TWI564030B - 具有高生長因子負載率之高分子微胞及其製造方法 - Google Patents

Description

具有高生長因子負載率之高分子微胞及其製造方法

本發明係關於一種高分子微胞(polymeric micelle)，尤其係關於一種具有高生長因子負載率之高分子微胞及其製造方法。

通常人們在皮膚受到擦傷、切割傷等創傷時，最重要是傷口的清潔，將傷口上的髒污例如泥沙等沖洗掉以避免進一步的感染。醫院最常用來清洗傷口的是生理食鹽水，在家則可以使用燒開過的冷開水將傷口清洗乾淨。當傷口清洗乾淨後就要使用合適的敷料覆蓋，以前的觀念是讓傷口保持乾燥，因此會使用烤燈或是用氧氣把傷口吹乾，或者不包紮讓傷口開放暴露在外，這種方式會製造出乾燥環境，讓細胞乾死，如此傷口也會比較疼痛，被暴露在外的傷口更易感染。新的研究發現，溼潤的傷口床(wound bed)有利血管新生和細胞生長，因此傷口照顧的新觀念是保持合宜的濕潤度促進癒合。現在市面上有許多新的敷料取代傳統的紗布，不但可以提供一個適合傷口癒合的環境，又可以增加舒適度，例如：人工皮、泡棉、矽膠敷料 等多種敷料可供選擇。

在生物體的數個發育過程中，生長因子為細胞命運及分化的關鍵調節者；然而，生長因子的生體利用率(bioavailability)通常不高，係因生長因子於一般環境下易失去活性，且容易分解或聚集沉澱。在所有的生長因子中，纖維母細胞生長因子1(Fibroblast growth factor 1，簡稱FGF1)被發現在許多種類的細胞內為一具有潛力的調節者，並且可誘導血管生成，此性質為組織再生的關鍵。唯，研究發現FGF1經由合成的聚合物負載效率不高，並且會因酶降解及自我聚集(self-aggregation)造成半生期短的特性。

透明質酸(Hyaluronic acid,HA)為一由D-葡糖醛酸(D-glucuronic acid)及(1-β-3)-N-乙醯-D-葡萄糖胺((1-β-3)-N-acetyl-D-glucosamine)之多醣分子組成之多醣類。另一方面，聚ε-己內酯(poly(ε-caprolactone)，PCL)比聚(丙交酯-co-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolide))疏水性鏈段有更強的抗水解性質。當PCL作為組成鏈段時，這樣的穩定性可拉長共聚物的儲存期限。

皮膚傷口的癒合速度越快，亦即缺乏表皮保護的皮膚暴露在外的時間越短，遭受感染的機率也就大為降低，並且可使患者更快回復正常生活。但一般來說，直接利用載體包覆藥物或蛋白質(例如生長因子)時，易有突釋之反應，造成局部濃度過高情形。以生長因子結合敷料或許是個方法，但在生長因子的負載率不佳的情況下，如何使生長因子穩定地存在於敷料中、或是使生長因子可於敷 料中呈現緩慢釋放的狀態，則是亟需解決的課題。

為解決上述問題，本發明提供一種具有高生長因子負載率之高分子微胞(polymeric micelle)，包含一親水性主鏈、一疏水性鏈段、以及一交聯劑，其中該生長因子係經由交聯劑接枝於該高分子微胞，且該交聯劑係為碳二醯胺(carbodiimide)。

在本發明之一較佳實施例中，該親水性主鏈係為係為透明質酸(hyaluronic acid,HA)、聚乙二醇(methoxy polyethylene glycol,mPEG)、或聚麩胺酸(poly-γ-glutamic acid,PGA)，較佳為透明質酸。疏水性主鏈係為聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚戊內酯(polyvalerolactone,PVL)、聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚丁內酯(polybutyro-lactone,PBL)、聚甘醇酸(polyglycolide)或聚丙內酯(polypropiolactone,PPL)，較佳為聚己內酯，其中該聚己內酯之分子量為2.7 kDa。

一般交聯劑多具有毒性或刺激性，用於醫藥用途須具備可清洗掉的特性，所以交聯劑之選擇與處理變得相當重要。本發明之一較佳實施例之碳二醯胺交聯劑，係為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二醯胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)，其安全性高，且交聯後產生的小分子尿素產物為水溶性，可清洗或透析處理。

