TWI424861B - And a method for producing the regenerated film and the method for producing the regenerated film - Google Patents
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Description
本發明與醫學之組織修復及再生領域有關，更詳而言之，係一種輔助及促進組織修復工程的膜狀物質，該膜狀物質具有流入及流出速率不對等之通透性，以及生物組織降解性，並可為藥物載體。本案涉及該膜狀物質的構造以及研製該膜狀物質的方法。
組織修復係指局部組織或細胞因某種致病因素而遭受損傷或死亡後，由鄰近健康細胞的再生來修補，以恢復組織完整性的過程。修復過程的快慢及完整與否受許多因素的影響，這些因素除受損傷的組織類型外，還有致損傷因子、營養、血液供應、感染、組織缺損率等。組織再生則是指組織損傷後細胞分裂增生以完成修復的過程。除了自體發生的修復及再生過程之外，在創傷處利用輔物可以促進組織修復再生工程。
再生膜即為上述輔物之一種，將再生膜置於組織損傷處的表面，在其所覆蓋的區域中隔離不必要的細胞、纖維組織或上皮組織等侵入損傷面，同時可以讓血液、養份或藥物通過，並且排除組織修復及再生工程中所產生的廢物。再生膜的放置可製造並組構一組織修織修復再生的空間。
以骨之修復再生為例，再生膜概可分為不可吸收再生膜以及可吸收再生膜兩種。
不可吸收再者膜常見的材料有Gore-TEXR、MilliporeR、BiobarrierR。它含有特殊的生化材料如e-polytetrafluoroethylene(e-PTFE)，對牙科種植體的骨整合有明顯的幫助。除了抑制上皮及纖維細胞侵入受損處之外，
還能促進骨細胞生長，它還具備以下特性：細胞隔絕性(cell occlusivity)、空間創造性(space making)、組織整合性(tissue integration)、生物相容性(biocompatability)、良好的穩定性及可靠性。
可吸收再生膜是從1990年開始發展，依材料組成之不同而可分為三大類。
第一類為膠原蛋白(collagen)再生膜：經交叉連結處理可以改善它的物理性質和吸收時間，使它的吸收時間可延至8週以上，有助於骨再生應用，如Bio-GageR、Bio-MendR、AtrisorbR。
第二類為聚合體(Polymer)再生膜：主要是由多乳酸和多甘醇酸所聚合而成，functional integrity時間延至8-10週，完全吸收需6-7個月，提供完整之組織隔絕。如Resolut XtR。
第三類為前面二種材料外之其它再生膜總稱。
目前用於組織損傷再生之再生膜有很多種，過去使用大多是人工合成材料，材料的優點為操作性佳，具有良好的生物相容性，以骨損傷為例，可併用含鈦材料或其它充填材料以獲得更穩定及更大的骨生長空間。此類再生膜，由於是不可吸收之材質，所以手術後約4至8週須再次手術將再生膜取出，如有暴露易造成感染而影響骨生長。現在再生膜已發展出許多種可吸收材質，置入後可慢慢被人體吸收，優點是可免除第二次手術。有許多文獻報告指出可吸收與不可吸收再生膜在臨床上的效果是大同小異的。
上述可吸收型或不可吸收型再生膜均具有相當的孔隙率而維持通透性，通透性是由膜兩側的流出速率與流入速率決定，而流出速率與流入速
率幾乎對等，吾等稱其為對等通透性。然而對等通透性將會淡化再生膜對組織修復及再生的促成。因為，組織損傷之初期、中期及末期都有不同的反應變化，在初期，損傷處充滿血腫、血塊、甚至有發炎反應，產生的大量壞死細胞和組織液應加速向膜外擴散排除，才能降低發炎反應；在中期和後期，生長因子開始長成並發揮作用，此時的再生膜必需阻止上皮細胞與結締組織透過膜而入侵受傷處。當再生膜為對等通透性時，將造成向膜外擴散排除速率與向膜內滲透侵入速率對等，而造成不利物質的排除速率降低及無法有效控制不利物質入侵的結果。
