TWI434680B

TWI434680B - 二萜類化合物於治療攝護腺癌之用途

Info

Publication number: TWI434680B
Application number: TW097139775A
Authority: TW
Inventors: 蕭培文; 林楓閔; 王升陽
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2008-10-16
Publication date: 2014-04-21
Also published as: US8519007B2; US20100022632A1; TW201004614A

Description

二萜類化合物於治療攝護腺癌之用途

本發明係關於二萜類化合物及其醫藥上可接受的鹽於治療攝護腺癌的用途。

攝護腺的生長由雄性素所控制，男性年紀越大，發生攝護腺癌的機率愈高；醫學研究亦顯示高脂肪性食物會增加攝護腺癌的發生機率。隨著世界人口老化及脂肪攝取的增加，不論是西方國家或是台灣，攝護腺癌發生率均呈現逐年增加的趨勢(Jemal A, Siegel R, Ward E, Murray T, Xu J, Thun M.J. Cancer Statistics, 2007. CA Cancer J Clin 2007; 57(1): 43-46)。根據行政院衛生署的統計，攝護腺癌是民國95年男性癌症死亡原因的第七位(中華民國96年行政院衛生署衛生統計資料)。

已知雄性素係藉由與雄性素受體(AR)之結合促進攝護腺生長並提高攝護腺特異抗原(PSA)基因轉錄以展現其功能，故PSA已廣泛作為診斷及治療攝護腺癌之血清生物指標(Balk SP, Ko Y.J., Bubley G.J. "Biology of prostate-specific antigen." J Clin Oncol 2003; 21(2):383-391及Cleutjens KB, van der Korput HA, van Edkelen CC, van Rooij HC, Faber PW, Trapman J. "An androgen response element in a far upstream enhancer region is essential for high, androgen-regulated activity of the prostate-specific antigen promoter." Mol Endocrinol 1997; 11(2):148-161)，且已知雄性素與AR之結合與攝護腺的生長、分化及癌症形成間具有極密切的關係(Culig Z. "Role of the androgen receptor axis in prostate cancer." Urology 2003; 62(5 Suppl 1):21-26及Heinlein CA. and Chang C. "Androgen receptor in prostate cancer." Endocr Rev 2004; 25(2):276-308)。因此減少患者體內的雄性素濃度，或阻斷雄性素活化其受體等內分泌療法，在臨床上產生顯著的治療效果。然而，在使用內分泌療法消除大部分雄性素依賴癌細胞一段時間後，會產生對此種療法具抗性的癌細胞。比卡魯胺(Casodex)是一種抗雄性素的非皮質類固醇，它可以作為治療晚期攝護腺癌的輔助用藥，也在治療早期攝護腺癌方面具有優異的效果。然而，已有臨床研究指出，攝護腺癌患者對比卡魯胺逐漸產生抗性，故在臨床醫療上，比卡魯胺已不敷使用。

吾人先前的研究發現，分離自柳杉Cryptomeria japonica D. Don (Taxodiaceae)的二萜類化合物對於抗藥性攝護腺癌細胞(衍生自22Rv1之103E細胞)具有抑制雄性素受體活性之功效(Tu WC, Wang SY, Chien SC,等人"Diterpenes from Cryptomeria Japonica Inhibit Androgen Receptor Rranscriptional Activity in Prostate Cancer Cells" Planta Med 2007, 73(13):1407-1409)。但該研究之結果尚無法證明二萜類化合物確可抑制攝護腺癌細胞之生長或殺死癌細胞(Fracnis M. Sirotnak等人"Studies with CWR22 Xenografts in Nude Mice Suggest That ZD1839 May Have a

Role in the Treatment of Both Androgen-dependent and Androgen-independent Human Prostate Cancer" Clinical Cancer Research, December 2002, Vol.8, 3870-3876)。因此，針對二萜類化合物對於攝護腺癌細胞的生長所造成的影響尚須作進一步之研究。

本發明現發現，二萜類化合物可有效抑制攝護腺癌細胞生長並誘發細胞凋亡現象。

因此，本發明之一態樣係關於二萜類化合物於製備攝護腺癌藥物的用途。本發明所使用的二萜類化合物及其醫藥上可接受的鹽，其係視情形另與其他攝護腺癌治療劑併用以製成供治療攝護腺癌的藥物。

