：9136-9144(1997)，因此有可能直接在該酶之活性位點設計突變以改變其底物特異性以包含高絲胺酸。第2步中之氧化還原酶之化學性質與包括大腸桿菌TCA循環中反丁烯二酸還原酶在內之幾個業已確定結構之酶相似。由於此反應之熱力學係非常有利的，因此具有廣泛底物特異性之內源還原酶有可能能夠還原4-羥基丁-2-烯酸。雖然與圖2中之路徑(1.09mol/mol葡萄糖)相比，此路徑在厭氧條件下之產量為0.9molBDO/mol葡萄糖，但這兩個路徑看起來對於代謝前驅物草醯乙酸具有相似之能量及還原要求(圖6)。
經發現琥珀醯-輔酶A路徑之產量較高，因為其能量利用效率更高。一個草醯乙酸分子藉由高絲胺酸路徑轉化為BDO要求消耗2個ATP當量物。由於從葡萄糖轉化為兩個草醯乙酸分子在假設PEP羧激酶可逆向催化之情況下最多可產生3個ATP分子，因此葡萄糖藉由高絲胺酸轉化為BDO整體而言其能量為負。如所預期，若假設可藉由呼吸作用產生能量，則高絲胺酸路徑之最大產量可提高到1.05mol/mol 葡萄糖，係琥珀醯-輔酶A路徑之96%。琥珀醯-輔酶A路徑可使部分碳通量藉由丙酮酸脫氫酶及TCA循環之氧化支路導入，以便在不消耗能量之情況下產生還原當量物及琥珀醯-輔酶A。因此，此舉不會遇到與高絲胺酸路徑相同之能量問題，因為並非所有之碳通量都藉由草醯乙酸導入琥珀醯-輔酶A，再到BDO。整體而言此路徑係生產BDO之一個相對高產之路徑。一個特別有用之特性係其只涉及最低程度之設計，只有兩個非原生步驟。該路徑有可能在熱力學上有利於BDO合成方向。
乙醯乙酸路徑亦可被設計為產生可生產BDO之微生物。在大腸桿菌中，乙醯乙酸係來自丙酮及亮胺酸之降解。乙醯乙酸亦可由參與脂肪酸代謝之酶催化乙醯-輔酶A形成，該等酶包括乙醯-輔酶A轉乙醯基酶及乙醯乙醯-輔酶A轉移酶(圖7)。藉由乙醯乙酸之生物合成路徑亦在可代謝單個碳化合物以形成乙醯-輔酶A之微生物中特別有用。
從乙醯乙酸到琥珀酸半醛之三步式路徑(圖8)可用於藉由乙醯乙酸合成BDO。琥珀酸半醛係從琥珀醯-輔酶A開始之一個還原步驟或者從α-酮戊二酸開始之一個脫羧步驟形成，可經三個還原步驟轉化為BDO(圖2)。簡言之，乙醯乙酸生物路徑之第1步係由ω-轉胺酶催化乙醯乙酸轉化為3-胺基丁酸。來自反硝化產鹼菌(Alcaligens denitrificans)之ω-胺基酸：丙酮酸轉胺酶(ω-APT)在大腸桿菌中過度表現，且在活體外實驗中顯示出朝向3-胺基丁酸之高活性(Yun等人，Appl.Environ Microbiol.70：2529-2534(2004)。本研究中未測定ω-APT催化所需反應方向之活性，因為乙醯乙酸在反應混合物中自發降解為丙酮。但是，熱力學指示此反應係可行的。
在第2步中，推定之胺基變位酶(aminomutase)將胺基從碳鏈之3位轉到4位。在3-胺基丁酸上執行此功能之胺基變位酶尚未被識別，但來自斯氏梭菌(Clostridium sticklandii)之一種酶具有非常相似之機 制(圖9)。該酶為D-賴胺酸-5,6-胺基變位酶，其參與賴胺酸之生物合成。
從乙醯乙酸到BDO之合成路徑需要藉由4-胺基丁酸，4-胺基丁酸為大腸桿菌中通常由麩胺酸脫羧而形成之代謝物。在形成後，4-胺基丁酸可由4-胺基丁酸轉胺酶(2.6.1.19)催化形成琥珀酸半醛，而該酶已在生化上特徵化。該酶之熱力學及此路徑之其他步驟接近平衡，因此酶朝所需方向之催化可能由底物及產物濃度推動。
為此路徑選擇候選酶時需要考慮之一點係前兩步中所參與酶之立體選擇性(stereoselectivity)。反硝化產鹼菌(Alcaligens denitrificans)中之ω-ABT特異於3-胺基丁酸之左旋立體異構體，而D-賴胺酸-5,6-胺基變位酶可能要求右旋立體異構體。若不能找到或設計具有互補立體選擇性之酶，則有必要在此路徑中增加第三個具有消旋酶活性之酶以轉化L-3-胺基丁酸到D-3-胺基丁酸。雖然胺基酸消旋酶之種類很多，但該等酶是否能作用於ω-胺基酸仍然未知。
此路徑在厭氧條件下之最大理論莫耳產量為1.091mol/mol葡萄糖。為了產生從乙醯乙酸到BDO之碳通量，有必要假設乙醯-輔酶A：乙醯乙醯輔酶A轉移酶(圖10中之酶3)之催化係可逆的。此酶在大腸桿菌中之功能係藉由首先將短鏈脂肪酸轉化為硫酯而對其進行代謝。
雖然乙醯-輔酶A：乙醯乙醯輔酶A轉移酶對於消耗乙酸反應方向之催化仍未在大腸桿菌中藉由實驗證明，但對於其他生物體中類似酶之研究支持「此反應可逆」之假設。腸道微生物羅斯氏菌(Roseburia sp.)及普拉氏桿菌(F.prasnitzii)中之丁醯-輔酶A：乙酸：輔酶A轉移酶可催化利用乙酸之反應方向以產生丁酸(Duncan等人，Appl.Environ.Microbiol.68：5186-5190(2002)。另一種非常相似之酶，布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)中之乙醯：琥珀酸-輔酶A轉移酶，亦可催化利用乙酸之反應方向。此反應之△rxnG接近於平衡，所以高濃度之乙酸有 可能推動反應向所需方向進行。在1.09mol/mol葡萄糖之最大理論BDO生產率下，模擬結果預測大腸桿菌可在無醱酵副產物之情況下利用每莫耳葡萄糖產生1.098mol之ATP。此ATP產量應足以為細胞生長、維持及生產提供能量。乙醯乙酸生物合成路徑係一個從乙醯-輔酶A到BDO之高產路徑。與高絲胺酸路徑類似，此路徑要求最低限度之菌株設計，只為BDO路徑添加兩個非原生步驟。
因此，除了為在所選宿主中建立4-HB生物合成而在前面舉例說明之多種修飾之外，生產BDO之微生物可包括任何上述4-HB路徑代謝修飾之組合及改變，以及為GBL及/或BDO產生生物合成路徑之不依賴輔酶A之醛脫氫酶、依賴輔酶A之醛脫氫酶或醇脫氫酶之任何表現組合。因此，本發明中之生產BDO之生物體具有對應於六個4-HB路徑中任一種酶及/或4個BDO路徑中任一種酶之一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或所有十個酶之外源表現。
遺傳修飾微生物之設計及構建係使用此項技術中所熟知之方法進行，以取得足夠數量之表現以生產BDO。具體而言，本發明之非天然產生之微生物可生物合成BDO以產生約在0.1-25mM之間或以上之胞內濃度。一般而言，BDO之胞內濃度係在約3-20mM之間，尤其在約5-15mM之間，更尤其在約8-12mM之間，包括約10mM或以上。亦可由本發明之非天然產生之微生物取得在上述該等範例範圍之間及高於此範圍之胞內濃度。與產生4-HB之生物體相同，產生BDO之生物體亦可在厭氧條件下維持、培養或醱酵。
本發明進一步提供一種生產4-HB之方法。該方法包括培養一種具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之非天然產生之微生物，該生物合成路徑包括至少一個編碼4-羥基丁酸脫氫酶、不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀醯-輔酶A合成酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶或麩胺酸脫羧酶之外源核酸，該培養 係在實質厭氧之條件下曆時充足之時間以生產單體4-羥基丁酸(4-HB)。該方法可另外包括4-HB到GBL及到BDO或THF之化學轉化。
應瞭解，在本發明之方法中，任何一或多個外源核酸均可引入到微生物中以形成本發明之非天然產生之微生物。引入之核酸可使該微生物獲得例如4-HB、BDO、THF或GBL生物合成路徑。或者，亦可引入編碼核酸以產生具有生物合成能力之中間微生物，藉此催化某些要求之反應以賦予4-HB、BDO、THF或GBL生物合成能力。例如，具有4-HB生物合成路徑之非天然產生之微生物包含至少兩個編碼所需酶之外源核酸，例如以下組合：4-羥基丁酸脫氫酶及不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶；4-羥基丁酸脫氫酶及依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶；依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及琥珀醯-輔酶A合成酶；琥珀醯-輔酶A合成酶及麩胺酸脫羧酶等。因此，應瞭解，一個生物合成路徑中兩個或更多酶之任何組合均可包含於本發明之一種非天然產生之微生物中。同樣，亦可瞭解到，一個生物合成路徑中三個或更多酶之任何組合均可根據需要包含於本發明之一種非天然產生之微生物中，例如：4-羥基丁酸脫氫酶、不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及琥珀醯-輔酶A合成酶；4-羥基丁酸脫氫酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶等，只要所需生物合成路徑之酶組合可產生相應之所需產物即可。
任何上述非天然產生之微生物均可經培養生產出本發明之生物合成產物。例如，產生4-HB之生物體可經培養進行4-HB之生物合成。4-HB可按下述說明分離或處理以產生GBL、THF及/或BDO。同樣，產生BDO之生物體可經培養進行BDO之生物合成。BDO被分離或接受進一步處理以進行BDO化合物家族之化學合成，例如圖11中舉例說明之彼等下游化合物。
在一些實施例中，培養條件包括厭氧或實質厭氧生長或維持條 件。厭氧條件之範例已在前面說明並在此項技術中廣為人知。醱酵過程之厭氧條件範例將在下面之「實例」部分描述。任何前述條件均可用於非天然產生之微生物及與此項技術中熟知之其他厭氧條件同時使用。在該等厭氧條件下，產生4-HB及BDO之生物體可分別以5-10mM或以上之胞內濃度及前面舉例說明之任何其他濃度，合成單體4-HB及BDO。
本發明中產生4-HB及BDO之非天然產生之微生物亦可產生多種下游化合物。對於本發明中產生4-HB之微生物，可在培養基中達到單體4-HB及GBL之平衡。4-HB到GBL之轉化可藉由例如在酸性pH培養基中培養微生物而高效地完成。小於或等於7.5之pH值，特別係等於或低於pH 5.5，會自發地將4-HB轉化為GBL，如圖1所示。
產生之GBL可使用此項技術中所熟知之多種方法與培養物中之4-HB及其他組分分離。該等分離方法包括例如「實例」中舉例說明之萃取程序，以及連續液-液萃取、全蒸發、膜過濾、膜分離、反滲透、電滲析、蒸餾、結晶、離心、萃取過濾、離子交換層析、尺寸排除層析、吸附層析及超濾等方法。所有上述方法已在此項技術中廣為人知。分離後之GBL可藉由蒸餾等方法進一步純化。
本發明中產生4-HB之非天然產生之微生物可產生之另一種下游化合物係BDO。此化合物之合成可藉由GBL之化學加氫而完成。化學加氫反應在此項技術中廣為人知。其中一個反應範例係4-HB及/或GBL或該兩種組分來自培養液之混合物，藉由多相或均相加氫觸媒，及氫或化學計量或催化使用之基於氫化物之還原劑，而產生1,4-丁醇之化學還原。
此項技術中已知之其他程序同樣適用於上述化學反應，且包括例如世界專利第82/03854號(Bradley等人)，它描述了氣相中γ-丁內酯在氧化銅及氧化鋅催化下之氫解。英國專利第1,230,276號描述了使用 氧化銅-氧化鉻觸媒對γ-丁內酯加氫。此加氫過程係在液相中進行。亦有人舉例說明具有高總反應壓力之批次反應。反應器內之反應物及產物分壓遠高於相應之露點(dew point)。英國專利第1,314,126號描述了液相中γ-丁內酯使用氧化鎳-鈷-釷觸媒加氫。亦有人舉例說明具有高總反應壓力及遠高於各自露點之組分分壓之批次反應。英國專利第1,344,557號描述了液相中γ-丁內酯使用氧化銅-鉻觸媒加氫。氣相或含蒸氣之混合相在某些情況下亦係合適的。亦有人舉例說明使用較高總反應壓力之連續流管式反應器。英國專利第1,512,751號描述了液相中γ-丁內酯使用氧化銅-氧化鉻觸媒加氫形成1,4-丁二醇。亦有人舉例說明具有高總反應壓力及(可測定時)遠高於各自露點之反應物及產物分壓之批次反應。美國專利第4,301,077號描述了γ-丁內酯使用Ru-Ni-Co-Zn觸媒加氫形成1,4-丁二醇。此反應可在液相或氣相或液氣混合相中進行。亦有人舉例說明較高總反應壓力及較低反應生產力下之連續流液相反應。美國專利第4,048,196號描述了γ-丁內酯使用氧化銅-氧化鋅觸媒液相加氫形成1,4-丁二醇。進一步之例子係在高總反應壓力及高反應物及產物分壓下工作之連續流管式反應器。而美國專利第4,652,685號描述了內酯加氫形成乙二醇類。
