TWI418631B

TWI418631B - 提昇光合產氫菌熱耐受性的方法

Info

Publication number: TWI418631B
Application number: TW100114907A
Authority: TW
Inventors: Chiehchen Huang; Shouchen Lo; Shauhua Shih
Original assignee: Univ Nat Chunghsing
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2011-04-28
Publication date: 2013-12-11
Also published as: TW201243052A

Description

提昇光合產氫菌熱耐受性的方法

本發明是有關於一種提昇光合產氫菌熱耐受性的方法。

氫為能量效率高、不排放二氧化碳及不助長溫室效應的綠色能源。生物產氫是藉由生物降解與生物轉換作用將有機物轉化為氫氣，光合微生物係利用固氮酶(Nitrogenase)產氫，藉由消耗三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)，將氫質子轉換為氫氣，其化學作用式為：

2H⁺ +2e^- +4ATP→ H₂ +4ADP+4Pi

培養光合微生物時，常會因光照導致培養槽溫度逐漸提高，當溫度超過光合微生物可適應的溫度範圍(28-35℃)，會影響光合微生物的生理狀態而造成細胞生長停滯，產氫量也因而降低，因此不利於連續操作。

一般而言，欲提升微生物的熱耐受性可從兩種方法做起，一是以分生技術異源或同源表達多個蛋白保護子(chaperone)來達成；或是以自然突變的方式篩選具有熱耐受性性狀的微生物。

本發明之一態樣是在提供一種提昇光合產氫菌熱耐受性的方法，包含以一載體將包含序列編號：1之去氧核糖核酸序列轉型於光合產氫菌，可使光合產氫菌成為可於40℃左右之環境下生長培養之轉型菌。

依據本發明一實施例，包含序列編號：1之去氧核糖核酸序列以質體轉型的方式，使光合產氫菌成為可於40℃左右培養環境下生長之轉型菌。

依據本發明一實施例，包含序列編號：1之去氧核糖核酸序列以嵌入該光合產氫菌的染色體的方式，使光合產氫菌成為可於40℃左右培養環境下生長之轉型菌。

根據上述，本發明實施例之提昇光合產氫菌熱耐受性的方法，利用於光合產氫菌中表達外源[FeFe]-產氫酶，不需額外表達侶伴蛋白(chaperone protein)，即可使宿主產生適應40℃左右培養環境的熱耐受性。特別是本發明實施例之方法並非僅應用產氫酶來加強微生物的產氫能力，而是在高溫的環境下產生穩定細胞生理活性、維持細胞生長濃度的效果。

依照本發明之實施方式，以一載體將包含序列編號：1之去氧核糖核酸序列轉型於光合產氫菌，可使光合產氫菌轉型成為可於40℃左右培養環境下生長之轉型菌。

本文中將可編碼產生[FeFe]-產氫酶之基因稱為hydA 基因或與hydA 基因同源(homology)之序列，其可透過轉殖方式由適當的菌株中取得，或是可以人工合成DNA方式來獲得此序列。適於本發明可用以獲取hydA 基因或與hydA 基因同源之序列的菌株，包括可於40-70℃環境生存之菌株，包含但不僅限於梭狀桿菌(Clostridium )屬之菌株。梭狀桿菌屬之菌株例如可為熱纖梭狀桿菌(Clostridium thermocellum )。可以轉殖方式自上述菌株之染色體DNA中取得hydA 基因或與hydA 基因同源之序列；或是利用人工合成方式合成出hydA 基因或與hydA 基因同源之序列。此領域中具有通常知識者可在不需過度實驗的情況下，利用已知操作獲取hydA 基因或與hydA 基因同源之序列。

上述「hydA 基因或與hydA 基因同源之序列」，包括序列編號：1所示的序列、其互補序列(complementary sequences)以及保守性類似物(conservative analogs)，例如具有簡併性密碼子取代(degenerative codon substitutions)的同源性序列(homologous sequences)。根據本領域之公知常識，簡併性密碼子取代可以經由在核酸序列中的一或多個被選定的密碼子的第3位置處替換。

在本發明一實施方式中，以所獲取之hydA 基因或與hydA 基因同源之序列來構築一載體，並以載體來轉型一光合產氫菌，使該光合產氫菌轉型成為可於40℃左右培養環境下生長之轉型菌。

