TWI411441B

TWI411441B - 血管收縮素轉化酶抑制性肽類

Info

Publication number: TWI411441B
Application number: TW100111621A
Authority: TW
Inventors: Kyoichi Ogura; Taeko Iino; Sumio Asami
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2003-03-18
Filing date: 2004-03-15
Publication date: 2013-10-11
Also published as: JP4369985B2; WO2004082709A1; PL2145630T3; EP2145630A2; CA2743539A1; ES2400308T3; DK1605969T3; CY1114072T1; EP2145630B1; EP1938832B1; KR20110015674A; AU2009236034A1; PL1938832T3; KR101078628B1; TW201125574A; AU2004222435A1; CN1780639A; KR101119449B1; JP2009084294A; CA2526891C

Description

血管收縮素轉化酶抑制性肽類

本發明係有關可抑制血管收縮素轉化酶因而可用為具有降血壓效應的健康食品、藥物等的成分之肽類。

患有高血壓-一種生活型態相關疾病的典型例子-的患者數目正逐漸增加著。已知者，高血壓會誘發出多種併發症例如腦出血、蜘蛛膜出血、腦梗塞、心肌梗塞、痠痛病、腎硬化、等等。因此，對於高血壓的起始機制已有多種研究進行過。

有關血壓調節系統，與血壓增高相關的血管緊張肽原酶-血管收縮素系統及與血壓降低相關的激肽釋放酶-激肽系統扮有重要角色。於血管緊張肽原酶-血管收縮素系統中，從肝分泌出的血管收縮素原會被腎中產生的血管緊張肽原酶轉化成血管收縮素I。血管收縮素I會被血管收縮素轉化酶(ACE)進一步轉化成血管收縮素II。血管收縮素系統II會誘導血管平滑肌的收縮因而增高血壓。另一方面，降血壓系統中的激肽釋放酶對激肽原作用因而變成血管舒緩激肽(bradykinin)。亦即，已知者，ACE透過上述二種效應而參與在血壓增高之中，亦即產生作為一血管加壓神經肽(vasopressor peptide)的血管收縮素II及抑制活化作為降血壓肽的血管舒緩激肽。如此一來，可以經由壓制ACE的酵素活性而減低血壓的增高。經開發成為ACE 抑制劑的脯胺酸衍生物例如刻甫定(captopril)和恩納比爾(enalapril)業經廣泛地用於高血壓的治療之中。

於最近數年內，業經報導者，用酵素消化食物所得之肽類具有ACE抑制活性。舉例來說，已有許多此等消化產物被報導過，例如，明膠的膠原酶消化產物(日本專利公開揭示內容SHO 52-148631)、酪蛋白的胰蛋白酶消化產物(日本專利公開揭示內容SHO 58-109425，日本專利公開揭示內容SHO 59-44323，日本專利公開揭示內容SHO 60-23086，日本專利公開揭示內容SHO 60-23087，日本專利公開揭示內容SHO 61-36226，及日本專利公開揭示內容SHO 61-36227)，γ-玉米醇溶蛋白的嗜熱菌蛋白酶消化產物(日本專利公開揭示內容SHO 2-32127)，沙丁魚肉的胃蛋白酶消化產物(日本專利公開揭示內容HEI 3-11097)，乾鰹魚的嗜熱菌蛋白酶消化產物(日本專利公開揭示內容HEI 4-144690)，芝麻蛋白質的嗜熱菌蛋白酶消化產物(日本專利公開揭示內容HEI 8-231588)，κ-酪蛋白的胃蛋白酶消化產物(日本專利公開揭示內容8-269088)等。