本發明中產生4-HB之非天然產生之微生物可產生之另一種下游化合物係THF。此化合物之合成可藉由GBL之化學加氫而完成。適用於GBL轉化為THF之在此項技術中廣為人知之一個反應範例係4-HB及/或GBL或該兩種组分來自培養液之混合物，藉由多相或均相加氫觸媒，及氫或化學計量或催化使用之基於氫化物之還原劑，而產生四氫呋喃之化學還原。在此項技術中廣為人知之其他程序同樣適用於上述化學反應，並包括例如美國專利第6,686,310號，它描述了高表面積的溶膠-凝膠途徑製備之加氫觸媒。還描述了順丁烯二酸還原為四氫呋喃(THF)及1,4-丁二醇(BDO)以及γ-丁內酯還原為四氫呋喃及1,4-丁二 醇之製程。
培養條件包括例如液態培養程序，以及醱酵及其他大規模培養程序。正如下面「實例」部分之進一步描述，在厭氧或實質厭氧之培養條件下，可獲得本發明中生物合成產物特別有用之產量。
本發明另外提供4-HB之製備方法。該方法包括醱酵具有4-羥基丁酸(4-HB)生物合成路徑之非天然產生之微生物，該生物合成路徑包括至少一個編碼4-羥基丁酸脫氫酶、不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀醯-輔酶A合成酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶或麩胺酸脫羧酶之外源核酸，該醱酵係在實質厭氧之條件下曆時充足之時間以生產單體4-羥基丁酸(4-HB)，該製程包括分批補料醱酵及分批分離；分批補料醱酵及連續分離；或者連續醱酵及連續分離。
上述培養及化學加氫亦可擴大規模及連續生長以生產4-HB、GBL、BDO及/或THF。生產程序範例包括分批補料醱酵及分批分離；分批補料醱酵及連續分離；或者連續醱酵及連續分離。所有該等程序在此項技術中廣為人知。使用產生4-HB之生物體可允許同時利用上述加氫程序及醱酵等連續培養方法同時進行4-HB之生物合成及到GBL、BDO及/或THF之化學轉化。在此項技術中，其他加氫程序亦廣為人知，並同樣可用於本發明之方法之中。
醱酵程序對於4-HB及/或BDO之商業級生物合成而言非常有用。一般而言，與非連續培養程序一樣，4-HB及/或BDO之連續及/或近連續生產將包括以充足之營養素及培養基培養本發明中產生4-HB或BDO之非天然產生之微生物，以維持及/或接近維持其指數生長。在該等條件下之連續培養可包括1、2、3、4、5、6或7天，或更長時間。另外，連續培養可包括1、2、3、4或5週或更多週，最多可為數月。另外，本發明之微生物可在適用於特定應用之情況下培養幾個小 時。應瞭解，連續及/或接近連續之培養條件亦可包括該等範例期間之間的所有時間間隔。
醱酵程序在此項技術中廣為人知。簡言之，用於4-HB、BDO或本發明之其他源自4-HB之產物之生物合成的醱酵程序可為：分批補料醱酵及分批分離；分批補料醱酵及連續分離；或者連續醱酵及連續分離。此項技術中熟知之批次及連續醱酵之範例將在下面之「實例」部分舉例說明。
此外，對於上述使用本發明中產生4-HB或BDO之微生物以分別用於單體4-HB及BDO大量連續生產之醱酵程序，產生4-HB之生物體亦可同時進行上述化學合成過程以便將單體4-HB化學轉化為GBL、BDO及/或THF。產生BDO之生物體同樣可同時進行上述化學合成過程以將BDO化學轉化為THF、GBL、吡咯啶酮及/或其他BDO家族化合物。另外，產生4-HB或BDO之生物體之產物可與醱酵培養液分離並按照本文之描述進行化學轉化。
簡言之，醱酵液(fermentation broth)中GBL之加氫可按照Frost等人，Biotechnology Progress 18：201-211(2002)之方法進行。在醱酵過程中加氫之另一個程序係美國專利第5,478,952號中所描述之方法。此方法在下面之「實例」部分進一步舉例說明。
因此，本發明又提供生產γ-丁內酯(GBL)、四氫呋喃(THF)或1,4-丁二醇(BDO)之方法。該方法包括醱酵具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑之非天然產生之微生物，該等生物合成路徑包括至少一個編碼以下酶之外源核酸：4-羥基丁酸脫氫酶、不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀醯-輔酶A合成酶、依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶、4-羥基丁酸：輔酶A轉移酶、麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶、麩胺酸脫羧酶、不依賴輔酶A之1,4-丁二醇半醛脫氫酶、依賴輔酶A之1,4-丁二醇半醛脫氫酶、不依賴輔酶A之1,4-丁二醇醇脫氫 酶或依賴輔酶A之1,4-丁二醇醇脫氫酶，該醱酵係在實質厭氧之條件下曆時足夠之時間以生產1,4-丁二醇(BDO)、GBL或THF，該醱酵程序包括分批補料醱酵及分批分離；分批補料醱酵及連續分離；或者連續醱酵及連續分離。
除了本文描述之4-HB、BDO及本發明其他產物之生物合成外，本發明之非天然產生之微生物及方法亦可以各種方式相互組合且與此項技術中熟知之其他微生物及方法結合使用，以藉由其他路徑完成產物之生物合成。例如，在不使用產生4-HB之生物體及化學步驟，或不直接使用產生BDO之生物體之情況下，生產BDO之一種替代方法係藉由添加另一種能夠將4-HB或本文舉例說明之4-HB之一種產物轉化為BDO之微生物。
此種程序之一係對本發明中產生4-HB之微生物進行醱酵以生產4-HB，正如本文前後部分所述。然後可將4-HB當成第二種微生物之底物將4-HB轉化為BDO、GBL及/或THF等。4-HB可直接加入到第二種生物體之另一培養液，或者產生4-HB之生物體之原始培養液可藉由細胞分離去除該等微生物，然後將第二種生物體添加到醱酵液以便在不經中間純化步驟之情況下產生最終產物。能夠以生化方式利用4-HB以作為合成BDO之底物之第二種生物體的一個範例係丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(請參閱Jewell等人，Current Microbiology,13：215-19(1986)。
在其他實施例中，本發明之非天然產生之微生物及方法可整合到多種支路中，以按照本文之說明完成4-HB及/或BDO之生物合成。在該等實施例中，本發明所需產物之生物合成路徑可分配到不同之微生物中，且可共同培養該等不同微生物以生產最終產物。在此種生物合成方案中，一種微生物之產物係第二種微生物之底物，直到合成出最終產物。例如，BDO之生物合成可按照上述說明而完成，即藉由構 建一種微生物，此微生物包含之生物合成路徑可用於將底物(例如，內源琥珀酸)經由4-HB轉化為最終產物BDO。另外，亦可藉由在同一容器內對兩種生物體共同培養或共同醱酵而生物合成BDO。作為4-HB生產者之第一種微生物具有從琥珀酸生產4-HB之基因，而作為BDO生產者之第二種微生物具有轉化4-HB到BDO之基因。
根據本文提供之教示及指導，熟悉此項技術者會理解本發明之非天然產生之微生物及方法與其他微生物之多種組合及改變、與具有支路之其他非天然產生之微生物之共同培養以及與此項技術中熟知之其他化學及/或生化程序之組合可產生本發明之4-HB、BDO、GBL及THF產物。
識別及設計有利於一種產物生物合成之代謝改變之一種計算方法係OptKnock計算框架，Burgard等人，Biotechnol Bioeng,84：647-57(2003)。OptKnock係一個代謝建模及模擬程式，其建議基因缺失策略以產生超量生產目標產物且在遺傳上穩定之微生物。具體而言，該框架檢測一種微生物之完整代謝及/或生化網路，以便提出強制所需生化產物成為細胞生長必然副產物之基因操控步驟。藉由利用特定之基因缺失或其他功能性基因中斷來耦合生化生產及細胞生長，生物反應器中施加於工程菌株上之長期生長選擇壓力會因強制之生長耦合生化生產而導致效能提高。最後，當構建基因缺失時，所設計菌株恢復到其野生型狀態之可能性幾乎可忽略，因為OptKnock所選擇之基因將從細胞之基因組中完全缺失。因此，此計算方法可用於識別導致4-HB及/或BDO生物合成之替代路徑，或者與非天然產生之微生物配合使用以進一步優化4-HB及/或BDO之生物合成。
簡言之，OptKnock在本文係指一種用於為細胞代謝機制建模之計算方法及系統。OptKnock程式與模型框架及將特定限制條件整合到通量平衡分析(flux balance analysis，FBA)模型中之方法相關。該 等限制條件包括定性之動力學資訊、定性之調控資訊及/或DNA之微陣列實驗數據。OptKnock亦計算各種代謝問題之解，例如藉由縮小通量平衡模型所得出之通量邊界，然後再探測添加或缺失基因時代謝網路之效能界限(performance limit)。OptKnock計算框架允許構建模型公式，藉此有效查詢代謝網路之效能界限，並提供關於所產生之混合整數線性規劃(mixed-integer linear programming)問題之求解方法。本文稱之為OptKnock之代謝建模及模擬方法例如見美國專利申請案第10/043,440號(2002年1月10日申請)及國際專利第PCT/US02/00660號(2002年1月10日申請)。
識別及設計有利於一種產物生物合成之代謝改變之另一種計算方法為稱為SimPheny®之代謝建模及模型系統。該計算方法及系統例如見美國專利申請案第10/173,547號(2002年6月14日申請)及國際專利申請案第PCT/US03/18838號(2003年6月13日申請)。
SimPheny®係一個計算系統，可用於藉由電腦模擬產生網路模型，並模擬生物系統化學反應中質量(mass)、能量或電荷之通量以定義含該生物系統中化學反應之任何及所有可能功能之解空間(solution space)，藉此確定該生物系統允許活動之範圍。此方法被稱為基於限制條件建模，因為解空間係由限制條件定義，諸如所含反應之已知化學計量及與反應中最大通量相關之反應熱力及容量限制條件。可藉由詢問該等限制條件所定義之空間，來判斷該生物系統或其生化組分之表型能力及行為。例如，可使用諸如凸分析(convex analysis)、線性規劃(linear programming)及極端路徑(extreme pathway)之計算等分析方法(請參閱Schilling等人，J.Theor.Biol.203：229-248(2000)；Schilling等人，Biotech.Bioeng.71：286-306(2000)及Schilling等人，Biotech.Prog.15：288-295(1999)來判斷此表型能力。如下面之「實例」部分所述，此計算方法用於識別及分析不產生4-HB之微生物 中，生物合成4-HB之可行性及其最佳生物合成路徑。
如上所述，適於本發明之計算程式中使用之一種基於限制條件之方法係通量平衡分析。通量平衡分析係基於穩定狀態下之通量平衡，並可依Varma及Palsson,Biotech.Bioeng.12：994-998(1994)所述進行。通量平衡方法已應用到反應網路以模擬或預測例如脂肪細胞代謝(Fell及Small,J.Biochem.138：781-786(1986)、大腸桿菌在ATP最大供應條件下乙酸分泌(Majewski及Domach,Biotech.Bioeng.35：732-738(1990)或者酵母乙醇分泌(Vanrolleghem等人，Biotech.Prog.12：434-448(1996)之系統特性。另外，此方法亦可用於模擬或預測大腸桿菌在多種單碳源上之生長及流感嗜血桿菌(H.influenzae)之代謝(Edwards及Palsson,Proc.Natl.Acad.Sci.97：5528-5533(2000)，Edwards及Palsson,J.Bio.Chem.274：17410-17416(1999)，及Edwards等人，Nature Biotech.19：125-130(2001)。
一旦定義解空間，即可進行分析以判斷各種條件下可能之解。此計算方法與生物現實一致，因為生物系統係靈活的，且可藉由多種途徑達到相同之結果。生物系統係藉由演化機制所設計，而演化機制受到所有生物系統必須面對之基本限制條件所限制。因此，基於限制條件之建模策略涵蓋該等一般現實。而且，由於能夠藉由緊縮限制條件而對網路模型連續施加進一步限制，導致解空間大小之下降，藉此提高了可預測之生理機能或表型之精度。
按照本文提供之教示及指導，熟悉此項技術者能夠應用多種用於代謝建模及模擬之計算框架，以在大腸桿菌及酵母以外之其他微生物中設計及實施4-HB、BDO、GBL、THF及其他BDO家族化合物之生物合成。該等代謝建模及模擬方法包括前面舉例說明之計算系統SimPheny®及OptKnock。為了闡釋本發明，在此描述了一些關於使用OptKnock計算框架建模及模擬之方法。熟悉此項技術者會瞭解如何 使用OptKnock及任何其他在此項技術中已知之代謝建模及模擬計算框架及方法來應用代謝改變之識別、設計及實施。
