[go: up one dir, main page]

TWI542685B - 供使用高甘油濃度製備1,3－丙二醇用之微生物 - Google Patents

供使用高甘油濃度製備1,3－丙二醇用之微生物 Download PDF

Info

Publication number
TWI542685B
TWI542685B TW100140808A TW100140808A TWI542685B TW I542685 B TWI542685 B TW I542685B TW 100140808 A TW100140808 A TW 100140808A TW 100140808 A TW100140808 A TW 100140808A TW I542685 B TWI542685 B TW I542685B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
genbank
atcc824
locus
replacing
encodes
Prior art date
Application number
TW100140808A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201226563A (en
Inventor
瑞勒 裴基
Original Assignee
代謝探索公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 代謝探索公司 filed Critical 代謝探索公司
Publication of TW201226563A publication Critical patent/TW201226563A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI542685B publication Critical patent/TWI542685B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/32—Processes using, or culture media containing, lower alkanols, i.e. C1 to C6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

供使用高甘油濃度製備1,3-丙二醇用之微生物
本發明涉及一種供製備1,3-丙二醇用之經修飾的新穎微生物。此微生物適於具有高甘油含量且特別是具有高濃度工業甘油的培養基中生長，並製備1,3-丙二醇用。本發明亦涉及該經改造微生物的培養條件以及製備1,3-丙二醇之方法。最後，本發明涉及由該經修飾微生物製備的1,3-丙二醇及其應用。
1,3-丙二醇(PDO)，亦被稱為三亞甲基二醇(trimethylene glycol)或丙二醇(propylene glycol)，是最為熟知的發酵產物之一。1,3-丙二醇最早是在1881年由August Freund在含有巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)的甘油發酵培養物中被鑑定出來。PDO是甘油發酵的一種典型產物，且已在其他有機物質的厭氧轉化中被發現到。僅有非常少數的生物(它們全為細菌)能夠形成PDO。這些生物包括桿菌屬(肺炎桿菌；K. pneumoniae)、腸桿菌(聚集腸桿菌；E. agglomerans)與檸檬酸桿菌(佛氏檸檬酸桿菌；C. freunddi)的腸內細菌(enterobacteria)、乳酸桿菌(短毛乳酸桿菌(L. brevis)和布氏乳酸桿菌(L. buchneri))及梭菌的丁酸梭菌(C. butyricum)與巴氏梭菌(C. pasteurianum)群。
作為雙功能性有機化合物的PDO可用於許多合成反應中，特別是作為用於聚縮合反應的單體以生產聚酯、聚醚、聚胺甲酸酯，以及特別是聚對苯二甲酸丙二酯(trimethylene terephtalate，PTT)。這些結構及反應性特點在化妝品、紡織品(衣服、纖維或地板材料)或塑膠(汽車工業及包裝或塗層)中有各不相同的應用。
PDO可藉由不同的化學路徑製備，但是它們會產生含有極富污染性物質的廢物流，且製造成本甚高。因此，以化學的方式製備PDO可能無法與石化工業上使用的二醇(例如1,2-乙二醇、1,2-丙二醇與1,4-丁二醇)相競爭。為增加競爭力，杜邦(DuPont)在1995年針對葡萄糖生物轉化成PDO開始一項研究計畫。儘管此製程對環境是友善的，但它仍具有下列缺點：i)使用非常昂貴的輔因子，維生素B12，以及ii)因為製備菌株的不穩定性而成為一個不連續的製程。
基於生質柴油產業所產生的大量甘油具有可利用性，一種具有更高碳產率的連續、無維生素B12的製程正是有益的。
在本技藝中，已知可以自甘油製備PDO，甘油是製備生質柴油的一種非所需副產物，其含有大約80-85%的甘油混合著鹽類和水。
丁酸梭菌在先前被描述為能夠在批式與兩階段連續發酵中生長並自工業甘油製備PDO(Papanikolaou et al.,2000)。但是，在最高甘油濃度下，在稀釋率0.02 h-1下所得到的最大PDO滴定量為48.1 g.L-1，表示生產率為0.9 g.L-1.h-1。在進料培養基中以最高甘油濃度90 g.L-1並在有酵母萃取物(一種含有機氮的昂貴化合物，習於該技藝者已知有助於增加細菌生質生產)存在下進行培養。