生長因子於一般環境下易失去活性，容易分解或聚集沉澱；而利用交聯劑對生長因子之殘基與材料固定可維持生長因子的分子量，避免遭到降解，其中該生長因子之高負載率係為50~99%，該高分子微胞之一生長因子的負載量為90 μg/mg微胞以上，且該高分子微胞在前20小時內只有5~40%的生長因子突釋量。本發明添加EDC可將蛋白質固定於微胞上後，仍對纖維母細胞有增生效果，且在動物實驗判斷於體內實驗對傷口修復與血管新生有優良的效果。

本發明之又一目的，係提供一種高分子微胞的製造方法，包含以下步驟：a.以一親水性單體為主鏈與一疏水性單體聚合，形成一共聚物；b.於一交聯劑存在的狀況下活化該共聚物之羧基，其中該交聯劑係為碳二醯胺；以及c.將一生長因子經由該交聯劑交聯於該共聚物上，形成一負載生長因子之高分子微胞；其中在該共聚物的量固定並量假設為1的情況下，交聯劑與生長因子之比值在0.5到5之間，該交聯劑濃度為0.05~0.5 mg/mL，該高分子微胞的表面電位為-29 mV~-60 mV，該高分子微胞的直徑為30~220 nm，該高分子微胞pH值約為7的環境，可持續其穩定性達1個月。

本發明亦提供一種促進傷口癒合之敷料，係包含如前所述之高分子微胞與一基質，其中該基質可為棉布或膠體。

另一方面，當直接利用載體包覆藥物或蛋白質時，易有突釋之反應，造成局部濃度過高的情形，如使用 交聯方式可降低突釋情形，達到控制釋放的效果。

本發明製備出由透明質酸接枝上PCL(HA-g-PCL)所建構之一新穎共聚物。我們利用一特定微胞濃度，顯示HA-g-PCL在水中能夠自我聚集在微胞中並重組人類FGF1。並分析由不同方法之新穎微胞中FGF1的釋放曲線。以體外及動物實驗評估負載FGF1之微胞的生物活性。發展出一種具有高負載效率、高負載量以及持久釋放之FGF1奈米載體。因此，本發明之透明質酸與聚己內酯之組合能製造出一具有高生長因子負載率之載體，係為傷口敷料發展的一大邁進。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

第一圖係為(A)透明質酸(HA)、聚(ε-己內酯)(PCL)、以及HA-g-PCL之分子結構；(B)HA-g-PCL之製備過程。

第二圖係為(A)HA-g-PCL之¹H NMR光譜，顯示接枝率為6~8%；(B)HA-g-PCL紅外線光譜；(C)決定HA-g-PCL微胞之臨界微胞濃度(Critical Micelle Concentration，簡稱CMC)；(D)裸微胞之TEM影像，箭頭所指即微胞；(E)以流體動力學粒徑及表 面電位評估HA-g-PCL微胞於儲存期間之穩定性；(F)HA-g-PCL微胞在不同pH值下的穩定性。

第三圖係為不同濃度之HA-g-PCL微胞對於纖維母細胞L929之細胞毒性分析：(A)形態學及(B)存活率；存活率數值經相對於控制組數值作正規化。*代表p<0.05。

第四圖係為(A)三種物理方式包裹FGF1之累積釋放率；(B)不同濃度交聯劑EDC接枝負載FGF1微胞之累積釋放率，「w/o EDC」組係為超音波震盪法組，累積釋放率數值經相對於初始FGF1負載量作百分比呈現；(C)以西方墨點法確認FGF1負載於微胞，EDC-M組之微胞負載FGF1的量高於物理方式包裹的組(w/o EDC，為超音波震盪法組)。*表示p<0.05。

第五圖係為(A)以ELISA檢測之FGF1累積釋放率；(B)西方墨點法計算21天釋放實驗後微胞上FGF1量(200倍稀釋)；基於半定量，EDC-M微胞比物理方式(w/o EDC)包裹FGF1之HA-g-PCL微胞存留更多FGF1。

第六圖以天然FGF1、負載FGF1微胞(釋放實驗第0天)、或負載FGF1微胞(釋放實驗第21天)處理L929纖維母細胞之細胞存活率，數值經相對於空白處理(0 ng/mL FGF1)之結果作正規化。*表示p<0.05。

