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TWI428143B - 增加淋巴功能之方法 - Google Patents

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TWI428143B
TWI428143B TW096101900A TW96101900A TWI428143B TW I428143 B TWI428143 B TW I428143B TW 096101900 A TW096101900 A TW 096101900A TW 96101900 A TW96101900 A TW 96101900A TW I428143 B TWI428143 B TW I428143B
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vegfr
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vascular endothelial
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Michael Detmar
Kentaro Kajiya
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Gen Hospital Corp
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Description

增加淋巴功能之方法 有關申請案之相互參考
本申請案主張美國申請案序號第60/760,328號(於2006年1月18日提出申請)優先權，特將此申請案之全部內容結合於此為參考。
本發明係有關於一種促進淋巴功能的方法，且特別有關於利用減少紫外線B所誘導之皮膚損傷來增加淋巴功能。
淋巴管系統由密集的薄壁微淋巴管網絡所組成，從細胞外回收富含蛋白之淋巴，其主要角色包括組織液穩態的維持及輸入免疫反應之調節(Oliver et al.(2002)Genes Dev.16：773－83；Witte et al.(2001)Microsc.Res.Tech.55：122－45)。淋巴管已知功能之一為從正常和發炎組織回收組織液(Kunstfeld et al.(2004)Blood 104：1048－57)。
已知老鼠皮膚經急性或慢性紫外線B(UVB)照射導致淋巴管明顯膨大。經活體淋巴管造影術(intravital lymphangiography)偵測，驚人地發現，這些膨大的淋巴管功能受損且呈現高滲透。在UVB照射的表皮中，血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor，(VEGF)－A)而非淋巴管新生因子(lymphangiogenesis factors)VEGF－C或－D表現量增強。基因轉殖小鼠經UVB照射表皮，VEGF－A標的過量表現(Targeted overexpression)導致淋巴管澎大及滲漏增加，而VEGF－A訊息系統性阻斷卻大量防止因UVB誘導之淋巴管異常及光損傷(photo－damage)。這些發現同時指出淋巴管為UVB－誘導皮膚光損傷之標的及VEGF－A調節淋巴管功能之損傷，俾使導致UVB照射皮膚之副作用。
在本發明之一形態中，其係為一種減少UVB誘導皮膚損傷之方法，係藉由降低如臉、胸、頸、手或身體其它區域之皮膚的VEGF－A活性或含量。這些方法更可包括增加皮膚中淋巴管新生因子活性或含量，如VEGF－C或VEGF－D。
在本發明另一形態中，其係為一種減少水腫(edema)的方法，係藉由降低VEGF－A活性或含量。
在本發明另一形態中，係為一種減少UVB誘導如臉、胸、頸、手或身體其它區域之皮膚損傷之方法，係藉由促進淋巴功能。
本發明另一形態中，其係為一種篩選抑制VEGF－A活性之抑制劑的方法，該方法包括：提供一具有可與VEGF－A結合及反應之跨膜受體(transmembrane receptor)的細胞；在測試化合物存在下，如天然產物或萃取物，使該細胞與含VEGF－A或其片段之多胜肽互相接觸；以及評估該多胜肽對該細胞之結合，其中，抑制多胜肽對該細胞之結合之測試化合物為抑制VEGF－A活性之抑制劑。
在本發明另一形態中，其係為一種篩選抑制VEGF－A活性之抑制劑的方法，該方法包括：提供含可結合至VEGF－A之跨膜受體部份的第一多胜肽；在測試化合物存在下，如天然產物或萃取物，使該多胜肽與含VEGF－A或其片段之第二多胜肽互相接觸，以及評估第一多胜肽對第二多胜肽之結合，其中，抑制第一多胜肽對第二多胜肽之結合之測試化合物為抑制VEGF－A活性之抑制劑。
在本發明另一形態中，其係為一種篩選抑制VEGF－A表現之抑制劑的方法，該方法包括：(a)提供一具有VEGF－A啟動子(promoter)區域之細胞；(b)使該細胞暴露於UVB照射；(c)步驟b)之前、期間或之後，使該細胞與一測試化合物(如天然產物或萃取物)互相接觸；以及(d)測定該啟動子區域所啟動之表現，其中，可降低表現之測試化合物為抑制VEGF－A表現之抑制劑。
在本發明一形態中，其係為一種治療具UVB－誘導如臉、胸、頸、手或身體其它區域之皮膚損傷之個體的方法。該方法包括投藥予個體一治療有效量之VEGF/VEGFR調節劑(modulator)。
實施例中，該調節劑為VEGF－A/VEGFR(如VEGFR－2)拮抗劑(antagonist)。VEGF－A/VEGFR拮抗劑為直接或間接降低細胞或個體中VEGF－A/VEGFR之活性的藥劑。拮抗劑包括核酸或蛋白質，如抗體或可溶性VEGF－A受體片段。舉例來說，該拮抗劑可為與VEGF－A交互作用及如減少對細胞表面VEGFR(如VEGFR－)VEGF－A結合親合力(binding affinity)之蛋白質。舉例來說，該蛋白質可為(i)辨識VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)之抗體，或(ii)包括VEGFR胞外區域如可溶性VEGF－A受體(融合至Fc功能區)之蛋白質。拮抗劑釋例包括可結合或其它方法抑制VEGF－A mRNA(如mRNA產製、處理或轉譯)的核酸分子。尚有其它拮抗劑包括：顯性抑制(dominant negative)VEGF－A蛋白或其片段及降低VEGF－A核酸表現之藥劑(如人造轉錄因子(transcription factor)或編碼人造轉錄因子之核酸)。其它適合的VEGF－A/VEGFR(如VEGFR－2)拮抗劑包括小分子、天然產物及萃取物。
實施上，該調節劑降低VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)內生含量。
一實施例中，該調節劑為VEGF－C/D/VEGFR(如VEGFR－3)促進劑(agonist)。VEGF－C/D/VEGFR促進劑為直接或間接增加個體中VEGF－C/D/VEGFR活性之藥劑。
很多VEGF－C/D/VEGFR(如VEGFR－3)促進劑增加VEGFR訊息傳導活性。VEGF－C/D/VEGFR促進劑釋例包括涵蓋VEGF－C/D多胜肽(如修飾成它的成熟異二聚體(heterodimeric form)或其生物活性片段或類似物的蛋白質、編碼VEGF－C/D或其生物活性片段或類似物之核酸。其它蛋白及分子，如抗體及小分子，亦可用於增加VEGFR活性。舉例來說，與VEGFR(如VEGFR－3)結合及選擇性交聯(如二聚化(dimerize))之抗體可用於VEGFR(如VEGFR－3)活性。其它適合VEGF－C/D/VEGFR(如VEGFR－3)促進劑包括小分子、天然產物及萃取物。
該調節劑可用於治療需要增加淋巴管功能之病情。這樣的病情包括如起因UVB照射的水腫。其它需要增加淋巴管功能之病情包括皮膚老化或皮膚損傷，如UVB造成的皮膚損傷。另外其它病情包括部分如基因或環境因子(如紫外線照射)所引起之病情。舉例來說，這病情為如老化或過度曝曬於紫外線所引起之皮膚細胞基質損傷。
本發明另一形態係特載辨識調節淋巴功能之化合物的方法。該方法包括：提供VEGF－A/VEGFR(如VEGFR－2)活性可被監控之細胞或生物體；使該細胞或生物體與一測試化合物(如天然產物或萃取物)互相接觸；以及評估細胞或生物體內VEGF－A/VEGFR(如VEGFR－2)活性。舉例來說，該細胞含VEGF－A/VEGFR(如VEGFR－2)報導子或有這樣細胞的生物體。VEGF－A/VEGFR活性可以監控如蛋白或mRNA表現或報導子活性進行評估。如報導子活性或其它相對參數改變顯示VEGF－A/VEGFR活性改變。該方法可又包括評估該測試化合物對於細胞增生或細胞移轉(如淋巴內皮細胞增生或移轉)之影響。
實施例中，該報導子為含有編碼可偵測之蛋白的序列及可操作性連結啟動子之基因，啟動子包括VEGF－A/VEGFR(如VEGFR－2)基因之啟動子區域，如下列區域：轉錄起始點(transcription start site)至上游至少100、200、300、500、800、1000、2000或5000鹼基、啟始密碼子(initiator codon)MET至上游至少100、200、300、500、800、1000、2000或5000鹼基、或TATA管理盒(TATA box)至上游至少100、200、300、500、800、1000、2000或5000鹼基。
該細胞或生物體一般為哺乳類動物，如人或非人類動物，如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、猴子等等。
本發明又另一形態係特載評估測試化合物的方法，如局部施用於測試生物體(如包含VEGF－A/VEGFR(如VEGFR－2)途徑活性之報導子的基因轉殖生物體)的化合物(如天然產物或萃取物)。該方法包括使測試化合物與該測試生物體相互接觸以及評估VEGF－A/VEGF途徑活性。舉例來說，該評估可包括評估下列蛋白或mRNA表現：VEGF－A、VEGFR(如VEGFR－2)或VEGFR所調控之基因或基因蛋白。該方法亦可包括在另一VEGF－A/VEGF途徑調節劑存在下，如包含可溶性VEGF(包含VEGFR可溶性胞外功能區的蛋白)之蛋白或對VEGF－A或VEGFR之抗體存在下，評估該測試化合物。
實施例中，報導子為含有編碼可偵測之蛋白的序列及可操作性連結啟動子之基因，啟動子包括VEGF或VEGFR基因之啟動子區域，如下列區域：轉錄起始點(transcription start site)至上游至少100、200、300、500、800、1000、2000或5000鹼基、啟始密碼子(initiator codon)MET至上游至少100、200、300、500、800、1000、2000或5000鹼基、或TATA管理盒(TATA box)至上游至少100、200、300、500、800、1000、2000或5000鹼基。該方法亦可包括評估二或多個這樣的報導子。
該方法可包括篩選是否改變如增加或減少VEGF/VEGFR途徑活性的測試化合物(如從像是天然產物或萃取物的測試化合庫)。經選擇的測試化合物可調製如醫藥組合物，如適用局部投藥或其它投藥途徑。該方法又可包括投該醫藥組合物予一個體，如有本發明所述疾病或罹患該疾病風險的個體。
本發明之一形態係特載辨識調節(如減少)皮膚損傷(如照射所引起皮膚損傷，像是慢性或急性UVB－誘導皮膚損傷)藥劑之方法。該方法包括辨識調節(如降低)VEGF－A訊號傳導之藥劑(如減少VEGF－A或VEGF受體(VEGF receptor，VEGFR)(如VEGFR－2)表現、活性或含量之藥劑)；將藥劑調節VEGF－A訊號傳導、含量或活性之能力與調節皮膚損傷(如照射所引起皮膚損傷，像是慢性或急性UVB－誘導皮膚損傷)之能力相關性分析。該方法又可包括篩選經辨識之藥劑，如調節皮膚損傷之藥劑。