本發明之另一態樣係關於一種包含二萜類化合物，而可作為攝護腺癌治療劑的醫藥組合物。本發明作為攝護腺癌治療劑之醫藥組合物，其係視情形另包含其他習知攝護腺癌治療劑。本發明醫藥組合物係可與其他臨床上治療攝護腺癌之療法併用。

本發明之其他特徵及優點將因以下實施方式及申請專利範圍而顯而易見。

本文中所指二萜類化合物，係選自下列具有松香烷骨架之式(I)化合物：其中A、B及C環係選自飽和或不飽和之芳基、飽和或不飽和之雜環基及飽和或不飽和之雜芳基，其中R₁ 係選自H、OH、=O及OCH₃ ; R₂ 、R₄ 及R₅ 係分別獨立選自H、OH、OCH₃ 、=O、NH₂ 、SH、OR及COOR，其中R係C_1-20 烷基或醣基；R₃ 及R₆ 分別獨立選自H及OH；及式(II)化合物

本發明中芳基代表6員芳族環系統，該芳基之實例為苯基。

雜環基代表可包含1至3個選自氮、氧或硫原子之6員環。

雜芳基代表包含6個環原子之芳香單環系統，其中有一至3個環原子為氮、氧或硫。

C_1-20 烷基代表具有1至20個碳原子之直鏈或支鏈飽和脂族烴。較佳者，該烷基具有1至6個碳原子。更佳者，該烷基具有1至4個碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基及第三丁基。

較佳者，本發明化合物係選自下列化合物：化合物1：柳杉樹脂酚(cryptojaponol)

化合物2:6-羥基-5,6-去氫柳杉酚(HDHS)

化合物3：柳杉酚(sugiol)

化合物4：彌羅松酚(ferruginol)

化合物5：柏醇(cupresol)

化合物6:8-β-羥基松香-9(11),13-二烯-12-酮(8-β-hydroxyabieta-9(11),13-dien-12-one)

化合物7:5-表黃檜醇(5-epixanthoperol)

化合物8：具有半日花烷骨架(labdane skeleton)之異柏油酸(isocupressic acid)，即本發明之式(II)化合物

本發明二萜類化合物可以實質上純物質之型態存在，或以萃取物之型態存在，該萃取物較佳為柳杉Cryptomeria japonica D. Don (Taxodiaceae)、台灣杉Taiwania cryptomerioides Hayata、柏科植物Cupressaceae、紅檜Chamaecyparis formosensis Matsum、台灣扁柏Chamaecyparis obtuse var. formosana 或刺柏Juniperus formosana Hayata之萃取物，更佳為柳杉萃取物。

本發明二萜類化合物之分離及純化可由技藝中已知技術所完成。例如，本發明包含二萜類化合物之萃取物之製備可藉由萃取柳杉樹皮及樹葉所得。以70%乙醇在室溫下萃取柳杉樹皮及樹葉七天後，將萃取物抽真空後所得殘餘物，續以20%甲醇予以懸浮之，再以己烷、乙酸乙酯或正丁醇針對葉子及樹皮萃取物進行液相-液相分配。該萃取物可進一步藉由半製備高效液相層析(HPLC)進行純化。例如上述化合物1至7可由柳杉樹皮的己烷萃取物中純化而得，而化合物8(式(II)化合物)則可由柳杉樹葉的乙酸乙酯萃取物中純化而得。

本文中所指「醫藥上可接受的鹽」乙詞，意指保有本發明式(I)及式(II)化合物之生物效力及性質，且由適當之無毒有機或無機酸或有機或無機鹼形成之慣用酸加成鹽或鹼加成鹽。

本發明中所指二萜類化合物，較佳者係6-羥基-5,6-去氧柳杉酚(HDHS)，即化合物2。

本文中所指「治療攝護腺癌」乙詞，意指個體投予一或多種本文中所描述之化合物，該個體中之攝護腺癌細胞的生長被抑制，或藉由細胞凋亡作用之被誘發，導至攝護腺癌細胞死亡。

本文中所指「治療有效量」乙詞，意指當活性成分單獨施用，或與其他治療攝護腺癌之療法及/或治療劑共同施用時，能顯現治療效果之劑量。

本發明之醫藥組合物或藥物，可非經腸、經口、經鼻、經直腸、局部或經面頰投與活性組合物。本文中所用之術語"非經腸"係指皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內或病灶內以及任何合適之注入技術。