第七圖係為負載FGF1微胞於大鼠皮膚模型傷口癒合之作用；(A)實驗期間傷口區域外觀及量化傷口區域； Blank：只有護創貼布；FGF1：自由FGF1(1.5 ng)分散於50 μL PBS；Micelles：裸微胞(50 μg)分散於50 μL PBS；FGF1-micelles(EDC-M)：負載FGF1(1.5 ng)之微胞(50 μg)分散於50 μL PBS；(B)第8天之傷口形態，以蘇木素與伊紅(hematoxylin-eosin，H&E)染色；箭頭所指為血管；「E」代表傷口上皮形成；比例尺為200 μm；(C)血管面積基於形態量化。*表示p<0.05。(D)第8天以H&E染色低倍放大之形態；箭頭所指為皮脂腺；比例尺為200 μm；(E)基於形態學每平方公厘皮脂腺的數量。*表示p<0.05。

第八圖係為大鼠皮膚傷口癒合實驗之結果(n=3)；(A)用來攜帶自由FGF1或負載FGF1之微胞的膠膜；(B)不同時間傷口區域收縮狀況；(C)實驗期間傷口區域數據量化圖表；(D)以H&E染色觀察第8天時傷口修復之組織學；箭頭所指為血管；長箭頭所指為殘餘之膠體；(E)基於組織學量化之血管面積。

本發明說明書中所指「微胞」一詞，除有特別說明外，指透明質酸接枝聚己內酯的共聚物微胞，亦即HA-g-PCL微胞。

本發明係一種具有高生長因子負載率之高分子微胞，包含一親水性主鏈、一疏水性鏈段、以及一交聯劑。本發明之一較佳實施例中，該親水性主鏈係為透明質 酸且疏水性主鏈係為聚己內酯，負載生長因子FGF1，且該交聯劑係為碳二醯胺。係將FGF1經由碳二醯胺接枝於透明質酸接枝聚己內酯共聚物的微胞上；在體外測試中可保護FGF1避免被水解，且經釋放21天後仍具有生物活性。在體內測試，證實具有收縮傷口且促進血管新生之功能。

本發明說明書中使用之材料來源如下：透明質酸(簡稱HA)(鈉鹽，分子量為16kDa)，購自Czech Chem s.r.o.(Dolni Dobrouc,Czech)。四丁銨(Tetrabutylammonium，簡稱TBA)氫氧化物水溶液、辛酸亞錫(stannous octoate，Sn(Oct)₂)、以及4,4'-二異氰酸酯二環己基甲烷(4,4’-diisocyanatodicyclohexylmethane，H₁₂MDI，90%)購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。1-十二醇(1-Dodecanol，98%)以及1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷(1,4-di-azabicyclo[2.2.2]octane，DABCO)係分別購自Acros Organics(Geel,Belgium)以及Alfa Aesar(Heysham,Lancashire，UK)。ε-己內酯係購自MP Biomedicals(Solon，CA，USA)。二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，DMSO)與二氯甲烷購自J.T.Baker(Phillipsburg,NJ,USA)。鈉及氫離子交換樹酯係購自Rohm and Haas Shanghai Chemical Industry(中國)。透析膜(Spectra/Por4，MWCO：14,000)及異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate，簡稱FITC)係由Spectrum Laboratories(Rancho Dominguez，CA，USA)及Sigma-Aldrich提供。1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimide hydrochloride，簡稱EDC)係購自Tokyo Chemical Industry(Tokyo，Japan)。醫藥級重組人類FGF1係購自Renogen Biotech(上海，中國)。

“約”、”約略”或”近似地”一般係指20%，較佳為10%，最佳為5%的範圍內。本文中之數值因量測儀器的不同，或是量測上的差異，本文中的數值係為近似值，在未明確定義的情況下可隱含「約」「約略」或「近似地」之含義。

本發明說明書中每一實驗皆使用多樣本分析。數值以平均值±標準差表示。所有的實驗中，每一種實驗皆獨立實驗三次以上，以確保實驗的重現性。實驗各組間統計上的差異係利用Student’s t test計算。p值<0.05視為具有統計上的意義。