實施例中，該藥劑經評估測試藥劑對VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)交互作用(如結合)之能力進行辨識。另一實施例中，該藥劑經評估測試藥劑對VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)調控區域(如啟動子，如VEGF－A或VEGFR啟動子)之交互作用影響進行辨識。另一實施例中，該藥劑經評估測試藥劑對皮膚細胞，如角質細胞(keratinocyte)，VEGF－A生產)之影響進行辨識。另一實施例中，該藥劑經評估，如定量或定性評估，測試藥劑對整個動物模型(如VEGF－A基因轉殖動物，像是VEGF－A過度表現之動物)中調節急性EGF－A訊息傳導之能力進行辨識。
該測試藥劑可為如核酸(如反義核酸(antisense)、核酸酵素(ribozyme))、多胜肽(如抗體或其抗原結合片段)、胜肽片段、擬肽類(peptidomimetic)或小分子(如低於2000道耳吞分子量之小有機分子)。該測試藥劑可經評估純度，如至少10、50、70、80、90或99%之純度，如不含其他測試藥劑之同質組合物。另一較佳實施例，該測試藥劑為組合庫之一員，如胜肽或有機組合庫、或天然產物或萃取物庫。一較佳實施例中，測試複數個測試藥劑，如化學庫成員。較佳地，該數個測試藥劑，如化學庫，分享結構或功能特性。該測試藥劑亦可為粗或半純化萃取物，如草藥萃取物，像是植物萃取物或海藻萃取物。
該方法可包括將該藥劑對於VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)表現、含量或活性與該藥劑對於哺乳類動物，如人類，之預測結果比較、關聯分析或牽連一起，以辨識該藥劑可能之效果或在哺乳類動物，如人類，之預測效果；預測結果如藉由(如政府、醫療服務、保險公司或病患)所提供關於該藥劑或它的使用之資訊、行銷或教材(如列印或電腦可讀取材料，如標籤或電子郵件)。該方法可包括辨識該藥劑作為減少如在人體中急性UVB－誘導皮膚損傷之藥劑，係與參考值比較是否該藥劑降低VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)表現、含量或活性。該辨識可為如本發明所述資訊、行銷或教材之形式。一實施例中，該方法包括藥劑效果值與減少皮膚損傷能力關聯性比較，如產生藥劑效果值與減少皮膚損傷能力關聯性資料庫。
一實施例中，該方法包括至少兩個評估步驟，如該方法包括第一步驟：評估該測試藥劑在第一系統，如無細胞、細胞、組織系統或動物模型；以及評估該測試藥劑在第二系統，如第二細胞、組織系統或非人類動物。實施例中，該評估步驟之一包括評估該藥劑對於個體皮膚或皮膚外植體之影響，如評估在皮膚中皮膚損傷之現況、程度或類型，較佳地，在急性UVB暴露前後。該個體可為實驗動物或人類。實施例中，第一評估包括測試該測試藥物對於EGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)啟動子之效果，該啟動子連結至異源序列，像是報導基因；以及第二評估包括投該測試藥劑予系統，如細胞或動物系統，並評估該藥劑對於皮膚損傷和/或VEGF生產之影響。在實施例中，該方法包括在相同系統類型進行兩個評估步驟，如該藥劑在相同或不同非人類動物第一次評估後，重複在非人類動物評估。兩個評估可由時間長短，如天、週、月或年分開進行。
在較佳實施例中，該辨識步驟包括：(a)提供藥劑予細胞、組織或非人類動物，其中細胞、組織或非人類動物之基因組包括涵蓋下列之外源核酸：VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因之調控區域(參閱如Gille et al.,EMBO J.1997 vol.16(4)：750－9 for VEGF－A promoter及Giraudo et al.,J Biol Chem.1998 vol.273(34)：22128－35 for VEGFR－2(flk1)promoter)、可操作性連結至異源序列，如編碼報導多胜肽(如比色分析蛋白(如LacZ))之核苷酸序列、冷光偵測蛋白，如螢光素酶(luciferase)或螢光可偵測報導多胜肽，如GFP、EGFP、BFP、RFP；(b)評估測試藥劑對於調節細胞、組織或非人類動物中報導多胜肽之表現的能力；以及(c)篩選調節報導多胜肽表現之測試藥劑作為調節急性UVB－誘導皮膚損傷之藥劑。
一實施例中，該動物為實驗的齧齒目動物。該動物可為野生型或基因轉殖實驗動物，如VEGF－A基因轉殖的齧齒目動物，如VEGF基因轉殖小鼠。該個體亦可為人類。較佳實施例中，該評估步驟包括投該藥劑予該個體，並評估皮膚損傷(如急性暴露於UVB所引起的皮膚損傷)。另一實施例中，該細胞或組織為皮膚細胞，如角質細胞、或組織，如皮膚外植體。又另一實施例中，細胞，如皮膚細胞，如角質細胞、或組織，如皮膚外植體為衍生自基因轉殖動物。
本發明之另一形態係特載治療個體(如人類個體)的方法。該方法包括：(a)辨識罹患或具有(如因照射暴露，如急性或慢性UVB－暴露)水腫或皮膚損傷之個體；以及(b)將調節個體中VEGF－A訊息傳導之藥劑(如天然產物或萃取物)投予個體，如將降低VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)活性、含量或表現之有效量藥劑投予該個體，藥劑如本發明所述。較佳地，該藥劑如局部投予個體皮膚。較佳實施例中，預防或降少慢性或急性UVB－誘導皮膚發紅、發炎、水腫、起水泡、腫脹和/或曬傷。急性UVB暴露意謂暴露於至少一最小紅斑量(MED)的UVB光，較佳至少2、3或5 MED。一實施例中，該個體暴露於3－8 MED間，如3－5、5－7或7－8 MED。實施例中，該個體未來、現在、過去暴露於當UV指數為中度到極高的太陽底下，如足夠時間引起曬傷。該個體可展示急性UVB暴露醫或多個症狀，如皮膚發炎、發紅、腫脹、起水泡、壓痛或水腫。一般來說，該個體至少5歲。較佳地，個體為至少10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多歲數。
較佳實施例中，該藥劑透過微脂體投藥，如卵磷脂微脂體(lecithin liposome)或烷基磷脂質(alkylphospholipid)微脂體。該藥劑可施用於臉部、胸部、頸部、手部和身體其它區域。該治療可涉及超過一種投藥，如至少兩種、三種或四種投藥。該治療亦可涉及每日投藥。
實施例中，該方法包括投予藥劑結合第二治療，如皮膚第二治療，如防曬、抗氧化、保濕、A酸(retinoic acid)、A酸衍生物或α羥基酸(alpha－hydroxy acid)。實施例中，投藥劑予個體時結合釋控裝置，如生物相容性聚合物、微粒或篩子。該裝置可減少藥劑降解及控制釋放。
實施例中，該方法包括評估該個體皮膚損傷。該評估可於投藥之前、期間獲之後執行。舉例來說，該評估可於投藥前和/或後至少4小時、8小時、12小時、1天、2天、4、7、14或更多天執行。
較佳實施例中，投藥可於下列情狀執行：暴露於UVB光前，如暴露於太陽前；經注意或診斷慢性或急性－UVB誘導皮膚損傷(如曬傷、腫脹、發紅和/或發炎)；治療皮膚損傷相關疾病開始或開始發揮它的效果；或一般需要去維持皮膚健康。
投藥期間或個體臨床效果水準維持期間可為短期，如一天、二天、一週；或長期，如六個月或超過或一年或超過；或短期，如少於一年、六個月、一個月、二週或更少。
需改善皮膚損傷個體的辨識可由如個體、醫療服務、皮膚損傷治療提供者或其它單位進行。該藥劑可由如個體、醫療服務、皮膚損傷治療提供者或其它單位進行投藥。同樣地，對於皮膚損傷效果評估可由如個體、醫療服務、皮膚損傷治療提供者或其它單位進行。
降低VEGF－A訊息傳導之藥劑可為如vEGF－A結合蛋白或VEGFR－2結合蛋白。舉例來說，這樣的結合蛋白可結合及抑制VEGF－A或結合及抑制VEGFR－2活性。該結合蛋白可抑制VEGF－A或VEGFR－2對於各自或其它結合夥伴分子交互作用能力。實施例中，該結合蛋白為特異結合VEGF－A或VEGFR－2之抗體，如中斷VEGF或VEGFR－2對各自或其它結合夥伴分子結合能力之抗體。另一藥劑釋例為結合VEGF－A或VEGFR－2，但中斷VEGF訊息傳導之經突變的不活化VEGF－A。又另一藥劑釋例為結合VEGF－A或VEGFR－2但中斷VEGF訊息傳導之VEGFR－2(如非訊息傳導變種)或其片斷(如VEGFR－2胞外功能區)。其它藥劑釋例可包括下列之VEGF－A或VEGFR－2核酸分子：結合細胞內VEGF－A或VEGFR－2核酸序列之核酸分子，如mRNA，及可抑制蛋白質表現之核酸分子，如反義核酸、siRNA分子或核酸酵素；降低VEGF－A或VEGFR－2基因表現之藥劑，如結合VEGF－A或VEGFR－2啟動子之小分子；或粗或半純化萃取物，如草藥萃取物，像是植物萃取物或海藻萃取物。
舉例來說，個體可以VEGF拮抗劑治療，如抗－VEGF抗體，像是貝伐單抗(bevacizumab)；或VEGF受體拮抗劑，如抗VEGF受體抗體或小分子抑制劑、分子量少於1500道耳吞之化合物。
抑制劑及VEGF受體拮抗劑釋例包括VEGF受體酪胺酸激酶(tyrosine kinase)活性之抑制劑。4－[4－(1－胺基－1－甲乙基)苯基]－2－[4－(2－嗎啉－4－基－乙基)苯胺基]嘧啶－5－腈(4－[4－(1－Amino－1－methylethyl)phenyl]－2－[4－(2－morpholin－4－yl－ethyl)phenylamino]pyrimidine－5－carb onitrile)為5－氰基嘧啶(5－cyanopyrimidines)結構組群之一，為可口服、具選擇性、奈莫耳(nanomolar)之血管內皮生長因子受體－2(VEGF－R2)抑制劑。其他釋例包括PTK－787/ZK222584(Astra－Zeneca)，SU5416,SU11248(Pfizer)及ZD6474([N－(4溴－2－氟苯基)－6－甲氧基－7－[(1－甲基哌啶－4－基)甲氧基]喹唑啉－4－胺]([N－(4－bromo－2－fluorophenyl)－6－methoxy－7－[(1－me thylpiperidin－4－yl)methoxy]quinazolin－4－amine]))。尚有其它可用藥劑為廣泛專一酪胺酸激酶抑制劑，如SU6668，參閱如Bergers,B.et al.(2003)J.Clin.Invest.111,1287－1295。
其它較佳實施例中，抑制VEGF－A或VEGFR－2係藉由降低內源VEGF－A或VEGFR－2基因表現水準，如降低VEGF－A或VEGFR－2基因轉錄。一較佳實施例中，VEGF－A或VEGFR－2基因轉錄可由下列方式降低：改變內源VEGF－A或VEGFR－2基因調控序列，如增加像是轉錄抑制子(transcriptional repressor)DNA－結合位置之負調控序列，或移除像是增強子(enhancer)或轉錄活化子DNA－結合位置之正調控序列。另一較佳實施例中，結合VEGF－A或VEGFR－2抗體為單株抗體，如人類化嵌合或人類單株抗體。
一實施例中，降低VEGF表現之藥劑為下列之VEGF－A或VEGFR－2核酸分子：結合細胞內VEGF－A或VEGFR－2核酸序列之核酸分子，如mRNA，及可抑制蛋白質表現之核酸分子，如反義核酸、siRNA分子或核酸酵素；降低VEGF－A或VEGFR－2基因表現之藥劑，如結合VEGF－A或VEGFR－2啟動子之小分子；或粗或半純化萃取物，如草藥萃取物，像是植物萃取物或海藻萃取物，如石榴籽(pomegranate seed)油或葡萄子油。
該方法更包括：增加一或多個淋巴因子活性，如增加像是個體中VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)之天然淋巴因子活性。VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)活性增加可藉由如投予增加VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)活性之藥劑。一較佳實施例中，增加VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)活性之藥劑可為一或多個下列物質：VEGF－C或－D多胜肽或其生物活性片段或類似物，如VEGF－C或－D衍生多胜肽或其反一轉型多肽(retro－inverso polypeptide)；編碼VEGF－C或－D多胜肽之核酸或其生物活性片段或類似物；VEGF－C或－D促進劑，如具有或增加VEGF－C或－D活性之抗體或小分子；或增加VEGF－C或－D核酸表現之藥劑，如結合VEGF－C或－D啟動子區域併增加表現之小分子。
