TWI558421B - 幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途 - Google Patents
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Description
本發明係有關於一種幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，尤其係指一種人類Whaiton’s Jelly間葉幹細胞之條件培養基，其可用以清除自由基及增加皮膚細胞於氧化壓力下之存活率，用以改善使用者皮膚狀況而達到抗氧化及抗老化之功效。
按，由於臭氧層破洞，使我們面對的紫外線更加強烈，紫外線係令皮膚氧化的首要原因之一，會造成細胞迅速氧化並老化。再者，隨著年齡增長，人體修復自由基的能力也隨之下降，若未能及時補充抗氧化物以保養或修護皮膚，細胞損傷情形就會越來越明顯。為了維持或恢復青春無瑕的外表，不僅女性重視美容保養，連男性也都趨之若鶩，因此，人體使用之美容保養用品已成為廠商爭相開發之重點。
目前，經研究證實具有抗氧化劑效果的天然物質例如維生素C(vitamin C，L-ascorbic acid)、維他命E、β胡蘿蔔素、麴酸(kojic acid)和超氧化物歧化酶(super dismutase)等等可以防止多數自由基的損害；雖然這些物質對於抗氧化的確有顯著的功效，卻有其使用上之限制，例如維生素C在陽
光下或接觸空氣易被氧化，並且不耐熱，當濃度超過5%以上會對皮膚產生刺激性及紅腫；麴酸非常的不穩定容易被氧化而變色及引起皮膚過敏，且長期過量使用麴酸產品會導致細胞毒性且發生病變；此外，有些抗氧化劑之作用係為直接破壞細胞，易造成細胞的毒殺性。因此，如何研發出一個安全且有效的抗氧化成分，便成為相關領域發明人所思及之方向。
幹細胞研究近年來在國際間蔚為風潮，其主要可分為胚胎、成體幹細胞兩大類，其中間葉幹細胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)係屬於成體幹細胞，具有強大的分化能力，除了可分化為人體骨骼等源自中胚層的細胞組織，還可以分化成內胚層的肝臟、胰臟等內臟細胞，以及源自外胚層的神經細胞等。間葉幹細胞雖廣泛存在於成人體內，可以由骨髓及多種器官中分離出來，但由於各部位所含的間葉幹細胞數目不多，而且成人體內的間葉幹細胞，會隨著年齡的增加而逐漸減少，故如何取得足量之間葉幹細胞勢必非常重要。骨髓間葉幹細胞主要係來自成人的骨髓，然，侵入性的取得方式會造成捐獻者有疼痛不舒服的感覺；而臍帶中含有數量豐富、年輕的間葉幹細胞，且取得方便、具較強分化潛力，因此可作為間葉幹細胞的重要來源。另，亦有研究指出，間葉幹細胞條件培養基(mesenchymal stem cell-conditioned medium，MSC-CM)可增加背根神經節細胞(dorsal root ganglia cells)暴露於過氧化氫(hydrogen peroxide)氧化壓力下之細胞存活率(PLoS One.8(5)：e62807,2013)，而具有神經保護(neuroprotective)特性。
今，發明人即是鑑於上述現有之抗氧化產品於實際實施使用時仍具有多處缺失，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識
及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明主要目的為提供一種幹幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，其係指一種人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞之條件培養基，可用以清除自由基及增加皮膚細胞於氧化壓力下之存活率，藉此，若將此幹細胞條件培養基運用於化妝材料組成物中，可用以改善使用者皮膚狀況而達到抗氧化及抗老化之功效。
為了達到上述實施目的，本發明一種幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，此條件培養基係先將幹細胞生長於含有完全培養基的細胞培養皿中，完全培養基係包含有α-MEM、胎牛血清以及人類鹼性成纖維細胞生長因子，並且條件培養基係於幹細胞繼代培養於基礎培養基(basal medium)之後收集而得，基礎培養基僅包含有α-MEM以及人類鹼性成纖維細胞生長因子(不含胎牛血清)。條件培養基係於幹細胞繼代培養至少三代後收集而得。
本發明亦提供一種幹細胞條件培養基於減少氧化作用之用途，其係施予一重量百分濃度為10%以上之條件培養基於皮膚，以清除自由基及增加皮膚細胞於氧化壓力下之存活率。
於本發明之一實施例中，幹細胞係為間葉幹細胞，最佳係為來自人類臍帶之Wharton’s Jelly間葉幹細胞。
於本發明之一實施例中，完全培養基若以100%的組成成份總重量百分比計算，係包含有10-20%的胎牛血清、2-6ng/ml的人類鹼性成纖維細胞生長因子，以及剩餘重量百分比的Minimum Essential Medium Alpha(α-MEM)；其中，幹細胞最佳係繼代培養三代。