WO2006/128381申請案揭示甘油供利用製備PDO的天然生物(諸如肺炎桿菌、丁酸梭菌與巴氏梭菌)進行批式及進料批式培養來製備PDO的用途。此外，WO2006/128381中所使用的培養基亦含有酵母萃取物。如該專利申請案中所述，所達到的最高生產率是介於0.8至1.1 g.l-1.h-1。
在Gonzalez-Pajuelo et al.,2005中已描述經修飾成含有來自丁酸梭菌(被稱為丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)DG1 pSPD5)之維生素B12獨立型甘油脫水酶以及PDO-去氫酶之丙酮丁醇梭菌的表現。此菌株起初在含有純甘油最高達120 g.l-1的進料培養基中生長並製備PDO。另外，對於含有純或工業甘油最高達60 g.l-1的進料培養基的分析並未指出有任何差異。這些結果是在有酵母萃取物存在下所得。再者，未在工業甘油濃度高於60 g.l-1的情況下進行過測試。當野生型丁酸梭菌與經修飾的微生物「丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5」相比較時，觀察到行為整體上是相似的。
在PCT/EP2010/056078專利申請案中，發明人已描述一種使丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5的菌株(諸如Gonzalez-Pajuelo et al.(2005)中所述)適應於生長在具有高濃度工業甘油且沒有酵母萃取物的培養基中的方法。所得到的菌株能夠在含有工業甘油高達120 g.l-1的培養基中以PDO至高為53.5 g.L-1的滴定量，至高為0.53 g.g-1的產量且至高為2.86 g.L-1.h-1的產率來製備PDO。
在本專利申請案中，發明人強調經適應的微生物之遺傳修飾供製備PDO用，該微生物是諸如在有高濃度工業甘油存在下適應後所得。
本發明涉及一種用於製備1,3-丙二醇(PDO)的丙酮丁醇梭菌族群，其中該族群含有至少一種丙酮丁醇梭菌種的菌株，該丙酮丁醇梭菌種的菌株具有選自於表1中所鑑別之突變的突變，其中該等突變的相對百分比是選自於下列基因家族：
特別地，本發明之族群包含至少一種選自於由下列所構成之群組中的丙酮丁醇梭菌菌株：
-　菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c01，以登錄編號I-4378寄存於CNCM；
-　菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c05，以登錄編號I-4379寄存於CNCM；
-　菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c07，以登錄編號I-4380寄存於CNCM。
CNCM表示位於巴黎巴斯德研究所的「國家微生物菌種保存中心」。
在本發明的一個特定具體例中，該族群包含經進一步突變而具有下列點突變中之至少一者的上述菌株：
-　在丙酮丁醇梭菌基因體的位置198989之基因座CA_C0175處以T取代C，該基因座編碼一種被預測是糖磷酸異構酶，是一種真核生物葡萄糖激酶調節子(醣類代謝)的同源物
-　在丙酮丁醇梭菌基因體的位置1444099之基因座CA_C1300處以A取代G，該基因座編碼RNA聚合酶σ因子RPOD(轉錄及轉譯調節)
-　在丙酮丁醇梭菌基因體的位置2787387之基因座CA_C2670處以T取代C，該基因座編碼Glu-tRNAGln醯胺轉移酶次單位A(轉錄及轉譯調節)
-　在丙酮丁醇梭菌基因體的位置3512658之基因座CA_C3339處以T取代C，該基因座編碼ABC轉運蛋白的ATP酶組分(兩個ATP酶結構域)
-　在丙酮丁醇梭菌基因體的位置1752341之基因座CA_C1610處以T取代C，該基因座編碼支鏈胺基酸通透酶(轉運蛋白)。
本發明亦涉及一種製備1,3-丙二醇的方法，其包含在含有甘油作為唯一碳源的培養基中培養本發明之用以製備1,3-丙二醇(POD)的丙酮丁醇梭菌族群，並由該培養基回收所製備之1,3-丙二醇。
用以製備1,3-丙二醇(POD)之丙酮丁醇梭菌族群
用以製備1,3-丙二醇(POD)的丙酮丁醇梭菌族群表示一或多個針對自作為唯一碳源之甘油製備1,3-丙二醇的經遺傳修飾丙酮丁醇梭菌菌株。此等菌株在該技藝中為已知的，並且特別是揭示於WO200104324和WO2008052595申請案中。依據本發明之族群可以是數個菌株的組合(其中大多數包含如本發明之突變)以及一個單一菌株，且特別是分別以登錄編號I-4378、I-4379、I-4380寄存於CNCM的菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c01、DG1 pSPD5 PD0001VE05c05或DG1 pSPD5 PD0001VE05c07，或是菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c08。
突變是在菌株基因體中的核苷酸改變，更特別地是當與母代菌株DG1 pSPD5 PD0001VT相比較時所鑑定出的SNP(「單一核苷酸多型性」)。該菌株揭示於WO200104324中並且是源自於菌株ATCC824，菌株ATCC824的基因體序列已被公開(Nlling et al.,2001)。
