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TWI428135B - And a carrier composition for quick-acting nucleic acid delivery - Google Patents

And a carrier composition for quick-acting nucleic acid delivery Download PDF

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Publication number
TWI428135B
TWI428135B TW097110544A TW97110544A TWI428135B TW I428135 B TWI428135 B TW I428135B TW 097110544 A TW097110544 A TW 097110544A TW 97110544 A TW97110544 A TW 97110544A TW I428135 B TWI428135 B TW I428135B
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TW
Taiwan
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nucleic acid
composition
acid delivery
sirna
choline
Prior art date
Application number
TW097110544A
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English (en)
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TW200902035A (en
Inventor
Hirofumi Takeuchi
Yasuyuki Hira
Koji Nakano
Hidekazu Toyobuku
Original Assignee
Hirofumi Takeuchi
Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hirofumi Takeuchi, Otsuka Pharma Co Ltd filed Critical Hirofumi Takeuchi
Publication of TW200902035A publication Critical patent/TW200902035A/zh
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Description

速效型核酸送達用載體組成物 技術領域
本發明有關於一種將核酸投予源自動物之細胞或生物時可有效送達細胞內之低毒性且高安全性的核酸送達用載體組成物以及核酸送達用組成物。
 背景技術
因近年來生物科技發展，各種於細胞內發揮生理活性機能之核酸已臻明朗化。舉例來說，已知siRNA(small interfering RNA)將引起存於細胞中之標的基因的mRNA分解，進而抑制標的基因之表現(RNA interference, RNA干擾)。該RNA干擾所引起之標的基因的表現抑制機能在減輕乃至於治療肇因於特定基因或基因群之異常表現而產生的疾病症狀上甚為有用，進而期待開發siRNA作為治療藥物。然而，為了將以siRNA為首之核酸作為治療藥加以利用，使siRNA之機能可於標的細胞內發揮是很重要的，因此，建立可使核酸有效率地送達標的細胞內之技術確是不可或缺的。
將外來性核酸分子或基因送達細胞內之技術已知有載體(vector)之利用。載體分為病毒性與非病毒性之載體。病毒性載體顯示出極高之基因導入效率，但在病原性、免疫抗原性及細胞毒性等安全性上仍多不明點，因而需要開發出安全性較高之非病毒載體。
迄今，就可促進siRNA等之核酸送達細胞內之非病毒性核酸送達用載體而言，舉例來說，專利文獻1已報告一種具特定結構之陽離子性脂質。但是，專利文獻1所報告之陽離子性脂質具有在投予培養細胞或活體時顯示出毒性之缺點。此外，專利文獻2揭示一種兩親媒性化合物及含有聚陽離子(polycation)之組成物作為毒性較低且可使siRNA送達細胞內之載體組成物。然而，專利文獻2所報告之組成物在使充分量之siRNA導入細胞內時，其對細胞之毒性將會顯著化，因此在安全性之觀點上仍有問題。
以前述習知技術為背景，而迫切需要開發出一種低毒性且可使以siRNA為首之核酸有效率地送達細胞內之核酸送達用載體組成物。
【專利文獻1】日本特表2002-529439號公報
【專利文獻2】日本特表2005-508394號公報
於此，本發明係以解決上述習知技術之課題為目的。具體來說，本發明之目的在於提供一種核酸送達用載體組成物及含有該載體組成物與核酸之核酸送達用組成物，其於將siRNA等核酸投予源自動物之細胞或動物時，可使核酸有效率地送達細胞內，低毒性且顯示高安全性。此外，本發明之另一目的在於提供一種具高安全性且可使核酸有效率地送達細胞內之將核酸導入細胞內的方法。
