TWI496791B

TWI496791B - Crosslinked chitosan and its preparation method

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Publication number: TWI496791B
Application number: TW099124102A
Authority: TW
Original assignee: Univ Nat Taiwan
Priority date: 2010-07-21
Filing date: 2010-07-21
Publication date: 2015-08-21
Also published as: TW201204745A

Description

經交聯之幾丁聚醣及其製備方法

本發明係關於一種經交聯之幾丁聚醣及其製備方法，特別係關於一種藉由醯胺鍵之形成產生交聯結構之幾丁聚醣及其製備方法。

幾丁聚醣由於具有抗菌活性、止血、促進組織再生、高生物相容性等優點，目前已廣泛應用於生醫用途上，例如作為生醫材料的骨架。

為了提升幾丁聚醣的功效，現有技術中有許多研究係著重於對幾丁聚醣進行修飾，而目前已知可用於修飾的生物材料包括膠原蛋白、褐藻酸、明膠等。

此外，若將幾丁聚醣與其他成分進行物理或化學性之交聯(crosslink)，則可得到機械強度較佳且具有特殊生醫用途之產物。舉例來說，若將戊二醛作為交聯劑使幾丁聚醣進行共價鍵交聯，將可產生特殊之微粒子結構，其不僅可用於藥物緩釋系統，亦可作為組織工程中使用之支架，此可參見Gupta,K.C.,et al.,Glutaraldehyde cross-linked chitosan microspheres for controlled release of centchroman. Carbohydr Res,2007. 342(15): p. 2244-52。

除前述應用外，目前也已知在適當的交聯條件下可將幾丁聚醣應用於創傷敷料。舉例來說，本案發明人曾發現可將幾丁聚醣與聚麩胺酸形成聚錯合物(polyelectrolyte complex)，並於冷凍乾燥後得到可應用於創傷敷料的不透明孔洞性支架材料。相較於未使用敷料的傷口，前述幾丁聚醣/聚麩胺酸複合支架對於傷口的癒合有顯著的幫助。由傷口的組織切片來看，幾丁聚醣對發炎細胞有抑制的作用，且對於纖維母細胞的增生有刺激的效果，而聚麩胺酸則是能增進上皮細胞的生長。此可參見林育永，幾丁聚醣/聚麩胺酸複合支架在創傷敷料之應用，國立臺灣大學高分子科學與工程學研究所碩士論文，2009年7月。

此外，亦有研究人員將幾丁聚醣分別與膠原蛋白、聚磷酸、玻尿酸等進行交聯，以得到不同性質而具有不同生醫應用之創傷敷料。

然而，由於前述針對幾丁聚醣進行修飾的技術仍存在某些令人不甚滿意之處，如交聯劑戊二醛具有毒性、大部分產生之創傷敷料不具有透明性、製備過程效率較低...等，如何提出一種新穎之經修飾幾丁聚醣及其製備方法，並將其應用於創傷敷料或水膠，乃是本領域研究人員所欲積極突破者。

有感於習知技術之缺憾，發明人遂竭其心智悉心研究，憑其從事該項產業多年所累積之經驗，進而研發出一種經交聯之幾丁聚醣及其製備方法，以作為新一代之水膠或創傷敷料，其具有令人滿意的透明度、吸水性、機械強度、化學穩定性等。

本發明之目的之一，在於提供一種經交聯之多醣，其單體包括葡萄糖胺及N-乙醯葡萄糖胺，且單體間彼此以β(1-4)糖苷鍵相連接，其中至少部分葡萄糖胺單體與交聯劑形成醯胺鍵。

於前述之經交聯之多醣中，交聯劑較佳係包括二元酸或其酸酐，且較佳係為胺基所取代。

於前述之經交聯之多醣中，交聯劑較佳係選自丙二酸、丁二酸、丁二酸酐、戊二酸、戊二酸酐、天門冬酸、麩胺酸以及具有至少兩個羧基之聚乳酸所組成之群組，且聚乳酸係包括乳酸寡聚物。