突變可能發生在編碼序列或非編碼序列中。這些突變可能是同義的(其中未修飾對應胺基酸)或非同義的(對應胺基酸被改變)。同義突變對於轉譯蛋白質的功能不具任何影響力，但若突變序列位在調節因子的結合位點時，可能對於對應基因或甚至其他基因的調節具影響力。非同義突變對於轉譯蛋白質的功能以及調節具有影響力，端視突變序列的特徵而定。
用以製備1,3-丙二醇的丙酮丁醇梭菌族群較佳地包含彼等寄存菌株中的一者，該菌株含有額外修飾，下列修飾中的至少一者：
-　在丙酮丁醇梭菌基因體的位置198989之基因座CA_C0175處以T取代C，該基因座編碼一種被預測是糖磷酸異構酶，是一種真核生物葡萄糖激酶調節子(醣類代謝)的同源物
-　在丙酮丁醇梭菌基因體的位置1444099之基因座CA_C1300處以A取代G，該基因座編碼RNA聚合酶σ因子RPOD(轉錄及轉譯調節)
-　在丙酮丁醇梭菌基因體的位置2787387之基因座CA_C2670處以T取代C，該基因座編碼Glu-tRNAGln醯胺轉移酶次單位A(轉錄及轉譯調節)
-　在丙酮丁醇梭菌基因體的位置3512658之基因座CA_C3339處以T取代C，該基因座編碼ABC轉運蛋白的ATP酶組分(兩個ATP酶結構域)
-　在丙酮丁醇梭菌基因體的位置1752341之基因座CA_C1610處以T取代C，該基因座編碼支鏈胺基酸通透酶(轉運蛋白)。
其較佳地包含該等突變的任一組合，該組合含有此等突變之一、二、三、四或五者。
本發明之菌株族群能夠在含有甘油高達120 g.L-1且特別是工業甘油的培養基中生長。
本發明之菌株族群可在如WO2008040387申請案中所揭示的梭菌中使用突變誘發及/或基因置換的標準技術而獲得，該申請案的內容併入本文中做為參考資料。
習於本技藝者可由WO200104324和WO2008052595申請案中所揭示的菌株之一以及使用分別以登錄編號I-4378、I-4379、I-4380寄存於CNCM的c01、c05或c07開始並且引入額外的突變。
在一個較佳具體例中，本發明之族群包含菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c08，其突變鑑別於表1中。習於該技藝者瞭解如何由分別以登錄編號I-4378、I-4379、I-4380寄存於CNCM的菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c01、DG1 pSPD5 PD0001VE05c05或DG1 pSPD5 PD0001VE05c07之一者開始，並使用標準基因置換與重組技術將突變引入梭菌菌株而產生類似於菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c08的菌株。
含甘油的培養基
「適當的培養基」或「培養基」意指最適於梭菌菌株或族群生長或製備二醇的培養基。發酵製程通常是在具有適於梭菌種使用且含甘油之具有已知限定組成物的合成(特別是無機)培養基的反應器中進行。
術語「合成培養基」表示一種生物可生長於其上之含有化學限定組成物的培養基。在本發明的培養基中，甘油為有利的單一碳源。
術語「甘油(glycerine)」與「甘油(glycerol)」同義，且交替使用於本發明中供意指相同分子。
在一個特定的具體例中，甘油以含有至少50%的甘油，較佳地至少85%的甘油之甘油組合物形式被添加至培養基。
有利地，本發明培養基中所使用的甘油為工業甘油。「工業甘油」表示自工業製程所得而基本上未經純化的甘油產物。工業甘油也可以表示為「粗製甘油」。工業甘油含有超過70%的甘油(較佳地超過80%)、水以及諸如礦物鹽與脂肪酸的雜質。工業甘油中的最大甘油含量一般為90%，更一般為約85%。
工業甘油所獲自的工業製程本身是製造方法，其中脂質與油(特別是植物來源的脂質與油)被加工成諸如清潔劑或潤滑劑的工業產物。在此等製造方法中，工業甘油被認為是副產物。
在一個特定具體例中，工業甘油是自製備生質柴油而來的副產物，且包含自製備生質柴油而來的已知甘油雜質，含有約80至85%甘油與鹽類、水和一些其他有機化合物，諸如脂肪酸。自生質柴油製備而來的工業甘油未進一步進行純化步驟。
較佳地，該培養基含有高濃度甘油。
術語「高甘油含量」或「高濃度甘油」表示培養基中的甘油超過90 g.L-1。在較佳具體例中，濃度是介於90至200 g.L-1甘油，更特別是介於90至140 g/L甘油，較佳約120 g.L-1甘油。
較佳地，培養基為不添加有機氮的合成培養基。
此等培養基揭示於本技藝中，特別是在2010年5月5日提申的PCT/EP2010/056078以及在2010年10月5日提申的PCT/EP2010/064825，其內容併入本文中作為參考資料。
培養微生物
在本發明方法中，製備有利地是在批式、進料批式或連續製程中完成。以工業規模培養微生物來製備1,3-丙二醇在該技藝中是已知的，特別是揭示於2010年5月5日提申的PCT/EP2010/056078以及在2010年10月5日提申的PCT/EP2010/064825，其內容併入本文中作為參考資料。
1,3-丙二醇回收
由發酵培養基中回收及最後純化1,3-丙二醇的方法對於習於該技藝者來說是已知的。1,3-丙二醇可以藉由蒸餾分離。在大多數具體例中，1,3-丙二醇是由具有諸如乙酸之副產物的發酵培養基中蒸餾，且接而進一步藉由已知方法來純化。