本案發明人為了解決前述課題而精心研討後，發現：組合含有(A)二醯基磷脂醯膽鹼、(B)膽固醇及/或其衍生物以及(C)脂肪族第1級胺之組成物之毒性低而顯示高安全性，且可使核酸有效率地送達細胞內，作為核酸送達用載體甚為有用。特別是，發現可將含有前述(A)~(C)成分之組成物調製成脂質體形態加以使用，藉此可兼具更加優異之安全性及核酸導入性。本發明即係基於該等見解而更反覆研討進而完成者。
即，本發明可提供下述態樣之發明： 第1項·一種核酸送達用載體組成物，含有：(A)二醯基磷脂醯膽鹼、(B)選自於由膽固醇及其衍生物所構成群組中之至少1種、以及(C)脂肪族第1級胺。
第2項　如第1項之核酸送達用載體組成物，其中該(A)成分係醯基部分之碳原子數為4~23之二醯基磷脂醯膽鹼。
第3項　如第1或2項之核酸送達用載體組成物，其中該(B)成分為膽固醇。
第4項　如第1項之核酸送達用載體組成物，其中該(C)成分係碳原子數為10~20之烷基胺。
第5項　如第1項之核酸送達用載體組成物，其中該(A)成分係選自於由二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼所構成群組中之至少1種，該(B)成分為膽固醇，且該(C)成分為硬脂醯基胺。
第6項　如第1項之核酸送達用載體組成物，其中(A)成 分：(B)成分：(C)成分之莫耳比為5~9:1~5:1。
第7項　如第1項之核酸送達用載體組成物，其係一siRNA送達用載體。
第8項　如第1項之核酸送達用載體組成物，其係一脂質體製劑，且形成有由(A)~(C)成分所形成之脂質體膜。
第9項　一種核酸送達用組成物，含有核酸以及如第1項之核酸送達用載體組成物。
第10項　如第9項之核酸送達用組成物，其中該核酸為siRNA。
第11項　如第9項之核酸送達用組成物，其係一脂質體製劑。
第12項　一種核酸導入方法，係包含下述步驟，即：使如第9項之核酸送達用組成物與細胞接觸，而使核酸導入細胞內。
第13項　如第12項之核酸導入方法，其中該細胞為培養細胞、從活體分離出之細胞或是存於活體內之細胞。
第14項　一種將組成物用於製造核酸送達用載體的用途，該組成物包含：(A)二醯基磷脂醯膽鹼、(B)選自於由膽固醇及其衍生物所構成群組中之至少1種以及(C)脂肪族第1級胺。
第15項　如第14項之用途，其中該核酸送達用載體為siRNA送達用載體。
 發明之效果
本發明之核酸送達用載體組成物及核酸送達用組成物 可使核酸有效率地送達細胞內，進而使核酸之有用機能於細胞內有效發揮，且具有低毒性及高安全性之優點。因此，該核酸送達用載體組成物及核酸送達用組成物在藉導入核酸作各種疾病之治療上，特別是以低分子化合物等難以治療之難治性疾病的治療上甚是有用。
此外，本發明之核酸送達用載體組成物及核酸送達用組成物特別是可有效抑制siRNA之副作用(即，誘導干擾素表現)，因此特別適合將siRNA導入細胞內。
再者，本發明之核酸送達用組成物可做冷凍乾燥處理，因此亦有可於冷凍乾燥狀態下保存之優點。
圖式簡單說明
第l圖顯示試驗例l之結果，即，評估核酸送達用組成物之細胞安全性的結果。
第2圖顯示試驗例2之各核酸送達用組成物中之siRNA攝入細胞內的評估結果。第2圖之縱軸為每一細胞螢光強度之平均值。
第3圖顯示試驗例2中使核酸送達用組成物中之核酸送達用載體的構成脂質(DSPC、膽固醇及硬脂醯基胺)濃度發生變化時，siRNA攝入細胞內之評估結果。
第4圖顯示試驗例3中評估含siRNA之核酸送達用組成物抑制誘導干擾素表現的結果。
 本發明之最佳實施形態
以下就本發明加以詳細說明。
核酸送達用載體
本發明之核酸送達用載體組成物的特徵在於包含：(A)二醯基磷脂醯膽鹼、(B)膽固醇及/或其衍生物以及(C)脂肪族第l級胺。
本發明之核酸送達用載體組成物係作為用以將核酸送達(導入)細胞內之核酸的載體而使用者。
本發明之核酸送達用載體組成物所適用之核酸僅需為必須送達至細胞內者即可，其種類及結構並未特別受限。該核酸之具體例可例示如siRNA、mRNA、tRNA、rRNA、cDNA、miRNA(微RNA)、核酶(ribozyme)、反意寡聚核苷酸、誘餌寡聚核苷酸、質粒DNA、胜肽核酸、三鏈形成性寡聚核苷酸(Triplex Forming Oligonucleotide, TFO)、適體(aptamer)及基因等。其中，本發明之核酸送達用載體組成物具有可抑制siRNA副作用(誘導干擾素表現)之有利特徵，而特別是在將siRNA送達細胞內上甚為有用。本發明之核酸送達用載體所適用之核酸無論是來自人類、動物、植物、細菌或病毒均可，亦可為藉由化學合成而製得者。再者，該等核酸可為單鏈、雙鏈或三鏈，且其分子量亦未特別受限。此外，於本發明中，核酸可經化學物質、酵素或胜肽修飾。於本發明中，核酸可使用單種或是適當地組合2種以上加以使用。
本發明之核酸送達用載體組成物所使用之二醯基磷脂醯膽鹼(以下僅標示為「(A)成分」)以藥理學上可接受為限，並未特別受限，但可列舉如醯基部分之碳原子數為4~23 者。此外，構成該二醯基磷脂醯膽鹼之2個醯基之碳原子數可相同或不同。