細胞或生物體以生物合成之方式產生生化產物之能力可在使用電腦模擬模型計算之典型代謝網路之生化產物生產界限內容中描繪。藉由將限制性底物之攝取率(uptake rate)固定到其實驗量測值，及在每個可達到之生長水準上計算生化產物之最大及最小生產率，可獲得該等界限。所需生化產物之生產一般與用於胞內資源之生物量(biomass)形成構成直接競爭關係。在該等情況下，生化產物之生產率提高必然導致低於最大值之生長速率。上述代謝建模及模擬程式(如OptKnock)所建議之剔除(knockout)，可設計成限制容許解邊界(solution boundary)，強制野生型菌株代謝行為之改變。雖然給定菌株之實際解邊界可能隨底物攝取率之增減而擴大或縮小，但每個實驗點均在其計算之解邊界內。像這樣之圖能夠準確預測所設計菌株與其效能界限之接近程度，此亦指示還有多少可提高之空間。
在本文舉例說明OptKnock數學計算框架以用於精確定位導致產物生物合成(特別係與生長耦合之產物生物合成)之基因缺失。此程式構建在基於限制條件之代謝模型之上，縮小了細胞系統可在連續施加生理化學限制條件調控時表現出之可能表型之範圍，Price等人，Nat Rev Microbiol,2：886-97(2004)。如上所述，基於限制條件之模型及模擬已在此項技術中為人熟知，而且一般會根據網路化學計量激發特定細胞目標之優化，以給出可能之通量分布。
簡言之，由N={1,...,N}個代謝物集合及M={1,...,M}個代謝反應集合組成的，定量為穩定狀態代謝網路累計反應通量(aggregate reaction flux)之細胞目標之最大化，可用數學方式表達如下：最大化v cellular objective
條件為 i N
v subsrrate =v substrate_uptake mmol/gDW．hr i {限制性地底物}
j {不可逆反應}
其中S ij 係反應j中代謝物i之化學計量係數；v j係反應j之通量；v substrate_uptake 代表限制性底物之假設或量測攝取率；而v atp_main 係非生長相關之ATP維持要求。向量v包括內外通量。在此研究中，細胞目標常被假設為按照生物量形成所要求之比率消耗生物合成前驅物，Neidhardt,F.C.等人，Escherichia coli and Salmonella：Cellular and Molecular Biology，第2版.1996,Washington,D.C.：ASM Press.2 v.(xx,2822,lxxvi)。該等通量之單位一般為1gDW．hr(公克乾重乘以小時)，而生物量形成一般表達為公克產生生物量/gDW．hr或1/hr。
基因缺失及消除反應之建模首先將二元變數(binary variable)整合到基於限制條件之框架中，Burgard等人，Biotechnol Bioeng,74：364-375(2001)、Burgard等人，Biotechnol Prog,17：791-797(2001)。該等二元變數，
假設反應j為活性時值為1，及反應j為非活性時值為0。以下限制條件，
確保反應通量v j 僅在變數y j 等於零時被設定為零。另外，當y j 等 於1時，v j 可被假設為v j min 下限及v j max 上限之間的任何值。此處v j min 及v j max 係由根據上述網路限制條件而相應最小化及最大化各反應通量來確定，Mahadevan等人，Metab Eng,5：264-76(2003)。
優化之基因/反應剔除可藉由對一個兩層優化(bilevel optimization)問題求解來識別，其中應選擇活性反應組(y j =1)，使所得網路之優化生長解(optimal growth solution)可超量生產相關之化學品。在數學上，此兩層優化問題可用以下兩層混合整數優化問題表達：
y j {0,1}, j M
其中v chemical 係指所需目標產物之生產，例如琥珀酸或其他生化產物，而K係允許之剔除數目。請注意，設定K等於零得到整個網路之最大生物量解(maximum biomass solution)，而設定K等於一確定單一基因/反應剔除(y j =0)，使所得網路包括在其最大生物量產量下之最大 超量生產。最後之限制條件確保所產生之網路達到最低生物量產量。Burgard等人，Biotechnol Bioeng,84：647-57(2003)提供了模型公式及求解步驟之詳細說明。含上百個二元變數之問題可藉由CPLEX 8.0，GAMS：The Solver Manuals.2003：GAMS Development Corporation，藉由GAMS，Brooke等人，GAMS Development Corporation(1998)，在IBM RS6000-270工作站之建模環境中，在幾分鐘到幾小時之時間內解出。OptKnock框架亦能夠為生化產物之超量生產找出有希望之基因缺失策略，Burgard等人，Biotechnol Bioeng,84：647-57(2003)、Pharkya等人，Biotechnol Bioeng,84：887-899(2003)，並建立一個系統框架，以自然地接納代謝及調控建模框架內之未來改進。
上述兩層OptKnock問題之任何求解都將提供一組需要中斷之代謝反應。消除此組內之各反應或代謝修飾可使4-HB或BDO成為生物體生長階段之必然產物。因為反應係已知的，所以兩層OptKnock問題之求解亦將提供相關之一或多個基因，以編碼催化反應組內各個反應之一或多個酶。反應組及其編碼參與各反應之酶的相應基因之識別一般而言係一個自動化過程，可藉由關聯反應與聯繫酶及編碼基因之反應資料庫而實現。
一旦識別後，為了獲得4-HB或BDO之生產而需要中斷之反應組將在目標細胞或生物體中，藉由對至少一個編碼該組內代謝反應催化酶之基因之功能性中斷而實施。對反應組進行功能性中斷之一個非常有用之方法係缺失各編碼基因。但在某些情況下，藉由其他基因變異中斷反應亦係有利的，例如調控區域(如啟動子)或調控因子順式結合位點之突變、缺失，或者在多個位置上之任意位置切斷編碼序列。後一個導致基因組部分缺失之變異可能很有用，例如在要求快速評估琥珀酸耦合(succinate coupling)時或遺傳逆轉(genetic reversion)不太可能發生時。
為了找出上述兩層OptKnock問題之其他高產解(productive solution)，以進一步中斷更多之反應組或進行代謝修飾以實現生物合成(包括4-HB或其他生化產物之生長耦合生物合成)，可實施一個叫做整數切割(integer cut)之優化方法。此方法藉由在每次迭代時添加一個叫做整數切割之額外限制條件而迭代求解上述OptKnock問題。整數切割限制條件有效地避免求解程序選擇與以前迭代中識別之必然耦合產物生物合成完全相同之反應組以進行生長。例如，若一個以前識別之生長耦合代謝修飾指定中斷反應1、2及3，則以下限制條件即避免此反應組在隨後之求解中被再次考慮：y 1 +y 2 +y 3 1。整數切割方法在此項技術者已眾所周知，參考文獻請參閱Burgard等人，Biotechnol Prog,17：791-797(2001)。因為本文介紹之所有方法均與用於代謝建模及模擬之OptKnock計算框架聯合使用，所以在迭代計算分析中降低冗餘(redundancy)之整數切割方法亦可與此項技術中所熟知之其他計算框架聯合使用，例如SimPheny®。
上述形式之限制條件排除了包含以前所識別反應組之較大反應組之識別。例如，在進一步迭代中使用上述整數切割優化方法將排除指定用於中斷之反應1、2及3之四重反應組(quadruple reaction set)之識別，因為該等反應已被識別。為了確保識別所有可能導致產物生物合成之反應組，可修改此整數切割方法。
簡言之，修改後之整數切割程序從第「零」次迭代開始，其計算所需生化產物在野生型網路之優化生長條件下之最大產量。此計算與K等於0之OptKnock解相對應。接下來，考慮單個剔除並引進兩個參數集objstore iter 及ystore iter_j 以在每次迭代計算iter中分別儲存目標函數(v chemical )及反應開關資訊(y j )。隨後在每次迭代中為OptKnock公式連續添加以下限制條件。
在上述等式中，ε及M分別係一個較小及較大之數。一般而言，ε可設定為0.01左右，而M可設定為1000左右，但亦可使用小於及/或大於這兩個數值之數。M確保限制條件可只結合以前識別之剔除策略，而ε確保在以前識別之策略中添加剔除必須能在優化生長條件下之生化產物生產中提高至少一個ε。此方法在單個缺失策略不能基於野生型菌株提高產量時變為雙缺失。然後當雙缺失策略不能基於野生型菌株提高產量時考慮三缺失，以此類推。最終之結果係一個排序列表，由至少相隔一個剔除之不同缺失策略在優化生長下所需生化產物之產量表示。此優化程序以及多個反應組之識別在被中斷時，可導致生化產物之生物合成，包括生長耦合生產。根據本文提供之教示及指導，熟悉此項技術者會瞭解本文例示之方法及代謝工程設計同樣可適用於識別新生物合成路徑及/或任何生化產物與細胞或微生物生長之必然耦合。
上面舉例說明並將在下面之「實例」部分進一步說明之方法允許構建將以生物合成方式生產目標生化產物之細胞及生物體，包括將目標生化產物之生產與經設計具有已識別基因改變之細胞或生物體之生長必然耦合在一起。為此，已識別導致4-HB及1,4-丁二醇生物合成之代謝改變。使用已識別代謝改變而構建之微生物菌株與未修飾之微生物相比，其4-HB或BDO產量顯著提高。該等菌株可有利地在連續醱酵等程序中用於4-HB、BDO、THF及GBL之商業化生產，而無需承受負選擇壓力。
因此，此處描述之計算方法識別及實施了一組藉由選自OptKnock或SimPheny之電腦模擬方法所識別之代謝修飾。該組代謝修飾可包括例如，一或多個生物合成路徑酶之增加及/或一或多個代謝反應之功能性中斷，例如由基因缺失導致之中斷。
不實質性影響本發明各種實施例活性之修飾亦包含於本發明之定義之內。相應地，以下實例意欲描述(但不限於)本發明。
實例I 4-羥基丁酸之生物合成
此實例描述4-HB生產之生化路徑。
微生物中4-HB合成之前述報告一直將此化合物當成生產生物可降解塑膠聚羥基烷酸酯(PHA)中之中間物(美國專利第6,117,658號)。在聚-3-羥基丁酸酯聚合物(PHB)上使用4-HB/3-HB共聚物可產生不易碎之塑膠(Saito及Doi,Intl.J.Biol.Macromol.16：99-104(1994)。本文描述之單體4-HB之生產因以下幾個原因而與上述程序完全不同：(1)產物係被分泌的，而非在胞內產生並留在細胞內之PHA；(2)對於生產羥基丁酸酯聚合物之生物體而言，不會生產游離之4-HB，而且聚羥基烷酸酯合酶使用的係輔酶A衍生物；(3)對於聚合物而言，顆粒產物之形成改變熱力學性能；及(4)胞外pH值對於聚合物之生產而言並非一個問題，而其會影響4-HB是否存在游離酸或共軛鹼狀態，及4-HB與GBL之間的平衡。
4-HB可從TCA循環之中心代謝物琥珀酸開始藉由兩個酶還原步驟產生，其中之中間物係琥珀酸半醛(圖2)。該等酶中之第一個，琥珀酸半醛脫氫酶，對於包括大腸桿菌在內之許多生物體而言皆係原生的，其中已發現依賴NADH及NADPH之酶(Donnelly及Cooper,Eur.J.Biochem.113：555-561(1981)；Donnelly及Cooper,J.Bacteriol.145：1425-1427(1981)；Marek及Henson,J.Bacteriol.170：991-994(1988)。亦有證據支持釀酒酵母菌(S.cerevisiae)(Ramos等人，Eur.J.Biochem.149：401-404(1985)中之琥珀酸半醛脫氫酶活性，並藉由序列同源分析識別了一個推定基因。但是，大多數報告指出此酶會朝琥珀酸合成之方向催化，如圖2所示(Donnelly及Cooper，同上；Lutke- Eversloh及Steinbuchel,FEMS Microbiol.Lett.181：63-71(1999)，參與4-HB及γ-胺基丁酸之降解路徑。琥珀酸半醛亦係某些微生物，例如大腸桿菌，藉由麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸脫羧酶兩個酶催化TCA循環中間物α-酮戊二酸所原生。由專性厭氧微生物克氏梭菌(Clostridium kluyveri)降解琥珀酸使用之另一條替代路徑，可活化琥珀酸到琥珀醯-輔酶A，然後使用已知向此方向催化之替代琥珀酸半醛脫氫酶轉化琥珀醯-輔酶A到琥珀酸半醛(Sohling及Gottschalk,Eur.J.Biochem.212：121-127(1993)。但是，此路徑在轉化琥珀酸到琥珀醯-輔酶A時需要消耗ATP。