此等ACE抑制性肽類，都是食物來源者，具有明顯的優點，亦即，彼等具有很少安全性問題(如副作用、毒性等)且如一般食物一樣可食用。不過，經報導上述肽產物主要包括有5或更多個胺基酸的肽類(日本專利公開揭示內容SHO 52-148631，日本專利公開揭示內容58-109425，日本專利公開揭示內容SHO 59-44323，日本專利公開揭示內容60-23086，日本專利公開揭示內容SHO 61-36226，日本專利公開揭示內容SHO 61-36227，日本專利公開揭示內容HEI 3-11097，日本專利第3135812和日本專利公開揭示內容HEI 8-269088)。經指出者由更長的胺基酸鏈所構成的肽類不能達到根據試管內強ACE抑制活性所預期的降血壓效應之水平，可能是因為彼等易於被體內的消化性酵素所消化因而喪失ACE抑制活性之故，或者即使彼等保持不被消化，彼等也會因為彼等的龐大分子結構而不容易被吸收。

綜上所述，本發明的一項目的為提供ACE抑制性三肽類，彼等在經口攝入時不容易被消化性酵素所消化因而具有較低在活體內失去彼等的ACE抑制活性之傾向。

於本發明中，也意欲提供可食用的(食物/飲料)組成物，血管收縮素轉化酶抑制劑及降血壓劑，彼等都包括一或多個上述三肽類。

發明詳細說明

本案發明人假設食物的嗜熱菌蛋白酶消化產物含有能夠解決上述問題的肽類而尋找由不超過3個胺基酸所構成的ACE抑制性肽類。其結果，他們成功地在芝麻的嗜熱菌消化產物中發現出3個三肽類，該三肽類都具有ACE抑制活性且在動物實驗中顯示出降血壓效應。本發明即根據此等發現而完成。

因而，本發明提供三肽類，分別具有胺基酸序列Leu-Ser-Ala、Val-Ile-Tyr和Leu-Val-Tyr且顯示出血管收縮素轉化酶抑制活性。

本發明進一步提供含有一或多個上述三肽類的可食用組成物，血管收縮素轉化酶抑制劑及降血壓劑。

本發明三肽類可經由化學合成而產生。不過，於本發明一具體實例中，三肽係加到食物，飲料或口服藥物內以利用彼等的ACE抑制活性，此時，較佳者係經由用嗜熱菌蛋白酶消化源自芝麻或類似者之內的植物蛋白質來產生富含至少一種上述3種三肽的可食用組成物。

有關植物性蛋白質來源，可以使用富含蛋白質的植物組織(較佳者為種子)，例如，穀類如米、小麥、大麥、燕麥和玉米、或豆類如菜豆、蠶豆、大豆和綠豆、及芝麻。

在用嗜熱菌蛋白酶消化以得到本發明肽類時，處理程序係依起始物所具性質而變異。較佳者，作為前處理者，係將材料先去脂肪，例如用溶劑如醇、丙酮、己烷等擠揑或萃取脂肪以移除汁液。為了改進用嗜熱菌蛋白酶對起始物的消化效率，也為較佳者係將起始物細磨後，在攪拌下懸浮於水中。於難溶性蛋白質的情況中，也可以採用另一種前處理例如添加氫氧化鈉或加熱藉以均勻地溶解或懸浮該蛋白質。然後於其中加入恰當量的嗜熱菌蛋白酶，較佳者為從500至50000 PU每克蛋白質，並在pH 5至9，溫度10 至80℃，穩態或攪拌之下進行蛋白質消化反應。(〝PU〞意指〝蛋白酶單位〞，且1 PU係經定義的使用牛奶酪蛋白作為受質在pH 7.2和35℃下促成相當於1微克酪胺酸每分鐘的非蛋白質Folin顏色的增加之酵素量)。要檢查反應是否已有足夠的進展(亦即，反應是否是以得到所提出的三肽)，可以採用包括〝將液體反應混合物施加到使用ODS管柱的高性能液體層析術及經由測量在210奈米(nm)的吸光度以測定溶析樣式〞之方法。反應係經由添加，例如，鹽酸予以停止。或者，可經由加熱將嗜熱菌蛋白酶抑制活化。也可以同時添加鹽酸和加熱來停止反應。然後將液體反應混合物離心、過濾等，並移除沈澱物。將如此所得濾液用氫氧化鈉或鹽酸中和後予以濾縮。另外，若有需要時，可用活性碳處理以移除異味(例如，苦味、澀味、難聞味、等)。如此所得芝麻肽含有Leu-Ser-Ala、Val-Ile-Tyr和Leu-Val-Tyr含量各為從0.001重量%至0.1重量%。