一較佳實施例中，VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)增加藉由藥劑，如誘導VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)表現之小分子。一較佳實施例中，誘導VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)表現之藥劑可局部施用。一較佳實施例中，暴露UVB前，如暴露於太陽底下，該藥劑投予個體，以便於暴露UVB同時個體皮膚產生淋巴管新生效果。
VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)增加亦可藉由下列控制釋放至個體：VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)核酸或VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)蛋白、片段或類似物。VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)核酸、蛋白、片段或類似物可結合控制釋放裝置投予個體，如生物相容性聚合物、微粒或篩子。該裝置可減少VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)核酸、蛋白、片段或類似物降解及控制釋放。這樣VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)生物相容性控制釋放系統可藉由下列投予個體如肌肉內、皮下、靜脈內、或器官、關節腔或病灶注射或灌輸。
VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)含量增加亦可藉由增加內源VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)活性。活性增加可透過增加基因表現水準，如增加VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)基因轉錄；增加VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)mRNA穩定性，如改變該mRNA二級或三級結構；增加VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)mRNA轉譯，如改變VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)mRNA序列；和/或增加VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)蛋白穩定性。VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)基因轉錄可透過如改變內源VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)基因調控序列而增加。一實施例中，該調控序列可藉由下列改變：增加像是增強子或轉錄活化子DNA－結合位置之正調控序列；刪除像是轉錄抑制子(transcriptional repressor)DNA－結合位置之負調控序列；和/或以其它基因取代內源調控序列或本發明之元件，俾使VEGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)基因更有效轉錄。
一實施例中，該藥劑為組合物，如誘導EGF－C或－D或VEGFR(如VEGFR－3)之小分子或或粗或半純化萃取物，如草藥萃取物，像是植物萃取物或海藻萃取物。
本發明之另一形態係特載組合物，含有降低VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)表現、活性或含量之藥劑，如本發明所述之藥劑，如經本發明篩選方法所辨識之藥劑，以減少急性或慢性UVB－誘導皮膚損傷。一較佳實施例中，該組合物為化粧品組合物，如調製成局部施用。一較佳實施例中，該組合物亦有香味、防腐劑或其它化粧品成分，如保濕劑或防曬劑，如桂皮酸鹽(octyl methoxycinnamate)、胺基苯甲酸(aminobenzoic acid)、氰笨甲酮((oxybenzone)、二甲基氨基苯甲酸(padimate O)、甲基水楊醇(homosalate)或二氧化鈦(titanium dioxide)。該組合物可以做成洗髮精、油、乳霜、乳液、肥皂、泡沫、膠或其它化粧品類型。一較佳實施例中，該組合物亦有化粧品成分，如香味或保濕劑。
本發明之另一形態係特載降低VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)表現、活性或含量之藥劑，如本發明所述之藥劑，如經本發明篩選方法所辨識之藥劑的應用，用以製備治療降低慢性或急性UVB－誘導皮膚損傷之藥物。實施例中，該藥物又包括增加VEGF－C、VEGF－D或VEGFR－3表現、活性或含量之藥劑。
本發明之另一形態係特載調節個體中皮膚損傷之方法。該方法包括提供該個體予含有影響VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)表現、活性或含量之藥劑，如本發明所述之藥劑，如經本發明篩選方法所辨識之藥劑的組合物；以及提供使用指導手冊，如治療像是急性UVB－誘導皮膚損傷的皮膚損傷。
本發明之另一形態係特載調節個體中皮膚損傷之套組，包括本發明所述之組合物，如含有影響VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)表現、活性或含量之藥劑之組合物；以及使用指導手冊，如說明施用該組合物於需急性UVB－誘導皮膚損傷治療之身體區域，如發紅、腫脹、曬傷和/或發炎。一較佳實施例中，該組合物亦有化粧品成分，如香味或保濕劑。
本發明藥劑之有效量定義為投藥予個體(如人類)以減少個體中皮膚損傷的組合物之數量。投予個體之有效量一般基於個種因素，包括年紀、性別、表面積、體重及皮膚情況。身體表面積可從病患身高體重判斷，參閱如Scientific Tables,Geigy Pharmaceuticals,Ardley,New York,1970,537。有效劑量為所熟悉該項技藝者所調整，視其投藥途徑、賦形劑使用及與像是皮膚損傷調節化合物使用之其他治療共用之可能性。
本發明之另一形態係特載一種方法，包括施用VEGF訊息傳導抑制劑保護量於人類個體皮膚區域(如前手臂、腳、背、軀幹、頭、臉、頭皮)；以及使個體暴露於照射中，如陽光，如直接或間接密集陽光；或紫外光，如助曬機。保護量為足以減少皮膚損傷制可偵測或統計顯著差異水準之數量。
本發明之另一形態係特載監控個體或個體的細胞，如皮膚細胞，之方法。該方法包括評估VEGF－A、－C和－D一或多個表現。相對於參考值(如對照或非經照射之細胞)，VEGF－A含量增加及VEGF－C或－D含量降低可謂該個體或個體細胞已暴露於皮膚損傷病情，如照射，如UVB照射，或風險。
本發明所用暴露於UVB－照射意謂暴露於至少一個MED的自然日光或人造UVB照射(如UVB日光燈，如用以助曬或光治療，如用於治療牛皮癬(psoriasis)、異位性皮膚炎(atopic dermatitis)或白斑(vitiligo))。
除非另有定義，此處所用之所有技術及科學名詞如同熟習該項技藝者所一般所了解之意思。雖然與此處所用相似或等同之方法及材料可用以本發明之實踐或測試，適當方法及材料仍敘述如下。此處所述之所有公開資料、專利申請、專利及其他參考資料之全部內容結合於此為參考。在有爭議時，本說明書，包括定義，將有所管理。此外，該材料、方法及實施例僅舉例而非用以限制。
本發明一或多個實施例之細節伴隨下列圖示及說明。本發明之其他特徵、目的及優點可由下列實施例及圖示以及申請專利範圍所了解。
紫外線B(UVB)照射誘導皮膚紅斑、細胞間質分子降解及皮膚起皺紋。淋巴管於正常皮膚維持體液平衡扮演重要角色。已知老鼠皮膚經急性或慢性UVB照射導致淋巴管明顯膨大。經活體淋巴管造影術偵測，驚人地發現，這些澎大的淋巴管功能受損且呈現高滲透。在UVB照射的表皮中，血管內皮生長因子受體－2而非淋巴管新生因子)VEGF－C或－D表現量增強。基因轉殖小鼠經UVB照射表皮，VEGF－A標的過量表現導致淋巴管澎大及滲漏增加，而VEGF－A訊息系統性阻斷卻大量防止因UVB誘導之淋巴管異常及光損傷。這些發現同時指出淋巴管作為預防UVB誘導皮下光損傷之新穎標的，且也暗喻淋巴功能加強，如透過像是VEGF－C之淋巴管新生因子，可減輕UVB照射所引起之損傷，該損傷部分為皮膚中VEGF－A所促成。因此，本發明特載治療(如減少、改善、預防)皮膚(如以UVB誘導)損傷的方法，其係藉由降低個體如皮膚之VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)含量或活性。
VEGF及VEGF請參照Shibuya and Claesson－Welsh(2006)Exp.Cell Res.312：549－60；Byrne et al.(2005)J.Cell.Mol.Med.9：777－94；以及Coultas et al.(2005)Nature 438：937－45。
UVB損傷
UV指數(由美國環境保護局(United States Environmental Protection Agency)所發展)指出給定日子日光UV光之強度。分成四類：中(UV指數低於3)、高(UV指數為3至6)、很高(UV指數為6至10)及極高(UV指數超過10)。中UV指數意謂超過一個小時皮膚將晒傷；極高意謂低於15分鐘皮膚將晒傷。通常天氣報導慧報導該指數。臨床上，UVB暴露以最小紅斑量(minimal erythema doses，MED)作為量測。一個MED為敏感性皮膚產生曬傷所需UVB數量。中度至嚴重UVB－誘導皮膚損傷，如曬傷，為3－8 MED。
篩選方法
有數種方法用以評估可調節VEGF－A訊息傳導，如VEGF－A或VEGFR基因表現、活性或含量。一實施例中，測試藥劑對於調節，如永久性或短暫性增加或降低，由VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因啟動子啟動表現之能力可藉由如常規的報導基因(如LacZ或GFP或螢光素酶(luciferase))轉錄分析進行評估。舉例來說，基因組包含報導基因可操作性連結至VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)啟動子的細胞或基因轉殖動物可與測試藥劑相互接觸；而該測試藥劑對於增加或降低報導基因活性之能力代表該藥劑對於調節急性UVB皮膚損傷之能力。另一實施例中，測試藥劑對於調節VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因表現或VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)活性或含量之能力評估於基因轉殖動物執行，如本發明所述之基因轉殖動物。