該路徑之第二個酶，4-羥基丁酸脫氫酶，對於大腸桿菌或酵母而言並非原生的，但存在於克氏梭菌(C.kluyveri)及富飬羅爾斯通氏菌(Rolstonia eutropha)等多種細菌內(Lutke-Eversloh及Steinbuchel，同上；ohling及Gottschalk,J.Bacteriol.178：871-880(1996)；Valentin等人，Eur.J.Biochem.227：43-60(1995)；Wolff及Kenealy,Protein Expr.Purif.6：206-212(1995)。已知該等酶依賴NADH，但亦存在依賴NADPH之形式。大腸桿菌中顯示自α-酮戊二酸到4-HB之另外路徑，可導致聚(4-羥基丁酸)之積累(Song等人，微生物學報(Wei Sheng Wu Xue.Bao.)45：382-386(2005)。重組菌株要求三個異源基因之過度表現：PHA合酶(富飬羅爾斯通氏菌(R.eutropha)、4-羥基丁酸脫氫酶(富飬羅爾斯通氏菌(R.eutropha)及4-羥基丁酸：輔酶A轉移酶(克氏梭菌(C.kluyveri)，以及兩個原生之大腸桿菌基因之過度表現：麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸脫羧酶。圖2中之第4及5步可藉由α-酮戊二酸脫羧酶(例如在小眼虫(Euglena gracilis)中識別的)而另外進行(Shigeoka等人，Biochem.J.282(Pt2)：319-323(1992)；Shigeoka及Nakano,Arch.Biochem.Biophys.288：22-28(1991)；Shigeoka及Nakano,Biochem J.292(Pt 2)：463-467(1993)。但此酶從未用於影響任何生物 體中4-HB或其相關聚合物之生產。
琥珀酸半醛脫氫酶之報告催化方向(directionality)要求調查4-HB代謝機制之熱力學。具體而言，此研究調查琥珀酸或琥珀醯-輔酶A到4-HB轉化中涉及到之反應在大腸桿菌及釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中之典型生理條件下是否在熱力學上有利(即△Gr<0)。所有之氧化/還原反應均被假設利用NADH，雖然假設利用NADPH之結果亦會類似。圖2中顯示之琥珀酸及琥珀醯-輔酶A路徑中每個化合物之標準生成吉布斯(Gibbs)自由能(△Gf o)均基於基團貢獻法(group contribution method)(Mavrovouniotis,M.L.,J.Biol.Chem.266：14440-14445(1991)。每個標準生成吉布斯自由能然後經轉換得到指定壓力、溫度、pH及離子強度下自發變化之標準(Alberty,R.A.,Biochem.Biophys.Acta 1207：1-11(1994)(等式1)。
其中△Gf o係標準生成吉布斯自由能，NH係化合物中氫原子之數目，R係通用氣體常數，T係298K下之常數，z係在所需pH值下分子之電荷，I係M中之離子強度，而B係等於1.6L0.5/mol0.5之一個常數。
等式1顯示胞內pH值及離子強度在決定熱力學可行性中起非常重要之作用。通常而言，細胞之胞內pH值受到嚴格調控，即使培養液之pH值變化較大。大腸桿菌及釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中之胞內pH值在文獻中均有報導。大腸桿菌在中性緩衝液中之典型生長條件下保持7.4-7.7之胞內pH值，但其可在pH值為6之培養基中下降到7.2，甚至在外界pH值為5時進一步下降到6.9(Riondet等人，Biotechnology Tech.11：735-738(1997)。但是，大腸桿菌之生長在外界pH值低於6時會受到嚴重抑制。酵母之pH值表現出更多之變化。在指數生長階段，在 外界pH值被控制於5.0時，釀酒酵母菌(S.cerevisiae)之內部pH值經量測在6.7-7.0之間(Dombek及Ingram,Appl.Environ.Microbiol.53：1286-1291(1987)。另一方面，在靜止之細胞中，其內部pH值在外界pH值等於或小於6時會下降到6以下(Imai及Ohno,J.Biotechnol.38：165-172(1995)。此分析假設大腸桿菌之胞內pH值為7.4，而釀酒酵母菌(S.cerevisiae)則為6.8。假設之離子強度為0.15(Valenti等人，同上)。
轉換後之生成吉布斯能在標準狀態(pH=7.0，I=0)及大腸桿菌(pH=7.4，I=0.15)及釀酒酵母菌(S.cerevisiae)pH=6.8，I=0.15)之生理狀態下計算。轉換後之反應吉布斯能(△Gr ')然後藉由產物與反應物之間的差異△Gf '而計算。表2給出轉化琥珀酸或琥珀醯-輔酶A到4-HB所必需之轉換後之反應吉布斯能。雖然有些步驟已計算得出正之△G值，但該等計算值及濃度梯度之標準誤差指示所有步驟皆係可行的。請注意，由基團貢獻理論計算之△Gf之標準誤差Uf,est係4kcal/mol。△Gr、Ur,est中之不確定性可作為每個化合物之△Gr之不確定性之歐幾裡得範數(Euclidean norm)來計算(等式2)。
其中n係化學計量係數，而i係化合物。對於經檢測之反應而言，此不確定性大約為8kcal/mol。
表2.不同pH值及離子強度下反應之吉布斯自由能(kcal/mol)。第一行係在標準條件下，而其他行係根據等式1調整。溫度固定在298K。按照等式2之計算，該等值之標準誤差約為8kcal/mol。縮寫：suc：琥珀酸；sucsa：琥珀酸半醛；succoa：琥珀醯輔酶A；Pi：無機磷酸。
表2揭露在吾人之計算中考慮到潛在不確定性後最有可能遇到熱障之反應係琥珀酸半醛脫氫酶(圖2中之第1步)。另外亦研究此反應是否可藉由改變參與代謝物之假設濃度而在熱力學上更加可行。例如，標準吉布斯能假設所有參與之化合物(水除外)都有1M之濃度。在厭氧環境中，NADH將以高於NAD幾倍之濃度存在。假設[NADH]=5×[NAD]，吾人使用以下等式計算對△Gr '之影響
此變化會導致琥珀酸半醛脫氫酶之△G值產生約1kcal/mol之差異。等式3亦可用於計算對△Gr之其他影響，例如推動反應之高琥珀酸濃度。琥珀酸及琥珀酸半醛1000倍之濃度差異將為△G值貢獻約5kcal/mol。加上8kcal/mol之假設不確定性，不能排除琥珀酸半醛脫氫酶在某些生理條件下朝琥珀酸半醛方向催化之可能性。因此，在後續分析中保留從琥珀酸到4-HB直接路徑之考慮。
在大腸桿菌及釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)兩種微生物中，使用各生物體之電腦模擬代謝模型探索了4-羥基丁酸之微生物生產能力。圖2顯示藉由琥珀酸、琥珀醯輔酶A或α-酮戊二酸中間物生產4-HB之潛在路徑。
從琥珀酸開始之4-HB生產路徑中之第一步涉及琥珀酸藉由依賴NADH或NADPH之琥珀酸半醛脫氫酶向琥珀酸半醛之轉化。在大腸桿菌中，gabD係一個依賴NADP之琥珀酸半醛脫氫酶，而且係參與4-胺 基丁酸攝取及降解之一個基因簇之一部分(Niegemann等人，Arch.Microbiol.160：454-460(1993)；Schneider等人，J.Bacteriol.184：6976-6986(2002)。sad被認為編碼具有依賴NAD之琥珀酸半醛脫氫酶活性之酶(Marek及Henson，同上)。釀酒酵母菌(S.cerevisiae)僅包含依賴NADPH之琥珀酸半醛脫氫酶，推定分配給UGA2，其位於胞質中(Huh等人，Nature 425：686-691(2003)。假設在大腸桿菌及釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中皆為至4-HB之琥珀酸路徑，則其最大產量計算只要求假設已在代謝網路內加入非原生4-HB脫氫酶。
從琥珀醯-輔酶A到4-羥基丁酸之路徑在美國專利第6,117,658號中係經描述為製備包含4-羥基丁酸單體單元之聚羥基烷酸酯程序之一部分。克氏梭菌(Clostridium kluyveri)係已知具有依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶活性之生物體之一(Sohling及Gottschalk，同上；ohling及Gottschalk，同上)。在此研究中，假設來自克氏梭菌(C.kluyveri)或其他生物體之該酶，在大腸桿菌或釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中與非原生或異源4-HB脫氫酶一起表現以完成從琥珀醯輔酶A到4-HB之路徑。大腸桿菌中從α-酮戊二酸到4-HB之路徑導致積累之聚(4-羥基丁酸)占細胞乾重之30%(Song等人，同上)。因為大腸桿菌及釀酒酵母菌(S.cerevisiae)原生或內源地具有麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸脫羧酶(Coleman等人，J.Biol.Chem.276：244-250(2001)，所以從AKG到4-HB之路徑可在這兩種生物中藉由只假設非原生4-HB脫氫酶存在而完成。
實例II 大腸桿菌中4-羥基丁酸之生產
此實例描述藉由各個生化路徑之4-羥基丁酸之生物合成產量。
在此部分中，從葡萄糖開始之4-HB之最大理論產量可在假設圖2中描繪之三個代謝路徑在大腸桿菌中均有效之基礎上進行計算。大腸 桿菌之基因組級代謝模型，類似於Reed等人，Genome Biol.4：R54(2003)中所描述之模型，當作此分析之基礎。每個最大產出路徑以所產生ATP分子表示之能量增益(energetic gain)在假設之厭氧條件下進行計算，除非另外說明。假設4-羥基丁酸藉由質子同向轉運(proton symport)離開大腸桿菌，與大多數有機酸相同。亦有可能GBL係藉由簡單擴散分泌，而在此情況下，能量學將比此處考慮之情況更有利。參與酶之輔助因數特異性(即NADH或NADPH依賴性)對各路徑最大產量及能量學之影響亦接受了調查。
分析結果請參閱表3 A-C。從能量及產量角度考慮，琥珀酸到4-HB路徑係最有前景的。具體而言，計算發現從葡萄糖開始之4-HB之最大理論產量係1.33mol/mol(0.77g/g；0.89Cmol/Cmol)，假設琥珀酸到4-HB路徑係可行的。另外，琥珀酸到4-HB之厭氧生產會導致每莫耳之葡萄糖淨產生1.8、1.5或1.1莫耳之ATP，這取決於參與酶之輔助因數之假設特異性。該等能量產量相當於每個葡萄糖分子產生2.0個ATP分子，而其可藉由生產乙醇或乳酸進行之底物級之磷酸化而獲得，顯示大腸桿菌中厭氧環境下之同源4-HB生產之可能性。
在考慮最大產量及能量學時，琥珀醯-輔酶A到4-HB路徑係另一個具有前景之路徑。若假設至少有一個路徑步驟係依賴NADH的，則可在大腸桿菌中取得1.33mol/mol之4-HB產量。但因為此路徑要求形成琥珀醯-輔酶A，其能量產量低於琥珀酸路徑。若假設依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及4-HB脫氫酶步驟均依賴NADPH，則預期高4-HB產量需要氧氣參與。在此情況下，4-HB之最高產量產生不會導致ATP淨增益，且可能不支持大腸桿菌存活所需之能量維持需求。因此，部分能量必須來自氧化磷酸化以允許原生醱酵之4-HB生產。利用麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸脫羧酶產生4-HB之α-酮戊二酸路徑在這三個可能之路徑中係最不利的，其最大可能產量為1.0mol 4- HB/mol葡萄糖。除了較低之最大產量外，此路徑在將1莫耳葡萄糖轉化為4-HB時要求1.5莫耳之氧。此路徑之能量學不受4-HB脫氫酶之假設輔助因數特異性之影響。
為了確認本報告中建議之計算預測值，可構建及測試表現形成4-HB之完整路徑之菌株。確認工作係在大腸桿菌(實例II及IV)及釀酒酵母菌(S.cerevisiae)(實例III)中進行。在大腸桿菌中，相關基因係在一個中或高套數質體(copy plasmid)上之可誘導啟動子後之合成操縱子中表現；例如，pBAD系列質體上由阿拉伯糖(arabinose)誘導之PBAD啟動子(Guzman等人，J.Bacteriol.177：4121-4130(1995)。在釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中，基因被整合到PDC1啟動子後之染色體中，以替換原生之丙酮酸羧化酶基因。有報導指出，此举導致之外來基因之表現高於質體(Ishida等人，Appl.Environ.Microbiol.71：1964-1970(2005)，亦可確保在厭氧條件下之表現。