於本發明之一實施例中，基礎培養基若以100%的組成成份總重量百分比計算，係包含有2-6ng/ml的人類鹼性成纖維細胞生長因子，以及剩餘重量百分比的α-MEM；其中，幹細胞最佳係繼代培養三代。
第一圖：幹細胞條件培養基可有效地清除過氧化氫。
第二圖-A：幹細胞條件培養基於ABTS自由基清除能力之示意圖。
第二圖-B：幹細胞條件培養基具有清除ABTS自由基的效果。
第三圖-A：幹細胞條件培養基於DPPH自由基清除能力之示意圖。
第三圖-B：幹細胞條件培養基具有清除DPPH自由基的效果。
第四圖：氧化壓力下之細胞存活率示意圖。
第五圖：幹細胞條件培養基增加細胞於氧化壓力下的存活率。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明一種幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，其其中條件培養基係先將幹細胞生長於含有完全培養基(complete growth medium)的細胞培養皿中；完全培養基以100%的組成成份總重量百分比計算，可包含有10-20%(最佳係為20%)的胎牛血
清(Fetal bovine serum)、2-6ng/ml(最佳係為4ng/ml)的人類鹼性成纖維細胞生長因子(human-basic fibroblast growth factor)，以及剩餘重量百分比的α-MEM；再者，條件培養基係於上述幹細胞繼代培養於基礎培養基(basal medium)至少三代後收集而得，最佳係為培養三代；基礎培養基以100%的組成成份總重量百分比計算，可包含有2-6ng/ml(最佳係為4ng/ml)的人類鹼性成纖維細胞生長因子，以及剩餘重量百分比的α-MEM，但不包含胎牛血清。幹細胞係間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)，最佳可為人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞。
再者，本發明一種幹細胞條件培養基於減少氧化作用之用途，其係施予一重量百分濃度為10%以上之條件培養基於皮膚，以清除自由基及增加皮膚細胞於氧化壓力下之存活率，其中條件培養基係先將幹細胞生長於含有完全培養基的細胞培養皿中，完全培養基係包含有α-MEM、胎牛血清以及人類鹼性成纖維細胞生長因子，再者，條件培養基係於上述幹細胞繼代培養於基礎培養基至少三代後收集而得，最佳係為培養三代；基礎培養基以100%的組成成份總重量百分比計算，可包含有2-6ng/ml(最佳係為4ng/ml)的人類鹼性成纖維細胞生長因子，以及剩餘重量百分比的α-MEM。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
實驗一：幹細胞條件培養基於過氧化氫清除能力之影響
〈細胞培養〉
首先，將人類包皮纖維母細胞(Hs68：BCRC 603800)培養於
含有完全培養基(complete growth medium)的細胞培養皿中(BD Falcon/BD biosciences)，完全培養基含有DMEM(Gibco)外加10% Fetal bovine serum(FBS)(Gibco)；而人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞(WJMSC：BCRC H-WJ001)培養於內含有完全培養基(complete growth medium)的細胞培養皿中(BD Falcon/BD biosciences)，此完全培養基含有α-MEM(Gibco)，外加20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco)以及4ng/ml人類鹼性成纖維細胞生長因子(human-basic fibroblast growth factor，bFGF)(Peprotech)。將上述兩種細胞培養於溫度37℃且內含有5%二氧化碳的細胞培養箱中。細胞培養3天之後進行繼代培養(subculture)。
繼代培養的步驟如下：先將原本的細胞培養基去除，之後利用phosphate buffered saline(PBS)(Roche)潤濕貼附的細胞，移除上清液再利用0.05% Trypsin-EDTA(Life Technologies)於細胞培養箱作用5分鐘，將細胞從培養皿上面移下來。之後加入培養基將細胞打散，以1,200rpm的轉速離心3分鐘，移除上清液，剩餘的細胞團塊(pellet)用培養基打散，並培養在5% CO2、37℃的細胞培養箱內。繼代培養至第3代後，開始收集細胞條件培養基。
〈細胞條件培養基〉
人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞以每5 X 104cells/cm2的密度種於細胞培養皿中，細胞培養1天之後利用PBS處理貼附的細胞三次，加入基礎培養基(只含α-MEM以及4ng/ml人類鹼性成纖維細胞生長因子)，經過48小時之後，用50ml離心管收集培養基，以2,000rpm的轉速離心10分鐘，將上清液用0.22μm濾杯(BD Falcon/BD biosciences)過濾，即可以得到間葉