測試藥劑對於VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因表現或VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)活性或含量之影響亦可於細胞、細胞溶解液(cell lysate)或個體評估，較佳為非人類實驗哺乳類動物及更佳為嚙齒類動物(如大鼠、小鼠或兔子)或其外植體(如皮膚)。評估VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因表現之方法為熟悉該項技藝者所熟知，如北方分析(Northern analysis)、核糖核酸酶保護分析(Ribonuclease Protection Assay，RPA)、逆轉錄－聚合酶鏈反應(Reverse Transcription－Polymerase Chain Reaction,RT－PCR)或RNA原位雜交(in situ hybridization)(參閱如Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual (3rd ed.2001))。VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)含量可藉由如西方分析(Western analysis)、免疫分析或原位雜交監控。VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)活性，如改變啟動子結合和/或轉錄活性，可藉由電泳膠遲緩試驗(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)、DNA足跡法(DNA footprinting)或報導基因分析判斷。較佳地，測試藥劑對於VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因表現或VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)活性或含量之影響觀察可作為個體中皮膚損傷之改變。更佳地’測試藥劑對於VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因表現或VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)活性或含量之影響於基因轉殖細胞或非人類動物或其外植體或細胞，並與野生型細胞或或非人類動物或其外植體或細胞比較，有改變VEGF訊息傳導。
該測試藥劑可投藥予表現轉殖基因之細胞、細胞萃取物、外植體或個體，該轉殖基因包括融合至LacZ 之VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因啟動子(增強或抑制轉殖基因(如報導基因，如LacZ 或GFP )轉錄增強或抑制作為該測試化合物對VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因啟動子或調控自VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因啟動子轉錄之因子的影響，可更容易以顏色改變觀察)。報導轉錄物含量及VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因啟動子活性可已建立方式做監控，如北方分析、核糖核酸酶保護分析、逆轉錄－聚合酶鏈反應或RNA原位雜交(參閱如Cuncliffe et al.(2002)Mamm.Genome 13：245)。藥劑可使用無細胞系統進行評估，如包含下列之環境：該VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因啟動子－報導轉殖基因(如VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因啟動子－LacZ 轉殖基因)、結合VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因啟動子之轉錄因子、粗細胞溶解液或核蛋白萃取物(nuclear extract)及該測試藥劑(如本發明所述之藥劑)，其中該藥劑對VEGF－A或VEGFR(如VEGFR－2)基因啟動子之影響以顏色改變偵測。
實施例中，VEGF－A及其生物活性片段作為經純化多肽。經純化多肽包括體外產生之多肽(如由體外轉譯或利用自動多肽合成器合成)及於細胞(如原核細胞、真核細胞、昆蟲細胞、酵母菌細胞、哺乳類動物細胞、植物細胞)先表現並經純化之多肽。表現經純化多肽的細胞可包括編碼內源基因的細胞、編碼多肽表現載體轉染之細胞以及實驗操作以誘導一般不在細胞表現之內源基因表現(如基因活化技術)的細胞。實施例中，多肽為融合蛋白(如VEGFR－麩胱胺酸－S－轉移酶(Glutathione－S－transferase，GST)融合蛋白)，可融合蛋白可包括蛋白酶切位點以便切斷且融合蛋白切斷成個別多肽。實施例中，多肽可包括促進該多肽純化之胺基酸序列(如多組胺酸標籤(multiple histidine tag)、FLAG標籤等)。從細胞分離蛋白或細胞表現之多肽的方法包括親和力純化、分子大小排斥層析(size exclusion chromatography)、高效液態層析(high performance liquid chromatography)及其它層析純化方法。該多肽可轉譯後修飾，如糖基化。
本發明另一形態包括篩選測試化合物方法，以辨識調節VEGF－A多肽及VEGFR(如VEGFR－2)多肽脂蛋白－蛋白交互作用之化合物。用於具有調節轉錄調節劑間蛋白－蛋白交互作用之化合物高通量篩選方法敘述於Lepourceletet al. ,Cancer Cell 5：91－102(2004)，並結合該全部作為參考。通常，提供第一化合物。第一化合物為VEGF－A多肽或其生物活性片段或第一化合物為VEGFR(如VEGFR－2)多肽或其生物活性片段。提供第不同於第一化合物且經標記之第二化合物。第二化合物為VEGF－A多肽或其生物活性片段或第二化合物為VEGFR(如VEGFR－2)多肽或其生物活性片段。提供測試化合物。第一化合物、第二化合物及測試化合物相互接觸。然後量測結合至第一化合物的標誌量。以結合之標誌評估第一化合物及第二化合物間蛋白－蛋白交互作用改變，以作為化合物在調節VEGF－A及YEGFR(如VEGFR－2)間蛋白－蛋白交互作用有效性之指標。實施例中，該改變相對於無添加該測試化合物之相同反應作為評估。
特定實施例中，所提供第一化合物附著於固相支撐體。該固相支撐體包括如樹脂，如瓊脂糖、微球及多孔穴平板。特定實施例中，該方法包括接觸步驟後清洗步驟，以便分離附著及未附著標定物。
特定實施例中，複數個測試化合物與第一測試化合物及第二測試化合物相互接觸。不同測試化合物可與其它化合物集體或分別相互接觸。特定實施例中，每一測試化合物與第一測試化合物及第二測試化合物兩者於個別孔穴相互接觸。舉例來說，該方法可篩選測試化合物庫。測試化合物庫詳細討論於上。化合物庫可包括如天然產物、有機化合物、胜肽和/或經修飾胜肽(包括如D－胺基酸、非傳統胺基酸及N－取代胺基酸)。通常，該化合物庫為與多孔穴盤(如96孔穴盤)篩選相容之形式。該分析對於多孔穴盤形式自動執行特別有用，該多孔穴盤形式自動執行很多步驟為電腦所控制，並由自動機器執行。該化合物庫亦可為用於其它形式，如合成化合物庫固定於固相支撐體且以微量吸管釋放。
特定實施例中，第一化合物為VEGF－A多肽或其片段；以及第二化合物為VEGFR(如VEGFR－2)多肽或其片段。第一化合物固定之固相支撐體可為如瓊脂糖小珠(sepharose bead)、SPA小珠(結合閃爍(scintillant)之圓球微粒)或多孔穴盤。當分析時無清洗步驟如親近閃爍檢測(Scintillation Proximity Assay，SPA)，SPA小珠可使用。當分析時無清洗步驟，瓊脂糖小珠可使用。第二化合物可以允許偵測之標誌物標記，如放射標誌、螢光劑、生物素(biotin)、胜肽標籤(peptide tag)或酵素片段。第二化合物亦可以如125 I或3 H標記。
特定實施例中，酵素之酵素活性化學連結至第一或第二化合物或與第一或第二化合物作為融合蛋白表現，用以偵測結合之蛋白。亦包括可用以偵測結合之蛋白之標準免疫方法的結合分析。特定實施例中，VEGF－A多肽或其片段及VEGFR(如VEGFR－2)多肽或其片段之交互作用以位於供體螢光團(donor fluorophore)及受體螢光團(acceptor fluorophore)之螢光共振能量傳遞(fluorescence resonance energy transfer；FRET)偵測；供體螢光團共價連結VEGF－A(如螢光基團化學結合至VEGF－A或以VEGF－A－GFP嵌合蛋白之綠色螢光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的變體)；受體螢光團共價連結VEGFR(如VEGFR－2)多肽或其片段；其中供體釋放光譜與受體激發光譜有適當之重疊，以給予有效非放射能量轉移，而當螢光團因VEGF－A多肽及VEGFR(如VEGFR－2)多肽蛋白交互作用，使得螢光團靠近，受體螢光團會因接收共振能量而釋放出螢光。
另一實施例中，該蛋白－蛋白交互作用以酵素，如β－半乳糖甘酶，重組功能區進行偵測(參閱Rossiet al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：8405－8410(1997))。
又另一實施例中，該蛋白－蛋白交互作用於細胞以適當EspFU 多肽及Tir或N－WASP多肽嵌合構築體的螢光比率濃度測量圖像(fluorescence ratio imaging)分析(Bacskaiet al. ,Science 260：222－226(1993))或利用VEGF－A及VEGFR(如VEGFR－2)之適當構築體的二雜交分析之變體分析(Fearonet al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7958－7962(1992)；Takacset al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10375－10379(1993)；Vidalet al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：10315－10320(1996)；Vidalet al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：10321－10326(1996))且量身訂做高通量分析，以偵測抑制VEGF－A/VEGFR交互作用之化合物。這些實施例具有化合物細胞滲透性之優勢，在確定之分析中作為調節劑。
舉例來說，一分析中，但非唯一分析，VEGF－A多肽或其片段被吸附至ELISA穴盤。然後，VEGF－A多肽暴露於測試化合物，再暴露於麩胱胺酸－S－轉移酶－VEGFR(如VEGFR－2)多肽融合蛋白。結合之蛋白以山羊抗GST抗體、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)連抗－山羊IgG及AP受質進行偵測。干擾蛋白－蛋白交互作用之化合物於ELISA穴盤減少AP訊息。
藥劑釋例
各種藥劑可用作為VEGF(如VEGF－A,－C或－D)或VEGFR(如VEGFR－2或－3)調節劑以治療或預防皮膚損傷。該藥劑可為用以投於個體之任何種類化合物(如抗體、蛋白質、胜肽、醣蛋白、醣脂質、多醣、寡醣、核酸、生物有機分子、擬肽類、醫藥藥劑及它們代謝物、轉錄及轉譯控制序列、天然產物及萃取物等等)。一實施例，該VEGF/VEGFR調節劑為生物製藥如具有分子量位於5－300kDa之蛋白。
舉例來說，VEGF/VEGFR調節劑可抑制VEGF對VEGFR之結合或可避免VEGF－引介訊息傳導，如VEGFR蛋白所傳導，如VEGFR－2。可結合至VEGF之VEGF/VEGFR調節劑可改變VEGF構型，阻礙VEGF對VEGFR結合或其它降低VEGF對VEGFR親和力，或避免VEGF及VEGFR交互作用。另外，VEGF/VEGFR調節劑可刺激VEGF對VEGFR之結合或可誘導於無VEGF下VEGFR蛋白所活化。
VEGF/VEGFR調節劑(如抗體)可結合至VEGF或至VEGFR，其親和常數(Kd )少於10－6 ,10－7 ,10－8 ,10－9 或10－10 M。該VEGF/VEGFR調節劑結合至VEGF(即VEGF－A親和力至少5,10,20,50,100,200,500或1000勝過對於非－VEGF－蛋白親和力，如VEGF－C或VEGF－D)。較佳VEGF/VEGFR調節劑專一地結合至VEGF或VEGFR，如VEGF或VEGFR特異抗體。
VEGF/VEGFR調節劑釋例包括結合至VEGF或VEGFR抗體及與細胞表面VEGFR競爭之VEGFR可溶形式用以結合至VEGF。VEGFR可溶形式釋例為包括至少VEGFR胞外功能區部分之蛋白(如VEGFR－2或VEGFR－3可溶VEGF－結合片段，如包括結合至VEGF部分)。