無菌可注射組合物可為於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之溶液或懸浮液，諸如於1,3-丁二醇中之溶液。可使用之可接受之載劑及溶劑為甘露醇、水、林格氏液(Ringer's solution)及等張氯化鈉溶液。另外，不揮發性油習知用作溶劑或懸浮介質(例如合成之單甘油酯或二甘油酯)。諸如油酸之脂肪酸及其甘油酯衍生物係適用於製備如天然醫藥學上可接受之油的可注射物，諸如橄欖油或蓖麻油，尤其聚氧乙基化型式。該等油溶液或懸浮液亦可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑、羧甲基纖維素或類似分散劑。出於調配之目的，亦可使用常用於製造醫藥學上可接受之固體、液體或其他劑型之其他常用界面活性劑(諸如土溫(Tween)或司盤(Span)或其他類似乳化劑)或生物可用性增強劑。

用於口服投藥之組合物可為任何經口可接受之劑型，包括膠囊、錠劑、乳液及水性懸浮液、分散液及溶液。在錠劑之情況下，常用載劑包括乳糖及玉米澱粉。亦通常添加諸如硬脂酸鎂之潤滑劑。對於膠囊形式之口服投藥，適用稀釋劑包括乳糖及乾玉米澱粉。當經口投與水性懸浮液或乳液時，可將活性成份懸浮或溶解於與乳化劑或懸浮劑組合之油相中。若需要，則添加某些甜味劑、調味劑或著色劑。

亦可以用於直腸投藥之栓劑形式投與活性組合物。醫藥組合物中之載劑就其與該組合物之活性成份相容(且較佳地，能夠使活性成份穩定)且對待治療之受檢者無害的方面而言必須為"可接受的"。一或多種增溶劑可用作用於傳遞活性化合物之醫藥賦形劑。其他載劑之實例包括膠狀氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素、月桂基硫酸鈉及D&C Yellow # 10。

本發明之醫藥組合物或藥物可與其他治療攝護腺癌之療法及/或治療劑共同施用，其中該治療攝護腺癌之療法包括，但不限定為手術療法、放射線療法、化學療法及雄性素去除；攝護腺癌之治療劑包括，但不限定為抗雄性素藥物，例如比卡魯胺、氟他胺(flutamide)及尼魯米特 (nilutamide)。

以下特定實例僅作為例示性解釋，且在任何情況下決不限制本揭示內容之其餘部分。在無進一步細述之情況下，咸信熟習此項技術者可基於本文中之說明最大程度地利用本發明。本文中所引用之所有公開案的全文以引用的方式併入本文中。

實施例1細胞試驗及動物試驗之前置處理 HDHS的製備

分離自柳杉樹皮的HDHS溶解在二甲基亞碸(DMSO, 100mM)，並以絕對酒精連續稀釋至1000倍。細胞試驗中，以含有0.1%(v/v)HDHS標準貯存溶液交換細胞培養基。動物試驗中，給予老鼠200μL HDHS(以PBS將2mM及10mM貯存液稀釋成10倍體積)，使得其劑量達0.5及2.5 mg/Kg。

化學藥劑及抗體的製備

商品化化學藥品及溶劑，包括5α-二氫睪固酮(DHT)、嘌呤黴素、碘化丙錠(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、比卡魯胺(CAX, TRC, Toronto, Canada)、RNase (Amresco, Solon, OH)、DMSO、乙醇、正己烷、甲醇及乙腈均屬分析級或高效能液相層析級試劑。AR (N-20)抗體、細胞週期蛋白cyclin D1 (C-20)抗體、細胞週期蛋白cyclin E (M-20)抗體、CDK2 (M-2)抗體、CDK4 (H-22)抗體、CDK6 (C-21)抗體、Rb (C-15)抗體、p27 (F-8)抗體、p21 (F-5)抗體、p53 (DO1)抗體、Bcl-xL抗體及β-肌動蛋白(actin)抗體係購自Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA)；半胱胺酸蛋白酶(caspase)-3抗體及半胱胺酸蛋白酶(caspase)-7抗體則分別購自NeoMarkers/Lab Vision Corporation (Fremont, CA)及Oncogene Research Products (Cambridge, MA)。PSA抗體係購自Chemicon (Temecula, CA)而PARP及P-Rb (Ser780)抗體則購自Cell Signaling (Beverly, MA)。