以上面所述方式得到之嗜熱菌蛋白酶消化產物可於在有或沒有採用離子交換樹脂，高孔調型聚合物樹脂等進一步處理以移除高分子量蛋白質，藉以提供富含本發明三肽的部份純化產物之後作為本發明三肽組成物之形式使用。此等消化產物和部份純化產物於後文中有時候概稱為〝富含三肽組成物〞。於需要時，此等組成物可用活性碳進一步處理以去除異味(例如，苦味、澀味、難聞味、等)之後再使用。

要得到本發明肽類的純化製備物時，係對上述濃縮物施以膠濾管柱層析術，使用離子交換樹脂或高孔調型聚合物樹脂之層析術，親和層析術等，並將具有ACE抑制活性的溶析肽部份合併。接著，可將合併的活性液份以純化肽常用的方法予以純化，例如，使用逆相管柱如ODS管柱或C 30管柱進行高性能液體層析術，藉此提供呈實質純態的單一肽形式。本發明三肽不僅可用上述方法得自芝麻(如，胡麻(Sesamum indicum L.)，而且也可以得自榖類例如稻(例如，水稻(Oryza Sativa L.)、小麥(如小麥(Triticum aestivum L.),T.durum Desf.，圖錐小麥(T.turgidum L.,)、埃及小麥(T.pyramidale(Delile)perciv.non Delite ex Schult)、T.abyssinicum Vavilov，和T.carthlicum Nevski)、大麥(如，大麥(Hordeum vulgare L.)、燕麥(如，燕麥(Avena sativa L.)或玉米(如，玉蜀黍(Zea myas)、或豆類(如菜豆(Phaseolus vulgaris L.)、蠶豆(Vicia faba L.)、大豆(如，大豆(Glycine max(L.)Merrill)或綠豆(如綠豆(Vigna radiata(L.)R.Wilcz)。該三肽或富含三肽組成物所具ACE抑制活性可用，例如，後文實施例中所要述及的試管內試驗法及/或活體內試驗法予以測量。

於本發明每一肽係以化學合成法製備之時，該合成可用合成肽中習用的固相法和液相法中任一者來進行。經由合成所得本發明肽可用常用的純化程序予以純化，例如逆相高性能液體層析術，使用離子交換樹脂或高孔調型聚合物樹脂的層析術，親和性層析術等。

如此所得三肽類和富含該三肽類的組成物具有強大的抑制ACE之活性且於經口攝入時展現出強ACE抑制效應。所以，彼等可用為高強力ACE抑制劑。再者，彼等可以透過胃腸道容易地被吸收且在墊下相當地穩定。由於此等特性，彼等可用於多種形式的食品，飲料和醫學製劑之中。

據此，本發明提出一種可食用的組成物，其包括一或多種上述三肽且其預期具有血管收縮素轉化酶抑制作用；一種血管收縮素轉化酶抑制劑及一種含有一或多種上述三肽的降血壓劑。

於一或多種本發明三肽用於食品，飲料，藥物等之中的情況中，可以使用從芝麻蛋白質部份的嗜熱菌蛋白酶消化產物充分地純化出之三肽，或可以使用化學合成產物。或者，由於本發明三肽具有高安定性及強ACE抑制活性，可以使用上述經部份純化的產物或嗜熱菌蛋白酶消化產物或其經部份純化的產物本身作為富含三肽的組成物；於此情況中，同樣地也得到充分的ACE抑制活性，因而，此為本發明的較佳具體實例。