由此可知，再生膜的流入與流出通透率(inflow and outflow permeability)對於組織修復及再生有重要的影響性。但以往對再生膜的研究，大多只聚焦於材料之選用及組合，並未對流入與流出通透率進行研究及發展。
本案之目的係在提供一種應用於組織修復工程之再生膜，該再生膜具有流入與流出通透率(inflow and outflow permeability)不對稱之特性，為一高單向通透率之再生膜，所謂的高單向通透率可以是高內流或高外流，需藉由損傷部位之需求，而決定對損傷區域採高外流或高內流應用模式。在高外流的應用模式下，該再生模可將組織損傷處所產生的大量壞死細胞和組織液等廢物加速排除，降低發炎反應，並隔絕上皮細胞、結締組織等不利物質侵入損傷處，從而輔助及促進組織修復工程之進行。該再生膜可為一藥物載體，在高內流的應用模式下，將對組織修復再生之有利物質或藥物導入受損組織，從而加速組織修復再生功能之進行。
本案之目的係在提供一種應用於組織修復工程之再生膜，該再生膜具有生物可降解性，於組織缺陷修復手術中被植入損傷部位後即無需第二次手術取出。
本案之目的係在提供一種製造上述再生膜之方法，該方法所產製的再生膜具有大孔隙層和小孔隙層，該大孔隙層具有大孔隙表面，該小孔隙層具有小孔隙表面。本發明之方法可進一步控制該大孔隙層和小孔隙層的孔隙尺寸及數量的比例差異，差異越大，則通透率之不對稱度越高，高單向通透率亦愈明顯。
本案之目的係在提供一種製造上述再生膜之方法，該方法可進一步控制大孔隙層和小孔隙層的比例差異，進而調整高單向通透率。
本案之目的係在提供一種製造上述再生膜之方法，該方法所產製之再生膜不具有習知的皮層效應，因此可保持預期的高單向通透率。
本案之不對稱再生膜之皮層效應缺點藉由親水性凝膠層製程而改善。
一種應用於組織修復工程之再生膜，該再生膜包含：鄰接結合的一第一孔隙層和一第二孔隙層；該第一孔隙層和第二孔隙層分佈有多數個與外部環境相連通的孔隙，且該第一孔隙層的孔隙尺寸大於該第二孔隙層的孔隙。
一種應用於組織修復工程之再生膜之製備方法，包括：步驟一，將高分子材料與第一溶劑以預定比例混合配製成高分子溶液；步驟二，將該高分子溶液附著於一模具表面而形成一再生膜半成品；步驟三，以第二溶劑對該再生膜半成品進行隙孔生成加工，於該再生膜半成品之膜壁上形成上述之孔隙。
為便於說明本案於上述發明內容一欄中所表示的中心思想，茲以具體實施例表達。實施例中各種不同物件係按適於說明之比例、尺寸、變形量或位移量而描繪，而非按實際元件的比例予以繪製，合先敘明。且以下的說明中，類似的元件是以相同的編號來表示。
如第一圖，係以工業繪圖方法描繪本案再生膜的剖面，本發明之再生膜10是以具有生物降解性之高分子聚合物所製成，該再生膜10之其中一側為一第一孔隙層11，該再生膜10的另一側為一第二孔隙層12，該第一孔隙層11和第二孔隙層12均具有與外部環境連通的多數孔隙111,121，且該第一孔隙層11的孔隙111尺寸大於該第二孔隙層12的孔隙121。該再生膜10其中一側之表面為第一表面13，該再生膜10之另一側之表面為第二表面14，該第一表面13具有該第一孔隙層11之孔隙111，該第二表面14具有該第二孔隙層12之孔隙121，該第一表面13的孔隙111尺寸大於該第二表面14的孔隙121尺寸。如第二圖，係以工業繪圖方法分別描繪該第一表面13和第二表面14的表面態様。如第三圖，係以工業繪圖方法描繪本案再生膜之不對稱通透率。基於孔隙尺寸之差異，該再生膜10從第一孔隙層11和第一表面13向第二孔隙層12和第二表面14的通透率高於從第二孔隙層12和第二表面14向第一孔隙層11和第一表面13的通透率。換言之，該再生膜10之膜兩側的通透率是不對稱的。且上述孔隙的尺寸和數量的比例差異愈大，該通透率之不對稱度越高，高單向通透率亦愈明顯。在第三圖之圖例中，描述了從第一孔隙層11向第二孔隙層12流通的高單向通透率。