幹細胞條件培養基。此培養基可放於-20℃冰箱中保存。
〈過氧化氫(H2O2)清除測試〉
本實驗係依據1989年Ruch等人所制訂出來的方法進行分析。過氧化氫在230nm會有最大吸光。因此，可以利用吸光值檢測過氧化氫清除率。利用phosphate-buffered saline(PBS,pH7.4)將過氧化氫配製成2mg/L，將1ml樣品(100%條件培養基、50%條件培養基以及控制組200mg/L的維他命C(L-ascorbic acid，L-AA))加入0.6ml的過氧化氫，經過10分鐘的反應，最後利用多功能微量盤分析儀230nm的波長進行分析。過氧化氫清除率(scavenging effects)(%)=[(控制組於230nm之吸光值(A230 of control)-樣品於230nm之吸光值(A230 of sample))/控制組於230nm之吸光值(A230 of control)]×100%。此實驗至少進行三重複，且圖中的標示為平均值(mean)±平均值標準誤差(SEM)。*** P<0.005。
實驗二：幹細胞條件培養基於ABTS自由基清除能力之影響
〈ABTS自由基清除測試〉
本實驗係利用抗氧化檢測試劑套組(Antioxidant assay kit，Cayman)進行抗氧化能力的分析，依據套組的方法取10μl樣品(1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM維他命C或是100%、50%、25%、12.5%、6.25%幹細胞條件培養基)混合10μl變性肌紅素(metmyoglobin)、150μl色素原(chromogen)以及40μl過氧化氫。因為幹細胞條件培養基(CM)為一個複合成分，所以無法得知抗氧化成分的濃度，故以百分比做為單位。經過室溫反應5分鐘之後，利用多功能微量盤分析儀750nm的波長進行分析。
實驗三：幹細胞條件培養基於DPPH自由基清除能力之影響
〈DPPH自由基清除測試〉
將1ml的樣品(100%、50%、10%和1%幹細胞條件培養基)與1ml新鮮配製且溶於95%乙醇(EOH)的0.1mM DPPH相互混和。經過室溫反應30分鐘之後，利用多功能微量盤分析儀517nm的波長進行分析。此實驗至少進行三重複，且圖中的標示為平均值(mean)±平均值標準誤差(SEM)。*P<0.05；*** P<0.005。
實驗四：幹細胞條件培養基於氧化壓力下之細胞存活率測定
〈細胞抗氧化測試〉
纖維母細胞以每2 X 104cells/cm2的密度種於細胞培養皿中培養一天，將原本的培養基去除，再加入基礎培養基(basal medium：只含有DMEM)、幹細胞完全培養基加上不同濃度的H2O2(0、0.0125以及0.025mM)一起培養，經過24小時之後，利用光學顯微鏡(Leica)拍照。先將原本的細胞培養基去除，之後利用PBS(Roche)潤濕貼附的細胞，移除上清液之後再利用0.05% Trypsin-EDTA(Life Technologies)於細胞培養箱作用5分鐘，將細胞從培養皿上面移下來。之後加入培養基將細胞打散，以1,200rpm的轉速離心3分鐘，移除上清液，剩餘的細胞團塊(pellet)加入0.2ml PBS將其打散，之後再加入0.2ml trypan blue(Invitrogen)(PBS：trypan blue=1：1)，進行染色。利用trypan blue exclusion test配合血球計數器可以計算出細胞數目。每一組樣品皆會進行三重複。
結果
結果一：幹細胞條件培養基可有效地清除過氧化氫
請參閱第一圖，經過student t-test分析得知，200mg/L的維他
命C(L-AA)處理之後可以清除88.18%±1.06%的過氧化氫；幹細胞條件培養基(CM)處理後可以清除61.69%±1.88%的過氧化氫，50%幹細胞條件培養基處理後可以清除27.77%±1.32%的過氧化氫。本實驗之數據係以無菌水加上過氧化氫處理定義為100%，此實驗至少進行三重複，且圖中的標示為平均值(mean)±平均值標準誤差(SEM)。*** P<0.005。由此結果可知，本發明之幹細胞條件培養基可有效地清除過氧化氫。
結果二：幹細胞條件培養基具有清除ABTS自由基的效果
請參閱第二圖-A，為幹細胞條件培養基於ABTS自由基清除能力之示意圖，將不同濃度的維他命C(L-AA)與幹細胞條件培養基(CM)與適量的ABTS以及氧化劑反應。由於ABTS在適量的氧化劑催化時，在OD 750nm有最大的吸光值，可藉由吸光值的高低推測出樣品抗氧化的能力。結果請參閱第二圖-B，經過統計分析得知，維他命C(L-AA)的半抑制濃度(IC50)為0.8059mM，相當於119.45%幹細胞條件培養基的抗氧化能力。此實驗證明幹細胞條件培養基具有清除ABTS自由基的能力，雖然沒有L-AA那麼強，但是依舊具有良好的抗氧化能力。
結果三：幹細胞條件培養基具有清除DPPH自由基的效果