細胞培養

LNCaP、PC-3及22Rv1攝護腺癌細胞株係購自ATCC (Manassas, VA)；纖維母細胞NIH-3T3由徐麗芬博士(中央研究院，農業生物科技研究中心)所提供。

LNCaP及22Rv1細胞株培養在含有10%胎牛血清(FBS)之RPMI 1640(Invitrogen, Carlsbad, CA)培養基中；PC-3及NIH-3T3則培養在含有10%PBS之DMSO中。前述細胞株係在37℃、5%CO₂ /空氣的濕度培養箱中培養。

實施例2細胞活性試驗 細胞活性及菌落形成之分析

將1×10⁴ 個攝護腺癌細胞(AR-依賴型LNCaP、AR-反應型22Rv1及AR-非依賴型PC-3細胞株)或纖維母細胞株植入含有10%FBS之培養基的96-孔培養盤中。24小時後，將細胞於溶劑對照組或不同濃度之HDHS的培養基中培養48小時，再利用AlamarBlue染劑(Serotec, Oxford, UK)根據製造商操作手冊進行3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)細胞活性測試。

HDHS對於上述細胞株的長期效果可藉由細胞形成群落生長試驗知悉。群落形成之細胞生長測試係使每一種攝護腺癌細胞株稀疏地(2×10⁴ 個細胞)接種在24-孔培養盤中在實驗組與對照組的處理下培養12天後，再量化比較細胞形成群落生長能力。

圖1A顯示，當HDHS超過10 μM時即可有效降低LNCaP及22Rv1細胞株的細胞代謝活性，而此現象在PC-3及NIH-3T3細胞株上則並不明顯。

圖1B顯示，2.5-10 μM HDHS對於AR-依賴型LNCaP攝護腺癌細胞株所產生的抗-增生功效顯然優於AR-非依賴型PC-3攝護腺癌細胞株。HDHS對於22Rv1、LNCaP及PC-3細胞株之IC₅₀ (抗-增生效力)分別是6.3、7.5及13.2 μM。

HDHS對於不同細胞株所產生的不同功效亦反映於細胞型態上。如圖1C所示，經10至50 μM HDHS處理48小時的LNCaP及22Rv1細胞株，其細胞型態逐漸趨向圓形且表面生成水泡，顯示該等細胞已走向凋亡；然而，即使HDHS濃度於高達50 μM下，PC-3細胞僅顯示細胞趨圓現象。上述結果說明，HDHS對AR-依賴型癌細胞具有選擇性之毒性作用。

細胞週期之分析

本實施例係藉由觀察HDHS對攝護腺癌細胞週期分佈的影響，研究抑制癌細胞生長的機制。

將5×10⁵ 個細胞培養於含有10% FBS之培養基的6-孔培養盤中48小時，再以不同新鮮的培養基替換之，該等新鮮的培養基分別為溶劑對照組，以及2.5、5及10 μM HDHS試驗組，繼續培養48小時。細胞經胰蛋白酶處理、離心及去除RNA後以碘化丙錠將細胞染色，續以流式細胞技術加以分析。其結果如表一所示。

由表一結果可發現，HDHS對於攝護腺癌細胞的細胞週期進行具抑制作用。經10 μM HDHS處理48小時後，LNCaP及22Rv1細胞株均顯示sub-G₁ 細胞數明顯增加，而G₀ -G₁ 及S細胞數則減少。相較於對照組，PC-3細胞在G₀ -G₁ 細胞數增加，G₂ -M細胞數減少，而sub-G1細胞數未有顯著的變化。經HDHS處理24小時的細胞株也顯示類似於經48小時處理細胞株所表現的變化，唯其變化程度較小(數據未顯示)。