基於組織降解性之需求，本案再生膜採用高分子材料製做，做為本發明高分子材料的例子，包含但不限於聚乳酸甘醇酸共聚物(poly(DL-lactci acid-co-glycolic acid)，以下簡稱PLGA)、聚己內酯(poly ε-caprolactone,PCL)、聚乳酸(polylactide acid,PLA)與幾丁聚醣(chitosan)等。
以上述材料製做再生膜的方法，主要包括以下步驟：步驟一，將高分子材料與第一溶劑以預定比例混合配製成高分子溶液；步驟二，將該高分子溶液附著於一模具表面而形成一再生膜半成品；步驟三，以第二溶劑對該再生膜半成品進行隙孔生成加工，於該再生膜半成品之兩側分別形成一上述的第一孔隙層和第二孔隙層；步驟四，清洗、乾燥、脫膜，完成一具有不對稱孔隙之再生膜。
可應用於本發明中的第一溶劑，在此並沒有特別的限制，只要是可使高分子材料得以溶解於其中的即可。若使用的高分子材料為聚乳酸甘醇酸共聚物、聚己內酯、聚乳酸時，作為第一溶劑的例子包含但不限於1,4-二氧陸圜(1,4-dioxane)、氯仿(chloroform)與六氟異丙醇(hexafluoroisopropanol,HFIP)等。若使用的高分子材料為幾丁聚醣時，作為第一溶劑的例子包含醋酸水溶液等，但並不僅限於此。高分子溶液的濃度於本發明並沒有特別的限制，但為使其易於操作及成膜，較佳為10%(w/w)。
步驟二中所採用的模具以平板模具為較佳，模具的形狀可依據所需要的膜形而加以備製。平板模具的材料於本發明中並沒有特別的限制，只要是不會與該高分子材料及/或第一溶劑起反應，且可便於脫膜者，均可被應用於本發明中。可舉出的例子包含但不限於金屬、玻璃、石英等。
前述步驟二中使高分子溶液黏附於模具表面的方法，在本發明中並沒有特別的限制，只要是任何習知可將高分子溶液黏附於模具表面者，皆可被應用於本發明中，包含但不限於習知的浸漬-鑄膜、澆淋附著...等方法。
前述再生膜半成品膜壁外層的孔隙大小可藉由步驟三中的第二溶劑的極性大小來調節，當第二溶劑的濃度愈低(極性愈高)，孔隙的尺寸也就愈大；反之，當第二溶劑的濃度愈高(極性愈小)，孔隙的尺寸也就愈小。例如，當以乙醇水溶液為第二溶劑時，乙醇水溶液的濃度較佳為10~60%(v/v)，更佳為20~40%(v/v)。膜壁外層與膜壁內層的孔隙大小差異越大，再生膜通透率之不對稱度越高，亦即物質通透進出膜壁的不對稱單側高流率也愈明顯。
以往所習知之浸漬-鑄膜法會於再生膜之表面形成皮層效應，以本案前述之再生膜10為例，說明該皮層效應的現象。理想的再生膜10應為前述實施例所描寫的，其第一孔隙層11和第一表面13的孔隙尺寸大於第二孔隙層12和第二表面14。然而，當皮層效應產生時，第一表面13的孔隙尺寸竟然小於第二表面14，這對於原本預期的高單向通透率產生嚴重影響。為解決此一問題，本發明於執行步驟二之前，先在模具的表面預先塗佈一層親水性凝膠層，該親水性凝膠層為不溶或難溶於第一溶劑的物質，包含但不限於生物性聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol,PVA)、明膠或F127凝膠等。此親水性凝膠可在上述步驟三再生膜半成品浸置於第二溶劑開始成膜時，阻斷第二溶劑侵入高分子材料與平板膜具之間，水凝膠的親水性高於高分子溶液，故該親水性凝膠層會吸取大部分之第二溶劑，可讓該再生膜的內側接觸最少之第二溶劑，從而維持第一孔隙層11和第一表面13的孔隙尺寸大於第二孔隙層12和第二表面14的理想狀況。