本發明所使用之二醯基磷脂醯膽鹼之具體例可列舉如：二月桂醯基磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯膽鹼、二亞麻醯基磷脂醯膽鹼、肉豆蔻醯基棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、肉豆蔻醯基硬脂醯基磷脂醯膽鹼、棕櫚醯基硬脂醯基磷脂醯膽鹼、二丁醯基磷脂醯膽鹼、二己醯基磷脂醯膽鹼、二庚醯基磷脂醯膽鹼、二癸醯基磷脂醯膽鹼、二鄰苯二甲醯基磷脂醯膽鹼、雙十二基磷脂醯膽鹼、雙二十醯基磷脂醯膽鹼、雙二十一醯基磷脂醯膽鹼、二反油醯基磷脂醯膽鹼、二花生醯基磷脂醯膽鹼、二(雙二十三醯基)磷脂醯膽鹼等。該等之中，較宜列舉如醯基部分之碳原子數為12~18之二醯基磷脂醯膽鹼，更宜列舉如二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、肉豆蔻醯基棕櫚醯基磷脂醯膽鹼、肉豆蔻醯基硬脂醯基磷脂醯膽鹼及棕櫚醯基硬脂醯基磷脂醯膽鹼等醯基部分之碳原子數為13~17之二醯基磷脂醯膽鹼；且尤宜列舉如二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼；而最宜列舉如二硬脂醯基磷脂醯膽鹼。該等二醯基磷脂醯膽鹼可使用單獨一種，亦可組合2種以上使用。
本發明之核酸送達用載體組成物所使用之膽固醇及/或其衍生物(以下亦僅記為「(B)成分」)以藥理學上可接受 為限，並未特別受限。膽固醇之衍生物係指具有膽固醇骨架之陽離子性脂質，具體來說可例示如：3β-[N-(N',N'-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基]膽固醇(DC-Chol)、3β-[N',N',N'-三甲基胺基乙烷]碘化膽固醇(TC-Chol)、雙(胍鎓)-tren-膽固醇(bis-guanidium-tren cholesterol, BGTC)、N-膽固醇氧羰基-3,7-二氮壬烷-l,9-二胺、β-丙胺酸-二乙醇胺-膽固醇、N4 -精胺膽固醇羰醯胺(GL-67; N4 -spermine cholesteryl carbamate)、N[N4 -3-胺基丙基亞精胺]膽固醇胺基甲酸酯(GL-78; N[N4 -3-aminopropylspermidine] cholesteryl carbamate)、N4 -精胺膽固醇羧氧基醯胺(GL-90; N4 -spermine cholesteryl carboxamide)、N1 ,N8 -雙(精胺酸羧基醯胺)-N4-亞精胺膽固醇胺基甲酸酯(GL-95; N1 ,N8 -Bis(argininc carboxamide)-N4 -spermidine cholestery carbamate)N-[N1 ,N4 ,N8 -三(3-胺基丙基)亞精胺]膽固醇胺基甲酸酯(GL-96; -[N1 ,N4 ,N8 -Tris(3-aminopropyl)spermidine]cholesteryl carbamate)。於本發明中，較適宜之(B)成分可列舉如膽固醇。本發明中，(B)成分可從膽固醇及其衍生物中挑出一種單獨使用，或是組合2種以上使用。
本發明之核酸送達用載體組成物所使用之脂肪族第1級胺(以下，亦僅記為「(C)成分」)以藥理學上可接受為限，並未受特別限制，可例舉如烷基部分之碳原子數為10~20之烷基胺。
本發明所使用之脂肪族第l級胺之具體例可列舉如月桂基胺、肉豆蔻基胺、棕櫚基胺、硬脂基胺、油基胺、癸 醯基胺及鄰苯二甲醯基胺等。該等之中，較佳者可列舉如烷基部分之碳原子數為12~18之烷基胺；更佳者可列舉如硬脂基胺、油基胺及棕櫚基胺，而特別宜為硬脂基胺。該等二脂肪族第1級胺可單獨使用一種亦可組合2種以上使用。
本發明之核酸送達用載體組成物只要組合含有前述(A)~(C)成分即可，但從採用下述組合態樣以更提高核酸送達細胞內之效率及更低毒性的觀點來看，下述所例示之組合甚為合適；(A)醯基部分之碳原子數為4~23的二醯基磷脂醯膽鹼、(B)膽固醇及/或其衍生物以及(C)碳原子數為10~20之烷基胺的組合；且更宜為(A)二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼及/或二硬脂醯基磷脂醯膽鹼、(B)膽固醇以及(C)硬脂醯基胺之組合。
此外，本發明之核酸送達用載體組成物中，(A)~(C)成分之配合比率並未特別受限，但舉例來說，可例舉如(A)成分：(B)成分：(C)成分之莫耳比為5~9:l~5:l，且較宜為6~9:1~4:l，更宜為7~8:2~3:l。藉由滿足上述比例，可更提高核酸送達細胞內之效率及更降低毒性。
此外，(A)~(C)成分相對於本發明之核酸送達用載體總量的合計量可列舉如1~100重量%，且較宜為20~90重量%，更宜為30~70重量%。