實施例一 HA-g-PCL之合成

HA-g-PCL合成步驟示意圖如第一圖所示(g為接枝之意)。單官能基(Mono-functional)聚己內酯(PCL，分子量2.7 kDa)之製備，首先利用Sn(Oct)₂作為催化劑使ε-己內酯開環，再以1-十二烷醇作為起始劑合成。單官能基PCL(1.08×10^-3莫耳)溶於8 mL DMSO並加入H₁₂MDI(0.97×10^-3莫耳)。接著依序加入Sn(Oct)₂ 3.3 mg以及溶於1 mL DMSO的DABCO 6.5 mg。於60℃反應20小時。TBA-HA鹽以等化學當量的TBA氫氧化物水溶液與透明質酸(HA)溶液混合3小時製備而成，再經以旋轉蒸發器以及 真空冷凍乾燥法進一步乾燥。TBA-HA鹽(4.84×10^-4莫耳)溶於100 mL的DMSO，並加入前述含有PCL的反應混合物中，接著加入含有5.9 mg Sn(Oct)₂的DMSO 1 mL以及11.8 mg DABCO。以60℃反應24小時。將HA-TBA-g-PCL共聚物移至透析膜中密封兩端並以DMSO透析1天，然後以去離子水透析2天。水完全蒸發乾燥並將粗產物進一步以二氯甲烷純化，去除自由PCL-OH部分。剩餘物以去離子水溶解，並將該溶液經由離子交換樹脂洗提，以將季銨離子替換為鈉離子。溶液於真空下以旋轉蒸發儀濃縮並冷凍乾燥(lyophilized)得到HA-g-PCL乾燥粉末。

HA-g-PCL微胞之特徵

HA-g-PCL微胞的¹H NMR光譜如第二A圖所示。HA的醯胺-CH₃(amide-CH₃)峰值定義為δ=1.9，且PCL的末端-CH₃定義為δ=0.76。在HA-g-PCL共聚物上的PCL接枝率，係基於¹H NMR光譜中HA末端醯胺-CH₃峰值與PCL末端-CH₃峰值相對強度比率，約為6~8%。HA-g-PCL的紅外線光譜如第二B圖所示。於1638 cm^-1有一吸收峰值，係為HA的C=O羧基醯胺I基團(C=O carboxyl amide I group)。另一位於1727 cm^-1之峰值為PCL的酯鍵。共聚物中錫含量經由電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)測定為約5 ppm。水分散液之臨界微胞濃度(Critical Micelle Concentration，簡稱CMC)測定為4μg/mL(如第二C圖所示)。TEM影像顯示微胞為直徑約為70±30 nm之球體(第二D圖)。微胞的流體力學直徑約為186 nm，表面電位約 為-50 mV。HA-g-PCL微胞之表面電位顯示其可穩定分散於水溶液中。HA-g-PCL微胞之分散液的pH值約為7(中性)。在這些條件之下，微胞可持續其穩定性達1個月(第二E圖)。微胞之穩定性在酸性環境中會下降，特別是pH值小於3的環境中(第二F圖)。

在量測粒徑時，不同的量測方法可能得到的結果不盡相同，例如一微胞利用靜態雷射(multiangle static light scattering)量測出來的Rg為22 nm，因此旋轉直徑為44 nm，而同一微胞利用動態雷射(dynamic light scattering)測出來的直徑卻是186 nm，其二者之間的差異可能是因為二者對水合半徑之定義不同造成。

HA-g-PCL微胞之細胞毒性

利用鼠L929皮膚纖維母細胞於細胞培養研究。細胞培養於添加10%胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)、1%青黴素-鏈黴素-兩性黴素B(penicillin-streptomycin-amphotericin B)、以及1.5 g/L碳酸氫鈉之低葡萄糖Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)，培養於37℃、潮濕、5% CO₂的環境中。暴露於HA-g-PCL微胞之細胞的存活率以MTT法評估，其中MTT為3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-2,5-二苯基溴化物(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)。細胞以5×10⁴個細胞/孔之密度植入24孔盤(於1mL培養基中)並培養至貼盤。24小時後，細胞以1 mL含有不同濃度(0~2000 μg/mL)HA-g-PCL之培養基處理。控制 組係僅以培養基處理。經過24小時的處理後，MTT溶液加入每一孔中，培養4小時。以DMSO溶解紫色結晶，並檢驗550 nm之波長的吸光度。

第三圖顯示L929細胞與HA-g-PCL微胞共同培養24小時後的形態及存活率。於微胞存在下，細胞保持與對照組相似之形態且微胞濃度最高可達2000 μg/mL。微胞濃度於1500 μg/mL以下時，微胞對細胞存活率影響不明顯。然而，在微胞濃度為2000 μg/mL時，細胞存活率降至約85%(如第三B圖所示)。基於這些數據，微胞於濃度低於1500 μg/mL時不具細胞毒性。這些濃度比本發明用於包裹FGF1的微胞濃度(即100 μg/mL)高得多。