一個特定的純化方法揭示於WO2009/068110以及WO 2010/037843中，其內容併入本文中作為參考資料。
實施例
實施例1自經演化的族群分離殖株
自族群菌株丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5 PD0001VE05之生長燒瓶培養物起在瓊脂平板上進行殖株分離。用於燒瓶培養的合成培養基每公升去離子水含有：甘油，30 g；KH2PO4，0.5 g；K2HPO4，0.5g；MgSO4,7H2O，0.2 g；CoCl2 6H2O，0.01g；乙酸，99.8%，2.2 ml；NH4Cl，1.65 g；MOPS，23.03 g；生物素，0.16 mg；p-胺基苯甲酸，32 mg；FeSO4,7H2O，0.028 g；刃天青，1 mg以及半胱胺酸，0.5 g。以6N之NH4OH將培養基的pH調整為6.5。
針對在瓊脂平板上的分離使用不同培養基：合成瓊脂培養基(與上述相同)具有商業甘油或粗製甘油以及CGM(梭菌生長培養基(Clostridial Growth Medium))瓊脂培養基，其每公升去離子水含有：商業甘油或粗製甘油，30 g；酵母萃取物，5 g；KH2PO4，0.75；K2HPO4,0.75 g；MgSO4,7H2O，0.4 g；天冬醯胺酸，2 g；(NH4)2SO4，2 g；NaCl，1 g；MnSO4,H2O，10 mg；FeSO4,7H2O，10 mg；MOPS，23.03 g；刃天青，1 mg以及半胱胺酸，15 g。以3N之NH4OH將培養基的pH調整至6.6。
以4種不同方式將細胞自燒瓶培養物(表2)平板培養至下列平板上：
-　在具有商業甘油之合成培養基的瓊脂平板上；
-　在具有粗製甘油之合成培養基的瓊脂平板上；
-　在具有商業甘油之豐富培養基(rich medium)的瓊脂平板上；
-　在具有粗製甘油之豐富培養基的瓊脂平板上。
在瓊脂平板上接連進行3次繼代培養之後所分離出來的殖株被認為是純殖株。繼而將純殖株轉移至含有商業甘油或粗製甘油的液體豐富培養基中(表2)。之後，以甘油20%將生長液體培養物保存於-80℃下直到進一步的特徵鑑定。
接著，以下列方式對殖株進行特徵鑑定：
-　測量保存後的成活力：評估細胞在合成培養基上的生長率；
-　評估生長與代謝：在培養期間測量OD620nm以及在合成培養基上的PDO/甘油產率；
-　遺傳評估：PCR分析以確認菌株的基因型；
-　連續培養以比對分離殖株與族群中的其他殖株的表現(實施例2)；
-　萃取gDNA供進行殖株的序列分析用(實施例3)。
表2：用於自族群中分離4個殖株的合成瓊脂培養
實施例2殖株c08在具有高濃度粗製甘油的連續培養中的表現
細菌菌株：
丙酮丁醇梭菌菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05(菌株經1/pSOL1處理，2/以具有dhaB1、dhaB2及dhaT基因(亦即1,3-丙二醇操縱子)的質體pSPD5轉形，和3/在高濃度粗製甘油中進行演化)的分離殖株。此分離步驟描述於實施例1中。
培養基：
用於梭菌批式培養的合成培養基每公升去離子水含有：甘油，30 g；KH2PO4，0.5 g；K2HPO4，0.5 g；MgSO4,7H2O，0.2 g；CoCl2 6H2O，0.01 g；H2SO4，0.1 ml；NH4Cl，1.5 g；生物素，0.16 mg；p-胺基苯甲酸，32 mg及FeSO4,7H2O，0.028 g。以NH4OH 3N將培養基的pH調整至6.3。購自於Sigma的商業甘油(純度99.5%)用於批式培養。用於連續培養的進料培養基每公升自來水含有：粗製甘油，105 g；KH2PO4，0.5 g；K2HPO4，0.5 g；MgSO4,7H2O，0.2 g；CoCl2 6H2O，0.026 g；NH4Cl，1.5 g；生物素，0.16 mg；p-胺基苯甲酸，32 mg；FeSO4,7H2O，0.04 g；消泡劑，0.05 ml；ZnSO4,7H2O，8 mg；CuCl2,2H2O，4 mg；MnSO4,H2O，40 mg；H3BO3，2 mg；Na2MoO4,2H2O，0.8 mg。在本例中未調整培養基pH。來自於生質柴油之轉酯反應的粗製甘油是由Novance(Venette,France)提供並具有以下純度：甘油84.8%(w/w)。
實驗架構：
在具有工作體積為2000 ml的5l生物反應器Tryton(Pierre Guerin,France)中進行連續培養。藉由自動調節培養物高度將培養物體積恆定維持於2000 ml。以200 RPM攪拌培養物，溫度設定於35℃並藉由自動添加NH4OH 5.5N而將pH恆定維持在6.5。在整個培養期間控制POR多寡(mV)。為創造出厭氧條件，在60℃下以無菌無O2的氮氣沖洗容器中的無菌培養基1小時並再次沖洗直到達至35℃(在2小時期間沖洗)。生物反應器氣體出口是受到五倍子酚的氧氣所保護(Vasconcelos et al,1994)。在殺菌之後，亦以無菌無O2的氮氣沖洗進料培養基直到達至室溫並維持在200 mbar的氮氣下以防止O2進入。
批式及連續培養方法：
用於評估的方法已描述於PCT/EP2010/056078專利申請案(實施例2)中。