本發明之核酸送達用載體組成物除上述(A)~(C)成分外，可更含有其他陽離子性脂質。具體來說，此種陽離子性脂質可列舉如鯊胺(Squalamine)、3a,7a,12a-參(3-胺基丙氧基)-5β-膽烷-24-(N,N-雙(3-胺基丙基)胺(3a,7a, 12a-Tris(3-aminopropoxy)-5β-cholan-24-(N,N-bis(3-aminopropyl)amine)、3a,7a,12a-參(3-胺基丙氧基)-5β-膽烷-24-(N-(N-(3-胺基丙基))-3-胺基丙基)-胺(3a,7a,12a-Tris(3-aminopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(N-(3-aminopropyl))-3-aminopropyl)-amine)、3a,7a,12a-參(3-疊氮丙氧基)-5β-膽烷-24-(N,N-雙(2-氰基乙基)胺)(3a,7a,12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N,N-bis(2-cyanoethyl)amine))、3a,7a,12a-參(3-疊氮丙氧基)-5β-膽烷-24-(N-(苄氧羰基)-N-(羥丙基)-胺)(3a,7a,12a-Tris(3-azidopropoxy)-5b-cholan-24-(N-(benzyloxycarbonyl)-N-(3-hydroxypropyl)-amine))等結合有膽固醇之陽離子性脂質；傘精胺複合物(Umbrella-spermine conjugates)等結合有膽酸之陽離子性脂質；結合有膽固醇配醣體之陽離子性脂質；結合有膽固醇皂苷之陽離子性脂質；溴化二甲基雙十八基銨鹽(DDAB)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-三甲基銨丙烷、l,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、l,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷甲基硫酸鹽、1,2-二棕櫚醯基-3-三甲基銨丙烷、l,2-二硬脂醯基-3-三甲基銨丙烷、N-(l-(2,3-雙(油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基銨鹽酸鹽(DOTMA)、溴化二肉豆蔻醯氧基丙基二甲基羥基乙基銨鹽(DMRIE)、溴化二油醯氧基丙基二甲基羥乙基銨(DORIE)、溴化二甲基雙十二基銨、N-(a-三甲基銨基乙醯)-雙十二基-D-麩醯胺鹽酸鹽、N-(a-三甲基銨基乙醯基)-O,O'-雙-(1H,1H,2H,2H-全氟癸基)-L-麩醯胺鹽酸鹽、O,O'-雙十二醯基-N-(a-三甲基銨乙 醯)二乙醇胺鹽酸鹽、溴化甲基烯丙基雙十二基銨、N-{p-(w-三甲基銨基丁氧基)-苯甲醯基}-雙十二基-L-麩醯胺鹽酸鹽、溴化9-(w-三甲基銨基丁基)-3,6-雙(十二醯基)咔唑、二甲基雙十八基銨鹽酸鹽、溴化N-w-三甲基銨基癸醯基-雙十六基-D-麩醯胺、溴化N-{p-(w-三甲基銨基己氧基)-苯甲醯基}-雙十四基-L-麩醯胺、溴化對(w-三甲基銨基癸氧基)-p'-辛氧基氮苯鹽(MC-1-0810)、溴化對{w-(b-羥乙基)二甲基-銨基-癸氧基}-p'-辛氧基氮苯鹽(MC-3-0810)、溴化O,O',O"-參十二醯基-N-(w-三甲基-銨基癸醯基)-參(羥甲基)胺基甲烷鹽(TC-l-12)、1,2-二月桂基-甘油醯-3-乙基磷酸膽鹼、1,2-二肉豆蔻醯基-甘油醯-3-乙基磷酸膽鹼、1,2-二棕櫚醯基-甘油醯-3-乙基磷酸膽鹼、1,2-二硬脂醯基-甘油醯-3-乙基磷酸膽鹼、l,2-二油醯基-甘油醯-3-乙基磷酸膽鹼、1-棕櫚醯基-2-油醯基-甘油醯-3-乙基磷酸膽鹼等第4級銨鹽型之陽離子性脂質等。
本發明中，含有(A)~(C)成分以外之其他陽離子性脂質時，該陽離子性脂質之比例只要不妨礙本案發明效果即不特別受限，但可例示如：相對於前述(A)~(C)成分之總量100重量分，該陽離子性脂質為1~10重量分，且宜為2~8重量分，更宜為4~6重量分之比例。
本發明之核酸送達用載體組成物更可依需要而含有油性基劑。藉由配合油性基劑並利用其特性，將可控制核酸送達用載體組成物之核酸導入效率。舉例來說，藉由配合油性基劑並調整核酸送達用載體組成物之比重，控制細胞 與核酸送達用載體組成物之接觸性，將考可改善活體內(in vitro)之導入效率。此外，舉例來說，可配合具有溫度感受性機能之油性基劑，藉此使核酸載體組成物之核心於預定溫度條件下崩解而引發在細胞表面上之搖動，進而使核酸導入效率提高。再者，舉例來說，可配合具有外部刺激崩解性之油性基劑，再以外部刺激使核酸載體組成物之核心崩解而引發於細胞表面上之搖動，進而使核酸導入效率提高。
本發明之核酸送達用載體組成物所配合之油性基劑可列舉如：全氟碳、全氟戊烷、全氟辛基溴、全氟己烷、全氟三丁基胺、大豆油、純化大豆油、大豆硬化油、非皂化大豆油、鯊烯、蓖麻籽油、丁香油、三油酸山梨糖醇酐、松節油、紅花籽油、紅花籽油脂肪酸、油酸、椰子油、菜籽油、雜醇油、橄欖油、亞痳籽油、芝麻油、葉綠素油、巴豆油、佛手柑油、香柏油、柑橘油、茴香油、尤加利油、玉米油、薰衣草油、馬鬱蘭油、檸檬油、棉籽油、卵黃油、玫瑰油、松油、杏仁油、花生油、山茶花油、樟腦白油、洋甘菊油、桂皮油、薄荷油、酯化玉米油、生薑油、羅馬洋甘菊油、蛇油、綠薄荷、向日葵油、可可脂、小麥胚芽油、氧化鋅油、硬化油、加氫植物油、輕質流動石蠟、流動石蠟、中鏈脂肪酸三酸甘油脂、水貂油、雲杉油、聚氧乙烯蓖麻籽油、聚氧乙烯硬化蓖麻籽油、聚氧乙烯硬化蓖麻籽油10、聚氧乙烯硬化蓖麻籽油100、聚氧乙烯硬化蓖麻籽油20、聚氧乙烯硬化蓖麻籽油40、聚氧乙烯硬化蓖麻籽 油5、聚氧乙烯硬化蓖麻籽油50、聚氧乙烯硬化蓖麻籽油60、聚氧基35蓖麻籽油及處理油(process oil)等。該等油性基劑中，全服戊烷具有溫度感受性，且具有於29.5℃沸騰而氣化之特性。此外，全氟己烷、全氟辛基溴及全氟三丁基胺具有外部刺激崩解性，具有可藉來自外部之刺激(超音波照射之刺激等)使載體組成物之核心發生空化而崩解之特性。