適用於本發明之載體，包括但不限於可於光合產氫菌宿主中複製的質體(plasmid)，以轉型(transformation)送入光合產氫菌宿主中；或利用噬菌體(bacteria phage)為載體或同源重組(homologous recombination)質體為載體，將去氧核糖核酸片段直接嵌入該光合產氫菌的染色體。

載體可至少帶有一去氧核糖核酸片段，具有hydA 基因或與hydA 基因同源之序列。例如，載體可包含具有如序列編號：1所示之序列的去氧核糖核酸片段。在一實施方式中，此質體為pMGPHT，以電穿孔(electroporation)方法轉型於光合產氫菌。pMGPHT包含序列編號：3的去氧核糖核酸序列。

啟動子區域可包含持續表現型啟動子或誘導型啟動子。除非特別指明，否則本文中所述「啟動子區域」涵蓋RNA聚合酶複合物(RNA polymerase)所辨識之啟動子序列、調節蛋白(regulator)所辨識之一或多個調節序列、TATA-BOX序列、轉錄起始點序列、Shine-Dalgarno(SD)序列。

適用於本發明之光合產氫菌宿主可包含但不僅限於紅假單胞菌(Rhodopseudomonas) 屬、紅螺菌(Rhodospirillaceae) 屬及紅細菌(Rhodobacter) 屬之菌株。其中紅假單胞菌屬之菌株例如可為紫色不含硫光合菌(Rhodopseudomonas palustris )。

此外，還可根據不同宿主，將與hydA 基因同源之去氧核糖核酸序列替換為目標宿主之偏好密碼子，以促進具備產氫功能的[FeFe]-產氫酶的表達。

以下將含有持續表現型啟動子區域及hydA 基因(序列編號：1)之去氧核糖核酸片段(序列編號：2)構築形成質體pMGPHT(序列編號：3)，並轉型於Rhodopseudomonas palustris CGA009(購自American Type Culture Collection；ATCC)宿主中為例，說明本發明之方法及異源產氫基因於光合產氫菌中表現對於提昇宿主熱耐受性的效果。

質體pMGPHT之構築

第1圖為質體pMGPHT之構築流程圖。在本實施例中，係以Clostridium thermocellum ATCC 27405為模版(購自食品工業研究所附設生物資源中心)，利用引子HydA-F(序列編號：4)及引子HydA-R(序列編號：5)增幅hydA 基因，將起始密碼子修改為ATG以提高hydA 基因在宿主中的表現；並在hydA 基因上游加入啟動子(Promoter)片段(序列編號：6)、hydA 基因下游加入終止子(Terminator)片段(序列編號：7)，得到如序列編號：2所示之去氧核糖核酸片段，其中5’端具有Xba I切位，3’端具有Sac I切位。在本實施例中，啟動子與終止子之序列係源於R. palustris P4之pckA 基因。

序列編號：1之去氧核糖核酸片段再與經由同樣限制酶Xba I/Sac I剪切的pMG105穿梭載體(Shuttle vector；日本京都Research Institute of Innovative Technology forthe Earth機構提供；序列編號：8)，利用T₄ 接合酶(T₄ DNA ligase)以適當比例進行接合，得到構築完成的pMGPHT質體(序列編號：3)。

上述質體選殖操作，可以包含但不限定以下列步驟完成。

在本實施例中，聚合酶連鎖反應之反應物及試劑依下述比例進行：1 μg的模板DNA，依序加入2 μL的dNTP溶液(1.25 mM)、2.5 μL的10倍濃縮聚合酶緩衝液(10X-Taq DNA polymerase buffer)、10 pmole的引子對及2.5單位(unit)的Taq-聚合酶(Taq DNA polymerase)，以無菌去離子水調整總體積為25 μL，置於聚合酶連鎖反應儀(GeneAmp PCR system 2400;Perkin Elmer)進行聚合酶連鎖反應。反應條件為94℃反應5分鐘，94 ℃反應1分鐘(進行10個循環；10 cycles)、50℃反應1分鐘、72℃反應1分20秒，94℃反應1分鐘(20個循環；20 cycles)、60℃反應1分鐘、72℃反應1分20秒，反應結束後持續於72℃反應10分鐘，然後降溫至4℃，並以瓊脂醣膠體電泳觀察PCR之結果。