指數生長期結束時於100 ml燒瓶的合成培養基(與上述批式培養物相同，但添加乙酸2.2 g.L-1及MOPS 23.03 g.L-1)中生長的培養物用作為接種源(5% v/v)。
首先以批式的方式使培養物生長。在指數生長前期時，吾人進行商業甘油的調節(pulse)：關於調節合成培養基(pulse synthetic medium)(與用於批式培養所述者相同)，在3小時期間以靜態流速添加105 g.L-1粗製甘油(亦即，添加18 g.L-1甘油)。接著，以批式的方式持續生長並且在指數生長期結束前以0.025 h-1的稀釋率開始連續進料。進料培養基含有105 g.L-1粗製甘油。在生物反應器接種8-10天後以及在3次滯留時間後，稀釋率按照不同階段由0.025 h-1增加至0.060 h-1：在48小時內增加0.01 h-1單位-24小時不改變-在48小時內增加0.01 h-1單位-24小時不改變-在48小時內增加0.015 h-1單位。之後，待培養穩定後製備1,3-丙二醇並且消耗甘油(第1圖)(使用下述的HPLC程序)。特別地，吾人等到殘餘甘油濃度儘可能為低之時。
c08殖株的總體成果呈現於表3中，且與在相同條件下的族群成果以及諸如Gonzalez-Pajuelo et al.(2005)中所述的菌株丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5 PD0001VT的成果相比較。
分析程序：
在620 nm下以濁度測量細胞濃度並且以直接測得的細胞乾重予以校正。甘油、1,3-丙二醇、乙醇、丁醇、乙酸與丁酸濃度是藉由HPLC分析來測定。在Biorad Aminex HPX-87H管柱上進行分離並且藉由折射率完成偵測。操作條件如下：移動相，硫酸0.5 mM；流速，0.5 ml/min；溫度，25℃。
表3：丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5族群PD0001VE05(4個連續培養的平均數據)、殖株c08 PD0001VE05c08的成果。進料培養基含有105 g.L-1粗製甘油，稀釋率為0.060 h-1和0.025 h-1。數值對應於在至少3次滯留時間後以0.060 h-1的稀釋率所分析的樣品平均值。
這些結果顯示，丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5的適應族群能夠生長在較高濃度的工業甘油中且因此使用工業甘油，比Gonzalez-Pajuelo et al.(2005)的未適應菌株丙酮丁醇梭菌DG1 pSPD5 PD0001VT(其無法生長於缺乏酵母萃取物的培養基中)表現出更好的滴定量與生產率。
實施例3
基因體DNA萃取
菌株PD0001VT、PD0001VE05、PD0001VE05c01、PD0001VE05c05、PD0001VE05c07以及PD0001VE05c08的基因體DNA是使用Qiagen Genomic kit 500G(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)進行萃取。簡言之，細胞分別在青黴素小瓶的豐富或合成甘油培養基(如實施例1與2中所述)中厭氧生長至指數晚期(A620 1.5至2.0)。整個細胞溶解過程均維持嚴格的厭氧條件。收集細胞並以SET緩衝液(25%蔗糖、0.05 M Tris-HCl、0.05 M EDTA)洗滌2次。將細胞丸懸浮於含44 μL RNA酶、30 mg/mL溶菌酶和100 μg/mL蛋白酶K的11 mL B1 kit緩衝液中。在37℃下培育混合物45分鐘、離心而上清液依據Qiagen DNA純化套組操作指南用於DNA萃取。接而將DNA懸浮於50 μL的10 mM Tris-HCl(pH8.0)中。
定序分析
天然DG1 pSPD5 PD0001VT菌株以及演化族群DG1 pSPD5 PD0001VE05的基因體是使用Roche GS FLX技術進行定序。定序計畫是由Eurofins Genomics MWG/Operon(ZA de Courtabeauf-9 Avenue de la Laponie,91978 Les Ulis Cedex)執行，針對各菌株使用1個長標記雙末端圖書館(Long-Tag paired end libraries)(8 Kb)、以不完全的GS FLX鈦序列化學(GS FLX Titanium series chemistry)(最大600 000讀數，最大180 000-300 000真實雙末端讀數)產生序列並組織片段重疊群(contig)。
自演化族群而來的分離殖株是使用NimbleGen(Roche NimbleGen Inc. 500 S. Rosa Rd. Madison WI 53719)發展出的比較基因體定序(CGS)方法來定序。CGS分析是以兩階段進行：在階段1中，基因體差異區是藉由比較雜交天然菌株與演化殖株的DNA而被鑑別。在階段2中，僅對經鑑別之基因體差異區進行定序而產生一組充分鑑別的單一核苷酸多型性(SNP)。
SNP分析