含有該油性基劑時，該油性基劑之比例只要不妨礙本發明效果即未特別受限，但可例示如下述比例，即：相對於前述(A)~(C)成分隻之總量100重量份，該油性基材為0·1~50重量份，且宜為1~30重量份，更宜為5~20重量份。
再者，本發明之核酸送達用載體組成物亦可依需要而含有膜融合性脂質(輔助(helper)脂質)。可藉由含有此種膜融合性脂質而更提高核酸送達細胞內之效率。此種膜融合性脂質可列舉如：二油醯基磷脂醯乙醇胺、二油醯基磷脂醯膽鹼、反式磷脂醯基磷脂醯乙醇胺銨、1,2-雙(10,12-雙二十三醯基)-磷酸乙醇胺、1,2-二反油酸醯基磷酸乙醇胺、l,2-雙十六基磷酸乙醇胺、1,2-二己醯基磷酸乙醇胺、l,2-二月桂醯基磷酸乙醇胺、1,2-二亞麻醯基磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺、l,2-二油醯基磷酸乙醇胺、1,2-二棕櫚油醯基磷酸乙醇胺、l,2-二棕櫚醯基磷酸乙醇胺、1,2-二植烷醯基(diphytanoyl)磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂醯基磷酸乙醇胺、l-棕櫚醯基-2-油醯基磷酸乙醇胺、1-棕櫚醯基-2-(10,12-雙二十三醯基)磷酸乙醇胺、l,2-二油醯基磷酸乙 醇胺-N-己醯基胺、l,2-二棕櫚醯基磷酸乙醇胺-N-己醯基胺、l,2-二油醯基磷酸乙醇胺-N,N-二甲基、l,2-二棕櫚醯基磷酸乙醇胺-N,N-二甲基、l,2-二棕櫚醯基磷酸乙醇胺-N-十二醯基、l,2-二油醯基磷酸乙醇胺-N-十二醯基、l,2-二油醯基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1,2-二棕櫚醯基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、l,2-二油醯基磷酸乙醇胺-N-戊二醯基、1,2-二棕櫚醯基磷酸乙醇胺-N-戊二醯基、l,2-二油醯基磷酸乙醇胺-N-乳糖、l,2-二油醯基磷酸乙醇胺-N-[4(對馬來醯亞胺甲基)環己烷-羧酸鹽、二棕梠醯基磷酸乙醇胺-N-[4(對馬來醯亞胺甲基)環己烷-羧酸鹽、l,2-二棕櫚醯基磷酸乙醇胺-N-[4(對馬來醯亞胺苯基)丁醯胺、l,2-二油醯基磷酸乙醇胺-N-[4(對馬來醯亞胺苯基)酪酸鹽]、l,2-二油醯基磷酸乙醇胺-N-甲基、二棕櫚醯基磷酸乙醇胺-N-甲基、1,2-二油醯基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶基二硫)丙酸鹽、l,2-二棕櫚醯基磷酸乙醇胺-N-[3-(2-吡啶基二硫)丙酸鹽、1,2-二油醯基磷酸乙醇胺-N-(琥珀醯基)、l,2-二棕櫚醯基磷酸乙醇胺-N-(琥珀醯基)等。其中，尤以二油醯基磷醯乙醇胺可適宜地使用於本發明之核酸送達用載體組成物中。
含有該膜融合性脂質時，該膜融合性脂質之比例只要不妨礙本發明效果即不特別受限，但可例示如：相對於前述(A)~(C)成分之總量100重量份，該膜融合性脂質為1~500重量份，且宜為10~250重量份，更宜為25~100重量分。
本發明之核酸送達用載體組成物可因應使用形態而含有等張化劑、賦形劑、稀釋劑、增黏劑、安定化劑、緩衝 劑及保存劑等各種添加劑；純水、糖水溶液、緩衝液、生理食鹽水、高分子水溶液及不含RNase之水等水性載體。該等添加劑及水性載體之配合量可因應核酸送達用載體之使用形態而適當設定。
本發明之核酸送達用載體組成物只要可包含送達至細胞內之對象核酸即可，其形態並未特別受限，但宜為脂質體之形態。
令本發明之核酸送達用載體組成物為脂質體形態時，前述(A)~(C)成分及依需要而添加之其他脂質將會形成脂質體膜。製為脂質體形態時，可為小型之單片膜脂質體(small unilamellar. vesicles: SUV)、大型之單片膜脂質體(large unilamellar vesicles: LUV)及多層脂質體(multilamellar vesicles: MLV)中之任一者。此外，其粒徑僅需因應送達對象之細胞種類等加以適當設定即可，但舉例來說，可例示如：SUV為20~100 nm，LUV為200~1000 nm，MLV為400~3500 nm程度。脂質體之粒徑可藉動態光散射法測定。
脂質體之製造及其粒徑之調節可依業界習知之方法實施。即，可使用含有前述(A)~(C)成分之油相及水相(水性載體)，並藉由薄膜法、逆相蒸法、醚注入法、界面活性劑法及加溫法等，使脂質體形成。此外，亦可藉擠製法、法式壓碎法、均質化法等來調節粒徑。
混合前述(A)成分、(B)成分及所需其他成分，在依目的形態加以適當製劑化，即可調製出本發明之核酸送達用 載體組成物。
核酸送達用組成物