該VEGFR蛋白可溶形式釋例包括結合至VEGF之VEGFR蛋白區域，如胞外功能區，如細胞外區域之功能區。該區域可為物理連結，如在N－或C－融合至另一胺基酸序列，如Fc功能區。來自VEGFR的區域可為異源胺基酸之連接子(linke)所隔開。其它VEGFR可溶形式，如不包括Fc功能區之形式，亦可使用。
VEGF/VEGFR調節劑釋例包括結合至VEGF和/或VEGFR之抗體。一實施例中，該抗體抑制VEGF及VEGFR間交互作用，如藉由物理阻斷該交互作用，降低VEGF和/或VEGFR對於它的配對物之親和力，瓦解VEGF複合物或使不穩定，隔離VEGF或VEGFR，以VEGF或VEGFR為目標降解。一實施例中，該抗體可結合至VEGF及VEGFR抗原決定部位(epitope)，該抗原決定部位包括參與VEGF/VEGFR結合介面之一或多個胺基酸殘基。這樣的胺基酸殘基可透過如丙胺酸掃描(alanine scanning)辨識。另一實施例中，該抗體可結合至不參與VEGF/VEGFR結合之殘基。舉例來說，該抗體可改變VEGF或VEGFR構型，俾使減少結合親和力；或該抗體立體阻礙VEGF/VEGFR結合。
除結合至VEGF和/或VEGFR之抗體外，其他抗體可使用。實施例中，該抗體可避免VEGF/VEGFR引介事件或活性之活化。
本發明所用之術語「抗體(antibody)」係指包括至少一個免疫球蛋白變異區(immunoglobulin variable region)，如作為免疫球蛋白變異功能區之胺基酸序列或免疫球蛋白變異功能區序列。舉例來說，抗體可包括重鏈(H)變異區(簡稱VH)及輕鏈(L)變異區(簡稱VL)。另一實施例，抗體包括兩個重鏈(H)變異區及兩個輕鏈(L)變異區。術語「抗體(antibody)」包括抗體之抗原結合片段(如單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)2 片段、Fd片段、Fv片段及dAb片段)及完整抗體，如IgA,IgG(e.g.,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4),IgE,IgD,IgM(及其亞型)完整和/或全長免疫球蛋白。免疫球蛋白輕鏈可為κ或λ。一實施例中，該抗體為糖基化(glycosylate)。抗體可具有抗體依賴性細胞介導的細胞毒反應(antibody－dependent cytotoxicity)和/或補體引介性細胞毒反應(complement－mediated cytotoxicity)功能或對這些活性一或兩個不具活性。
該VH及VL區域可進一步再分成高度多變區域，稱為互補決定區域(complementarity determining region，CDR)，穿插較保守之區域稱為骨架區(framework regions，FR)。The extent of the FR及CDR的程度已經被精準確定(參閱Kabat,E.A.,et al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition ,US Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91－3242；and Chothia,C.et al. (1987)J.Mol.Biol. 196：901－917)。本發明所採用微Kabat定義。每一VH及VL一般由三個CDR及四個FR所組成，從胺基端至羧基端依下列順序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。
「免疫球蛋白功能區(immunoglobulin domain)」係指免疫球蛋白分子變異區之功能區或恆定功能區。免疫球蛋白功能區一般包含兩個大約七條β－股(β－strand)及保守雙硫鍵所形成之β摺板(參閱如A.F.Williams and A.N.Barclay(1988)Ann.Rev Immunol. 6：381－405)。「免疫球蛋白變異功能區序列(immunoglobulin variable domain sequence)」係指可在適合抗原結合構型上形成足以上定位CDR序列結構之胺基酸序列。舉例來說，該序列可包括天然變異功能區胺基酸序列所有或部分。舉例來說，該序列可刪去一、二或多個N－或C－端胺基酸、內部胺基酸；可包括一或多個插入或增加末端胺基酸；或可包括其它變型。一實施例中，包括免疫球蛋白變異功能區序列之多肽可連結其它免疫球蛋白變異功能區序列形成標的結合結構(或抗原結合位置(antigen binding site))，如與VEGFR交互作用之結構。
該抗體VH或VL鏈可進一步包括輕鏈或重鏈恆定區所有或部分，俾使分別形成重或輕免疫球蛋白鏈。一實施例中，該抗體為兩條重免疫球蛋白鏈及兩條輕免疫球蛋白鏈之四聚體。I該重及輕免疫球蛋白鏈可透過雙硫鍵連結。該重鏈恆定區一般包括三個恆定功能區CH1、CH2及CH3。該輕鏈恆定區一般包括CL功能區。輕鏈或重鏈變異區包含與抗原交互作用的結合功能區。該抗體恆定區一般引介抗體對寄主組織或因子之結合，包括免疫系統各種細胞(如效應細胞(effector cell))及典型補體系統之第一分子(Clq)。
抗體之一或多個區域可為人源的、有效地人源的(effectively human)或人源化。舉例來說，一或多個變異區可為人源的、有效地人源的。舉例來說，一或多個CDR，如HC CDR1,HC CDR2,HC CDR3,LC CDR1,LC CDR2及LC CDR3可為人源的。每一輕鏈CDR可為人源的。HC CDR3可為人源的。一或多個骨架區可為人源的，如HC或LC之FR1,FR2,FR3及FR4。一實施例中，所有骨架區為人源的，如衍生自人類體細胞，如生產免疫調蛋白之造血細胞(hematopoietic cell)或非造血細胞。一實施例中，該人類序列為種細胞(germline)序列，如編碼種細胞核酸。一或多個恆定區可為人源的、有效地人源的或人源化。另一實施例，該骨架區(如FR1、FR2及FR3共同及FR1,FR2,FR3及FR4共同)至少70,75,80,85,90,92,95或98%或整個可為人源的。舉例來說，FR1、FR2及FR3共同地可為至少92,95,98或99%或完全與人類種細胞片段編碼知人類序列相同。
「有效地人源的(effectively human)」免疫球蛋白變異區為包括足量人類骨架胺基酸位置之免疫球蛋白變異區，以便該免疫球蛋白變異區不會在人體引起免疫原性反應(immunogenic response)。「有效地人源的(effectively human)」抗體為包括足量人類骨架胺基酸位置之抗體，以便該抗體不會在人體引起免疫原性反應。
人源化(humanized)免疫球蛋白變異區為經修改之免疫球蛋白變異區，以便該修改型在人體較非修改型引起較少免疫原性反應，修改成包括足量人類骨架胺基酸位置，以便該免疫球蛋白變異區不會在人體引起免疫原性反應。人源化免疫球蛋白之敘述包括如美國專利號6,407,213及5,693,762。一些案例，人源化免疫球蛋白可包括於一或多個骨架胺基酸位置中一非人類胺基酸。
結合至VEGF或VEGFR之抗體可藉由各種方式產生，包括免疫，如利用動物或像是噬菌體表面展示技術(Phage display)之體外方法。VEGF或VEGFR所有或部分可作為免疫原(immunogen)或篩選之標的。舉例來說，VEGF或其片段、VEGFR或其片段可作為免疫原。一實施例中，該接種動物包含具有天然、人類的或部分人類免疫球蛋白基因座(loci)之免疫球蛋白生產細胞。一實施例中，該非人動物包括至少部份人類免疫球蛋白基因。舉例來說，製作具有人類Ig基因座大片段但缺少小鼠抗體隻小鼠品系是為可能的。因此，利用融合瘤(hybridoma)技術，至少部份人類具有所要特異性之抗原特異單株抗體可生產及篩選，參閱如XENOMOUSETM ,Greenet al. (1994)Nat.Gen. 7：13－21；美國專利申請號US 2003－0070185；美國專利號5,789,650及WO 96/34096。
對VEGF及VEGFR之非人類抗體亦可由如嚙齒類動物生產。該非人類抗體可為人源化，如敘述於歐洲專利號239 400、美國專利號6,602,503、5,693,761及6,407,213，非免疫或其它修飾使得成為有效地人源的。
歐洲專利號239 400(Winteret al. )敘述藉由對一物種之互補決定區域(一給定之變異區)以不同物種的取代改變抗體。一般而言，非人(如鼠科動物)抗體之CDR取代至人類抗體相對應區域，其利用重組核酸技術生產編碼所要經取代抗體之序列。所要之同型(Isotype)抗體(通常為CH之γ及CL之κ)之人類恆定區基因片段可增加且該人源化重鏈及輕鏈基因可於哺乳類動物細胞共同表現以產生可溶性人源化抗體。人源化抗體其他方法亦可使用。舉例來說，其它方法可產生抗體、立體鄰近結合抗原決定位(determinant)之骨架及免疫原胜肽序列之立體結構。參閱如WO 90/07861；美國專利號5,693,762、5,693,761、5,585,089及5,530,101；Tempestet al. (1991)Biotechnology 9：266－271及美國專利號6,407,213。
結合至VEGF及VEGFR之全人類單株抗體可以如利用體外引發人脾細胞(vitro－primed human splenocytes)生產，如文獻所述：Boerneret al. (1991)J.Immunol. 147：86－95。它們也可利用全套選殖(repertoire cloning)製備，如Perssonet al. (1991)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88：2432－2436或Huang and Stollar(1991)J.Immunol.Methods 141：227－236、美國專利號5,798,230。大非接種人類噬菌體表面展示庫亦可用於分離高親和力抗體，該抗體可利用標準噬菌體技術發展成人類藥物(參閱如，Hoogenboomet al. (1998)Immunotechnology 4：1－20；Hoogenboomet al. (2000)Immunol Today 2：371－378；and US 2003－0232333)。
本發明所述之抗體及其它蛋白可於原核及真核細胞生產。一實施例中，該抗體(如scFv)於像是Pichia 、Hanseula 或Saccharomyces 酵母菌細胞表現(參閱如Powerset al. (2001)J.Immunol.Methods 251：123－35)。
抗體，尤其是全長抗體，如IgG，可於哺乳類動物細胞生產。用以重組表現之哺乳類動物細胞釋例包括具有參閱如Kaufman and Sharp(1982)Mol.Biol. 159：601－621)的中國DHFR可篩選標誌之倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)(包括二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞(dihydrofolate reductase－negative CHO cell)如Urlaub and Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216－4220所述，淋巴細胞系，如NS0瘤細胞及SP2細胞、COS細胞、K562及來自轉殖基因動物(如基因轉殖哺乳類動物)之細胞。舉例來說，該細胞為乳腺上皮細胞。
除編碼免疫球蛋白功能區之核酸序列外，該重組表現載體可攜帶核酸序列，如於寄主細胞調控載體複製之序列(如複製起點(origin of replication或ori))及可篩選之標誌基因。可篩選之標誌基因促使該載體導入之寄主細胞篩選(參閱如美國專利號4,399,216；4,634,665及5,179,017)。可篩選之標誌基因釋例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於dhfr － 寄主細胞，以甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)篩選/放大)及neo 基因(以G418篩選)。