本發明可食用的組成物係經由添加單一攝取劑量為從0.001毫克至100毫克，較佳者從0.01毫克至20毫克且更佳者從0.1毫克至10毫克之量添加一或多種上述三肽而製成。本發明三肽係呈可以容易處置且高度溶於水中之固體或粉末形式，此外，該等三肽可透過胃腸道獲得良好的吸收。所以，該等三肽可以沒有特別限制地於任何階段以任何方法添加到食物中。也就是說，該等三肽可用粉末，溶液，懸浮液等形式，在食物製造程序的起始階段，中間階段或最後階段使用食品工業領域中常用的方法添加。含有本發明三肽的可食用組成物之暫時，間斷，連續或每日攝取可以抑制血管收縮素轉化酶且得到，例如，降血壓效應。該等食品和飲料可呈，例如，固體、半固體或液體之形式。固體食物的例子包括一般的食品與健康食品，呈餅乾、片、丸等形式例如錠、膠囊、顆粒、粉末等。半固體食品的例子包括呈糊、果凍、凝膠等形式者。液體食品的例子包括一般飲品與健康飲料，呈果汁、冷飲、茶飲料、滋補飲料等形式。此等食品或飲料可用營養補充飲料或佐料形式供給以使我們可連續地攝取本發明三肽，藉而壓制血壓增高的風險。

本發明醫藥組成物含有在量上類似於上述可食用組成物的量之本發明三肽。本發明醫藥組成物可臨時給高血壓患者服用以壓制體內的血管收縮素轉化酶，藉此得到降血壓效應。或者，本發明醫藥組成物可安全地連續給用，因為該活性成分係源自天然物質。有關本發明醫藥組成物可治療及/或預防的疾病之例子，可提及者為高血壓。較佳者，該醫藥組成物係呈口服製劑形式例如錠劑、膠囊、粉、粒或糖漿。非經腸給用所用製劑的例子包括經靜脈內、動脈內、皮下、肌肉內或鼻內給用的無菌溶液。此等溶液可呈乾固體形式，而於使用前才溶解。注射製劑可經由將一有效量的三肽溶解在生理食鹽水中且在無菌條件下處理而製成，如製造注射製劑所常用者。

實施例

至此，本發明要參照下列諸實施例予以更詳細地說明。

測量ACE抑制活性的方法

於本發明中，ACE抑制活性(IC₅₀ )係根據下述方法予以測量。

緩衝液：0.1 M HEPES，0.3 NaCl，0.01% Triton-X(pH 8.3)

酵素：得自兔子肺的ACE(Sigma)。

溶解在上述緩衝液及經調整劑1 mU/50微升濃度。

受質：Bz-Gly-His-Leu-H₂ O(Peptide Institute Inc.)。

將8.95毫克的受質溶解在1毫升二甲亞碸中且用水進一步稀釋5倍(最後濃度：4 mM)。

吸收5微升含有本發明肽的樣品到96－洞微滴板內。於添加25微升緩衝液和10微升酵素之後，充分地攪拌混合物且在37℃下溫澱5分鐘。添加10微升受質之後，將混合物置於37℃下反應30分鐘。然後添加40微升的0.1 N NaOH以停止反應。於添加20微升1%鄰－酞醛/甲醇溶液且靜置於室溫下10分鐘之後，加入100微升0.1 N HCl並將所得混合物在37℃下溫浸30分鐘。然後經由將在組胺酸殘基所含胺基與鄰－酞醛之間反應形成的螢光性物質予以激發(於355奈米)且測量在460奈米波長的螢光而測定ACE水解所形成的His－Leu之量。根據下面的方程式測定本發明肽的百分抑制率且計算出ACE抑制活性(IC₅₀ )

百分抑制率={1-(A-a)/(B-b)}×100

A：加入樣品時的螢光測量值。

a：加入樣品且以緩衝液取代酵素加入時的螢光測量值。

B：加入蒸餾水取代樣品時的螢光測量值

b：加入蒸餾水取代樣品及加入緩衝液取代酵素時的螢光測量值

實施例1：肽的製造和純化

將2升的水加到100克去脂芝麻中並經由添加NaOH將所得混合物的pH值調整到12.0至12.5。於55℃下攪拌1小時之後，過濾混合物而得蛋白質萃取物。於蛋白質萃取物中加入HCl以調整pH值到4.0。於離心之後，得到芝麻蛋白質(乾基重量：19.8克)。