PCR產物回收可先以瓊脂醣膠體電泳進行分離。將含有目標片段之膠體切下，並利用本技術領域中常用回收DNA的方法或商品化套組進行回收。回收後的產物即可進行後續之剪切及接合反應。

DNA分子剪切依照限制酶廠商提供之流程進行。取適量DNA樣品與滅菌去離子水、限制酶緩衝液混合均勻後，再加入適量限制酶混合均勻，於酵素最適反應溫度下反應。

DNA接合反應切依照T₄ 接合酶廠商提供之流程進行。取質體DNA及欲嵌入之DNA片段以適當比例混合後與滅菌去離子水、接合酶緩衝液混合均勻後，再加入適量接合酶混合均勻，於酵素最適反應溫度下反應一段時間再終止反應，即可進行轉型作用。

選殖含質體pMGPHT之光合產氫菌轉型株

R. palustris 為一種紫色不含硫菌(purple non-sulfur bacteria;PNSB)，可利用固氮酶(nitrogenase)生產氫氣。紫色不含硫菌為產氫效率最佳的光合微生物，在光處及暗處都可產氫。

將穿梭質體pMGPHT以電轉型方式轉型至R. palustris 電勝任細胞，培養後篩選具有卡那黴素(Kanamycin)抗生素抗性的菌落。篩選到的轉型株命名為R. palustris strain pMGPHT。

上述轉型株選殖操作，可以包含但不限定以下列步驟完成。例如，本實施例係將R. palu stris在32℃之厭氧環境下培養於紅螺菌培養基(Rhodospirillaceae medium)，並提供50 W/m² 的光照。紅螺菌培養基含K₂ HPO₄ (0.5 g/L)、KH₂ PO₄ (0.5 g/L)、MgSO₄ ‧7H₂ O(0.2 g/L)、NaCl(0.4 g/L)、CaCl₂ ‧2H₂ O(0.05 g/L)、酵母萃取物(0.2 g/L)、1.0 g/L之Iron citrate solution(5 mL/L)及微量元素溶液(1 mL)。微量元素溶液含ZnCl₂ (70 mg/L)、MnCl₂ ‧4H₂ O(100 mg/L)、H₃ BO₃ (60 mg/L)、CoCl₂ ‧6H₂ O(200 mg/L)、CuCl₂ ‧2H₂ O(20 mg/L)、NiCl₂ ‧6H₂ O(20 mg/L)、NaMoO₄ ‧2H₂ O(40 mg/L)；25%之HCl(1 mg/L)。

上述藥劑可預先配製成濃縮液：(A)KH₂ PO₄ +K₂ HPO₄ (50 g/L：50 g/L)；(B)MgSO₄ ‧7H₂ O(20 g/L)；(C)NaCl+CaCl₂ ‧2H₂ O(40 g/L：5 g/L)。配製300 mL時先在三角瓶裝入約150 mL的去離子水，再加入濃縮液(A)(B)(C)各3 mL、Fe-citrate溶液1.5 mL，微量元素溶液0.3 mL、酵母萃取物(Yeast Extract)0.06g，麩胺酸(Glutamate)0.12 g及作為碳源的CH₃ COONa 0.3 g。碳源可視需求替換成乳酸(Lactate)。使用0.1 M NaOH調整培養基pH值至7.1，用氦氣充填培養瓶的瓶頂空間以成厭氧狀態。

固體培養基則是液體培養基中另外添加1.5%的細菌瓊脂(Bacto Agar;Difco)，以滅菌釜滅菌並溶解後，視實驗的需要添加抗生素，並分裝置培養皿(90×15 mm Petri dishes，Alpha plus)中，待凝固風乾後可使用。在本實施例中，R .palustris 電勝任細胞之製備與電穿孔轉型係依照Donohue與Kaplan在1991年發表的方法進行。將R .palustris 培養於上述培養液中8-24小時，以無菌二次水反覆稀釋、離心7-8次後加入10%甘油製作電勝任細胞。以40 μL聚乙二醇(polyethylene glycol 6000;PEG 6000)(50%)、20 μL質體與40 μL電勝任細胞混合後，以衰退波電擊8.5 m/sec後置於冰上1分鐘重複四次(BIO-RAD GENE PULSER II)，電轉型條件為電阻400Ω、2.5kV、電容25μF、電場強度為12.5kV/cm。將電轉型後的細胞加入含卡那黴素(Kanamycin)(200 μg/mL)的培養基培養，並篩取具有抗生素抗性的轉型株。