以下實驗即利用PLGA高分子材料溶於1-4dioxan(第一溶劑)，並將其黏附於玻璃材質之平板模具上後利用95%與40%乙醇(第二溶劑)分別進行浸漬-沉澱法反應。
請參照第四圖和第五圖，為利用95%乙醇浸漬-沉澱法後再生膜之掃描式電子顯微鏡圖(SEM)，其中第四圖為再生膜之橫切面，第五圖為該再生膜的上表面及下表面。第六圖及第七圖則為利用40%乙醇浸漬-沉澱法後再生膜之電子顯微鏡圖(SEM)，其中第六圖為再生膜之橫切面，第七圖為膜之第一表面和第二表面。以95%乙醇浸漬-沉澱法之再生膜做為控制組，在電子顯微鏡的觀察下，其橫切面表現出對稱的小孔隙結構層30，且再生膜的上表面及下表面皆為小孔隙表面層31,32。而第六圖及第七圖則為本案之再生膜10，電子顯微鏡圖(SEM)顯示其橫切面具有第一孔隙層11和第二孔隙層12，該第一孔隙層11和第二孔隙層12均具有與外部環境連通的多數孔隙111,121，且該第一孔隙層11的孔隙111尺寸大於該第二孔隙層12的孔隙121。該第一孔隙層11具有一第一表面13，該第二孔隙層12具有一第二表面14，該第一表面13的孔隙尺寸大於該第二表面14的孔隙尺寸。從SEM結果顯示，上述習知之沈漬-沈澱法所造成的皮層效應，在本發明中並沒有發生。
本發明之再生膜具有不對稱通透率，可由以下實驗證明。
本通透率實驗為利用10%葡萄糖溶液，分別置入四個玻璃管中，其中第一支玻璃管之端口被本案之再生膜(對照組40%乙醇浸漬)以第一表面黏著封口，第二支玻璃管之端口被本案之再生膜(對照組40%乙醇浸漬)以第二表面黏著封口，第三支及第四支玻璃管分別被控制組(95%乙醇浸漬)再生
膜的上表面及下表面黏著封口。接著，將此些裝有溶液之玻璃管，分別浸入5ml裝載於瓶子內的磷酸鹽緩衝溶液中。之後，於1、2及3天後，自瓶子內的磷酸鹽緩衝溶液中取出20μl，分別分析其葡萄糖濃度。在此，葡萄糖濃度測定係藉由紫外光分光光度計(Hitachi Co.,U-2000)，於500nm的波長下進行測定。
請參閱第八圖，為葡萄糖通透膜壁的雙向通透率之結果分析圖。從第八圖中可以看出，對照組(40%再生膜)顯示顯著的高單向通透率(<0.001)，其第一孔隙層11(大孔隙層)往第二孔隙層12(小孔隙層)的通透率大於第二孔隙層12(小孔隙層)往第一孔隙層11(大孔隙層)的通透率。然而控制組因為皆為小孔隙層31,32，同樣以上述方式分別觀察雙側之通透率，其結果顯示該膜具低的雙側流通率。
本案更進一步將其進行動物實驗，請參照附件一，於無菌操作下將八周大白鼠頭蓋骨上以外口手術磨棒製造二個直徑5mm深度0.5mm之圓形骨損傷，並在其上面覆蓋本案之再生膜，覆蓋方式有兩種，第一種是以本案再生膜的第一表面13覆蓋於骨損傷處40表面(如第九圖)；第二種是以本案再生膜的第二表面14覆蓋於骨損傷處40表面(如第十圖)。第一種覆蓋方式構成骨損傷處40高外流低內流通透率(High outflow and low inflow permeability,HOLI)之環境，第二種覆蓋方式構成高內流低外流通透率(High inflow and low outflow permeability,HILO)之環境。另外並與低外內流通透率組(low permeability,LP)、無再生膜控制組(control)進行比較。
於4、8、12周將其頭蓋骨取下進行X光攝影，定量其骨損傷修復百分比(bone defect regeneration percentage，BDRp)，其結果請參照第十一
圖，以此實驗結果可觀察出在各時間點上尤其是8與12周之結果，利用HOLI組皆較他組之結果復原速度快。由是可證，在高外流的環境下，該再生模可將組織損傷處所產生的大量壞死細胞和組織液等廢物加速排除，降低發炎反應，並隔絕上皮細胞等結締組織等不利物質侵入損傷處，從而輔助及促進組織修復工程之進行。