演化族群的生物資訊以及SNP分析是由Eurofins Genomics MWG/Operon執行。針對這個分析，將兩種菌株的讀值組分別使用軟體gsMapper(Roche 454,V2.3)與Genbank參考序列(Clostridium acetobutylicum ATCC 824 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE001437)相比對。提供3個SNP檔案，它們比較DG1 pSPD5 PD0001VT與ATCC824、DG1 pSPD5 PD0001VE05與ATCC824，以及DG1 pSPD5 PD0001VT與DG1 pSPD5 PD0001VE05。天然與演化菌株間獨特的SNP表示如下。依據家族群演繹(family group annotations)所用的KEGG資料庫，剔除低涵蓋範圍(<25)以及低變異株頻率(<85%)而產生160個分布在17個家族中的特有SNP。
分離殖株的SNP分析是由NimbleGen(Roche)執行。使用Genbank參考序列(Clostridium acetobutylicum ATCC 824 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE001437)提供SNP檔案，它們是比較天然DG1 pSPD5 PD0001VT與DG1 pSPD5 PD0001VE05c01、DG1 pSPD5 PD0001VE05c05、DG1 pSPD5 PD0001VE05c07或DG1 pSPD5 PD0001VE05c08。
序列結果呈現於表1中，其含有下列資訊：
RefStart　出現差異之參考序列內的起始位置
RefNuc　差異位置處的參考核苷酸序列
VarNuc　差異位置處的不同核苷酸序列
VarFreq　不同讀值相對於完全橫跨差異位置之全部讀值的百分比
類型　不論在演繹基因內或演繹基因間是否有發現SNP的列表。基因內的SNP被標示為編碼。基因間的SNP被標示為基因間
AA改變　依據是否會改變蛋白質的胺基酸序列而區別編碼SNP。S表示同義SNP(無胺基酸改變)。N表示非同義SNP(胺基酸改變)。FC(骨架改變)表示蛋白質轉譯時因為插入或刪除核苷酸所致的修飾。
ORIG_AA　就對應SNP位置與參考序列相關的胺基酸
SNP_AA　就對應SNP位置與測試序列相關的胺基酸
基因座標記　Genbank之對應基因的基因座標記
功能　Genbank中所述的基因功能
家族　KEGG之基因家族
表1：天然菌株與演化菌株之間的突變。首先在經適應的族群中鑑定出突變並接著在分離殖株中核對各突變的存在(最後4欄：Y為突變存在而N為突變不存在)
參考文獻
1.　Gonzlez-Pajuelo M,Meynial-Salles I,Mendes F,Andrade JC,Vasconcelos I,and Soucaille P. 2005. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrial production of 1,3-propanediol from glycerol. Metabolic Engineering 7: 329-336.
2.　Gonzlez-Pajuelo M,Meynial-Salles I,Mendes F,Soucaille P. and Vasconcelos I. 2006. Microbial conversion of a natural producer,Clostridium butyricum VPI 3266,and an engineered strain,Clostridium acetobutylicum DG(pSPD5). Applied and Environmental Microbiology,72: 96-101.
3.　Nlling J,Breton G,Omelchenko MV,Makarova KS,Zeng Q,Gibson R,Lee HM,Dubois J,Qiu D,Hitti J,Wolf YI,Tatusov RL,Sabathe F,Doucette-Stamm L,Soucaille P,Daly MJ,Bennett GN,Koonin EV,Smith DR. 2001. Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridium acetobutylicum. Journal of bacteriology 183(16):4823-4838
4.　Papanikolaou S,Ruiz-Sanchez P,Pariset B,Blanchard F and Fick M. 2000. High production of 1,3-propanediol from industrial glycerol by a newly isolated Clostridium butyricum strain. Journal of Biotechnology. 77: 191-208.
5.　Vasconcelos I,Girbal L,Soucaille P. 1994. Regulation of carbon and electron flow in Clostridium acetobutylicum grown in chemostat culture at neutral pH on mixtures of glucose and glycerol. Journal of bacteriology. 176(5): 1443-1450.