於10克所得芝麻蛋白質中，加入300毫升的水並用NaOH將混合物的pH值調整到7.5。然後於其中加入10毫克的嗜熱菌蛋白酶(Nacalai Tesque，7000 PU/毫克)且將混合物置於65℃下溫和攪拌反應6小時。於反應完全之後，於反應混合物中加入HCl以調整到pH 4.0並加熱到90℃ 10分鐘以抑活化該嗜熱菌蛋白酶。於加熱之後，離心移除如此形成的沈澱物並將上澄液濾過濾紙(Toyo，No.2)。將濾液冷凍乾燥而得5.9克肽粉末。

將80毫克此肽粉末溶解在2毫升10%乙醇溶液中並施以膠濾管柱層析術。所用條件如下。

管柱：Bio-Gel P-2(15毫米ID×820毫米L，Bio-Rad)。

溶析劑：10%乙醇。

流速：0.15毫升/分鐘。

偵檢：UV 210奈米。

以15分鐘間隔使用液份收集器分液收集得自管柱的溶析液。根據上述方法測量每一液份的ACE抑制活性。其結果，在液份32至38中觀察到在上述條件下的主要ACE抑制活性。將此等液份合併及冷凍乾燥。重複此程序三次，因而得到總共37.5毫克的肽。

接著，將以Bio-Gel P-2膠濾管柱層析術得到37.5毫克ACE抑制活性肽溶解在2毫升的純化水中且使用ODS管柱施以高性能液體層析術藉此分離該肽。所用條件如下。

管柱：Develosil ODS-10(20毫米ID×250毫米L，Nomura Chemical)。

移動相：緩衝液A：5% CH₃ CN，0.1% TFA。

緩衝液B：40% CH₃ CN，0.1% TFA。

梯度：0至20分鐘：0%緩衝液B。

20至80分鐘：0至100%緩衝液B。

流速：10毫升/分鐘。

偵檢：UV 210奈米。

於上述條件之下，使用液份收集器以1分鐘間隔逐液份收集溶析液。吸取5微升部分的每一液份到一96-洞微滴板內且在減壓之下蒸發乾。其次，將剩餘物溶解在5微升的純水內而得測量ACE抑制活性所用樣品。然後根據上述方法測量每一液份的ACE抑制活性。其結果，液份39、52和54顯示出強ACE抑制活性。將該3液份分別冷凍乾燥因而從每一液份得到小量的肽。

液份39中的ACE抑制性肽之純化

將液份39的冷凍乾燥肽溶解在200微升的純水中且使用C 30管柱施以高性能液體層析術藉此分離該肽。所用條件如下。

管柱：Develosil C30-UG-5(10毫米ID×250毫米L，Nomura Chemical)。

移動相：緩衝液：5% CH₃ CN，0.1% TFA。

流速：4毫升/分鐘。

偵檢：UV 210奈米。

於上述條件之下，使用液份收集器以15分鐘間隔逐液份收集溶析液。吸取5微升部分的每一液份到一96-洞微滴板內且在減壓之下蒸發乾。其次，將剩餘物溶解在5微升的純水內而得測量ACE抑制活性所用樣品。然後根據上述方法測量每一液份的ACE抑制活性。其結果，液份44和45顯示出強ACE抑制活性。將該2液份分別冷凍乾燥因而從每一液份得到小量的肽。接著，對此等部份施以胺基酸分析與TOF MS/MS分析。其結果，發現液份44和45的肽為Leu-Ser-Ala。

液份52中的ACE抑制性肽之純化

將液份52的冷凍乾燥肽溶解在200微升的純水中且使用C 30管柱施以高性能液體層析術藉此分離該肽。所用條件如下。

管柱：Develosil C30-UG-5(10毫米ID×250毫米L)。

移動相：緩衝液：14% CH₃ CN，0.1% TFA。

流速：4毫升/分鐘。

偵檢：UV 210奈米。

於上述條件之下，使用液份收集器以15分鐘間隔逐液份收集溶析液。吸取5微升部分的每一液份到一96-洞微滴板內且在減壓之下蒸發乾。其次，將剩餘物溶解在5微升的純水內而得測量ACE抑制活性所用樣品。然後根據上述方法測量每一液份的ACE抑制活性。其結果，液份89和90與液份96和97顯示出強ACE抑制活性。將該4液份分別冷凍乾燥因而從每一液份得到小量的肽。接著，對此等部份施以胺基酸分析與TOF MS/MS分析。其結果，發現液份89和90的肽為Ile-Val-Tyr且液份96和97的肽為Val-Ile-Tyr。