5 μM HDHS使得LNCaP及22Rv1細胞株在G₀ -G₁ 細胞數適度地增加，但10 μM HDHS濃度下則是急遽性的減少；同時，同樣的濃度下的sub-G₁ 細胞數卻是急速地增加。對AR-非依賴型PC-3細胞株而言，高劑量HDHS僅阻擋於G₀ /G₁ 細胞週期，卻不至增加sub-G₁ 細胞數。本實施例結果顯示，HDHS可誘發LNCaP及22Rv1細胞株之G₀ -G₁ 阻斷及細胞凋亡之現象；然而在PC-3細胞株中僅誘發G₀ -G₁ 阻斷。至於經10 μM CAX處理之三種細胞株，其結果顯示CAX不會改變該等細胞株之細胞週期。

由此可見，對於AR-依賴型攝護腺癌細胞株而言，其經由HDHS處理所表現的細胞週期變化程度與HDHS劑量係呈高度關連性。

實施例3 ELISA斷裂DNA測定法檢測細胞凋亡程度

由於根據上述測試已知HDHS會造成AR-依賴型攝護腺癌細胞sub-G1細胞數的增加，吾人茲進一步藉由定量攝護腺癌細胞中核小體之釋出以分析受測細胞的凋亡現象。本實施例中係以細胞死亡偵測ELISA Plus套組(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)定量細胞凋亡，該檢測方法係利用針對組織蛋白和DNA的抗體，特定偵測當凋亡現象發生時，釋放於細胞質內之核小體。實驗係將2×10⁴ 個細胞於96-孔培養盤中進行，在實驗組與對照組的處理下培養24小時後，並藉波長405 nm吸光讀值進行量化比較。

如圖2A所示，對LNCaP及22Rv1細胞而言，經以5-10 μM的HDHS處理24小時後，其顯著的誘導該等細胞的凋亡現象。雖然22Rv1細胞上AR表現係雄性素非依賴性，但其仍會對雄性素的刺激產生反應，故HDHS會引發22Rv1細胞的細胞凋亡。然而，22Rv1細胞經CAX以10 μM的濃度處理24小時，並未出現細胞凋亡的現象。

在細胞凋亡的過程中，多種半胱胺酸蛋白酶(caspase)會被活化且參與在多種重要細胞物質的水解與活化，例如DNA修復酶(PARP)的活化(Herceg Z, Wang ZQ "Failure of Poly (ADP-ribose)polymerase Cleavage by Caspases Leads to Induction of Necrosis and Enhanced Apoptosis" Mol Cell Biol 1999, 19(7):5124-5133及Okada H, Mak TW "Pathways of Apoptotic and Non-apoptotic Death in Tumour Cells" Nat Rev Cancer 2004, 4(8):592-603)。本實施例發現，於10 μM HDHS存在的條件下，PARP會被裂解，且圖2B亦顯示半胱胺酸蛋白酶(caspase)3及7呈現經由蛋白酶裂解後所產生的活化現象。此測試結果證實HDHS可刺激LNCaP細胞的凋亡現象，其與實施例2所載表一及前述有關圖2A所獲致的結論一致。然而，根據圖2B，即使以10 μM HDHS處理的PC-3細胞24小時，仍無法偵測到半胱胺酸蛋白酶(caspase)3及7的活化或PARP的裂解。

抑癌因子p53係控制G1、細胞凋亡的關鍵之一。並且，LNCaP細胞表現之p53係具抑癌功能之野生型(van Bokhoven A, Varella-Garcia M, Korch C, et al. "Molecular Characterization of Human Prostate Carcinoma Cell Lines" Prostate 2003, 57(3):205-225)。根據本實施例圖2B所示，經10 μM HDHS處理24小時的LNCaP細胞中，p53的量增加三倍，且細胞凋亡抑制因子Bcl-xL之量減少約50%。

根據圖3之結果可知，(1)經HDHS處理24小時的LNCaP細胞，其表現出對細胞週期蛋白D1及E之濃度-依賴性下降的現象；(2)HDHS亦會降低CDK2、CDK4及CDK6的蛋白質含量；(3)作用在G1的CDK抑制因子p21及p27之蛋白質表現亦因HDHS(10 μM)的存在而增加；及(4)HDHS處理可顯著地降低LNCaP細胞中CDK對抑癌因子Rb的磷酸化作用。上述結果顯示，HDHS可抑制細胞週期，並可降低CDK的活性及後續的Rb磷酸化作用。