實施例二 以EDC接枝或物理方法負載FGF1至HA-g-PCL微胞上 (一)EDC化學接枝法

利用交聯劑EDC製成三種不同濃度的水溶液(0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、以及0.5 mg/mL)，並分別將1 mL EDC水溶液與1mg HA-g-PCL粉末混合並超音波震盪半小時，以活化HA-g-PCL之羧基。震盪後隨即於4℃以14000 rpm離心15 min，去除上清液並加入1 mL FGF1溶液(100 μg/mL)以分散微胞並完成接枝反應。FGF1微胞生成並將EDC濃度不同的各組命名為EDC-L(EDC濃度為0.05 mg/mL)、EDC-M(EDC濃度為0.1 mg/mL)、以及EDC-H(EDC濃度為0.5 mg/mL)。

(二)習知物理方法

另以三種習知物理方法：超音波震盪法(sonication)、冷凍真空乾燥法(lyophilization)或靜電噴霧法(electrospraying)負載FGF1至微胞上，以作為對照組：

1.超音波震盪法：1 mg的HA-g-PCL及FGF1(100 μg/1 mL)以超音波震盪30秒，然後放置於4℃的環境中隔夜以形成負載FGF1之微胞。

2.冷凍真空乾燥法：FGF1溶液(100 μg/去離子水0.1 mL)滴入1 mg HA-g-PCL粉末中，將該混合物用超音波震盪並隨即置於冷凍乾燥機(FDU-1200,Eyela,Tokyo,Japan)。冷凍乾燥的粉末進一步以1 mL去離子水溶解以形成微胞。

3.靜電噴霧法：如超音波震盪法的步驟製作溶液，再利用電壓20kV自針尖以200 μL/min的速率靜電噴霧出，且噴嘴距收集處10公分。

微胞自含有非關聯(non-associated)FGF1之水溶液中於4℃以14000 rpm離心15分鐘後，計算負載率。上清液中FGF1的數量以蛋白質定量分析(Bradford assay)評估。在蛋白質定量分析中，孔孟欣亮藍G-250(Coomassie Brilliant Blue G-250)染劑(Bio-Rad,Richmond,VA,USA)用於鍵結上清液中的蛋白質並進一步經由微量盤式光譜儀測量於波長595 nm之吸光度，結果如表一及表二所示。負載率以下式計算：負載率=[(總FGF1-上清液FGF1)/總FGF1]×100%。

表一 經由EDC化學接枝方法製備之負載FGF1微胞

前述各種方法所製造之負載FGF1微胞的粒徑、表面電位、蛋白質定量分析(Bradford assay)評估負載率如表一及表二所示。經由EDC接枝製備之負載FGF1微胞的粒徑、表面電位、以及負載率之數值隨EDC濃度而改變。其表面電位於-39.6~-43.1mV之間，但因量測儀器不同，量測出來的表面電位數值會些許不同，可能相差10mV左右，故本案經由EDC接枝製備之負載FGF1微胞的表面電位於-29~-54mV皆有可能。當利用較高濃度的EDC時(例如0.5 mg/mL，EDC-H組)，FGF1微胞之表面電位稍微增加。同時地，該些微胞更加緊實(即粒徑更小)。EDC之濃度越高，FGF1之負載率係顯著提升。EDC-L、EDC-M、以及EDC-H組之FGF1負載率約為61%、87%、以及92%。

另外，將總FGF1/mg HA-g-PCL之1.5 μg重複負載率實驗，其中上清液FGF1以酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析。人類FGF1免疫分析套組(Antigenix,Huntington,NY,USA)用於檢測上清液中的蛋白質於波長450 nm的吸光度。以超音波震盪法、冷凍真空乾燥法以及靜電噴霧法製備之FGF1微 胞的負載率以ELISA量測之結果，分別約為32%、48%、以及30%；而本發明之EDC-M為85%，遠高於以物理方式包裹FGF1之包覆率，且EDC接枝製備之負載FGF1微胞的負載率皆為90 μg/mg微胞以上，而EDC-M微胞之FGF1最大負載量可達175 μg/mg微胞以上。