請參閱第三圖-A，為幹細胞條件培養基於DPPH自由基清除能力之示意圖，將不同濃度的幹細胞條件培養基(CM)與適量的DPPH反應。利用DPPH在OD 517nm有最大的吸光值，當抗氧化劑將DPPH還原時會改變其吸光值。因此，藉由吸光值的高低可以推測出樣品抗氧化的能力。結果請參閱第三圖-B，經過統計分析得知，10%以上的幹細胞條件培養基(CM)混合就具有DPPH抑制能力(inhibition)。由此結果可知，幹細胞條件培養基可
用以有效地清除DPPH自由基，具有抗氧化的能力。
結果四：幹細胞條件培養基可增加細胞於氧化壓力下的存活率
請參閱第四圖，為氧化壓力下之細胞存活率示意圖，纖維母細胞在經過一般培養基(DMEM)(control)、DMEM+0.025mM H2O2、DMEM+0.0125mM H2O2、幹細胞條件培養基(CM)、CM+0.025mM H2O2以及CM+0.0125mM H2O2細胞不同處理條件下，幹細胞條件培養基可以明顯增加細胞的存活率。請再參閱第五圖，經過student t-test分析得知，在一般條件培養基(DMEM)加上0.025或是0.0125mM的H2O2皆會造成纖維母細胞全數死亡；幹細胞條件培養基加上0.025mM的H2O2處理後仍有28.57%±8.25%的細胞可以存活，幹細胞條件培養基加上0.0125mM的H2O2處理後仍有85.71%±8.25%的細胞可以存活。圖中的數據係以一般培養基(DMEM)處理過後的細胞存活率定義為100%，此實驗至少進行三重複，且圖中的標示為平均值(mean)±平均值標準誤差(SEM)。*P<0.05；**P<0.001；***P<0.005。由此可知，幹細胞條件培養基可顯著地增加細胞於氧化壓力下的存活率，故具有良好的抗細胞氧化能力。
綜上所述，人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞(WJMSC)可分泌許多生長因子到培養基中，形成一幹細胞條件培養基(WJMSC-CM)；此幹細胞條件培養基培養可藉由清除H2O2、清除ABTS、清除DPPH自由基及增加皮膚細胞於氧化壓力下之存活率，達到抗氧化的功效。藉此，本發明所述之幹細胞條件培養基可進一步運用、添加於化妝材料組成物中，用以改善使用者皮膚狀況而達到減緩皮膚老化之功效。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：
1.本發明之間葉幹細胞條件培養基，其內含有大量的生長因子(growth factors)可藉由清除自由基及增加細胞抗氧化能力，明顯減緩氧化作用達到抗肌膚老化之功效，進而改善皮膚細胞受損等問題。
2.本發明所使用之臍帶Wharton’s jelly間葉幹細胞係取自嬰兒出生後不需要的臍帶，相較於取自骨髓，不會造成疼痛感，亦可避免倫理道德的問題；並且，幹細胞於臍帶的含量較高，因此取得較容易。
3.骨髓間葉幹細胞屬於較晚期的細胞，可以分化的細胞種類比較少，並且容易受到捐獻者年齡的影響；而臍帶Wharton’s jelly間葉幹細胞屬於較早期的族群，可以分化的細胞種類比較多，其條件培養基具有較佳之蛋白因子，較能有效的減緩氧化作用、修護肌膚，提升肌膚凍齡效果。
綜上所述，本發明之幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
Claims (5)
- 一種幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，其中該條件培養基係先將幹細胞生長於含有完全培養基(complete growth medium)的細胞培養皿中培養3天之後進行繼代培養，該幹細胞條件培養基係於該幹細胞繼代培養於基礎培養基(basal medium)，並經離心及過濾之後收集而得，該完全培養基係包含有α-MEM、胎牛血清(Fetal bovine serum)以及人類鹼性成纖維細胞生長因子(human-basic fibroblast growth factor)，該基礎培養基係包含有α-MEM以及人類鹼性成纖維細胞生長因子；其中該幹細胞係為人類Wharton’s Jelly間葉幹細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，其中該幹細胞係繼代培養至少三代。
- 如申請專利範圍第2項所述之幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，其中該幹細胞係繼代培養三代。
- 如申請專利範圍第1項所述之幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，其中該完全培養基以100%的組成成份總重量百分比計算，係包含有10-20%的胎牛血清、2-6ng/ml的人類鹼性成纖維細胞生長因子，以及剩餘重量百分比的α-MEM，且該基礎培養基以100%的組成成份總重量百分比計算，係包含有2-6ng/ml的人類鹼性成纖維細胞生長因子以及剩餘重量百分比的α-MEM。
- 如申請專利範圍第1項所述之幹細胞條件培養基用於製備抑制氧化作用達到皮膚抗老化之組成物的用途，其中該條件培養基係進一步作為抗氧化或抗老化之化妝材料組成物。
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