根據圖3，經HDHS處理的PC-3細胞亦會表現上述所有的現象，惟PC-3細胞受影響的程度低於LNCaP細胞。

經CAX處理的LNCaP及PC-3細胞則未在細胞週期分析中顯示任何顯著的變化。根據本發明可知，HDHS係透過阻止細胞週期及活化凋亡訊息路徑，誘導AR-依賴型攝護腺癌細胞的凋亡現象；反之，藉由HDHS處理，AR-非依賴型攝護腺癌細胞只會出現細胞週期中止的現象。

實施例4活體內試驗-口服投予HDHS與攝護腺癌腫瘤生長的關係

本實施例係利用具22Rv1腫瘤之無胸腺裸鼠作為測試對象。當腫瘤成長至可觸知的大小時(>200mm³ )，即口服給予受測裸鼠每天0.5及2.5 mg/每公斤體重的HDHS，並在HDHS療程期間記錄腫瘤的大小，療程後測量腫瘤重量。圖4A-C顯示口服給予裸鼠HDHS即顯著地延遲攝護腺癌腫瘤的生長。根據24-天HDHS療程記錄得知，受測裸鼠並未表現任何因HDHS毒性造成的副作用，諸如食慾降低、活動力減緩或任何其他明顯的病徵。如圖4D所示，即使每天給予受測裸鼠高達2.5 mg/Kg劑量的HDHS，該受測裸鼠的體重也不致受影響。值得注意的是，根據圖4B有關治療末期腫瘤重量結果可知，HDHS的劑量對於腫瘤抑制效果係呈正向相關。

實施例5活體內試驗-口服投予HDHS與受測裸鼠表現細胞凋亡現象的關係

本實施例係根據免疫組織化學的技術原理，檢測HDHS對於裸鼠體內異種移植腫瘤的影響。以人類-特異性Ki-67抗體針對增生腫瘤細胞進行染色，比較經24-天療程處理後的腫瘤細胞百分比。圖5A顯示，口服投予受測裸鼠0.5及2.5 mg/Kg/天HDHS達24天之久後，HDHS減少Ki-67抗體陽性染色的增生細胞數(a-c)，並發現藉由TUNEL法染色的凋亡腫瘤細胞數則呈增加的趨勢(d-f)。根據圖5B統計結果可知，由HDHS所誘導的抗增生作用及促細胞凋亡現象均呈劑量正向相關，即分別給予受測裸鼠0.5及2.5 mg/Kg/天劑量所導致的抗增生及細胞凋亡結果具統計上顯著的差異性。

再者，吾人針對腫瘤細胞內的AR表現進行染色，亦顯示雄性素-AR活性關係，如圖5A(g-i)所示，在經HDHS處理的腫瘤內發現AR表現呈普遍減少的現象。

實施例6受測裸鼠血漿及腫瘤內HDHS含量分析

為瞭解劑量-功效的關係，吾人茲檢測受測裸鼠於療程結束24小時後其體內血漿及腫瘤細胞內HDHS含量。該檢測方法係利用HPLC定量原理，與HDHS相對於內部標準品的比例測量血漿中和腫瘤中HDHS濃度(nmol/mL及nmol/g)。如圖6A及6B(圖譜b)所示，僅接受內部標準品的老鼠的血漿及腫瘤細胞中均未偵測到HDHS。然而，餵食HDHS的老鼠體內則發現明顯的劑量-正向關係(圖譜c、d及e)。如圖6C所示，口服投予0.5及2.5 mg/Kg HDHS分別導致在血漿內含有0.45±0.14及1.45±0.30 nmol/mL HDHS，而圖6D則顯示，在腫瘤組織中HDHS累積量則分別高達98.45±19.80及154.93±12.97 nmol/g。血漿及腫瘤組織中HDHS濃度的增加顯示與服用劑量呈正向關係，且與腫瘤抑制程度具密切關連。

其他實施例

本說明書中所揭示之所有特徵可與任何組合相結合。本說明書中所揭示之每個特徵可由用作相同、等效或類似用途之替代性特徵替代。

自上文描述，熟習此項技術者可易於確定本發明之基本特徵，且在不脫離本發明之精神及範疇下可作出本發明之多種變化及修改以使其適應多種用法及條件。因此，本發明亦涵蓋其他實施例。