體外FGF1釋放曲線

短期釋放實驗中，在1 mL去離子水中使用100μg的FGF1負載至1 mg HA-g-PCL上。經由前述不同EDC濃度分為EDC-L、EDC-M、EDC-H、以及超音波震盪法、冷凍真空乾燥法、以及靜電噴霧法製成之負載FGF1微胞作為對照組。自由懸浮於溶液中的FGF1經由離心自水介質(aqueous medium)中分離出來。負載FGF1之微胞再分散於1 mL去離子水，保持在37℃。適當的時間將1 mL上清液去除，再添加1 mL的新鮮去離子水。每一時間點懸浮於上清液之FGF1量皆以蛋白質定量法(Bradford assay)測定。

以物理方式(超音波震盪法、冷凍真空乾燥法、以及靜電噴霧法)包裹FGF1的微胞於體外累積釋放之濃度曲線如第四A圖所示。以物理方式包裹FGF1的微胞在前20小時內有40~60%的突釋量。在48小時後，微胞的FGF1釋放量非常少，幾乎偵測不到。以EDC接枝而負載FGF1的微胞，在前20小時內只有5~40%的突釋量，而本實施例之釋放曲線如第四B圖所示，約為20~35%的突釋量，與以物理方式包裹FGF1的微胞比較，其釋放曲線相 對緩和許多，突釋現象大為降低。

另外，隨著EDC用量從低(0.05 mg/mL)到中等(0.1 mg/mL)，FGF1的釋放率下降。進一步提高EDC用量從中等(0.1 mg/mL)到高(0.5 mg/mL)，不影響FGF1的釋放率。由ELISA的檢測結果，在EDC-M組的FGF1初始量約每毫克HA-g-PCL有1270 ng。FGF1在微胞上的負載量另以西方墨點法確認(如第四C圖所示)。基於條帶強度，與0.1 mg/mL的EDC接枝而負載FGF1之微胞的負載量(EDC-M組)約1174 ng，高於無EDC接枝而負載FGF1之微胞的組別(w/o EDC，表未添加EDC之組別，此為超音波震盪法組)。

考慮負載率以及降低突釋的發生，選擇EDC-M組做長期釋放測試。長期釋放實驗中，在1 mL去離子水中使用1.5 μg的FGF1負載至1 mg HA-g-PCL上。分為EDC-M組以及超音波震盪法製成之負載FGF1微胞作為對照組。負載與釋放量以ELISA測定。微胞上初始負載與21天後仍存留的FGF1量亦以西方墨點法驗證每組的沉澱物，微胞上的FGF1量係基於條帶強度(band intensities)與FGF1標準量決定。

第五A圖顯示自EDC-M長期釋放實驗的ELISA結果。FGF1從EDC-M中以相同速率釋放(斜率為每小時0.0159%)。以物理方式包裹FGF1的微胞在5天後釋放量非常少(w/o EDC，超音波震盪法組)。西方墨點實驗結果第五B圖顯示EDC-M組的FGF1的分子量與FGF1控制組相較，在21天後並未改變。於21天後，以物理方式包 裹的微胞中，FGF1留在微胞中的實際量約為450 ng(每毫克HA-g-PCL)，而EDC-M微胞約762 ng(每毫克HA-g-PCL)。

微胞負載的FGF1之生物活性

為驗證FGF1的生物活性，以MTT分析測定負載FGF1微胞對於纖維母細胞之活性。L929纖維母細胞以2×10⁴個細胞/孔的密度植入一般培養基的24孔盤24小時。然後將培養基換成含有不同濃度的FGF1(0~10 ng/mL)或前述釋放實驗第0天(對照組)、或21天後的負載FGF1微胞約20 μg。所有組皆經四重複實驗。考慮負載率以及降低突釋的發生，選擇EDC-M組做生物活性測試。

為驗證21天後FGF1在微胞上的活性，測試負載FGF1的微胞對於纖維母細胞增殖的作用，係與標準濃度於0~10 ng的天然FGF1比較，如第六圖所示。EDC-M微胞在21天的釋放後持續刺激纖維母細胞增殖。相對於控制組，經由EDC-M微胞處理21天後的細胞存活率為120%。經由物理方包裹FGF1的微胞在培養21天時的細胞存活率僅稍微增加(約106%)。