本發明之核酸送達用組成物含有前述核酸送達用載體組成物及核酸。即，該核酸送達用組成物被用來在將該組成物內所含核酸導入送達對象之細胞內。
核酸送達用載體組成物為脂質體形態時，於該核酸送達用組成物中，核酸可以被封入之狀態存在於脂質體之內水相中，或是藉離子鍵結或疎水鍵結而結合存在於脂質體膜之內側或外側。此外，若核酸送達用載體組成物為脂質體以外之形態時，於該核酸送達用組成物中，僅需核酸與核酸送達用載體組成物之配合成分作離子鍵結或疎水鍵結而形成複合物即可。
本發明之核酸送達用組成物係將前述核酸送達用載體組成物與核酸混合而調製成所需形態，或是將核酸及前述核酸送達用載體組成物之配合成分以任意順序混合製成所需形態而製造者。
於本發明之核酸送達用組成物中，核酸與核酸送達用載體組成物之配合比率係依所用核酸及核酸送達用載體之種類以及核酸送達對象之細胞種類等而異，但舉例來說，相對核酸送達用載體組成物所含(A)~(C)成分之總量100重量份，核酸為1.0×10-5 ~1.0重量份，且宜為1.0×10-4 ~1.0×10-1 重量份，更宜為l.0×l0-3 ~l.0×l0-2 重量份之比例。
再者，舉例來說，核酸送達用組成物所含(A)~(C)成分之合計量相對於該組成物之總量為10~90重量%，且宜為 30~80重量%，更宜為40~60重量%。
本發明之核酸送達用組成物可依照使用形態而含有等張化劑、賦形劑、稀釋劑、增黏劑、安定化劑、緩衝劑及保存劑等各種添加劑；以及純水、葡萄糖水溶液、緩衝液、生理食鹽水等水性載體。該等添加劑及水性載體之配合量可依照核酸送達用組成物之使用形態而適當設定。
本發明中，核酸送達之細胞可列舉如培養細胞、從活體抽提之細胞(包含確立細胞(established cel1 line))及存於人類等活體內之細胞等。
本發明之核酸送達用組成物之使用態樣僅需為，使適量之該核酸送達用組成物與核酸導入對象之細胞接觸即可，並未特別受限。舉例來說，若於將核酸送達人類等活體內之細胞時，可例示如：直接注入組織；注射至靜脈、皮下、肌肉、腹腔、眼內、消化器官內及齒內等；鼻腔、口腔及肺等之吸入投藥；經口投藥；經由皮膚之經皮投藥；及經由口腔黏膜、陰道黏膜、眼黏膜、直腸黏膜及子宮黏膜之經黏膜投藥等。此外，若於將核酸送達培養細胞以及從活體抽提出之細胞時，可例示如：培養時以預先使適量核酸送達用組成物存在之狀態培養細胞的方法。此外，將核酸送達至培養細胞或從活體抽提出之細胞時，即使於血清存在下，亦可使核酸送達細胞內。
此外，本發明之核酸送達用組成物對核酸導入對象之細胞的適用量可依照所用核酸種類、該核酸送達用組成物種類及對象細胞種類等來加以適當設定。例如，在核酸送 達對象為人體中之細胞時，僅需將治療有效量之本發明核酸送達用組成物投藥予可藉投予核酸而期待治療效果之患者即可。
實施例
以下，基於實施例等來詳細說明本發明，但本發明不僅侷限於此。此外，於以下實施例等中，係將二硬脂醯基磷脂醯膽鹼記為「DSPC」、將二軟脂醯基磷脂醯膽鹼記為「DPPC」且將二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼記為「DMPC」。此外，於下述試驗例1及2中，siRNA係使用GL3-siRNA(相對於螢火蟲螢光素酶之siRNA；Dharmacon社，Boulder, CO, USA; sense: 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT、antisense: 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT)。此外，試驗例3中，siRNA係使用Human MMP-9-siRNA(Samchully Pharm. Co., Ltd, Korea; Sense 5'-CCAACUAUGACCAGGAUAAdTdT-3', antisense: 5'-UUAUCCUGGUCAUAGUUGGdTdT-3')。
實施例l 調製含DSPC之核酸送達用載體組成物
以莫耳比DSPC：膽固醇：硬脂醯基胺=7:3:1秤量該等成分，再於茄型燒瓶中使該等溶解於氯仿中。藉旋轉蒸發器(Rotaly Evapolater)減壓乾燥之，而形成脂質薄膜。於其中加入DEPC-treated water(Ambion社製；不含Rnase之水)使DSPC濃度為30 mg/mL後，使用擠壓機通過孔徑100 nm之膜使粒徑均勻，調製出陽離子性脂質體形態之核酸送達用載體組成物。
實施例2 調製含DPPC之核酸送達用載體組成物
除了使用DPPC取代DSPC外，以與前述實施例1相同之方法調製出陽離子性脂質體形態之核酸送達用載體組成物。
實施例3 調製含DMPC之核酸送達用載體組成物
除了使用DMPC取代DSPC外，以與前述實施例l相同之方法調製出陽離子性脂質體形態之核酸送達用載體組成物。
實施例4 調製含DSPC之核酸送達用組成物
使用以DEPC-treated water(Ambion社製；不含Rnase之水)將20×Tris-EDTA(TE)緩衝液(Invitrogen社製)稀釋20倍之溶液，以2 μM濃度調製含siRNA之溶液(siRNA溶液)。接著，將實施例l之核酸送達用載體組成物與siRNA溶液等量混合，形成脂複合體(lipoplex)(複合物)，調製出核酸送達用組成物。