液份54中的ACE抑制性肽之純化

將液份54的冷凍乾燥肽溶解在200微升的純水中且使用C 30管柱施以高性能液體層析術藉此分離該肽。所用條件如下。

管柱：Develosil C30-UG-5(10毫米ID×250毫米L，Nomura Chemical)。

移動相：緩衝液：17% CH₃ CN，0.1% TFA。

流速：4毫升/分鐘。

偵檢：UV 210奈米。

於上述條件之下，使用液份收集器以15分鐘間隔逐液份收集溶析液。吸取5微升部分的每一液份到一96-洞微滴板內且在減壓之下蒸發乾。其次，將剩餘物溶解在5微升的純水內而得測量ACE抑制活性所用樣品。然後根據上述方法測量每一液份的ACE抑制活性。其結果，液份69至73顯示出強ACE抑制活性。將該5液份分別冷凍乾燥因而從每一液份得到小量的肽。接著，對其中的液份69、70、72和73施以胺基酸分析與TOF MS/MS分析。其結果，發現每一此等液份的肽皆為Leu-Val-Tyr。

實施例2：以化學合成製造肽

使用自動肽合成器(Model ABI 430，為Applied Biosystems所製)，經由從C－端起始及根據程式以BOC法依序延展肽鏈而合成一經有意保護的肽樹脂。

於肽在樹脂上的構造完成之後，將經保護的肽樹脂乾燥。將如此得到的經保護肽去保護基且經由用無水氟化氫處理(HF/對-甲酚8：2 v/v，60分鐘)而從樹脂承載體取下肽。用90%乙酸萃取如此所得粗製肽後冷凍乾燥而得粉末狀固體。將如此得到的粗製肽用ODS管柱以高性能液體層析術進一步純化因而得到合意的肽。

管柱：YMC-Pack ODS-2(30毫米ID×250毫米L，YMC)。

移動相：緩衝液A：5% CH₃ CN，0.1% TFA。

緩衝液B：40% CH₃ CN，0.1% TFA。

梯度：0至10分鐘：0%緩衝液B。

10至90分鐘：0至100%緩衝液B。

流速：20毫升/分鐘。

偵檢：UV 220奈米。

經如此純化的肽所具純度再用ODS管柱以高性能液體層析術予以檢驗。

管柱：Zorbax 300SB-C18(46毫米ID×150毫米L，Agilent Technologies)。

移動相：緩衝液A：1% CH₃ CN，0.1% TFA。

緩衝液B：60% CH₃ CN，0.1% TFA。

梯度：0至25分鐘：0至100%緩衝液B。

流速：1毫升/分鐘。

偵檢：UV 220奈米。

Leu-Ser-Ala之合成

使用Boc-Ala(Brz)樹脂(0.5毫莫耳)作為起始胺基酸樹脂承載體，使用2 mM分量的胺基酸衍生物Boc-Ala和Boc-Leu延展肽鏈。然後以上面實施例2所述純化方法得到經純化的Leu-Ser-Ala。該經純化的產物所具純度在用上面實施例2中所述方法測量得知為99.0%。

Val-Ile-Tyr之合成

使用Boc-Tyr(Brz)樹脂(0.5毫莫耳)作為起始胺基酸樹脂承載體，使用2 mM分量的胺基酸衍生物Boc-Ile和Boc-Val延展肽鏈。然後以上面實施例2所述純化方法得到經純化的Val-Ile-Tyr。該經純化的產物所具純度在用上面實施例2中所述方法測量得知為98.8%。