包含相關構建基因之細胞在含葡萄糖之基本培養基(minimal medium)中生長，而對於含在PBAD啟動子下表現之基因之大腸桿菌，則添加阿拉伯糖。為了進行基因表現及酶活性分析，對培養液定期採樣。酶活性检定係使用此項技術中廣為所知之程序在粗細胞萃取物上進行。另外，亦可利用基於NAD(P)H(在所有脫氫酶反應步驟中產生並可藉由分光光度法偵測)氧化之檢定。此外，可使用抗體偵測特定酶之活性水準。作為酶活性量測之替代或補充，可從平行樣本中分離RNA並藉由反轉錄酶之PCR来量测相關基因之轉錄。然後對所有缺乏可偵測轉錄表現之構建基因重新分析以確保編碼核酸處於可表現形 式。在偵測到轉錄物後，則指示缺乏轉譯或產生了無活性之酶。亦可另外使用此項技術中所熟知之多種方法，例如密碼子優化、設計強大之核糖體結合位點、使用來自其他物種之基因，及藉由轉化天門冬醯胺(Asn)殘基到天門冬胺酸(Asp)而防止N-糖基化(N-glycosylation)(在酵母中用於細菌酶之表現)。在偵測到所有要求之酶活性後，下一步係量測4-HB之活體內生產。根據要求之條件(見上)及定期採集之樣本，可在厭氧或微氧條件下進行三重搖瓶培養。培養物上清液中存在之有機酸使用Aminex AH-87X管柱進行HPLC分析。4-HB之溶離時間將用購自一家化學品供應商之標準品測定。
不依賴輔酶A之路徑可在實施後進行確認測試。在此情況下，過度表現之基因係來自各生物體之原生琥珀酸半醛脫氫酶及來自富飬羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)之4-羥基丁酸脫氫酶。在這兩種酶之活性按上述討論內容得到偵測後，測試菌株之4-HB生產。亦可藉由實施依賴輔酶A之路徑而獲得確認。來自克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及4-羥基丁酸脫氫酶按上述說明表現。另外，亦可過度表現原生琥珀醯輔酶A合成酶，以促使更多之琥珀酸進入異源路徑。最後，若4-HB之生產係不利的，則可測試不同之培養條件，例如改變可控制NAD(P)H/NAD(P)比率之氧化狀態。
實例III 酵母中4-羥基丁酸之生產
此實例描述釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中來自各個生化路徑之4-羥基丁酸之生物合成產量。
在此部分中，從葡萄糖開始之4-HB之最大理論產量係在假設圖2中描繪之三個代謝路徑均可在釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中正常發揮作用之基礎上進行計算。釀酒酵母菌(S.cerevisiae)之基因組級代謝模 型，類似於Forster等人(Genome Res.13：244-253(2003)中所描述之模型，當作此分析之基礎。各最大產量路徑之能量增益係在假設厭氧條件之前提下進行計算，除非另外說明。假設4-羥基丁酸係藉由質子同向轉運離開釀酒酵母菌(S.cerevisiae)，與大多數有機酸相同。另外還研究了參與酶之輔助因數特異性(即NADH或NADPH依賴性)對各路徑最大產量及能量學之影響。
分析結果見表4 A-C。與大腸桿菌相同，琥珀酸到4-HB之路徑係最有前景的，但前提係能夠克服實例I中發現之熱力學問題。計算發現，釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中從葡萄糖開始之4-HB之理論最大產量係1.33mol/mol(0.77g/g；0.89Cmol/Cmol)。另外，琥珀酸到4-HB之厭氧生產會導致每莫耳之葡萄糖淨產生1.4、1.1或0.5莫耳之ATP，這取決於參與酶之假設輔助因數特異性。
琥珀醯輔酶A到4-HB路徑係第二個最有利之路徑。無論輔助因數之特異性如何，均可在釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中取得1.33mol 4-HB/mol葡萄糖之最大產量。但是，最大理論產量下之淨能量產生只在假設依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及4-HB脫氫酶步驟均依賴NADH時才有可能實現。若任一步驟係依賴NADPH的，則4-HB之厭氧生產中就不會產生ATP淨增益，並需要使用另外之能量來源(例如氧化磷酸化)支持細胞之生長及維持。在釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中，4-HB之α-酮戊二酸路徑係這三個可能之路徑中最不利的，雖然其最大產量1.1-1.2mol 4-HB/mol葡萄糖略高於大腸桿菌中所见之。然而，此路徑要求每莫耳葡萄糖0.8-0.9莫耳氧之攝取率才能在能量上達到平衡。
表4.假設釀酒酵母菌(S.cerevisiae)中之A)琥珀酸；B)琥珀醯輔酶A；或C)α-酮戊二酸路徑能正常發揮作用時，底物到4-HB之總體轉化化學計量。在生產所有其他分子時，消耗葡萄糖及氧。
實例IV 從琥珀酸及α-酮戊二酸開始之1,4-丁二醇之生物合成
此實例展示微生物中4-HB及BDO之構建及生物合成生產。
如前面實例I-III所述，圖1中顯示之從4-HB到BDO之生物轉化步驟之熱力學特性亦係基於由基團貢獻法所測定之標準生成吉布斯自由能而計算。表5列出其結果。同樣，雖然有些步驟已計算得出正之△G 值，但該等計算值及濃度梯度之標準誤差指示所有步驟皆係可行的。
理論產量係在圖2中之所有路徑均已併入大腸桿菌之假設下計算的。大腸桿菌之基因組級代謝模型，類似於Reed等人，Genome Biol.4：R54(2003)中所描述之模型，當作此分析之基礎。微氧條件下，在假設能量平衡及沒有細胞生長或維持時之最大理論產量為1.09mol BDO/mol葡萄糖。模擬在厭氧條件下進行，其可用於推動此路徑朝產生BDO之方向進行，並產生副產物乙酸或乙醇。在該等條件下，最大產量分別為1.04及1.00mol/mol。另一個替代方法係添加限量之硝酸作為電子受體，藉此控制可能發生之呼吸作用。在此條件下，最大產量回到1.09mol/mol。
另外，還可在上述路徑中利用幾個替代酶。用於轉化琥珀酸到琥珀醯輔酶A(圖2中之步驟1)之原生或內源酶可由輔酶A轉移酶替代，例如由克氏梭菌(C.kluyveri)之cat1基因編碼之輔酶A轉移酶(Sohling,B.及G.Gottschalk,Eur.J Biochem.212：121-127(1993)，其功能與步驟9中之酶類似。但此酶催化下之乙酸生產可能並非最優的，因為其可能被分泌而非被轉化回乙醯輔酶A。為此，在第9步中消除乙酸之形 成亦係有利的。作為此輔酶A轉移酶之一個替代方法，可使用一個首先由ATP將4-HB磷酸化然後再轉化為輔酶A衍生物之機制，而其類似於大腸桿菌中轉化乙酸到乙醯輔酶A之乙酸激酶/磷酸轉乙醯酶路徑。此路徑之淨消耗係一個ATP，而其與從乙酸再生乙醯輔酶A之要求相同。已知磷酸轉丁醯酶(ptb)及丁酸激酶(bk)係丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)中產生丁酸時對未羥基化分子催化該等步驟之酶(Cary等人，Appl Environ Microbiol 56：1576-1583(1990)；Valentine,R.C.及R.S.Wolfe,J Biol Chem.235：1948-1952(1960)。該等酶係可逆向催化的，允許合成朝4-HB方向進行。
BDO亦可藉由補充或替換琥珀酸之α-酮戊二酸而進行生產。如上所述及下面之實例說明，完成產物生物合成之一條路徑係使用內源酶藉由α-酮戊二酸生產琥珀酸半醛(圖2，第4-5步)。另一種方法係使用可在一步內完成此轉化之α-酮戊二酸脫羧酶(圖2，第8步；Tian等人，Proc Natl Acad Sci U S.A 102：10670-10675(2005)。
對於構建產生BDO之不同微生物菌株而言，可編纂一個適用基因清單以進行確認。簡言之，可藉由可用之文獻資源、NCBI基因資料庫及同源性搜尋而為圖2中所示之產生BDO之完整路徑之每一個步驟識別4-HB及/或BDO生物合成路徑中之一或多個基因。本研究中選殖及評估之基因在下面之表6中列出，同時還有多肽序列之相關參考及URL索引。正如下面之討論所示，某些基因係為密碼子優化而合成的，而其他基因係從原生或野生型生物體之基因組DNA中藉由PCR選殖的。對於某些基因而言，同時使用這兩種方法，而在此情況下，原生基因係在實驗中使用之基因識別號前添加「n」首碼表示。請注意，僅DNA序列不同；蛋白質係相同的。
表6.在產生BDO之宿主微生物中表現之基因。
BDO路徑表現載體之構建。載體骨架及部分菌株由 Expressys(http：//www.expressys.de/)之Rolf Lutz博士提供。載體及菌株係基於Rolf Lutz博士及Hermann Bujard教授開發之pZ表現系統(Lutz,R.及H.Bujard,Nucleic Acids Res 25：1203-1210(1997)。獲得之載體係pZE13luc、pZA33luc、pZS*13luc及pZE22luc，並包含當成填充片段(stuffer fragment)之螢光素酶基因。為了用側接合適限制酶之lacZ-α片段替換螢光素酶填充片段，首先要藉由以EcoRI及XbaI消化而從所有載體中去除螢光素酶填充片段。然後lacZ-α片段用以下引子從pUC19開始進行PCR擴增：lacZalpha-RI
5'GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATT CACTGGCCGTCGTTTTAC3'
lacZalpha 3'BB
5'-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGC
AGA-3'。
此舉會產生一個5'端含有EcoRI位點、NheI位點、核糖體結合位點、SalI位點及起始密碼子之片段。在該片段之3'端則含有終止密碼子、XbaI、HindIII及AvrII位點。然後PCR產物用EcoRI及AvrII消化並連接到經EcoRI及XbaI消化之基本載體(base vector)上(XbaI及AvrII有相容(compatible)之兩端並可產生一個非位點(non-site)。因為NheI及XbaI限制酶之位點會產生可連接在一起之相容兩端(但產生一個不能被其中任一個酶消化之NheI/XbaI非位點)，所以可藉由「生物磚(Biobricked)」技術將該等基因一起選殖入載體中(http：//openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology：BioBricks)。簡言之，此方法允許使用相同之2個限制位點(只要該等位點不在基因內部)將數目不限之基因加入載體中，因為基因之間的位點在每次添加後均被 破壞。
所有載體都有pZ之開頭，然後係指示複製起點、抗抗生素標記及啟動子/調控單元之字母及數字。複製起點由第二個字母表示，其中E代表ColE1；A代表p15A；而S代表pSC101起點。第一個數字代表抗抗生素標記(1代表胺苄青黴素(Ampicillin)；2代表卡那徽素(Kanamycin)；3代表氯黴素(Chloramphenicol)；4代表觀黴素(Spectinomycin)；5代表四環素(Tetracycline)。最後一個數字定義調控相關基因之啟動子(1代表PLtetO-1；2代表PLlacO-1；3代表PAllacO-1；4代表Plac/ara-1)。然後係MCS及相關之基因。對於此處討論之工作，吾人採用兩個基本載體pZA33及pZE13，用於按照上述討論進行生物磚插入(biobricks insertions)。在將相關之基因選殖到其中後，所產生之質體使用表6中之四位基因代碼表示，例如pZA33-XXXX-YYYY-...。