第1圖說明在自接種至高D=0.06 h-1起的連續培養期間，族群以及殖株c08的1,3-丙二醇製備及甘油消耗的演化。

Claims (8)

  1. 一種用於製備1,3-丙二醇(PDO)的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)菌株，其選自於由下列所構成之群組：a)菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c01，以登錄編號I-4378寄存於CNCM，其中該等菌株進一步包含下列核苷酸突變：-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置2231570之基因座CA_C2137處，刪除C，該基因座編碼陽離子轉運P-型ATP酶(轉運蛋白)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置27240之基因座CA_C0019處，以T取代C，該基因座編碼轉錄調節子(轉錄轉譯調節)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置670931之基因座CA_C0578處，以A取代G，該基因座編碼鈷胺素-依賴型甲硫胺酸合成酶I(胺基酸代謝)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置3478420之基因座CA_C3309處，以T取代C，該基因座編碼一預測膜蛋白(膜蛋白)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank： AE001437)的核苷酸位置3927304處，以G取代A，及-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置899104之基因座CA_C0776處，以G取代A，該基因座編碼NCAIR變位酶(核酸代謝)；或b)菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c05，以登錄編號I-4379寄存於CNCM，其中該等菌株進一步包含下列核苷酸突變：-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置2231570之基因座CA_C2137處，刪除C，該基因座編碼陽離子轉運P-型ATP酶(轉運蛋白)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置2307214之基因座CA_C2215處，以T取代C，該基因座編碼鞭毛切換蛋白F1iY(細胞運動)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置3174743之基因座CA_C3032處，以A取代G，該基因座編碼半乳糖變旋酶相關蛋白(醣類代謝)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置299266之基因座CA_C0267處，以A取代G，該基因座編碼L-乳 糖去氫酶(能量代謝)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置3242900之基因座CA_C3088處，以C取代G，該基因座編碼NtrC家族轉錄調節子(轉錄轉譯調節)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置2551103之基因座CA_C2434處，以A取代G，該基因座編碼具有HAMP結構域之膜相關組胺酸激酶(轉錄轉譯調節)，及-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置36341之基因座CA_C0025處，以G取代A，該基因座編碼三磷酸去氧胞苷去胺酶(核酸代謝)；或c)菌株DG1 pSPD5 PD0001VE05c07，以登錄編號I-4380寄存於CNCM，其中該等菌株進一步包含下列核苷酸突變：-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置2231570之基因座CA_C2137處，刪除C，該基因座編碼陽離子轉運P-型ATP酶(轉運蛋白)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置27240之基因座CA_C0019處，以T取代C，該基因座編碼轉錄 調節子(轉錄轉譯調節)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置3242900之基因座CA_C3088處，以C取代G，該基因座編碼NtrC家族轉錄調節子(轉錄轉譯調節)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置3478420之基因座CA_C3309處，以T取代C，該基因座編碼一預測膜蛋白(膜蛋白)，-在丙酮丁醇梭菌基因體(ATCC824,Genbank：AE001437)的核苷酸位置3927304處，以G取代A，及-在丙酮丁醇梭菌基因體的核苷酸位置899104之基因座CA_C0776處，以G取代A，該基因座編碼NCAIR變位酶(核酸代謝)。
  2. 一種用於製備1,3-丙二醇(PDO)的丙酮丁醇梭菌族群，其中該族群至少包含申請專利範圍第1項所定義之菌株。
  3. 一種製備1,3-丙二醇的方法，其包含在含有甘油作為唯一碳源而無添加有機氮的合成培養基中培養如申請專利範圍第1項所定義的菌株或申請專利範圍第2項所定義的族群，並且由該培養基回收所 製備之1,3-丙二醇。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中1,3-丙二醇經進一步純化。
  5. 如申請專利範圍第3或4項之方法，其中該培養基中的甘油濃度介於90至120g/L甘油。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該培養基中的甘油濃度約105g/L。
  7. 如申請專利範圍第3項之方法，其中甘油是以工業甘油提供。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中工業甘油是製備生質柴油的副產物。
TW100140808A 2010-11-10 2011-11-09 供使用高甘油濃度製備1,3－丙二醇用之微生物 TWI542685B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41216210P 2010-11-10 2010-11-10
EP10306234 2010-11-10

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201226563A TW201226563A (en) 2012-07-01
TWI542685B true TWI542685B (zh) 2016-07-21

Family

ID=43828229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100140808A TWI542685B (zh) 2010-11-10 2011-11-09 供使用高甘油濃度製備1,3－丙二醇用之微生物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20130177956A1 (zh)
EP (2) EP2638172A1 (zh)
JP (1) JP2013545461A (zh)
KR (1) KR20140005170A (zh)
CN (1) CN103298945A (zh)
AR (1) AR083799A1 (zh)
BR (1) BR112013011417A2 (zh)
CA (1) CA2814441A1 (zh)
TW (1) TWI542685B (zh)