圖1說明HDHS對於AR活性及攝護腺癌細胞的影響：A顯示LNCaP、22Rv1、PC-3及NIH-3T3細胞株分別以HDHS及溶劑對照組處理後，MTT試驗所得細胞活性結果(對照組的吸光度以100%表之)。B顯示HDHS對於抑制AR-依賴型細胞株LNCaP、AR-反應型細胞株22Rv1及AR-非依賴型細胞株PC-3之細胞形成群落生長呈劑量-反應曲線；C顯示HDHS對於培養皿中LNCaP、22Rv1及PC-3細胞株的數量及型態的影響。

圖2說明HDHS對於誘發攝護腺癌細胞株細胞凋亡的影響：A顯示以HDHS及溶劑對照組處理之LNCaP、22Rv1及PC-3細胞株所呈現的核小體釋出量；B顯示經HDHS處理之LNCaP細胞及對照組與抗-PARP、抗-半胱胺酸蛋白酶(caspase)-3及7、抗-p53及抗-Bcl-xL抗體反應之西方墨點分析結果。

圖3顯示HDHS對攝護腺癌細胞之細胞週期過程的影響。

圖4說明HDHS對裸鼠之腫瘤細胞生長的影響：A顯示HDHS抑制腫瘤體積的生長；B顯示活體試驗最終期，裸鼠體內腫瘤的重量；C顯示受測裸鼠腫瘤的形狀大小；D顯示受測小鼠的體重變化。

圖5說明HDHS對裸鼠體內異種移植腫瘤細胞數量的影響：A(a-c)顯示人類-特異性Ki-67抗體針對受測裸鼠腫瘤細胞的染色結果；(d-f)顯示TUNEL測試細胞凋亡的結果；(g-i)顯示AR表現的結果；B代表Ki-67-陽性及TUNEL-陽性百分比(%)。

圖6說明HDHS在受測裸鼠細胞質及移植22Rv1腫瘤組織中藥理上可達到的量：A代表血漿樣品中HDHS的HPLC層析圖譜，其中a表空白血漿組，b表空白添加內部標準品組，c表0.5 mg/Kg HDHS實驗組，d表2.5 mg/Kg HDHS實驗組，e表d組樣品(額外添加10 nmol/mL HDHS)；B代表腫瘤組織樣品中HDHS的HPLC層析圖譜，其中a表空白腫瘤組(無給藥)，b表空白添加內部標準品組，c表0.5 mg/Kg HDHS實驗組，d表2.5 mg/Kg HDHS實驗組，e表d組樣品(腫瘤組織額外添加100 n mol/g HDHS)；C顯示老鼠各組血漿中HDHS的平均量；D顯示各組老鼠腫瘤中HDHS的平均量。

所有圖式中，＊及＊＊表示具統計上顯著差異性，其中＊表示P<0.05，及＊＊表示P<0.01。

Claims

一種二萜類化合物及其醫藥上可接受之鹽於製備治療攝護腺癌之藥物的用途，其中該化合物係為：
如請求項1之用途，其中該二萜類化合物係以柳杉Cryptomeria japonica D.Don(Taxodiaceae)萃取物之型態存在。
如請求項2之用途，其中該萃取物係為柳杉樹皮、木材或樹葉之萃取物。
如請求項1之用途，其中該藥物視情形可與其他攝護腺癌治療劑併用。
如請求項1之用途，其中該藥物視情形可與其他臨床上治療攝護腺癌之療法併用。
一種醫藥組合物於製備用以治療攝護腺癌的藥物之用途，其中該醫藥組合物包含治療有效量之二萜類化合物或其醫藥上可接受之鹽，及醫藥上可接受之載劑，其中該化合物係為：
如請求項6之用途，其中該二萜類化合物係以柳杉Cryptomeria japonica D.Don(Taxodiaceae)萃取物之型態存在。
如請求項7之用途，其中該萃取物係為柳杉樹皮、木材或樹葉之萃取物。
如請求項6之用途，其中該藥物視情形可與其他攝護腺癌治療劑併用。
如請求項6之用途，其中該藥物視情形可與其他臨床上治療攝護腺癌之療法併用。