實施例5 調製含DPPC之核酸送達用組成物
使用以DEPC-treated water(Ambion社製；不含Rnase之水)將20×Tris-EDTA(TE)緩衝液(Invitrogen社製)稀釋20倍之溶液，以2 μM濃度調製出含siRNA之溶液(siRNA溶液)。接著，將實施例2之核酸送達用載體組成物與siRNA溶液等量混合，形成脂複合體(複合物)，調製出核酸送達用組成物。
實施例6 調製含DMPC之核酸送達用組成物
使用以DEPC-treated water(Ambion社製；不含Rnase之水)將20×Tris-EDTA(TE)緩衝液(Invitrogen社製)稀釋20倍之 溶液，以2 μM濃度調製含siRNA之溶液(siRNA溶液)。接著，將實施例3之核酸送達用載體組成物與siRNA溶液等量混合，形成脂複合體(複合体)，調製出核酸送達用組成物。
試驗例1 細胞安全性之評估試驗
使用MTS試驗法進行。MTS試驗係使用Promega社製之「CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay」進行。具體來說，於96井皿中將A594細胞(ATCC, USA)以3.16×104 cells/well播種至含10容量%牛胎兒血清(FBS)之Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)200 μL中，於37℃下培養24小時。以Hanks' balanced salt solution(HBSS)洗淨3次後，換為不含FBS之DMEM，再將前述實施例4~6之核酸送達用組成物各自添加每井20 μL，以37℃、5%CO2 條件下培養4小時。接著，將井中之培養上清液換為含10容量%FBS之DMEM後，更於37℃、5%CO2 條件下培養20小時。接著，於各井中添加MTS(重金屬蛋白質)試劑20 μL及含FBS10容量%之DMEM培養基100 μL培養2小時後，測定492 nm之吸光度，算出細胞生存率。此外，細胞生存率係以不添加核酸送達用組成物而以前述條件培養時所測定之490 nm吸光度為100%算出者。
茲將所得結果示於第l圖。如第l圖所示，明確得知實施例4~6之核酸送達用組成物均細胞毒性低且安全性高。特別是，已確認二醯基磷脂醯膽鹼係使用DSPC或DPPC之核酸送達用組成物(實施例4或5)安全性顯著較高。
試驗例2 siRNA送達細胞內效率之評估試驗
使用流式細胞儀，測定標記於siRNA之FITC螢光強度以評估細胞內之攝入。此外，本試驗中，係利用已預先作FITC標記之siRNA而調製出的核酸送達用組成物。具來說，於24井皿中將A594細胞(ATCC, USA)以5×l05 cells/well播種於含10容量%FBS之DMEM 500 μL中，於37℃、5%CO2 條件下培養24小時。以HBSS洗淨3次後，更換為不含FBS之DMEM，再將前述實施例4~6之核酸送達用組成物各自添加每井0.05 mL，以37℃、5%CO2 條件下培養4小時。接著，將井中之培養上清液更換為含10容量%FBS之DMEM，更於37℃、5%CO2 條件下培養20小時。將各井以HBSS洗淨1次後，添加CellScrubBuffer(Gene Therapy Systems, Inc.製)0.2 mL，於37℃、5%CO2 條件下培養15分鐘。再以HBSS洗淨2次後，使用胰蛋白，剝下附著在井底部之細胞，以離心分離回收細胞，再使所得細胞懸濁於HBSS中。使該懸濁液通過孔徑41 μm之膜。使用流式細胞儀測定核酸送達用組成物添加2小時後及24小時後的細胞螢光強度。此外，對照對象係使用對照用核酸送達用組成物，與前述相同地測定細胞之螢光強度，而該對照用核酸組成物係以容量比l:l混合下述成分而成者，即：以OptiMEM培養基將市售經常用作基因載體之Lipofectamine2000TM (Invitrogen社製)稀釋成0.1 mg/mL之溶液；及，以2 μM濃度將siRNA稀釋於TE緩衝液之siRNA溶液。
茲將所得結果示於第2圖。從該結果可確認，實施例4~6之核酸送達用組成物均可使siRNA有效率地攝入細胞內。特 別是二醯基磷脂醯膽鹼使用DSPC或DMPC之核酸送達用組成物(實施例4及6)於添加2小時後，siRNA攝入細胞內之情況與市售經常被用作基因載體之LipofectamineTM 2000相較下甚顯著，具有優異速效性之有利特徵。
此外，使用DSPC、膽固醇及硬脂醯基胺(莫耳比為DSPC：膽固醇：硬脂醯基胺=7:3:1，以下將該等通稱為「核酸送達用載體構成脂質」)，依實施例1記載之方法製造DSPC濃度為7.5~30 mg/mL之核酸送達用載體。接著，將該核酸送達用載體與含200 nM siRNA之TE緩衝液同量混合，形成脂複合體(複合物)，調製核酸送達用組成物。使用如此調製出之核酸送達用組成物，以與前述相同之方法評估細胞內之攝入狀況。茲將結果示於第3圖。從該結果可看出，若使核酸送達用載體之構成脂質濃度變化，核酸送達用組成物所致細胞內的核酸攝入量隨其變化。此外，明顯看出核酸送達用載體構成脂質無論是何種濃度，24小時後之值與2小時相較下均顯示出較低值，於24小時後siRNA開始消失。亦即，從本結果亦可確認，將DSPC、膽固醇及硬脂醯基胺組合用作核酸送達用載體，可於添加2小時後的短時間內使siRNA送達細胞內，速效性優異。