WO (1) WO2012062832A1 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015035266A1 (en) * 2013-09-06 2015-03-12 The Curators Of The University Of Missouri Conversion of glycerol to 1,3-propanediol under haloalkaline conditions
BR112019000132A2 (pt) 2016-07-08 2019-04-16 Metabolic Explorer Sa método para a produção fermentativa de moléculas de interesse por microrganismos compreendendo genes que codificam sistema de fosfotransferase de açúcar
CN106190901B (zh) 2016-07-15 2020-06-26 上海交通大学 一种菌及其获取方法和应用
CN106978380A (zh) * 2016-12-14 2017-07-25 天津科技大学 一株高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌株及其构建方法
KR102620924B1 (ko) * 2017-02-20 2024-01-05 메타볼릭 익스플로러 글리세롤로부터의 1,3-프로판디올 생산을 위한 클로스트리디아를 포함하는 미생물 컨소시엄
EP3438270A1 (en) 2017-08-04 2019-02-06 Metabolic Explorer Microorganism and method for improved 1,3-propanediol production by fermentation on a culture medium with high glycerine content
US11293039B2 (en) 2017-10-02 2022-04-05 Metabolic Explorer Method for producing organic acid salts from fermentation broth
AR114547A1 (es) * 2018-08-10 2020-09-16 Metabolic Explorer Sa Microorganismos con producción mejorada de 1,3-propanodiol y ácido butírico
CN112358986B (zh) * 2020-11-09 2022-10-21 华南理工大学 一种丁酸梭菌及其在固定化发酵生产1，3-丙二醇的应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2796081B1 (fr) * 1999-07-09 2003-09-26 Agronomique Inst Nat Rech Procede de preparation du 1,3-propanediol par un micro-organisme recombinant en l'absence de coenzyme b12 ou de l'un de ses precurseurs
CN1327001C (zh) 2005-06-03 2007-07-18 清华大学 利用生物柴油副产物甘油生产1,3－丙二醇的方法
CN101500565A (zh) * 2006-06-29 2009-08-05 弗特克斯药品有限公司 毒蕈碱性受体的调节剂
MX2009003605A (es) 2006-10-03 2009-04-22 Metabolic Explorer Sa Procedimiento para integracion cromosomica y reemplazo de secuencia de adn en clostridia.
KR20090090319A (ko) 2006-10-31 2009-08-25 메타볼릭 익스플로러 높은 수율로 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 생물학적으로 생산하는 방법
EP2220018B1 (en) 2007-11-30 2012-07-04 Metabolic Explorer Method for purifying an alcohol from a fermentation broth
CN102238990B (zh) 2008-10-03 2014-07-23 代谢探索者公司 使用降膜、刮膜、薄膜或短程蒸发器从发酵液纯化醇的方法
EP2248904A1 (en) * 2009-05-05 2010-11-10 Metabolic Explorer Continuous culture for 1,3-propanediol production using high glycerine concentration

Also Published As

Publication number Publication date
CA2814441A1 (en) 2012-05-18
AR083799A1 (es) 2013-03-20
EP3012325A1 (en) 2016-04-27
US20130177956A1 (en) 2013-07-11
CN103298945A (zh) 2013-09-11
JP2013545461A (ja) 2013-12-26
TW201226563A (en) 2012-07-01
EP2638172A1 (en) 2013-09-18
WO2012062832A1 (en) 2012-05-18
BR112013011417A2 (pt) 2017-04-04
KR20140005170A (ko) 2014-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI542685B (zh) 供使用高甘油濃度製備1,3－丙二醇用之微生物
González-Pajuelo et al. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrial production of 1, 3-propanediol from glycerol
EP2248904A1 (en) Continuous culture for 1,3-propanediol production using high glycerine concentration
KR101005453B1 (ko) 신규 글리세롤 탈수 효소
CN102388141A (zh) 使用丙三醇氧化途径被阻断的重组菌株生产1,3-丙二醇的方法
US20160319308A1 (en) Recombinant microorganism having enhanced 1,3-propanediol producing ability and method for producing 1,3-propanediol using the same
US11814663B2 (en) Microorganisms with improved 1,3-propanediol and butyric acid production
EP3662073B1 (en) Microorganism and method for improved 1,3-propanediol production by fermentation on a culture medium with high glycerine content
CN102395671B (zh) 用于制造1，3-丙二醇的丙三醇氧化途径中阻隔的突变体
KR102620924B1 (ko) 글리세롤로부터의 1,3-프로판디올 생산을 위한 클로스트리디아를 포함하는 미생물 컨소시엄
CN104611383A (zh) 重组生物体3 - 羟基丙酸的制备方法