實施例三 負載FGF1之微胞的動物傷口癒合效果

所有動物實驗過程皆符合倫理規範並經國立台灣大學實驗動物照護與使用委員會核准。利用200-250 g的Sprague Dawley(SD)大鼠(購自樂斯科生物科技股份有限 公司)，利用氧和異氟醚的混合氣體麻醉，再於大鼠背部剪下1.5×1.5 cm²的皮膚形成傷口。評估傷口上負載FGF1之微胞的效果。傷口區域覆蓋護創貼布(band-aids；空白組)、或護創貼布添加下列其中一種成份：1.5 ng FGF1分散於50 μL PBS中(天然FGF1)、50 μg HA-g-PCL分散於50 μL PBS中(裸微胞)、以及負載FGF1微胞(50 μg微胞及1.5 ng FGF1，EDC-M)分散於50 μL PBS中，每兩天更換一次。

每2天記錄傷口的收縮情形。第8天以CO₂將大鼠犧牲，取下後背的皮膚組織。取下的組織隨即固定於4%甲醛一天再以PBS沖洗，並在脫水後以石蠟包埋。將埋入的樣本切薄片並以蘇木素與伊紅(hematoxylin-eosin，H&E)染色，置於正立式顯微鏡(upright microscope)下觀察。傷口部分新生區域每平方公釐之剖面血管、皮脂腺面積比例以ImageJ軟體計算。

如第七A圖所示，以負載FGF1的微胞(EDC-M)處理之傷口保持濕潤，且傷口面積隨時間縮小。以負載FGF1的微胞(EDC-M)處理之組於8天後有最佳的恢復率82%。以天然FGF1與裸微胞處理的組恢復率相似，約為76%。利用護創貼布(band-aid)處理的組有68%的傷口恢復率。經過8天的傷口組織學顯示FGF1、裸微胞、以及負載FGF1的微胞會比不處理的控制組引起更多的微血管生成，如第七B圖所示。負載FGF1的微胞平均微血管生成的數量高於不處理的控制組的3倍，如第七C圖所示。負載FGF1的微胞比其他三組在再生皮膚周圍有更多皮脂腺組織。負載FGF1的微胞組於每毫米平方面積之平均皮脂 腺數量比護創貼布或裸微胞組高於50%，如第七E圖所示。

負載FGF1傷口處理之動物實驗，利用Tegaderm作為比較

利用200-250 g的Sprague Dawley(SD)大鼠，利用氧和異氟醚的混合麻醉，再剪下1.5×1.5 cm²的皮膚形成傷口。一膠膜(簡稱Gel)以4 mL的明膠-聚(γ-谷氨酸)(gelatin-poly(γ-glutamic acid)(γ-PGA))溶液(10% type A bloom 300 gelatin and 1% γ-PGA)以及400 μL之1.7% EDC(根據Biorheology 2007；44：17-28製備而成)塗於傷口區域。為準備含有FGF1之膠體，自由的FGF1(400 μg)或負載FGF1之微胞(EDC-M組，2 mg HA-g-PCL上公稱(nominal)有400μg FGF1，或實際負載約350μg FGF1)，在加入400μl EDC前，加入明膠-γ-PGA溶液(4mL)。將膠體膜裁剪成1.5×1.5 cm²的大小以覆蓋傷口，如第八A圖所示。每片膠體膜的乾燥重量為6.5 mg，含有自由的FGF1 15 μg(簡稱“Gel+FGF1”)或是負載FGF1之微胞88.1 μg(即75 μg HA-g-PCL微胞以及13.1 μg FGF1；簡稱“Gel+FGF1-micelles”)。另以Tegaderm作為對照組，其為3M公司所出品的一種防水透氣敷料。

添加負載FGF1微胞之傷口敷料的作用如第八圖所示。所有的傷口以相似的比率收縮，如第八B、C圖所示。第8天的傷口組織學顯示FGF1與負載FGF1之微胞(於膠膜中)的組，皆會引起更多微血管形成，如第八D、E圖所示。另一方面，Tegaderm或未含FGF1之膠膜顯示較 少的血管新生。負載FGF1微胞與天然FGF1(埋於膠中)於傷口癒合的作用相似。此結果顯示負載FGF1微胞可結合傷口敷料增進傷口癒合的作用。

通常，在偏中性環境之下，微胞與生長因子之電性皆為負電，彼此吸引力弱；雖然微胞的形成可能使少部份生長因子吸附或產生糾結，但在無特定鍵結結構下，能包覆的效率低落，而如本案之對照組利用直接混合包覆，其效率也甚差。另外，一般對於處理生長因子的方式皆會儘可能不使用交聯劑，除了在製作過程會增加洗去交聯劑等步驟外，更重要的是因交聯劑會造成生長因子變性、喪失活性而檢測不到生長因子。