試驗例3 抑制該導干擾素之評估試驗
於24井皿中將A594細胞(ATCC, USA)以5×l05 cells/well播種於含10容量%FBS之DMEM 500 μL中，於37℃、5%CO2 條件下培養24小時。以HBSS洗淨3次後，於各井中加入不含FBS之DMEM培養基450 μL，再於各井中 添加前述實施例4之核酸送達用組成物50 μL，於37℃、5%CO2 條件下培養4小時。接著，將井中之培養上清更換為含有10容量%FBS之DMEM後，更於37℃、5%CO2 條件下培養20小時。再進一步以HBSS洗淨3次後，使用胰蛋白將附著於井底部之細胞剝下，以離心分離回收細胞。使用Rneasy Plus Mini(Qiagen社製)從所得細胞抽提RNA，再使用QutantiTect Reverse Transcription(Qiagen社製)進行轉錄而獲得cDNA。使用QutantiTectPrimer Assay(Qiagen社製)與iCycler iQ(Bio-RAD社製)將所得cDNA干擾素誘導基因之IFIT-l的mRNA以實時PCR定量。對照對象係使用對照用核酸送達用組成物，且與前述相同地定量IFIT-1之mRNA，而該對照用核酸組成物係以容量比1:1混合下述成分而成者，即：以OptiMEM培養基將市售經常用作基因載體之Lipofectamine2000TM (Invitrogen社製)稀釋成0.1 mg/mL之溶液；及，以2 μM濃度將siRNA稀釋於TE緩衝液之siRNA溶液。用於修正定量之管家基因(housekeeping gene)係使用18rRNA。此外，blank則不添加核酸送達用組成物而以前述條件定量IFIT-1之mRNA。
茲將所得結果顯示於第4圖。使用DSPC之實施例4的核酸送達用組成物與使用LipofectTM amine2000之對照用核酸送達用組成物相較下，顯示出明顯較低之干擾素誘導。從本結果可確知，藉由使用本發明之核酸送達用組成物，可抑制siRNA副作用之干擾素誘導。
第1圖顯示試驗例1之結果，即，評估核酸送達用組成物之細胞安全性的結果。
第2圖顯示試驗例2之各核酸送達用組成物中之siRNA攝入細胞內的評估結果。第2圖之縱軸為每一細胞螢光強度之平均值。
第3圖顯示試驗例2中使核酸送達用組成物中之核酸送達用載體的構成脂質(DSPC、膽固醇及硬脂醯基胺)濃度發生變化時，siRNA攝入細胞內之評估結果。
第4圖顯示試驗例3中評估含siRNA之核酸送達用組成物抑制誘導干擾素表現的結果。

Claims (10)

  1. 一種siRNA送達用組成物，含有：siRNA；以及siRNA送達用載體組成物，其含有(A)選自於由二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼所構成群組中之至少1種物質、(B)選自於由膽固醇及其衍生物所構成群組中之至少1種物質、及(C)脂肪族第1級胺，且(A)成分：(B)成分：(C)成分之莫耳比為6~9：1~4：1。
  2. 如申請專利範圍第1項之siRNA送達用組成物，其中該(A)成分係醯基部分之碳原子數為4~23之二醯基磷脂醯膽鹼。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之siRNA送達用組成物，其中該(B)成分為膽固醇。
  4. 如申請專利範圍第1項之siRNA送達用組成物，其中該(C)成分係碳原子數為10~20之烷基胺。
  5. 如申請專利範圍第1項之siRNA送達用組成物，其中該(B)成分為膽固醇，且該(C)成分為硬脂醯基胺。
  6. 如申請專利範圍第1項之siRNA送達用組成物，其中(A)成分係選自於由二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼所構成群組中之至少1種物質。
  7. 如申請專利範圍第1項之siRNA送達用組成物，其中該siRNA送達用載體組成物為脂質體製劑，且形成有由(A)~(C)成分所形成之脂質體膜。
  8. 如申請專利範圍第1項之siRNA送達用組成物，其為脂質體製劑。
  9. 一種活體外之siRNA導入方法，包含下述步驟：使如申請專利範圍第1項之siRNA送達用組成物於活體外(in vitro)與細胞接觸，而使siRNA導入細胞內。
  10. 一種將含有下述成分之組成物用於製造siRNA送達用組成物的用途，該組成物含有(A)選自於由二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼、二軟脂醯基磷脂醯膽鹼及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼所構成群組中之至少1種物質、(B)選自於由膽固醇及其衍生物所構成群組中之至少1種、及(C)脂肪族第1級胺，且(A)成分：(B)成分：(C)成分之莫耳比為6~9：1~4：1。
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