實驗鼠另外更進行電腦斷層掃描並利用影像重組觀察骨損傷之修復情形，其結果請參照附件二，利用HOLI組的骨損傷於第四周與十二周的電腦斷層重組影像可看出中幾已修復完成(白色箭頭處)，然而他組再生膜之修復效率則為較差。
並於X光攝影實驗完後，利用H&E染色法進行組織切片染色，其第八周之結果顯示於附件三，附件三為本案HOLI於第八周之切片結果，附件四為本案之LP組。NB為再生骨，OB為舊骨，黑色箭頭為骨小島，而新生骨中顏色較深為尚未成熟之新生骨，結果顯示本創作之不對稱骨再生膜對於骨損傷之新骨生成於前期生長較快，骨小島分布較密集，代表新骨之成熟度較高，由附件四可看出，其骨小島分布較少，且顏色較深，意即代表此組於第八周仍正在進行骨化作用，其為表面膠原蛋白聚集，新生骨成熟度較差。
綜上所陳，本案之不對稱再生膜具下列優點：再生膜使用之材料為生物相容性極高之高分子聚合物，具有生物可降解性，於組織缺陷修復手術中無需二次手術取出再生膜。
本案之再生膜具有不對稱之孔隙結構，即具大小孔隙層。該不對稱結構使再生膜具有不對稱之通透率。
本案之再生膜不對稱通透率可在製造過程中藉由溶劑的濃度而調整。
本案之不對稱再生膜之皮層效應缺點藉由親水性凝膠層製程而改善。
本案之不對稱再生膜具有高單向通透率，可在組織損傷處形成高外流低內流通透率(High outflow and low inflow permeability,HOLI)之環境，可大量排放出損傷造成的發炎代謝物，並阻隔有效上皮細胞侵入缺陷部影響生長。
本案之不對稱再生膜具有高單向通透率，可對組織損傷處構成高外流低內流通透率(High outflow and low inflow permeability,HOLI)之環境，或高內流低外流通透率(High inflow and low outflow permeability,HILO)之環境。該單向流通率需藉由損傷部位之需求而選擇高外流環境或高內流環境。
本案再生膜可為一藥物載體，如同本創作所揭示之三鈣磷酸鹽外，更可利用物理、化學方法交聯各式生長因子例如：PDGF(platelet derived growth factor)、TGF-β(transforming growth factors)、VEGF(vascular endothelial growth factor)、EGF(epithelial growth factor)、IGF(insulin-like growth factor)；以及幫助組織再生之胜肽例如RGD；或是用血小板含量豐富的血漿platelet-rich plasma(簡稱PRP)這種現今醫學界上最常使用之材料。再生膜為藥物載體時，其覆蓋於組織損傷處的方式應以形成高內流環境為佳。
本案創作之再生膜應用於硬骨缺陷修復來說明該膜之優勢，但再生膜應用於人體組織之修復並非為僅只有硬骨缺陷修復，組織缺損時皆須大量排出發炎物質以及阻隔其餘組織侵入，故需單向高通透率之不對稱再生膜。
雖然本案是以一個最佳實施例做說明，但精於此技藝者能在不脫離本
案精神與範疇下做各種不同形式的改變。以上所舉實施例僅用以說明本案而已，非用以限制本案之範圍。舉凡不違本案精神所從事的種種修改或變化，俱屬本案申請專利範圍。
10‧‧‧再生膜
11‧‧‧第一孔隙層
111‧‧‧孔隙
12‧‧‧第二孔隙層
121‧‧‧孔隙
13‧‧‧第一表面
14‧‧‧第二表面
30‧‧‧小孔隙結構層
31‧‧‧小孔隙表面層
32‧‧‧小孔隙表面層
40‧‧‧骨損傷處
第一圖，係以工業繪圖方法描繪本案再生膜的剖面。
第二圖，係以工業繪圖方法描繪本案再生膜第一表面和第二表面的表面態樣。
第三圖，係以工業繪圖方法描繪本案再生膜之不對稱通透率。
第四圖，為利用95%乙醇浸漬-沉澱法後再生膜之電子顯微鏡(SEM)橫切面圖。
第五圖，為第四圖之再生膜的上表面及下表面。
第六圖，為利用40%乙醇浸漬-沉澱法後再生膜之電子顯微鏡(SEM)橫切面圖。