抗體(如全長抗體或其抗原結合部分)重組表現系統釋例中，編碼抗體重鏈及抗體輕鏈兩者重組表現載體以磷酸鈣介導轉染(calcium phosphate－mediated transfection)導入dhf －CHO細胞。該重組表現載體內，該抗體重及輕鏈基因每一可操作連結至增強子/啟動子調控元件(如衍生自SV40、CMV、腺病毒(adenovirus)等等，如CMV增強子/AdMLP啟動子調控元件或SV40增強子/AdMLP啟動子調控元件)，以驅動高水準基因轉錄。該重組表現載體亦攜帶DHFR基因，以甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)篩選/放大篩選已轉染該載體之CHO細胞。經篩選之轉型株(transformant)寄主細胞培養以供抗體重及輕鏈表現，且從培養基回收完整抗體。標準分子生物技術用於製備該重組表現載體，轉染該寄主細胞、篩選轉型株、培養寄主細胞及自培養基回收抗體。舉例來說，一些抗體可以具蛋白A或蛋白G之親和色層分析分離。
抗體(及Fc融合)亦可包括修飾，如改變Fc功能之修飾，如增加或移除與Fc受體或C1q或兩者之交互作用。舉例來說，該人類IgG1恆定區可於一或多個殘基突變，如於一或多個殘基234和237，如按照美國專利號5,648,260。其它修飾釋例包括敘述於美國專利號5,648,260那些。
一些包括Fc功能區之蛋白，該抗體/蛋白生產系統可設計成合成糖基化Fc區之抗體或其它蛋白。舉例來說，IgG分子功能區於CH2功能區之天門冬胺酸(asparagine)297糖基化。Fc功能區亦可包括其它真核後轉譯修飾。其它案例，該蛋白以未經糖基化形式生產。
抗體和其他蛋白亦可以基因轉殖動物生產。舉例來說，美國專利號5,849,992敘述於基因轉殖哺乳類動物乳腺表現抗體的方法。轉殖基因構築包括奶汁特異啟動子(milk－specific promoter)及編碼所要抗體之核酸序列，如本發明所述之抗體，及分泌訊息序列。這樣雌性基因轉殖哺乳類動物所生產之乳汁包括分泌之所要之蛋白，如抗體或Fc融合蛋白。該蛋白可從乳汁純化或在一些應用直接使用。
內文方法所述抗體可採用其它蛋白，如Fc融合及可溶性受體片段。
特定執行上，核酸拮抗劑用於降低編碼VEGF或VEGFR內源基因之表現。一實施例中，該核酸拮抗劑為以編碼VEGF或VEGFR之mRNA為標的之siRNA。拮抗性酸拮之其它類型亦可用的如dsRNA、核酸酵素、三螺旋形式(triple－helix former)或反義核酸。實施例中，核酸拮抗劑可針對VEGFR活化之下游效應標的作用。
siRNA為選擇性包括突出之小型雙股RNA(dsRNA)。舉例來說，siRNA雙股區域長度大約18－25個核苷酸，如長度大約19,20,21,22,23或24個核苷酸。一般來說，該siRNA序列精準與標的mRNA互補。尤其是dsRNA及siRNAs可用以使捕乳類動物細胞(如人類細胞)基因表現沉默。siRNA亦包括具有29鹼基對極2－核苷酸3’突出之短髮夾RNA(shRNA)。參閱如Clemenset al. (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6499－6503；Billyet al. (2001)Proc.Natl.Sci.USA 98：14428－14433；Elbashiret al. (2001)Nature. 411：494－8；Yanget al. (2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：9942－9947；Siolaset al. (2005),Nat.Biotechnol. 23(2)：227－31；美國專利公開號20040086884；、20030166282、20030143204、20040038278及20030224432。
反義藥劑可包括如從大約8至大約80個核苷鹼基(即從大約8至大約80個核苷酸)，如大約8至80個核苷鹼基或大約12至30個核苷鹼基。反義化合物包括核酸酵素、外源指導序列(external guide sequence，EGS)、寡核苷酸(寡酶(oligozyme))及其它短催化RNA或與該標的核酸雜交並調節表現之催化寡核苷酸。反義化合物可包括與標的基因之序列互補之至少八個保守核苷鹼基架構。寡核苷酸不需與它特異雜交標的核酸序列100%互補。寡核苷酸為可特異雜交，是以寡核苷酸對該標的之結合妨礙該標的分子正常功能，引起利用損失，並有足夠程度互補以避免於需要特異結合之條件下，該寡核苷酸對於非標的序列之非特異結合，該條件即於活體分析、醫藥治療或體外分析之生理條件下，該導入分析之條件。
反義寡核苷酸與mRNA(如編碼VEGF或VEGFR之mRNA)雜交可干擾mRNA一或多個正常功能。被干擾之mRNA功能包括所有重要功能，如RNA易位(translocation)至蛋白轉譯之位置、從RNA轉譯蛋白、RNA剪接以產生一或多種mRNA及RNA參與之催化作用。特異蛋白對RNA之結合亦可經由反義寡核苷酸對該RNA雜交所干擾。
反義化合物釋例包括對該標的核酸，如編碼VEGF或VEGFR mRNA，特異性雜交之DNA或RNA序列。該互補區域可介於大約8或大約80個核苷鹼基。該化合物包括一或多個經修飾核苷鹼基。經修飾核苷鹼基可包括，如5－經取代嘧啶(pyrimidine)，如5－碘尿嘧啶(5－iodouracil)、5－碘胞嘧啶(5－iodocytosine)；及C5－丙炔基嘧啶(C5－propynyl pyrimidine)，如C5－丙炔胞嘧啶及C5－丙炔尿嘧啶。其它適當經修飾核苷鹼基包括N4 －－(C1 －C12 )二烷基胺基胞嘧啶(N4 －－(C1 －C12 )alkylaminocytosine)及N4 ,N4 －－(C1 －C12 )二烷基胺基胞嘧啶。經修飾核苷鹼基亦可包括7－取代－8－氮－7脫氮嘌呤(7－substituted－8－aza－7－deazapurine)及7－取代－7脫氮嘌呤，如7－碘－7－脫氮嘌呤、7－氰基－7－脫氮嘌呤、7－甲醯胺基－7－脫氮嘌呤。這些例子包括6－胺基－7－碘－7－脫氮嘌呤、6－胺基－7－氰基－7－脫氮嘌呤、6－胺基－7－甲醯胺基－7－脫氮嘌呤、2－胺基－6－羥基－7－碘－7－脫氮嘌呤、2－胺基－6－羥基－7－氰基－7－脫氮嘌呤及2－胺基－6－羥基－7－甲醯胺基－7－脫氮嘌呤。此外，N6 －－(C1 －C12 )烷基胺基嘌呤(N6 －－(C1 －C12 )alkylaminopurine)及N6 ,N6 －－(C1 －C12 )二烷基胺基嘌呤包括N6 －甲基胺基腺嘌呤(N6 －methylaminoadenine)及N6 ,N6 －二甲基胺基腺嘌呤亦為適當之經修飾核苷鹼基。同樣地，其它6－經取代嘌呤包括如6－硫代鳥嘌呤(6－thioguanine)可為適當之經修飾核苷鹼基。其它適當核苷鹼基包括2－硫代尿嘧啶(2－thiouracil)、8－溴腺嘌呤、8－溴鳥嘌呤、2－氟腺嘌呤及2－氟鳥嘌呤。任一上述經修飾核苷鹼基衍生物以為適當。任一前述化合物取代基可包括C1 －C30 烷基、C2 －C30 烯基、C2 －C30 炔基、芳基、烷芳基、雜芳基、鹵素、胺基、醯胺基、硝基、硫代、磺醯基(sulfonyl)、羧基、烷氧基、烷羰基(alkylcarbonyl)、烷氧羰基等等。
任一型態核酸藥劑之敘述亦可獲得。參閱如美國專利號4,987,071、5,116,742及5,093,246；Woolf et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA ；Antisense RNA and DNA ,D.A.Melton,Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)；89：7305－9；Haselhoff and Gerlach(1988)Nature 334：585－59；Helene,C.(1991)Anticancer Drug Des. 6：569－84；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci. 660：27－36；以及Maher(1992)Bioassays 14：807－15。
人工轉錄因子亦可用於調控VEGF或VEGFR表現。人工轉錄因子可從資料庫(如具有結合編碼VEGF或VEGFR內源基因中序列，如調控區域，如啟動子，的能力)去設計或篩選。舉例來說，該人工轉錄因子可以體外篩選製備(如噬菌體表面展示技術；美國專利號6,534,261)或活體或基於編視碼設計(參閱如WO 00/42219及美國專利號6,511,808)。參閱Rebaret al. (1996)Methods Enzymol 267：129；Greisman and Pabo(1997)Science 275：657；Isalanet al. (2001)Nat.Biotechnol 19：656；以及Wuet al. (1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：344於這些文獻，創造各種鋅手指功能區(zinc finger domain)庫的方法。
選擇性地，人工轉錄因子可融合至轉錄調控功能區，如對活化轉錄之活化功能區或抑制轉錄之抑制功能區。特別地，抑制功能區可用以降低編碼VEGF或VEGFR內源基因表現。該人工轉錄因子自己可為傳輸至細胞之異源核酸所編碼或該蛋白本身可傳輸至細胞(參閱如美國專利號6,534,261)。包括編碼該人工轉錄因子之序列的異源核酸可操作性連結至誘導性啟動子(inducible promoter)，如可使細胞中(如內皮細胞)人工轉錄因子含量微控制。
投藥
本發明所述之藥劑可以系統或區域投藥，如局部投藥。本發明所述藥劑之局部投藥為較佳投藥途徑。對於局部投藥，本發明之組合物可包括與細胞、外植體或個體相容之媒介。這樣的局部醫藥組合物可有各種劑型，如溶液、乳霜、軟膏、凝膠、乳液、洗髮精、肥皂或氣霧。各種廣泛之載體材料可以本發明組合物，如酒精、蘆薈膠、尿囊素(allantoin)、甘油、維他命A及E油、礦物油、聚乙二醇。其它添加物可用於該組合物，如防腐劑、香味、防曬劑或其它化裝品成份。
局部投藥較佳載體為微脂體。微脂體可用以攜帶並傳輸藥劑(如本發明所述之藥劑)至細胞。細節說明可於如Yarosh et al.(2001)Lancet 357：926 and Bouwstra et al.(2002)Adv.Drug Deliv.Rev.54 Suppl 1：S41找到。
對於系統性投藥，該藥劑可透過口服或腸胃外的途徑投藥，如皮下投藥、腹腔注射、肌肉注射、靜脈注射或其它。對於區域投藥，可透過局部、經皮、經黏膜、經鼻或其他投藥。細胞可透過微注射或轉染方式於細胞外或細胞內與該藥劑相互接觸。該藥劑可施用並立即移除、施用但不移除、和/或重複施用一定、增加或減少頻率和/或增加或減少劑量或濃度。超過一個投藥途徑可同時使用，如局部投藥結合口服。腸胃外投藥劑型釋例包括該活性藥劑於等滲鹽水、5%葡萄糖或其它習知醫藥可接受腹形劑之液態溶液。加溶劑(Solubilizing agent)，如環狀糊精，或其它熟之該項技藝者所熟知之加溶劑可用以作為醫藥賦形劑，用為色素調節組合物之傳輸。
該組合物可以作為化妝品、藥品或皮膚照護產品。該組合物亦可調製成其它利用息之方法進行投藥途徑之劑型。醫葯組合物可調製成如口服劑型之粉末、細粒、或與用以製備固態組合物之選擇性醫藥載體作成膠囊、藥片(每一包括時間控制釋放及長效釋放劑型)、膠封；載體如賦形劑(如澱粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、明膠等)、潤滑劑(如硬脂酸鎂(magnesium stearate))、分散劑(disintegrator)(如澱粉及晶質纖維素(crystalline cellulose))、及增粘劑(binder)(如乳糖、甘露醇、澱粉及阿拉伯膠)。該組合物為注射劑，可使用如溶劑(如注射用無菌水)、穩定劑(依地酸鈉(sodium edetate))、等滲劑(如氯化鈉、甘油及甘露醇)、pH－調整劑(如氯化氫、檸檬酸及氫氧化鈉)、懸浮劑(如甲基纖維素)等等。