因此，本發明經由上述實施例，提出新穎的HA-g-PCL微胞，可用於有效負載高量的生長因子。經由與EDC接枝反應負載FGF1至微胞上擁有高負載率(>85%)以及比其他方式製成之負載FGF1微胞有較不明顯的突釋現象。體外實驗中，以EDC接枝方式負載之FGF1持續自微胞中釋放，甚至在21天後仍持續釋放。收集釋放21天後的負載FGF1之HA-g-PCL微胞，體外實驗發現HA-g-PCL微胞上之FGF1仍具有刺激纖維母細胞增殖的能力。微胞中的FGF1分子量逾21天釋放實驗後未改變，顯示HA-g-PCL微胞應會保護FGF1避免水解。裸微胞與負載FGF1微胞在大鼠皮膚傷口模型中皆有促進傷口收縮的作用。

Claims (20)

1. 一種具有高生長因子負載率之高分子微胞，包含一親水性主鏈、一疏水性鏈段、以及一交聯劑，其中該生長因子係經由交聯劑接枝於該高分子微胞，且該交聯劑係為碳二醯胺(carbodiimide)；其中，該親水性主鏈、該疏水性鏈段之任一者係具有-COOH之基團。
2. 如申請專利範圍第1項所述之高分子微胞，其中該親水性主鏈係為透明質酸(hyaluronic acid,HA)、聚乙二醇(methoxy polyethylene glycol,mPEG)、或聚麩胺酸(poly-γ-glutamic acid,PGA)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之高分子微胞，其中該疏水性主鏈係為聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚戊內酯(polyvalerolactone,PVL)、聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚丁內酯(polybutyro-lactone,PBL)、聚甘醇酸(polyglycolide)或聚丙內酯(polypropiolactone,PPL)。
4. 如申請專利範圍第1項所述之高分子微胞，其中該碳二醯胺係為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二醯胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)。
5. 如申請專利範圍第1項所述之高分子微胞，其中該生長 因子之負載率係為50~99%。
6. 如申請專利範圍第1項所述之高分子微胞，其中該高分子微胞之一生長因子負載量為90μg/mg微胞以上。
7. 如申請專利範圍第1項所述之高分子微胞，其中該高分子微胞在前20小時內只有5~40%的生長因子突釋量。
8. 如申請專利範圍第1項所述之高分子微胞，其中該生長因子為纖維母細胞生長因子1(Fibroblast growth factor 1，簡稱FGF1)。
9. 如申請專利範圍第8項所述之高分子微胞，其中該FGF1之高負載率係為61%~92%。
10. 如申請專利範圍第8項所述之高分子微胞，其中該高分子微胞之一FGF1最大負載量為175μg/mg微胞以上。
11. 如申請專利範圍第8項所述之高分子微胞，其中該高分子微胞在前20小時內只有20~35%的生長因子突釋量。
12. 一種如申請專利範圍第1項所述之高分子微胞的製造方法，包含以下步驟：a.以一親水性單體為主鏈與一疏水性單體聚合，形成具有一親水性主鏈及一疏水性鏈段之共聚物；其中該親水性主鏈、該疏水性鏈段之任一者係具有-COOH^-之基團； b.於一交聯劑存在的狀況下活化該共聚物之羧基，其中該交聯劑係為碳二醯胺；以及c.將一生長因子經由該交聯劑交聯於該共聚物上，形成一負載生長因子之高分子微胞。
13. 如申請專利範圍第12項所述之製造方法，其中該交聯劑與該生長因子之比值在0.5到5之間。
14. 如申請專利範圍第12項所述之製造方法，其中該高分子微胞的表面電位為-29mV~-60mV。
15. 如申請專利範圍第12項所述之製造方法，其中該高分子微胞的直徑為30~220nm。
16. 如申請專利範圍第12項所述之製造方法，其中該高分子微胞pH值約為7的環境，可持續其穩定性達1個月。
17. 如申請專利範圍第12項所述之製造方法，其中該碳二醯胺係為1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二醯胺。
18. 一種高分子微胞用於負載生長因子之用途，其中該高分子微胞係如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之高分子微胞。
19. 一種促進傷口癒合之敷料，係包含如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之高分子微胞與一基質。
20. 如申請專利範圍第19項所述之促進傷口癒合之敷料，其中該基質為棉布或膠體。