第七圖，為第六圖再生膜的第一表面和第二表面。
第八圖，為葡萄糖通透膜壁的雙向通透率之結果分析圖。
第九圖，以本案再生膜的第一表面覆蓋於骨損傷處表面，形成高外流低內流通透率環境之示意圖。
第十圖，以本案再生膜的第二表面覆蓋於骨損傷處表面，形成高內流低外流通透率環境之示意圖。
第十一圖，以取下小白鼠的頭蓋體進行X光攝影，定量其骨損傷修復百分比(bone defect regeneration percentage，BDRp)之結果。
附件一，於無菌操作下將八周大白鼠頭蓋骨上以外口手術磨棒製造二個直
徑5mm深度0.5mm之圓形骨損傷，並在其上面覆蓋本案之再生膜。
附件二，實驗鼠更進行電腦斷層掃描並利用影像重組觀察骨損傷之修復情形。
附件三，對高外流低內流通透率(High outflow and low inflow permeability,HOLI)環境之損傷組織進行H&E染色法進行組織切片染色之結果。
附件四，對低外內流通透率組(low permeability,LP)環境之損傷組織進行H&E染色法進行組織切片染色之結果。
10‧‧‧再生膜
11‧‧‧第一孔隙層
111‧‧‧孔隙
12‧‧‧第二孔隙層
121‧‧‧孔隙
13‧‧‧第一表面
14‧‧‧第二表面
Claims (10)
- 一種應用於組織修復工程之再生膜，其特徵在於：該再生膜是以具有生物降解性之高分子聚合物所製成，該再生膜之其中一側為一第一孔隙層，該再生膜的另一側為一第二孔隙層；該第一孔隙層和第二孔隙層均分佈有多數個與外部環境相連通的孔隙，且該第一孔隙層的孔隙尺寸大於該第二孔隙層的孔隙尺寸。
- 如申請專利範圍第1項所述應用於組織修復工程之再生膜，其中，該再生膜其中一側之表面為第一表面，該再生膜另一側之表面為第二表面，該第一表面具有該第一孔隙層之孔隙，該第二表面具有該第二孔隙層之孔隙，該第一表面的孔隙尺寸大於該第二表面的孔隙尺寸。
- 一種如申請專利範圍第1項所述應用於組織修復工程之再生膜的製備方法，包括：步驟一，將高分子材料與第一溶劑以預定比例混合配製成高分子溶液；步驟二，將該高分子溶液附著於一模具表面而形成一再生膜半成品；步驟三，以第二溶劑對該再生膜半成品進行隙孔生成加工，於該再生膜半成品之膜壁上形成上述之孔隙。
- 如申請專利範圍第3項所述應用於組織修復工程之再生膜的製備方法，其中，該高分子材料係選自具生物降解性的聚乳酸甘醇酸共聚物(poly(DL-lactci acid-co-glycolic acid,PLGA)、聚己內酯(poly ε-caprolactone,PCL)、聚乳酸(polylactide acid,PLA)之擇一或組合。
- 如申請專利範圍第4項所述應用於組織修復工程之再生膜的製備方法，其中，該第一溶劑包含1,4-二氧陸圜(1,4-dioxane)、氯仿 (chloroform)與六氟異丙醇(hexafluoroisopropanol,HFIP)之擇一。
- 如申請專利範圍第3項所述應用於組織修復工程之再生膜的製備方法，其中，該第二溶劑為乙醇水溶液。
- 如申請專利範圍第6項所述應用於組織修復工程之再生膜的製備方法，其中，該第二溶劑的濃度為10~60%(v/v)。
- 如申請專利範圍第6項所述應用於組織修復工程之再生膜的製備方法，其中，該第二溶劑的濃度為20~40%(v/v)。
- 如申請專利範圍第3項所述應用於組織修復工程之再生膜的製備方法，其中，該再生膜半成品膜壁外層的孔隙大小係藉由步驟三中的第二溶劑的極性大小來調節。
- 如申請專利範圍第3項所述應用於組織修復工程之再生膜的製備方法，其中，執行步驟二之前，先在模具的表面預塗佈一層阻斷第二溶劑侵入高分子材料與模具之間的親水性凝膠層。
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