Leu-Val-Tyr之合成

使用Boc-Tyr(Brz)樹脂(0.5毫莫耳)作為起始胺基酸樹脂承載體，使用2 mM分量的胺基酸衍生物Boc-Val和Boc-Leu延展肽鏈。然後以上面實施例2所述純化方法得到經純化的Leu-Val-Tyr。該經純化的產物所具純度在用上面實施例2中所述方法測量得知為99.2%。

實施例3：肽的ACE抑制活性之測量

實施例2所得3肽的ACE抑制活性係根據上面所述方法測量且定出IC₅₀ 值。表1顯示出結果。作為對照者，也測量實施例1所得芝麻肽粉末的ACE抑制活性且測定出其IC₅₀ 值。

實施例4：肽對自然高血壓大鼠的降血壓效應

將17至22週大的SHR大鼠禁食整夜。然後將實施例2中得3肽分別以1毫克/公斤的劑量經口給用。對-對照組，以相同量的水經口給用作為比較。測量給用之前，及直到24小時之後的收縮期血壓之變化(BP-98A，SOFTRON)。圖1顯示出結果。

實施例5

使用實施例2的合成產物，從下列諸成分製造穀物茶飲料。

組成：

烤過的大麥　50克

熱水　2000毫升

實施例2的肽

Leu-Ser-Ala　19毫克

Val-Ile-Tyr　18毫克

Leu-Val-Tyr　18毫克

製造方法：

將熱水加到烤過的大麥且加熱到90℃ 5分鐘。於冷卻到40℃之後，過濾該混合物。然後將水加到萃取物中以調整體積到2000毫升。接著，加入上述肽並攪拌溶解而得榖的茶飲料。

實施例6：從蛋白酶處理過的植物種子離析及定量Leu-Val-Tyr

分別稱取25克的稻粒和燕麥粒，然後研磨成粉。於每一粉中加入50毫升已烷且濾過濾紙(Whatman，No.1)以移除溶劑。重複相同的已烷處理，共4次。從濾紙上的剩餘物移除己烷而分別得到18.8克去脂肪米粉末和15.9克去脂肪燕麥粉。

分別稱取10克的去脂肪粉末，懸浮在200毫升0.01N NaOH中且在55℃下攪拌1小時。於冷卻到室溫之後，將懸浮液濾過一濾紙(Whatman，No.1)。經由添加0.1N HCl將濾液調整到pH 4.0。離心收集如此形成的沈澱物，冷凍乾燥而分別得到0.38克和0.57克的米和燕麥粗蛋白粉末。

別稱取0.2克所得粉末，懸浮在10毫升0.1 mM CaCl₂ 中。將懸浮液整到pH 7.5，於其中加入0.2毫克嗜熱菌蛋白酶(7.000 PU/毫克，Nacalai Tesque)以在65℃下溫和混合實施酵素反應6小時。於反應期之後，以1N HCl調整pH到4.0且在90℃加熱混合物10分鐘以抑活化嗜熱菌蛋白酶。以3,000 rpm離心30分鐘以移除該經加熱所形成的沈澱物。將上澄液冷凍乾燥而得28.6毫克來自稻米和87.8毫克來自燕麥的肽粉末。

按下述進行上面所得稻米和燕麥肽粉中所含本發明諸肽之一的Leu-Val-Tyr之離析與定量。

i)在PD-10管柱上預處理

分別稱取20毫克的稻米和燕麥肽粉，溶解在0.1 N乙酸中到5毫克/毫升，濾經一微濾器(Millex-HV，孔徑0.45微米，濾器直徑13微米，Millipore Corporation)以移除不溶性成分。取2.5毫升份的濾液導到用0.1 N乙酸平衡過的PD-10管柱(脫鹽管柱，Amersham Biosciences)中。用另一份3.5毫升體積0.1 N乙酸洗該管柱。然後收集用另一3.0毫升體積的0.1 N乙酸所溶析出之液份，蒸乾，溶解在0.5毫升水中，再冷凍乾燥。

ii)使用TSK-GEL G2000 SWXL進行膠濾HPLC

將在PD-10管柱上預處理所製樣品溶解在250微升45% CH₃ CN，0.1% TFA中，以2,000 rpm離心5分鐘。將濾液經一微濾器(Millex-HV，孔徑0.45微米，濾器直徑13微米，Millipore Corporation)以移除不溶性成分。