該藥劑可包含其它醫藥成分，如用以皮膚的第二藥劑，如保濕劑、防曬劑。
套組
本發明所述之藥劑(如VEGF抗體或調節VEGF或VEGFR之藥劑)可作成套組。該套組包括(a)藥劑，如包括藥劑之組合物；以及(b)資訊材料。該資訊材料可為描述性、教學的、行銷或其他關於本發明所述之方法和/或用以本發明所述VEGF或VEGFR應用之材料。舉例來說，該資訊材料牽涉急性UVB皮膚損傷，如曬傷。
一實施例中，該資訊材料可包括於適當方式投予本發明所述之藥劑之指導說明，以執行本發明所述之方法，如投藥之適當劑量、劑型或途徑(如本發明所束投藥之適當劑量、劑型或途徑)。投藥之較佳劑量、劑型或途徑為局部及經皮投藥(percutaneous)。另一實施例中，該資訊材料可包括投本發明所述之藥劑予適當個體(如人，如具有急性UVB損傷或罹患該病風險之人)之指導說明。
該套組資訊材料不限於它的形式。很多例子，該資訊材料如指導說明，以印刷形式提供，如印刷文字、圖示和/或照片，如標籤或印刷單(printed sheet)。然而，該資訊材料亦可以其他格式提供，如點字、電腦可讀取媒體、錄影或錄音。另一實施例中，該套組資訊材料為聯絡資訊，如住址、電子郵件、網站或電話號碼，讓套組使用者可獲取VEGF或VEGFR和/或其於本發明所述方法之應用的實質訊息。當然，該資訊材料亦可以任何格式組合提供。
除本發明所述之藥劑外，該套組之組合物可包括其它成分，如溶劑或緩衝液、穩定劑、防腐劑或香味或其它化妝品成分，和/或治療本發明所述病情或疾病制之第二藥劑。另外，套組但不同本發明所述藥劑之組合物或容器可包括其他成分。實施例中，該套組可包括混合本發明所述藥劑和其他成份或結合其他成分使用本發明所述之藥劑之指導說明。
本發明所述之藥劑可做成任何劑型，如液態、乾燥或凍乾品。較佳地，本發明所述之藥劑大體純淨和/或無菌。本發明所述之藥劑作為液態溶液，該液態溶液較佳為水溶液，無菌水溶液較佳。本發明所述之藥劑作為乾燥品，復原一般為加入適當溶劑。該套組可選擇性提供該溶劑，如無菌水或緩衝液。
該套組可包括一或多個用於裝入含有本發明所述藥劑之組合物的容器。實施例中，該套組包含各別用以裝組合物之容器、藥盒(divider)、裝藥隔間及資訊資料。舉例來說，該組合物可裝於瓶子、藥水瓶或注射器，且該資訊材料裝於塑膠套或塑膠袋。另一實施例中，該套組個別元件裝於單一不分開之容器。舉例來說，該組合物裝於瓶子、藥水瓶或注射器，而資訊材料以標籤形式黏貼於上面。實施例中，該套組包括複數個(如一包)單獨容器，每一個包含一或多個單位劑型(如本發明所述之劑型)之本發明所述之藥劑。舉例來說，該套組包括複數個注射器、注射液瓶、錫箔包或膜泡包裝，每一個包含依單一單位劑量之本發明所述藥劑。該套組之容器可為空氣壓縮和/或防水。
該套組選擇性包括：適用於該組合物投藥之裝置，如注射器、吸入器、微量吸管、鑷子、量匙、滴管(如眼滴管)、拭子(swab)(如棉花棒或抹片棒)或人和這樣的傳輸裝置。較佳實施例中，該裝置為拭子。
實施例 材料與方法
UVB－照射方案(UVB－irradiation regimen)雌性無毛Skh1小鼠(8週大)暴露於所述之UVB照射(使用四個等間螢光燈(Southern New England Ultraviolet,Bradford,CN)之燈源)(Kochevar et al.(1993)J.Invest.Dermatol.100：186－93)。小鼠(n＝每群7隻)模擬照射或曝露於UVB照射每週三次，為期10週，起始劑量為40mJ/cm2 (0.5暴露以最小紅斑量，MED)，逐漸增加0.5 MED至最大劑量4.5 MED。總累積UVB劑量為5.46J/cm2 。無急性曬傷反應發現。額外研究中，8週雌性Skh1小鼠，具K14啟動子控制下鼠科動物VEGF164皮膚特異過量表現的FVB基因轉殖小鼠(Detmar et al.(1998)J.Invest.Dermatol.111：1－6)或野生型FVB小鼠(n＝每群5隻)以單一UVB劑量40mJ/cm2 (0.5 MED)或80mJ/cm2 (1 MED)照射。此外，野生型小鼠(n＝5/群)暴露於54mJ/cm2 UVB照射前24小時以腹腔內注射(intraperitoneal injection)50 μ g抗－小鼠VEGF中和抗體(R&D Systems,Minneapolis,MN)或以50 μ g對照IgG。(Hirakawa et al.(2005)Blood 105：2392－9)。所有動物試驗經過密西根總醫院(Massachusetts General Hospital)研究動物照護小組委員會認可的。
活體淋巴管造影術(Intravital lymphangiography)小鼠(n＝7/群)以阿佛丁(avertin)(0.4g/kg,Sigma)麻醉，並於耳朵邊緣內側以10 μ l Hamilton注射針皮內注射於0.9% NaCl之伊文思藍(Evans blue)染劑1%溶液，以便看的到淋巴管。小鼠耳朵於染劑注射後1、3及5分鐘拍照。
定量即時聚合酶鍊反應(Quantitative real－time RT－PCR)總細胞RNA從持續UVB照射後兩天之小鼠(n＝7/群)整背部皮膚以TRIZOL試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)，隨後以無RQ1 RNase之DNase(Promega,Madison,WI)處理分離。整個皮膚以高速震盪研磨儀系統(Tissue Lyser)(Qiagen GmbH,Germany)均質化。VEGF－A,－C及－D mRNA表現水準以定量即時RT－PCR並使用ABI PRISM7000序列偵測系統(ABI PRISM7000 Sequence Detection System)(Applied Biosystems,Foster City,CA)測得，如(Hong et al.(2004)Nat.Genet.36：683－5)所述。每一反應以甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceralaldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)前置引子(primer)(5’－TCACTGGCATGGCCTTCC－3’(SEQ ID NO：1)反置引子5’－GGCGGGCACGTCAGATCCA－3’(SEQ ID NO：2))及控制組探針(internal control)(5’－JOE－TTCCTACCCCCAATGTGTCCGTCG－TAMRA－3’(SEQ ID NO：3))多工處裡。
免疫染色及電腦輔助形態測量管分析(Immunostaining and computer－assisted morphometric vessel analysis)免疫螢光分析於小鼠組織6－μ m冰凍切片以多株抗體抗鼠科動物LYVE－1(Banerji et al.(1999)J.Cell Biol.144：789－801)、鼠科動物CD31(BD Biosciences,Pharmingen,SanDiego,CA)及標定ALEXA FLUOR488或ALEXA FLUOR594(Molecular Probes,Eugene,OR)相對應二級抗體進行(Kajiya et al.(2005)EMBO J.24：2885－95)。切片以Nikon E－600顯微鏡(Nikon,Melville,NY)檢測，且影像以SPOT數位相機(Diagnostic Instruments,Sterling Heights,MI)捕捉。形態量測分析以IPLAB軟體(Scanalytics,Fairfax,VA)進行(Hirakawa et al.(2005)Blood 105：2392－9)。每一切片檢測三個不同地方；且在表皮及真皮連結處200 μ m距離內面積真皮檢測每平方微米淋巴管數量、淋巴管平均大小及淋巴管占組織相對面積。以非配對學生t檢驗(unpaired Student t－test)分析微管密度及大小之差異性。此外，進行常規之蘇木紫－伊紅染色法(Hematoxylin－Eosin stain)，如前人所述(Prophet,Arrington,and Sobin(1992)Laboratory Methods in Histotechnology ).
實施例1、慢性UVB照射導致皮膚的淋巴管膨大(Chronic UVB irradiation leads to enlargement of cutaneous lymphatic vessels)為調查UVB照射對於淋巴管之影響，首先進行Skh1無毛小鼠慢性UVB照射(Kligman(1996)Clin.Dermatol.14：183－95)為期10週，累積劑量5.46J/cm2 。慢性UVB照射導致如先前報導明顯皺紋形成(Yano et al.(2002)J.Invest.Dermatol.118：800－5)，然而模擬照射之小鼠則無此改變。組織檢驗顯示慢性UVB損害典型特徵，包括表皮過度增生(epidermal hyperplasia)、發炎細胞浸潤(inflammatory cell infiltration)及水腫形成(圖1A及B)。對泛管(panvascular)標誌CD31及淋巴－特異玻尿酸受體LYVE－1之雙重免疫螢光染色顯示CD31＋/LYVE－1－血管中度膨大(圖1C及D)，如先前所知道(Yano et al.(2005)Br.J.Dermatol.152：115－21)。驚人地發現，LYVE－1－正皮膚淋巴管在大小戲劇性增加且有不規則形狀，有時候管壁有不完整內皮細胞內層，卻只是正常，而模擬照射小鼠則發現萎陷淋巴管(圖1C及D)。電腦輔助形態測量分析確認相較於模擬照射小鼠，UVB－照射皮膚的平均淋巴管占皮膚面積(增加超過模擬照射小鼠2.5倍，P<0.01)及皮膚淋巴管平均大小顯著增加(增加2.1－倍，P<0.01)(圖1E及F)。兩者相比，兩組的淋巴管密度是可比較的(圖1G)。
實施例2、慢性UVB照射後淋巴管功能受損且滲漏增加(Impaired function and increased leakiness of lymphatic vessels after chronic UVB－irradiation)為進一步慢性UVB照射對於皮膚淋巴管功能之影響，於小鼠耳朵邊緣皮內注射伊文思藍染劑。注射後1及3分鐘，相較於模擬照射小鼠，慢性UVB照射小鼠皮膚看見明顯的膨脹淋巴管(圖2A,B,D,E)。5分鐘後，慢性UYB照射小鼠皮膚顯示伊文思藍染劑從淋巴管溢出，然而模擬照射小鼠未發現該滲漏(圖2C及F)。這些發現指出UVB照射後膨大的淋巴管為功能受損且滲漏增加。
實施例3、慢性UVB照射導致VEGF－A上升，非VEGF－C或－D表現上升(Chronic UVB irradiation leads to upregulation of VEGF－A,but not of VEGF－C or－D expression)為調查UVB照射是否導致表皮角質細胞任一已知淋巴管新生因子VEGF－A(Nagy et al.(2002)J.Exp.Med.196：1497－506)，VEGF－C或VEGF－D(Jussila et al.(2002)Physiol.Rev.82：673－700)上調，由耳朵皮膚表皮分離總RNA，以定量即時TAQMANRT－PCR分析mRNA表現。發現相較於模擬照射對照組，UVB照射表皮VEGF－A mRNA表現2.2倍上調(P<0.01，圖3A)。相比較下，兩組VEGF－C及VEGF－D mRNA表現量是可比較的(圖3B及C)。從包括表皮及真皮兩者的整各皮膚溶解液分離之總RNA檢測，可獲得比較結果。