第2圖為抽取篩選到的轉型株R .palustris strain pMGPHT質體，並以限制酶Bgl II進行剪切(digest)後之凝膠電泳確認結果。其中，泳道M為分子量標誌(marker)，泳道1為抽取到的質體以Bgl II剪切後的結果。根據第1圖所示之pMGPHT限制酶圖譜，以Bgl II進行剪切後，理論可得到5704鹼基對(base pair；bp)、1460 bp、471 bp的片段。第2圖之凝膠電泳結果顯示有約5.7 kb、約1.5 kb及約0.47 kb的片段，與預估之片段大小相符，可確認為pMGPHT無誤。

此外，選殖完成的R .palustris strain pMGPHT在第二次繼代之後全部菌落仍可保有卡那黴素抗生素抗性，顯示質體pMGPHT在R .palustris 中具穩定性。第3圖為以反轉錄聚合酶連鎖反應(Reverse transcription polymerase chain reaction;RT-PCR)偵測pMGPHT的hydA 基因在宿主中的表現結果。

萃取生長對數期之轉型株R. palustris strain pMGPHT的總核糖核酸(total RNA)，以對hydA 序列具專一性的引子PHT-45F(R)(序列編號：9)配合PHT-45F(L)(序列編號：10)進行RT-PCR，偵測所選殖的hydA 基因是否在宿主中成功表達。其中M為分子量標記(100 bp DNA Ladder)，RT(+)為實驗組(添加反轉錄酶及反應緩衝液、引子PHT-45F(R)、total RNA)，RT(-)為控制組(未添加反轉錄酶)。由第3圖之結果顯示，RT(+)實驗組成功增幅出hydA 之互補DNA(Complementary DNA;cDNA)片段，表示hydA基因確實在宿主中表達。

外源[FeFe]-產氫酶蛋白表達對於提昇宿主熱耐受性之效應

第4圖為R. palustris strain pMGPHT轉型株與含有空載體(pMG105；不含hydA 基因)之對照組，於不同溫度條件下的細胞生長速率比較。

溫度試驗時，待測菌株分別以厭氧密封試管培養於38℃、40℃、42℃、及45℃水浴槽中。細胞生長情形(濃度)以分光光度計(spectrophotometer)偵測。各組數據皆以至少三次之獨立實驗的平均值及標準差來表示。

第4圖之結果顯示R. palustris strain pMGPHT轉型株在攝氏40℃左右培養時，其細胞倍增時間明顯少於僅含有空載體的控制組。

其中，如下表一所示，於38℃、40℃、42℃及45℃培養時，相較於控制組，R. palustris strain pMGPHT轉型株可縮短細胞倍增時間的比值(對照組/轉型株)分別為1.04、1.46、1.32及1.34，顯示R. palustris strain pMGPHT轉型株確實具有適應較高溫度培養環境的能力。表一、轉型株與對照組於不同溫度條件下的細胞生長速率

第5圖為外源[FeFe]-產氫酶對於提昇光合產氫菌熱耐受性效應之機轉示意圖。

光合微生物利用固氮酶(Nitrogenase)產氫來平衡細胞內的還原能，藉由消耗三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)，將氫質子轉換為氫氣，其需要較高的活化能，其化學作用式為：

2H⁺ +2e^- +4ATP→ H₂ +4ADP+4Pi

產氫酶(Hydrogenase)可於厭氧發酵環境下分解有機質，代謝有機質過程產生的部份電子則藉由電子傳遞系統傳送給水體中之氫質子而產生氫氣。其化學作用式為：

2H⁺ +2e^- → H₂

如第5圖途徑(A)所示，當光合產氫菌利用固氮酶產氫時，需消耗ATP將氫質子轉換為氫氣。當菌體額外表達外源[FeFe]-產氫酶時，推測可提供菌體另一個節能的細胞內還原能平衡途徑(B)。

當菌體培養於較嚴苛之環境時，可能影響細胞代謝而導致生長速度減緩。當菌體額外表達外源[FeFe]-產氫酶時，可部份經由途徑(B)來產氫，相對節省途徑(A)所消耗的能量，藉由此節省能量的機轉可促進菌體生長，有助於適應較高溫之培養環境。