將一50微升份的濾液給到一用45% CH₃ CN，0.1% TFA平衡過的TSK-GEL G2000 SWXL管柱(7.8×300毫米，Tosoh Corporarion)，且用45% CH₃ CN，0.1% TFA實施HPLC(流速0.7毫升/分，偵檢波長280奈米)。收集在滯留時間30秒鐘之前與30秒之後之間內一分鐘的溶析物，蒸乾，溶解在0.5毫升水中且冷凍乾燥。Leu-Val-Tyr的滯留時間係經由另外對合成Leu-Val-Tyr施以相同條件下的HPLC而預先測定的。

iii)在Develosil C30-UG-5上的逆相HPLC(Leu-Val-Tyr之定量分析)

對得自膠濾的活性肽液份中所含Leu-Val-Tyr以逆相HPLC在Develosil C30-UG-5管柱(3×150毫米，Nomura Chemical Co.,Ltd.)上定量分析。將TSK-GEL G2000 SWXL上膠濾HPLC所得部份溶在250微升5% CH₃ CN，0.1% TFA中，以2,000 rpm離心5分鐘並將上澄液濾經微濾器(Millex-HV，孔徑0.45微米，濾器直徑13微米，Millipore Corporation)以移除不溶性成分。將一50微升份的濾液給到用5% CH₃ CN，0.1% TFA平衡過的Develosil C30-UG-5管柱上以在下列條件下實施層析術：

溶析溶劑：

0-5分：5% CH₃ CN，0.1% TFA

5-10分：5-14% CH₃ CN，0.1% TFA

10-35分：14% CH₃ CN，0.1% TFA

流速：0.4毫升/分鐘

偵檢波長：280奈米

收集稻米和燕麥肽分別在Develosil C30-UG-5管柱層析術中對應於真Leu-Val-Tyr肽的滯留時間處之溶析峰。對該液份實以TOF MS分析及TOF MS/MS分析而確定該液份為Leu-Val-Tyr。

經由將不同量的真品Leu-Val-Tyr給到相同的Develosil C30-UG-5管柱上於上述相同條件下溶析且將峰面積對所給量進行標繪而製備一校準曲線。

校準曲線Y=249197X-2510.6(R2=0.9991)

Y：峰面積，X：Leu-Val-Tyr的量(微克)

將得自Develosil C30-UG-5層析術的稻米和燕麥之Leu-Val-Tyr液份的峰面積代入校準曲線中。其結果測定出1毫克得自稻米肽和燕麥肽中的Leu-Val-Tyr之量分別為0.71微和和1.05微克。

圖1為一圖解，顯示出使用自然高血壓大鼠探討本發明肽類的降血壓效應所得結果。

Claims

一種三肽，其具有胺基酸序列Val-Ile-Tyr。
根據申請專利範圍第1項之三肽，其係經由將源自一或多種選自稻米、小麥、大麥、燕麥、玉米、菜豆、蠶豆、大豆、綠豆和芝麻之中的材料之蛋白質用嗜熱菌蛋白酶消化而得者。
一種可食用組成物，其含有具有胺基酸序列Val-Ile-Tyr之三肽。
根據申請專利範圍第3項之可食用組成物，其包括在一單一攝取劑量中從0.001毫克至100毫克的該三肽。
一種血管收縮素轉化酶抑制劑，其含有作為活性成分的具有胺基酸序列Val-Ile-Tyr之三肽。
根據申請專利範圍第5項之血管收縮素轉化酶抑制劑，其包括在一單一口服攝取劑量中從0.001毫克至100毫克的該三肽。
一種降血壓劑，其含有作為活性成分的具有胺基酸序列Val-Ile-Tyr之三肽。
根據申請專利範圍第7項之降血壓劑，其包括在一單一口服攝取劑量中從0.001毫克至100毫克的該三肽。