宿主菌株之構建。本文描述之所有研究中之親本菌株係大腸桿菌K-12菌株MG1655。adhE、gabD及aldA中無標記之缺失菌株係根據與第三方達成之服務合約使用redET方法(Datsenko,K.A.及B.L.Wanner,Proc Natl Acad Sci U S.A 97：6640-6645(2000)構建。後續菌株係藉由噬菌體P1介导之轉導構建(Miller,J.1973.Experiments in Molecular Genetics.Cold Spring Harbor Laboratories,New York)。菌株C600Z1(laciq,PN25-tetR,SpR,LacY1,leuB6,mcrB+,supE44,thi-1,thr-1,tonA21)係來自Expressys並用作P1轉導之lacIq等位基因(allele)之來源。噬菌體Plvir生長於C600Z1大腸桿菌菌株上，而後者具有與lacIq相關联之觀黴素抗性基因。生长於C600Z1上之P1溶菌液(lysate)用於感染MG1655以選擇觀黴素抗性。然後藉由测定轉導子抑制與PAllacO-1啟動子相關联之一個基因表現之能力，為相關联之lacIq篩選具有觀黴素抗性之菌落。所產生之菌株命名為MG1655 lacIq。使用類似之程序將lacIQ引入缺失菌株。
從琥珀酸生產4-HB。對於構建一個從琥珀酸開始產生4-HB之微生物而言，從琥珀酸到4-HB及4-HB輔酶A之基因編碼步驟(圖2中之1、6、7及9)被组装到pZA33及pZE13載體中，如下所述。評估基因之各種組合及作為對照物而攜帶不完整路徑之構建菌株(表7及8)。然後將質體轉型到含lacIQ之宿主菌株中，以允許藉由添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)進行可誘導表現。測試了野生型及缺失原生琥珀酸半醛脫氫酶(圖1中之第2步)編碼基因之宿主菌株。
異源酶之活性首先在活體外檢定中測試，使用菌株MG1655 lacIQ作為含路徑基因之構建質體之宿主。細胞於好氧環境下在含對應於各構建菌株之抗生素之LB培養基(Difco)中生長，並藉由在光學密度(OD600)達到約0.5之1mM下添加IPTG而誘導。在24小時後收穫細胞，並按下述說明進行酶檢定。
活體外酶檢定。為了獲得用於活性檢定之粗萃取液，藉由在4,500rpm下離心(Beckman-Coulter,Allegera X-15R)10分鐘而收穫細胞。然後將沈澱物(pellet)再懸浮於含核酸酶(benzonase)及溶菌酶(lysozyme)之0.3mL BugBuster(Novagen)試劑中，並在室溫下輕輕搖動溶解15分鐘。然後於4℃及14,000rpm下離心(Eppendorf離心機5402)30分鐘獲得無細胞之溶菌液。樣本中之細胞蛋白質使用Bradford等人，Anal.Biochem.72：248-254(1976)之方法測定，並按下述說明進行具體之酶檢定。酶活性之單位為「單位/毫克蛋白質」，其中活性單位之定義係室溫下1分鐘內轉化1μmol之底物所需之酶量。一般而言，報告值係至少3次重複檢定之平均值。
琥珀醯輔酶A轉移酶(Cat1)之活性係藉由按照文獻中記載之方法(Sohling及Gottschalk,J.Bacteriol 178：871-880(1996)監控從琥珀醯輔酶A及乙酸開始之乙醯輔酶A之形成而測定。琥珀醯輔酶A合成酶 (SucCD)之活性係藉由在存在ATP之條件下監控從琥珀酸及輔酶A開始之琥珀醯輔酶A之形成而測定。實驗遵循Cha及Parks,J.Biol.Chem.239：1961-1967(1964)所述之程序。有機酸之輔酶A及輔酶A衍生物按上述方法藉由GCMS在檢定混合液中量測。依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶(SucD)之活性係藉由在存在琥珀酸半醛及輔酶A之條件下，監控在340nm下從NAD到NADH之轉化來測定。4HB脫氫酶(4Hbd)之活性係藉由在存在琥珀酸半醛之條件下，監控在340nm下從NADH到NAD之氧化來測定。實驗遵循已發表之程序(Gerhardt等人，Arch.Microbiol.174：189-199(2000)。4HB輔酶A轉移酶(Cat2)之活性係按照Scherf及Buckel,Appl.Environ.Microbiol.57：2699-2702(1991)之改良方法测定。4HB-輔酶A之形成或從乙醯-輔酶A及4-HB或丁酸到丁醯輔酶A之形成係藉由HPLC測定。
醇(ADH)及醛(ALD)脫氫酶係使用改編自幾篇文獻來源之程序按還原方向檢定(Durre等人，FEMS Microbiol.Rev.17：251-262(1995)；Palosaari及Rogers,J.Bacteriol 170：2971-2976(1988)及Welch等人，Arch.Biochem.Biophys.273：309-318(1989)。NADH之氧化係藉由在室溫下在連續240秒中每四秒於340nM下讀取吸光度來追蹤。還原檢定係在100mM之MOPS(使用KOH調節到pH 7.5)、0.4mM之NADH及使用1到50μl之細胞萃取液進行。該反應藉由添加以下試劑開始：100μl之100mM乙醛或丁醛(ADH)，或100μl之1mM乙醯輔酶A或丁醯輔酶A(ALD)。在快速對分光光度計進行空白校正後開始動力學讀數。得出之340nM下每分鐘吸光度降低斜率，及340nM(6000)下NAD(P)H之莫耳消光係數及萃取液之蛋白質濃度可用於判斷特異活性。
PTB之酶活性按照從丁醯輔酶A到丁醯磷酸之方向量測(Cary等人，J.Bacteriol.170：4613-4618(1988)。其為轉化提供無機磷酸，然 後用試劑5,5'-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)或DTNB提高游離輔酶A。DTNB快速與硫醇基(如游離輔酶A)反應釋放黃色之2-硝基-5-巰基苯甲酸(TNB)，而其在412nm下吸收之莫耳消光係數為14,140M cm-1。檢定緩衝液含pH 7.4之150mM磷酸鉀、0.1mM之DTNB及0.2mM之丁醯輔酶A，而反應藉由添加2到50μL之細胞萃取液開始。BK之酶活性按照從丁酸形成丁醯磷酸之方向量測，要消耗ATP。該程序類似於如前所述之用於乙酸激酶之檢定(Rose等人，J.Biol.Chem.211：737-756(1954)。但吾人發現Sigma提供之另一個乙酸激酶檢定方案更加有用及敏感。此檢定將藉由由乙酸激酶催化之從ATP到ADP之轉化，聯繫到由丙酮酸激酶催化之從ADP及磷酸烯醇丙酮酸(PEP)到ATP及丙酮酸之轉化，然後到乳酸脫氫酶催化之丙酮酸及NADH到乳酸及NAD+之轉化。將乙酸替換成丁酸係允許檢定BK酶活性之唯一重大修改。检定混合液含pH 7.6下之80mM三乙醇胺緩衝液、200mM丁酸鈉、10mM之MgCl2、0.1mM之NADH、6.6mM之ATP、1.8mM磷酸烯醇丙酮酸。丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶及肌激酶按照製造商之說明予以添加。反應藉由添加2到50μL之細胞萃取液開始，然後根據指示NADH氧化之340nm下吸光度之下降進行監控。
輔酶A衍生物之HPLC分析。開發基於HPLC之檢定用以監控涉及輔酶A(CoA)轉移之酶反應。此方法藉由對活體外反應混合液中存在之輔酶A、乙醯輔酶A(AcCoA)、丁醯輔酶A(BuCoA)及4-羥基丁酸輔酶A(4HBCoA)進行定量分析而確定酶活性之特徵。此方法可取得低至μM級之敏感度及所有相關輔酶A衍生物之極佳解析度。
化學品及樣本準備方法如下。簡言之，CoA、AcCoA、BuCoA及所有其他化學品均來自Sigma-Aldrich。溶劑、甲醇及乙腈均為HPLC級。標準校準曲線在0.01-1mg/mL濃度範圍內表現出極佳線性。酶反應混合液含100mM之Tris HCl緩衝液(pH 7)，取自不同時間點之等分 試樣，用甲酸(最終濃度0.04%)淬熄並用HPLC直接分析。
HPLC分析使用Agilent 1100 HPLC系統，配備有二元泵、脫氣裝置、恆溫自動取樣器及管柱腔及二極體陣列偵測器(diode array detector，DAD)。亦採用逆相管柱Kromasil 100 5um C18,4.6×150mm(Peeke Scientific)。流速為1mL/分鐘之25mM之磷酸鉀(pH 7)及甲醇或乙腈用作水性及有機溶劑。開發了兩種方法：一種係梯度更快之短路徑，用於分析良好解析之CoA、AcCoA及BuCoA，而另一種係用於區分伴隨溶離之AcCoA及4HBCoA之較長路徑。短路徑方法採用乙腈梯度(0分鐘-5%、6分-30%、6.5分鐘-5%、10分鐘-5%)並分別為CoA、AcCoA及BuCoA帶來2.7、4.1及5.5分鐘之保留時間。長路徑方法中則使用乙醇及以下線性梯度：0分鐘-5%、20分鐘-35%、20.5分鐘-5%、25分鐘-5%。CoA、AcCoA、4HBCoA及BuCoA之保留時間分別為5.8、8.4、9.2及16.0分鐘。注射體積為5μL，管柱溫度30℃，並在260nm下量測紫外吸光度。
結果證明四個路徑步驟之活性(表6)，雖然其活性明顯依賴於基因來源、基因在載體中之位置及伴隨其表現之其他基因。例如，基因0035編碼之琥珀酸半醛脫氫酶之活性大於0008所編碼之，而與0009相比0006及0010n係活性更好之4-HB脫氫酶基因。另外，看起來在同一操縱子上先前有另一個基因時，所編碼4-HB脫氫酶之活性更大。
表7.來自MG1655 lacIQ(其中包含表現4-HB輔酶A路徑中基因之質體)之細胞萃取液中之活體外酶活性。酶活性之單位為「單位/毫克蛋白質」，其中活性單位之定義係室溫下1分鐘內轉化1μmol之底物所需之酶量。
(a)來自colE1並具有胺苄青黴素抗性之高套數質體pZE13上Plac表現之基因。基因識別號見表2。
(b)來自pACYC並具有氯黴素抗性之中套數質體pZA33上Plac表現之基因。
(c)細胞蛋白質單位為每毫升萃取液含蛋白質之毫克數。
然後評估含4HB路徑中基因之重組菌株利用中心代謝中間物在活體內產生4-HB之能力。首先使細胞在LB培養基中厭氧生長到OD600約為0.4，然後用1mM之IPTG誘導。一小時後，添加琥珀酸鈉達到10mM，然後在等待24及48小時後取樣分析。培養液中4HB按材料及方法部分之說明分析。結果指示重組菌株能在24小時後產生超過2mM之4HB，而對照菌株中基本為零(表8)。
(a)標準化之4HB濃度，單位為μM/OD600單位
另一種利用輔酶A轉移酶(cat1)從琥珀酸生產琥珀醯輔酶A之路徑係使用編碼琥珀醯輔酶A合成酶之原生大腸桿菌sucCD基因。此基因簇與負責生產4HB之其餘步驟之候選基因一起選殖到pZE13上產生pZE13-0038-0035-0036。
從葡萄糖開始之4-HB之生產。雖然上述實驗論證了一個從中心代謝中間物(琥珀酸)生產4HB之可行路徑，但吾人要求一個從葡萄糖或蔗糖等低成本碳水化合物原料生產化學品之工業製程。因此，下一組實驗旨在判斷細胞在以葡萄糖為來源之生長中產生之內源琥珀酸是否能夠驅動4HB路徑。使細胞在M9基本培養基(6.78g/L Na2HPO4，3.0g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，1.0g/L NH4Cl，1mM MgSO4，0.1mM CaCl2)中厭氧生長，同時補充20g/L葡萄糖、提高緩衝能力之100mM 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、10μg/mL之硫胺(thiamine)及相應之抗生素。在OD600達到約0.2時，加入0.25mM之IPTG，然後在誘導後每24小時取樣進行4HB分析。在所有情形下，4HB之生產均在24小時後達到平台期，最好之菌株中最大產量約為1mM(圖12a)，而琥珀酸之濃度則繼續上升(圖12b)。這指示在路徑中琥珀酸之供應不太可能 具有限制作用，而且該路徑之瓶頸可能係酶本身之活性或NADH之可用性。0035及0036明顯分別係依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶及4HB脫氫酶之最佳候選基因。去除對已知(gabD)或推定(aldA)原生琥珀酸半醛脫氫酶進行編碼之基因之一或全部對效能影響不大。最後，應注意，產生4HB之菌株中細胞生長之最終OD遠低於對照菌株中(圖12c)。
從葡萄糖開始生產4HB之另一條路徑係藉由α-酮戊二酸。吾人嘗試利用來自結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(30)之α-酮戊二酸脫羧酶以直接從α-酮戊二酸產生琥珀酸半醛(圖2中之第8步)。為了證明此基因(0032)能在活體內工作，吾人將其表現於pZA33上4HB脫氫酶(基因0036)使用之相同宿主之pZE13上。此菌株能夠在用1mM IPTG誘導後之24小時內產生1.0mM以上之4HB(圖13)。因為此菌株不表現依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶，所以排除了藉由琥珀醯輔酶A產生琥珀酸半醛之可能性。負責生產琥珀酸半醛之原生基因亦有可能在該路徑中起作用(圖2中之第4及5步)；但是，在宿主中沒有pZE13-0032質體時4HB之產量可忽略不計。