由上述本發明實施方式可知，本發明不同於傳統分生方法，以表達多個蛋白保護子的方式來保護宿主蛋白質來提升微生物的熱耐受性，而是僅藉由在光合產氫菌中異源表達[FeFe]-產氫酶，即可有效提昇光合產氫菌的熱耐受性，使原本僅適應於28-35℃環境下生長的光合產氫菌，可適應40℃左右之溫度。

因此，本發明實施方式解決了光合菌無法適應太陽光照射後培養槽溫度過高的問題。應用本發明可達到以太陽光作為光合菌之光照及熱能來源，以節省培養槽運作成本的目標。雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

＜110＞國立中興大學

＜120＞具熱耐受性的光合產氫菌轉殖株

＜160＞9

＜210＞SEQ ID NO: 1

＜211＞1739

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞CDS

＜223＞hydA 基因序列

＜400＞2

＜210＞SEQ ID NO: 2

＜211＞1894

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞CDS

＜223＞可轉錄[FeFe]-Hydrogenase的DNA片段

＜400＞2

＜210＞SEQ ID NO: 3

＜211＞7635

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞環狀的核酸序列

＜223＞可於光合菌宿主中表現HydA蛋白的質體pMGPHT序列

＜400＞3

＜210＞SEQ ID NO: 4

＜211＞28

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞primer

＜223＞增幅hydA 基因的引子(HydA-F)

＜400＞4

＜210＞SEQ ID NO: 5

＜211＞28

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞primer

＜223＞增幅hydA 基因的引子(HydA-R)

＜400＞5

＜210＞SEQ ID NO: 6

＜211＞124

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞promoter

＜223＞源於Rhodopseudomonas palustris P4之pckA 基因

＜400＞6

＜210＞SEQ ID NO: 7

＜211＞52

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞terminater

＜223＞源於Rhodopseudomonas palustris P4之pckA 基因

＜400＞7

＜210＞SEQ ID NO: 8

＜211＞7635

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞環狀的核酸序列

＜223＞穿梭載體pMG105

＜400＞8

＜210＞SEQ ID NO: 9

＜211＞27

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞primer

＜223＞對hydA 序列具專一性的引子PHT-45F(R)

＜400＞

＜210＞SEQ ID No: 10

＜211＞28

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜220＞primer

＜223＞對hydA 序列具專一性的引子PHT-45F(L)

＜400＞

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1圖是質體pMGPHT之構築流程圖。

第2圖轉型株R. palustris strain pMGPHT質體以限制酶剪切後之凝膠電泳確認結果。

第3圖為以反轉錄聚合酶連鎖反應偵測pMGPHT的SEQ ID NO:1片段在宿主中的表現結果。

第4圖為R. palustris strain pMGPHT轉型株與對照組於不同溫度條件下的細胞生長速率比較。

Claims

一種提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，包含：以一包含序列編號：1之去氧核糖核酸序列的載體轉型於光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris ，使該光合產氫菌成為可於40℃至45℃培養環境下生長之一轉型菌，其中該序列編號：1之去氧核糖核酸可編碼產生一[FeFe]-產氫酶蛋白產物。
如請求項1所述之提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，其中該包含序列編號：1之去氧核糖核酸序列是序列編號：2之序列。
如請求項1所述之提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，其中該包含序列編號：1之去氧核糖核酸序列是序列編號：3之序列。
如請求項1所述之提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，其中該序列編號：1之去氧核糖核酸序列上游包含一啟動子區域。
如請求項4所述之提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，其中該啟動子區域為可誘導型啟動子區域。
如請求項1所述之提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，其中該轉型菌寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)，編號BCRC 910506。
如請求項1所述之提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，其中該去氧核糖核酸序列是嵌入該光合產氫菌的染色體。
如請求項1所述之提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，其中該包含序列編號：1之去氧核糖核酸序列是源自可於40-70℃以上生存之菌株的染色體DNA。
如請求項8述之提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，其中該菌株是Clostridium 屬。
如請求項8述之提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，其中該菌株為Clostridium thermocellum 。
如請求項1所述之提昇光合產氫菌Rhodopseudomonas palustris 熱耐受性的方法，其中該包含序列編號：1之去氧核糖核酸序列可以人工方式合成。