實施例4、急性UVB照射誘導皮膚淋巴管膨大及高滲透(Acute UVB irradiation induces enlargement and hyperpermeability of cutaneous lymphatic vessels)隨後調查單一劑量急性UVB照射是否可足以使功能受損。單一劑量40mJ/cm2 UVB照射(0.5暴露以最小紅斑量，MED)後兩天，皮下注射伊文思藍染劑，明顯可見皮膚淋巴管，不同於非照射皮膚且不具高滲透(圖4A－F)。相比較下，80mJ/cm2 UVB劑量(1 MED)照射導致皮膚淋巴管膨大(圖4G－H)且發現顯著滲漏(圖4I)。皮膚切片差異免疫螢光分析顯示80mJ/cm2 UVB劑量照射後，LYVE－1＋淋巴管顯著膨大，但CD31＋/LYVE－1－血管僅中度膨大(圖4L)。然而，於非照射皮膚及以40mJ/cm2 UVB劑量照射並未發現改變(圖4J,K)。
實施例5、UVB照射VEGF－A基因轉殖小鼠之淋巴管膨大增加(Increased enlargement of lymphatic vessels in UVB－irradiated VEGF－A transgenic mice)因為發現UVB照射後表皮角質細胞表皮角質細胞之mRNA表現上調，隨後檢測表皮衍生VEGF－A是否可直接增強淋巴管之UVB誘導膨大及滲露。因此，於角蛋白(keratin)14啟動子控制下，過量表現鼠科動物VEGF164之轉殖基因FVB小鼠(Detmar et al.(1998)J.Invest.Dermatol.111：1－6)及FVB野生型小鼠暴露於單一劑量40mJ/cm2 UVB照射或模擬照射。UVB照射後兩天，耳朵切片差異免疫螢光分析顯示於模擬照射及UVB照射野生型小鼠之CD31＋/LYVE－1－血管及LYVE－1＋淋巴管可比較的數量及大小(圖5A及C)。模擬照射VEGF轉殖基因小鼠，相較於野生型小鼠，已顯示淋巴管大小輕微增加(圖5B)。重要地，VEGF轉殖基因小鼠經UVB照射後淋巴管顯著膨大(圖5D)，而增加耳朵厚度及水腫形成。電腦輔助形態測量分析確認相較於野生型小鼠，模擬照射VEGF轉殖基因小鼠淋巴管大小增加1.3倍(p<0.05)，且UVB照射後顯著膨大1.9倍(p<0.01，圖5E)。所有組淋巴管密度為可比較的(圖5F)。實施例6、VEGF－A系統性阻斷抑制淋巴管UVB－誘導之膨大(Systematic blockade of VEGF－A inhibits the UVB－induced enlargement of lymphatic vessels)
隨後檢測VEGF－A系統性阻斷是否可避免淋巴管UVB－誘導之膨大。野生型FVB小鼠以腹腔內注射抗VEGF－A阻斷抗體或等量對照IgG後，暴露於單一劑量54mJ/cm2 UVB照射一天。UVB照射對照IgG處理之小鼠後兩天CD31及LYVE－1雙重免疫螢光染色顯示LYVE－1正淋巴管明顯膨大，CD31＋/LYVE－1－血管中度膨脹(圖6A及C)。相比較下，以VEGF－A阻斷抗體系統性處裡完全避免淋巴管及血管膨大(圖6B及D)。
其它實施例
雖然本發明實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，仍可作些許的更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
所有引述專利、專利申請及參考文獻一併結合於此作為參考。
圖1A－B為蘇木紫－伊紅染色皮膚組織樣本之顯微照片，顯示慢性UVB照射後淋巴管膨大(圖1B)，但模擬照射皮膚則無(圖1A)。比例尺：100 μ m。
圖1C－D為UVB照射(圖1D)及模擬照射(圖1C)皮膚組織樣本CD31及LYVE－1免疫螢光顯微照片。UVB照射皮膚樣本顯示UVB照射皮膚之CD31＋/LYVE－1－血管中度膨大(圖1D)。LYVE－1－正皮膚淋巴管在大小顯著增加且有不規則形狀，有時候管壁有不完整內皮細胞內層，卻只是正常，而模擬照射小鼠則發現萎陷淋巴管(圖1D)。比例尺：100 μ m。
圖1E－G為從慢性UVB－照射及模擬照射小鼠之皮膚形態測量分析的柱狀圖。圖1E說明從慢性UVB－照射及模擬照射小鼠之皮膚樣本的淋巴管覆蓋面積。圖1F說明從慢性UVB－照射及模擬照射小鼠之皮膚樣本的淋巴管平均大小。圖1G說明從慢性UVB－照射及模擬照射小鼠之皮膚樣本的淋巴管密度。相對於模擬照射皮膚，UVB－照射皮膚之淋巴管覆蓋面積(圖1E)及淋巴管平均大小(圖1F)顯著增加(**,p<0.01)。
圖2A－F為皮內注射伊文思藍染劑之小鼠耳朵的照片。圖2A－C說明模擬照射小鼠。圖2D－F說明UVB照射小鼠。注射後一分鐘染劑分散顯示如圖2A及2D；三分鐘如圖2B及2E；以及五分鐘如圖2C及2F。注射後1及3分鐘，相較於模擬照射小鼠(圖2A－B)，慢性UVB照射小鼠(圖2A－B)皮膚看見明顯的膨脹淋巴管。5分鐘後，慢性UVB照射小鼠皮膚顯示伊文思藍染劑從淋巴管溢出(圖2F)，然而模擬照射小鼠未發現該滲漏(圖2C)。
圖3A－C為慢性UVB照射後48小時從耳朵表皮分離之總RNA檢測的定量即時RT－PCR分析的柱狀圖。相較於模擬照射對照組，UVB照射表皮VEGF－A mRNA表現上調(圖3A)(***,P<0.01)。相比較下，兩組VEGF－C(圖3B)及VEGF－D(圖C)mRNA表現量是可比較的。
圖4A－I為皮內注射伊文思藍染劑之小鼠耳朵的照片。圖4A－C說明模擬照射小鼠(0mJ/cm2 )。圖4D－F說明單一劑量40mJ/cm2 UVB(0.5 MED)照射後兩天之小鼠。圖4G－I說明單一劑量80mJ/cm2 UVB(1 MED)照射後兩天之小鼠。注射後一分鐘染劑分散顯示如圖4A、4D及4G；三分鐘如圖4B、4E及4H；以及五分鐘如圖4C、4F及4I)。80mJ/cm2 UVB劑量(1 MED)照射導致皮膚淋巴管膨大(圖4G－H)且發現顯著滲漏(圖4I)。
圖4J－L為皮膚樣本以0mJ/cm2 (圖4J)、40mJ/cm2 (圖4K)及80mJ/cm2 (圖4L)照射LYVE－1及CD31免疫螢光顯微照片。皮膚切片LYVE－1及CD31差異免疫螢光分析顯示80mJ/cm2 UVB劑量照射後，LYVE－1＋淋巴管顯著膨大(圖4L)。然而，於非照射皮膚及以40mJ/cm2 UVB劑量照射並未發現改變(圖4J,K)。比例尺：100 μ m。
圖5A－D為野生型(圖5A及5C)及VEGF基因轉殖(圖5B及5D)小鼠皮膚樣本以單一劑量40mJ/cm2 UVB照射(圖5C－D)或模擬照射(圖5A－B)LYVE－1及CD31免疫螢光顯微照片。模擬照射VEGF轉殖基因小鼠，相較於野生型小鼠(圖5A)，顯示淋巴管大小輕微增加(圖5B)。VEGF轉殖基因小鼠經UvB照射後淋巴管顯著膨大(圖5D)，水腫形成。比例尺：100 μ m。
圖5E－F為柱狀圖，說明從慢性UVB－照射及模擬照射野生型及VEGF轉殖基因小鼠之皮膚樣本的形態測量分析。圖5E說明從慢性UVB－照射及模擬照射野生型及VEGF轉殖基因小鼠之皮膚樣本的淋巴管平均大小。圖5F說明從慢性UVB－照射及模擬照射野生型及VEGF轉殖基因小鼠之皮膚樣本的淋巴管密度。形態測量分析顯示相較於野生型小鼠，模擬照射VEGF轉殖基因小鼠淋巴管大小增加1.3倍(*,p<0.05)，且UVB照射後顯著膨大1.9倍(**,p<0.01)(圖5E)。所有組淋巴管密度為可比較的(圖5F)。
圖6A－D為腹腔內注射抗VEGF－A阻斷抗體(圖6B及6D)或對照IgG(圖6A及6C)後，暴露於單一劑量54mJ/cm2 UVB照射一天之小鼠皮膚樣本CD31及Hoechst染色(圖6A－B)或CD31及LYVE－1(圖6C－D)的免疫螢光顯微照片。UVB照射對照IgG處理之小鼠後兩天CD31及LYVE－1雙重免疫螢光染色顯示LYVE－1正淋巴管膨大(箭頭)，CD31＋/LYVE－1－血管中度膨脹(箭)(圖6A及6C)。抗VEGF－A處裡避免淋巴管及血管膨大(圖6B及D)。比例尺：100 μ m。

Claims (14)

  1. 一種血管內皮生長因子-A(VEGF-A)之拮抗劑(antagonist)及/或血管內皮生長因子-C(VEGF-C)之促進劑(agonist)用於製備減少慢性或急性紫外線B(UVB)誘導之皮膚損傷之配方的用途，其中：該血管內皮生長因子-A(VEGF-A)之拮抗劑係擇自由一抗體，其結合至血管內皮生長因子-A或血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)、一突變、去活化之血管內皮生長因子-A多胜肽、一可溶性之血管內皮生長因子受體-2多胜肽或片段、一核酸，其可分別結合至血管內皮生長因子-A或血管內皮生長因子受體-2之核酸並降低血管內皮生長因子-A或血管內皮生長因子受體-2之表現，與一血管內皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑所組成之群組；與該血管內皮生長因子-C之促進劑為一多胜肽，其包括一血管內皮生長因子-C多胜肽之一序列，或為一核酸，其包含編碼出一血管內皮生長因子-C多胜肽的一序列。
  2. 一種血管內皮生長因子-A之拮抗劑及/或血管內皮生長因子-C之促進劑用於製備減少紫外線B誘導之於皮膚中之水腫(edema)之配方的用途，其中：該血管內皮生長因子-A(VEGF-A)之拮抗劑係擇自由一抗體，其結合至血管內皮生長因子-A或血管內皮生長因子受體-2(VEGFR-2)、一突變、去活化之血管內皮生長因子-A多胜肽、一可溶性之血管內皮生長因子受體-2多胜肽或片段、一核酸，其可分別結合至血管內皮生長因子-A或血管 內皮生長因子受體-2之核酸並降低血管內皮生長因子-A或血管內皮生長因子受體-2之表現，與一血管內皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑所組成之群組；與該血管內皮生長因子-C之促進劑為一多胜肽，其包括一血管內皮生長因子-C多胜肽之一序列，或為一核酸，其包含編碼出一血管內皮生長因子-C多胜肽的一序列。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中該配方包括該血管內皮生長因子-C之促進劑。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中該配方包括該血管內皮生長因子-A之拮抗劑。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中該配方包括該血管內皮生長因子-C之促進劑與該血管內皮生長因子-A之拮抗劑。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該血管內皮生長因子-A之拮抗劑為一抗體，其結合至血管內皮生長因子-A或血管內皮生長因子受體-2。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該核酸係擇自由下列所組成之群組：一反義核酸(antisense)、一siRNA與一核酸酵素(ribozyme)。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該血管內皮生長因子-A之拮抗劑為一血管內皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑。
  9. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中該血管內皮生長因子-C之促進劑為一多胜肽，其包括一血管內 皮生長因子-C多胜肽之一序列。
  10. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，更包括一載體用於製備該配方的用途。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的用途，其中該載體為一微脂體。
  12. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中該配方被調製成局部施用。
  13. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，更包括一防腐劑、一香味、一保濕劑或一防曬劑用於製備該配方的用途。
  14. 如申請專利範圍第1或2項所述的用途，其中該配方被調製為溶液、乳霜、軟膏、凝膠、乳液、洗髮精、肥皂或氣霧。
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