從4-HB生產BDO。從4-HB生產BDO要求兩個由脫氫酶催化之還原步驟。醇及醛脫氫酶(分別為ADH及ALD)係依賴NAD+/H及/或NADP+/H之酶，它們一起可將分子上之羧酸基還原為醇基，或反向催化，將醇氧化為羧酸。此生物轉化已在野生型之丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)中證明(Jewell等人，Curr.Microbiol.13：215-219(2007)，但並未識別負責之酶及基因。另外，仍不清楚是否首先要求活化為4HB輔酶A(圖2中第9步)，或者醛脫氫酶(第12步)是否可直接作用於4HB。吾人基於未羥化類似物對於4HB及路徑中間物之已知活性，或者根據與該等已特徵化之基因之相似性而開發出來自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)及相關生物體之候選酶之清單(表 6)。因為其中部分候選酶係多功能脫氫酶，他們可能催化酸(或輔酶A衍生物)到醛及醛到醇之依賴NAD(P)H之還原反應。在開始在大腸桿菌中測試該等基因之前，吾人首先使用丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)ATCC 824驗證了上述結果。使細胞在Schaedler培養液(Accumedia,Lansing,MI)中生長，同時補充10mM之4HB，培養溫度30℃，而厭氧氣氛組成為10%之CO2、10%之H2及80%之N2。按照材料及方法中之說明定期採集培養液樣本，離心，並進行BDO分析。在培養1天、2天及7天後分別偵測到0.1mM、0.9mM及1.5mM之BDO濃度。在未添加4HB之培養菌中未偵測到BDO。
接下來藉由在大腸桿菌宿主MG1655 lacIQ中進行表現而測試4HB到BDO轉化路徑之候選基因。含在pZA33上表現之各候選基因之重組菌株在37℃下及加入0.25mM之IPTG後生長四小時，以完全誘導酶之表現。誘導四小時後，收穫細胞，並按照材料及方法部分中之說明進行ADH及ALD之活性檢定。因為無商用之4HB輔酶A及4-羥基丁醛，吾人使用未羥化之底物進行檢定(表9)。丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)adhE2(0002)及大腸桿菌adhE(0011)之4-碳及2-碳底物之間的活性比接近於文獻中所報導之彼等值(Atsumi等人，Metabl.Eng.(2007))。
對於BDO製備實驗而言，來自牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)W83(基因0034)之cat2被包括於pZA33上以將4HB轉化為4-HB輔酶A，而候選之脫氫酶基因則在pZE13上表現。宿主菌株為MG1655 lacIQ。吾人在測試候選醇及醛脫氫酶之同時，亦測試了依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶(sucD)在此步驟中之催化能力，因為該等酶之底物相似。在補充有10mM 4HB之LB培養基中使細胞生長到約0.5之OD處，然後用1mM IPTG誘導，24小時後對培養液取樣，並按材料及方法中之說明分析BDO。在使用來自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)之adhE2、來自克氏梭菌(C.kluyveri)之sucD或來自牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)之sucD時取得最好之BDO產量。有意思的係，產生之BDO之絕對量在有氧條件下較高；但是，其主要原因在於厭氧培養中獲得之細胞密度較低。在標準化細胞之OD後，單位生物量之BDO產量在厭氧條件下較高(表10)。
如第2部分所討論，使用從4HB轉化為4HB輔酶A，且不產生副產物乙酸之路徑可能係有利的。為此，吾人測試了來自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)之磷酸轉丁醯酶(ptb)及丁酸激酶(bk)藉由圖2中第10及11步進行此轉化。來自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)之原生ptb/bk操縱子(基因0020及0021)在選殖後於pZA33中表現。按照材料及方法中之說明對含所產生構建基因之細胞之萃取液採樣，並檢定該兩種酶之活性。BK之特異活性約為65U/mg，而PTB之特異活性約為5U/mg。1單位(U)活性之定義係室溫下1分鐘內轉化1μM之底物所需之酶量。最後，測試構建基因對4HB到BDO轉化過程之參與。使用上述構建基因pZA33-0020-0021及pZE13-0002轉型宿主菌株，並與使用圖14中上述有氧程序之BDO生產中cat2之使用相比較。BK/PTB菌株產生1mM之BDO，而在使用cat2時會產生2mM之BDO。有意思的係，其結果取決於宿主菌株中是否缺失原生adhE基因。
表11.在pZE13中表現來自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)之adhE2及在pZA33上來自牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)(0034)之cat2或來自丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)之PTB/BK基因之細胞培養液中之絕對及標準化BDO濃度。宿主菌株係MG1655 lacIQ或MG1655 △adhE lacIQ。
從葡萄糖生產BDO。路徑驗證之最後一步係在大腸桿菌中同時表現路徑之4HB及BDO部分，並在葡萄糖基本培養基中論證BDO之生產。構建新質體以將所有要求之基因放入兩個質體上。一般而言，cat1、adhE及sucD基因由pZE13表現，而cat2及4hbd由pZA33表現。在MG1655 lacIQ背景中測試多種基因來源及基因次序之各種組合。使細胞在M9基本培養基(6.78g/L Na2HPO4，3.0g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，1.0g/L NH4Cl，1mM MgSO4，0.1mM CaCl2)中厭氧生長，同時補充20g/L葡萄糖、提高緩衝能力之100mM 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、10μg/mL之硫胺及相應之抗生素。在接種約15小時後添加0.25mM之IPTG，並在誘導後24及48小時對培養液上清液取樣進行BDO、4-HB及琥珀酸分析。BDO之生產看起來依賴於基因次序(表12)。在cat2首先表現，然後係pZA33上之4hbd，接著係cat1，最後係pZE13上之牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)sucD之情況下，可取得超過0.5mM之最高BDO產量。在pZE13之最後位點上添加丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)之adhE2可導致產量之略微提高。產生之4HB及琥珀酸之濃度亦較高。
表12.在補充有20g/L葡萄糖之基本培養基中生長之表現BDO路徑基因組合之重組大腸桿菌菌株中BDO、4-HB及琥珀酸之產量。濃度單位為mM。
為了證明所產生之BDO係衍生自葡萄糖，吾人使BDO產量最高之菌株MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036在補充有4g/L均勻標記之13C-葡萄糖之M9基本培養基中生長。然後在細胞OD達到0.67時用1mM之IPTG誘導，並在24小時後取樣。最後對培養液之上清液進行質譜分析。
BDO、4HB及琥珀酸之GCMS分析。醱酵及細胞培養液樣本中之BDO、4HB及琥珀酸係藉由矽烷基化衍生並用GCMS定量分析。吾人之方法表現出低至1μM之良好敏感度、線性高達至少25mM，而且具有極佳之選擇性及再現性。
樣本準備按以下方法進行：100μL之過濾(0.2μm或0.45μm之針筒過濾器)樣本，例如醱酵液、細胞培養液或標準溶液，在Speed Vac濃縮器(Savant SVC-100H)中於室溫下乾燥約1小時，然後添加20μL於二甲基甲醯胺中之10mM環己醇溶液(作為內部標準)。在水浴(Branson 3510)中渦旋及超音波處理混合物15分鐘以保證均質性。添加100μL之矽烷基化衍生化試劑N,O-雙(三甲矽烷基)三氟乙醯胺(BSTFA)及1%之三甲基氯矽烷，並將混合物在70℃下培養30分鐘。然後將衍生化後之樣本離心5分鐘，且將澄清溶液直接注入GCMS。所有之化學品及試劑均來自Sigma-Aldrich，但BDO購自J.T.Baker。
GCMS分析在Agilent氣相層析儀6890N上進行，它連接了一個質量選擇偵測器(mass-selective detector，MSD)5973N，分析時處於電子撞擊電離(EI)模式下。使用一個30m×0.25mm i.d.×0.25μm薄膜厚 度之DB-5MS毛細管柱(J&W Scientific,Agilent Technologies)。GC在分流進樣模式下工作，以20：1之分流比注射1μL之樣本。進樣口溫度為250℃。氦氣係運載氣體，其流速保持在1.0mL/分鐘。對溫度梯度程式進行了優化以確保相關分析物之良好解析度及最低程度之基體干擾。開始時爐溫在80℃保持一分鐘，然後以2℃/分鐘之速度逐漸上升到120℃，再以100℃/分鐘之速度快速上升到320℃，最後在320℃下保持6分鐘。質譜介面傳輸線溫度保持在280℃。使用「lowmass(低質量)」MS tune設定及30-400m/z質量範圍掃描獲得數據。總分析時間為29分鐘，包括3分鐘之溶劑延遲。BSTFA衍生之環己醇、BDO、4HB及琥珀酸之保留時間分別為5.2、10.5、14.0及18.2分鐘。為了進行定量分析，選擇以下之具體質量碎片(萃取離子層析)：內部標準環己醇為m/z 157；BDO為116；而4HB及琥珀酸均為147。使用相應細胞培養液或醱酵培養基中之分析物溶液構建標準校準曲線以儘可能匹配樣本基體。GCMS數據經環境數據分析ChemStation軟體(Agilent Technologies)處理。
結果指示，所產生之大部分4HB及BDO標記有13C(圖13，右側)。在未標記葡萄糖中，生長之平行培養細胞之質譜用於比較(圖15，左側)。值得注意的係，所見之峰係含來自代謝物之不同數目碳原子之衍生分子之碎片。衍生化試劑亦貢獻了部分天然標記之碳及矽原子，因此該等結果並非係嚴格定量的。
實例V 4-羥基丁酸、γ-丁內酯及1,4-丁二醇之生物合成
本實例描述醱酵及其他生物製程下4-羥基丁酸、γ-丁內酯及1,4-丁二醇之生物合成。
下面描述將4-HB醱酵步驟整合到生產純化GBL、1,4-丁二醇(BDO)及四氫呋喃(THF)之完整製程中之方法。因為4-HB及GBL處於 平衡狀態，所以醱酵液中將包含這兩種化合物。在低pH值下，此平衡轉向產生GBL。因此，醱酵可在pH 7.5或以下進行，一般在pH 5.5或以下。在移除生物量後，產物流進入分離步驟，於其中移除GBL並回收富含4-HB之剩餘流。最後，蒸餾GBL以移除所有雜質。此製程藉由以下三種方式之一進行：1)分批補料醱酵及分批分離；2)分批補料醱酵及連續分離；及3)連續醱酵及連續分離。圖16係前兩種方法之示意圖。以下描述之整合醱酵程序亦可用於本發明中產生BDO之細胞，進行BDO及隨後BDO家族產物之生物合成。
生產4-HB/GBL之醱酵方案(分批)：在噴入N2/CO2混合氣體之10L生物反應器中，使用含5g/L磷酸鉀、2.5g/L氯化銨、0.5g/L硫酸鎂及30g/L玉米漿及20g/L初始葡萄糖濃度之5L培養液，生長目標生物體。隨著細胞之生長及對葡萄糖之消耗，以大約能平衡葡萄糖消耗之速度向生物反應器中補充70%之葡萄糖。生物反應器之溫度保持在攝氏30度。細胞生長連續進行約24小時，直到4-HB濃度達到20-200g/L之間而細胞密度達到5-10g/L之間。不控制pH值，一般在醱酵結束時降低到pH 3-6。在培養期結束時，醱酵罐內含物藉由細胞分離設備(例如離心機)移除細胞及細胞碎片，並將醱酵液轉移到產物分離設備中。4-HB及/或GBL之分離將使用此項技術中所採用之標準分離程序將有機產物與稀水溶液分離，例如使用與水不混溶之有機溶劑(例如甲苯)進行液-液萃取以獲得4-HB/GBL之有機溶液。得到之溶液然後經標準蒸餾方法之處理，移除及回收有機溶劑並獲得作為純化液體分離之GBL(沸點204-205℃)。
生產4-HB/GBL之醱酵方案(完全連續)：首先用上述容器及培養基組成在分批醱酵模式下生長目標生物體，但初始葡萄糖濃度為30-50g/L。在葡萄糖耗盡時，以0.5L/小時與1L/小時之間的速度連續補充組成相同之培養基，並以相同之速度提取醱酵液。生物反應器中之 4-HB濃度保持恆定在30-40g/L，而細胞密度保持恆定在3-5g/L。溫度保持在攝氏30度。pH值則根據需要使用濃NaOH及HCl保持在4.5。生物反應器連續工作一個月，其中每天取樣以確保4-HB濃度之一致性(consistency)。在連續模式下，醱酵罐之內含物以補充新培養基之速度連續移除。然後，流出液、所含細胞、培養基及產物4-HB及/或GBL接受移除或不移除細胞及細胞碎片之連續產物分離步驟，並使用此項技術中所採用之標準連續分離方法將有機產物與稀水溶液分離，例如使用與水不混溶之有機溶劑(例如甲苯)進行連續液-液萃取以獲得4-HB/GBL之有機溶液。得到之溶液然後經標準連續蒸餾方法移除及回收有機溶劑，並獲得作為純化液體分離之GBL(沸點204-205℃)。
GBL之還原方案：在按上述方法分離及純化GBL後，將使用此項技術中所熟知之(參考文獻)還原方案處理GBL以產生1,4-丁二醇或四氫呋喃(THF)或二者之混合物。眾所周知多相或均相加氫觸媒加上GBL在氫氣壓力下能夠產生1,4-丁二醇或四氫呋喃(THF)或二者之混合物。值得注意的係，按上述方法從醱酵液中分離出之4-HB/GBL產物混合物可直接在分離及純化GBL前經相同之還原方案產生產物1,4-丁二醇或四氫呋喃或二者之混合物。然後再使用此項技術上所熟知之程序分離及純化1,4-丁二醇及THF。
直接產生BDO或THF之醱酵及加氫方案(分批)：在噴入N2/CO2混合氣體之10L生物反應器中，使用含5g/L磷酸鉀、2.5g/L氯化銨、0.5g/L硫酸鎂及30g/L玉米漿及20g/L初始葡萄糖濃度之5L培養液，生長細胞。隨著細胞之生長及對葡萄糖之消耗，以大約能平衡葡萄糖消耗之速度向生物反應器中補充70%之葡萄糖。生物反應器之溫度保持在攝氏30度。細胞生長連續約24小時，直到4-HB濃度達到20-200g/L之間而細胞密度達到5-10g/L之間。不控制pH，一般在醱酵結束時降低到pH 3-6。在培養期結束時，醱酵罐內含物藉由細胞分離設備 (例如離心機)移除細胞及細胞碎片，並將醱酵液轉移到還原設備(例如加氫容器)中，然後在其中直接將4-HB/GBL之混合物還原為1,4-丁二醇或四氫呋喃或二者之混合物。還原步驟完成後，將反應器之內含物轉移到產物分離設備中。1,4-丁二醇及/或THF之分離將使用此項技術中所採用之標準分離程序將有機產物與稀水溶液分離，例如使用與水不混溶之有機溶劑(例如甲苯)進行液-液萃取以獲得1,4-丁二醇及/或THF之有機溶液。得到之溶液然後經標準蒸餾方法移除及回收有機溶劑並獲得作為純化液體分離之1,4-丁二醇及/或THF。
直接產生BDO或THF之醱酵及加氫方案(完全連續)：首先用上述容器及培養基組成在分批醱酵模式下生長細胞，但初始葡萄糖濃度為30-50g/L。在葡萄糖耗盡時，以0.5L/小時與1L/小時之間的速度連續補充組成相同之培養基，並以相同之速度提取醱酵液。生物反應器中之4-HB濃度保持恆定在30-40g/L，而細胞密度保持恆定在3-5g/L。溫度保持在攝氏30度。pH值則根據需要使用濃NaOH及HCl保持在4.5。生物反應器連續工作一個月，其中每天取樣以確保4-HB濃度之一致性。在連續模式下，醱酵罐之內含物以補充新培養基之速度連續移除。然後，流出液、所含細胞、培養基及產物4-HB及/或GBL藉由細胞分離設備(例如離心機)移除細胞及細胞碎片，並將醱酵液轉移到連續還原設備(例如加氫容器)中，然後在其中直接將4-HB/GBL之混合物還原為1,4-丁二醇或四氫呋喃或二者之混合物。還原步驟完成後，將反應器之內含物轉移到連續產物分離設備中。1,4-丁二醇及/或THF之分離將使用此項技術中所採用之標準連續分離程序將有機產物與稀水溶液分離，例如使用與水不混溶之有機溶劑(例如甲苯)進行液-液萃取以獲得1,4-丁二醇及/或THF之有機溶液。得到之溶液然後經標準連續蒸餾方法移除及回收有機溶劑，並獲得作為純化液體分離之1,4-丁二醇及/或THF。
直接生產BDO之醱酵方案(分批)：在噴入N2/CO2混合氣體之10L生物反應器中，使用含5g/L磷酸鉀、2.5g/L氯化銨、0.5g/L硫酸鎂及30g/L玉米漿及20g/L初始葡萄糖濃度之5L培養液，生長目標生物體。隨著細胞之生長及對葡萄糖之消耗，以大約能平衡葡萄糖消耗之速度向生物反應器中補充70%之葡萄糖。生物反應器之溫度保持在攝氏30度。細胞生長連續約24小時，直到BDO濃度達到20-200g/L之間而細胞密度達到5-10g/L之間。在培養期結束時，醱酵罐內含物藉由細胞分離設備(例如離心機)移除細胞及細胞碎片，並將醱酵液轉移到產物分離設備中。BDO之分離將使用此項技術中所採用之標準分離程序將有機產物與稀水溶液分離，例如使用與水不混溶之有機溶劑(例如甲苯)進行液-液萃取以獲得BDO之有機溶液。得到之溶液然後經標準蒸餾方法移除及回收有機溶劑並獲得作為純化液體分離之BDO(沸點228-229℃)。
直接生產BDO之醱酵方案(完全連續)：首先用上述容器及培養基組成在分批醱酵模式下生長目標生物體，但初始葡萄糖濃度為30-50g/L。在葡萄糖耗盡時，以0.5L/小時與1L/小時之間的速度連續補充組成相同之培養基，並以相同之速度提取醱酵液。生物反應器中之BDO濃度保持恆定在30-40g/L，而細胞密度保持恆定在3-5g/L。溫度保持在攝氏30度。pH值則根據需要使用濃NaOH及HCl保持在4.5。生物反應器連續工作一個月，其中每天取樣以保證BDO濃度之一致性。在連續模式下，醱酵罐之內含物以補充新培養基之速度連續移除。然後，流出液、所含細胞、培養基及產物BDO接受移除或不移除細胞及細胞碎片之連續產物分離程序，並使用此項技術中所採用之標準連續分離方法將有機產物與稀水溶液分離，例如使用與水不混溶之有機溶劑(例如甲苯)進行液-液萃取以獲得BDO之有機溶液。得到之溶液然後經標準連續蒸餾方法移除及回收有機溶劑並獲得作為純化液體(mpt 20℃)分離之BDO(沸點228-229℃)。
本申請案中以圓括號方式引用了各種文獻。該等文獻之揭示內容在本申請案中以引用之方式全部併入，以更加全面地描述本發明所屬技術之現狀。
雖然本發明已結合所揭示之實施例加以描述，但熟習此項技術者應瞭解，上述具體實例及研究僅係對本發明之說明。應瞭解，在不背離本發明精神之情況下可做出各種修改。相應地，本發明僅受隨附申請專利範圍所約束。
<110> 美商奇諾麥提卡公司
<120> 用於1,4-丁二醇及其前驅物之生物合成的組合物及方法
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<160> 2
<170> PatentIn Ver.3.3
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 1
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成引子
<400> 2
1‧‧‧琥珀醯-輔酶A合成酶
2‧‧‧不依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶
3‧‧‧α-酮戊二酸脫氫酶
4‧‧‧麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶
5‧‧‧麩胺酸脫羧酶
6‧‧‧依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶
7‧‧‧4-羥基丁酸脫氫酶
8‧‧‧α-酮戊二酸脫羧酶
9‧‧‧4-羥丁醯輔酶A：乙醯輔酶A轉移酶
10‧‧‧4-羥基丁酸激酶
11‧‧‧磷酸轉羥丁醯酶
12‧‧‧醛脫氫酶
13‧‧‧醇脫氫酶

Claims (19)

  1. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)α-酮戊二酸脫氫酶及依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶；(b)4-羥基丁酸脫氫酶；(c)丁酸激酶及磷酸轉羥丁醯酶；及(d)醛脫氫酶及醇脫氫酶之外源核酸，其中該外源核酸之表現量足以生產1,4-丁二醇(BDO)。
  2. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)α-酮戊二酸脫羧酶；(b)4-羥基丁酸脫氫酶；(c)4-羥丁醯輔酶A：乙醯輔酶A轉移酶；及(d)醛脫氫酶及醇脫氫酶之外源核酸。
  3. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)α-酮戊二酸脫氫酶及依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶；(b)4-羥基丁酸脫氫酶；(c)4-羥丁醯輔酶A：乙醯輔酶A轉移酶；及(d)醛脫氫酶及醇脫氫酶之外源核酸。
  4. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸脫羧酶；(b)4-羥基丁酸脫氫酶；(c)4-羥丁醯輔酶A：乙醯輔酶A轉移酶；及(d)醛脫氫酶及醇脫氫酶之外源核酸。
  5. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)α-酮戊二酸脫羧酶；(b)4-羥基丁酸脫氫酶；(c)丁酸激酶及磷酸轉羥丁醯酶；及(d)醛脫氫酶及醇脫氫酶之外源核酸。
  6. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸脫羧酶；(b)4-羥基丁酸脫氫酶；(c)丁酸激酶及磷酸轉羥丁醯酶；及(d)醛脫氫酶及醇脫氫酶之外源核酸。
  7. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)α-酮戊二酸脫羧酶；(b)4-羥基丁酸脫氫醇；(c)4-羥丁醯輔酶A：乙醯輔酶A轉移酶；及(d)醛/醇脫氫酶之外源核酸。
  8. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)α-酮戊二酸脫氫酶及依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶；(b)4-羥基丁酸脫氫酶；(c)4-羥丁醯輔酶A：乙醯輔酶A轉移酶；及(d)醛/醇脫氫酶之外源核酸。
  9. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸脫羧酶；(b)4-羥基丁酸脫氫酶；(c)4-羥丁醯輔酶A：乙醯輔酶A轉移酶；及(d)醛/醇脫氫酶之外源核酸。
  10. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)α-酮戊二酸脫羧酶；(b)4-羥基丁酸脫氫酶；(c)丁酸激酶及磷酸轉羥丁醯酶；及(d)醛/醇脫氫酶之外源核酸。
  11. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)α-酮戊二酸脫氫酶及依賴輔酶A之琥珀酸半醛脫氫酶；(b)4-羥基丁酸 脫氫酶；(c)丁酸激酶及磷酸轉羥丁醯酶；及(d)醛/醇脫氫酶之外源核酸。
  12. 一種非天然產生之微生物，其具有4-羥基丁酸(4-HB)及1,4-丁二醇(BDO)生物合成路徑，該等生物合成路徑包含編碼(a)麩胺酸：琥珀酸半醛轉胺酶及麩胺酸脫羧酶；(b)4-羥基丁酸脫氫酶；(c)丁酸激酶及磷酸轉羥丁醯酶；及(d)醛/醇脫氫酶之外源核酸。
  13. 如請求項1至12中任一項之非天然產生之微生物，其中該外源核酸包括至少一個異源核酸。
  14. 如請求項1至12中任一項之非天然產生之微生物，其中該微生物係在實質厭氧之培養基中。
  15. 如請求項1至12中任一項之非天然產生之微生物，其中該微生物係為細菌。
  16. 如請求項15之非天然產生之微生物，其中該細菌為大腸桿菌。
  17. 一種製備BDO之方法，其包括在製備BDO之條件及足夠之時間期間下培養如請求項1至16中任一項之非天然產生之微生物。
  18. 如請求項17之方法，其中該BDO係分離自該微生物。
  19. 如請求項18之方法，其中該BDO係藉由蒸餾來分離。
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