此外，於一較佳之實施例中，前述多醣於交聯前之分子量係介於60kDa至800kDa之間，其去乙醯度(degree of deacetylation，DD)係大於80%，且-NH₃ ⁺ 對-COO^- 之重複單元比例(repeating unit ratio)係介於1:1至9:1之間。於另一較佳實施例中，交聯劑可為乳酸寡聚物，其具有至少兩個羧基，且分子量較佳係介於300~3000之間，更佳係約為500、1000或2000。

前述經交聯之多醣係可應用於吸濕性材料中，如尿布、女性用品、面膜等，且較佳係作為創傷敷料。

本發明之再一目的，在於提供一種包含幾丁聚醣之水膠，其中至少部分葡萄糖胺單體與交聯劑形成醯胺鍵，且交聯劑較佳係為天然小分子酸或其酸酐，且可選自丙二酸、丁二酸、丁二酸酐、戊二酸、戊二酸酐、天門冬酸、麩胺酸以及具有至少兩個羧基之聚乳酸所組成之群組。

本發明之又一目的，在於提供一種經交聯之幾丁聚醣，其具有如式I所示之部分結構：

於較佳之實施例中，X係為經取代或未經取代之C₁ -C₅ 伸烷基，且其較佳係為胺基所取代。

此外，本發明之目的之一，在於提供一種製備經交聯之幾丁聚醣之方法，包括利用二元酸或二元酸酐使幾丁聚醣藉由醯胺鍵之形成產生交聯結構。

於前述方法中，交聯結構之產生較佳係於碳二亞胺之存在下進行，且更佳係於N,N-(3-二甲胺丙基)-N’-乙基-碳二亞胺以及N-羥基-琥珀醯亞胺之存在下進行。此外，N,N-(3-二甲胺丙基)-N’-乙基-碳二亞胺以及N-羥基-琥珀醯亞胺較佳係溶於醇類(如乙醇)中。

為充分說明本發明之目的、特徵及功效，使本發明所屬技術領域中具有通常知識者能瞭解本發明之內容並可據以實施，茲藉由下述具體之實施例配合所附之圖式，對本發明做一詳細說明如後。

名詞定義

於本發明中，「幾丁聚醣」係指為幾丁質進行去乙醯化後所得之產物，其屬於一種線性之多醣，且單體為隨機分佈的葡萄糖胺與N-乙醯葡萄糖胺，彼此間以β(1-4)糖苷鍵相接。

於本發明中，「去乙醯度」係指幾丁聚醣分子中葡萄糖胺所佔有的莫耳比率。

於本發明中，「交聯」係指聚合物分子鏈之間或之內兩個以上之特定官能基藉由交聯劑而形成架橋結構。舉例而言，一幾丁聚醣分子鏈中的葡萄糖胺單體上的胺基，可藉由二元酸作為交聯劑，而與另一幾丁聚醣分子鏈中的葡萄糖胺單體上的胺基進行交聯。

於本發明中，「水膠」係指一種非水溶性聚合物材料，水膠可於水中吸水膨脹，進而將水保持於其結構中。此外，如本發明所屬技術領域中具有通常知識者所知，水膠係與乾凝膠(xerogel)、泡棉(sponge)、氣膠(aerogel)不相同。

水膠製備

將0.8克幾丁聚醣粉末在室溫下溶解於20mL之2.0%(v/v)醋酸水溶液中，之後進行攪拌直至粉末完全溶解，以製得4.0%(w/w)之幾丁聚醣溶液，之後再將溶液靜置一晚以去除溶液中的泡泡。於一實施例中，所使用之幾丁聚醣的平均分子量為300kDa，去乙醯度為97%，然其平均分子量亦可介於60kDa至800kDa，且去乙醯度可大於80%。

分別將麩胺酸、丁二酸、丁二酸酐溶解於去離子水中，之後將此等二元酸或其酸酐溶液分散於幾丁聚醣溶液中並均勻攪拌。接著，再將作為催化劑之N,N-(3-二甲胺丙基)-N’-乙基-碳二亞胺(EDC)以及N-羥基-琥珀醯亞胺(NHS)加入，以促進醯胺鍵之形成。之後溶液乃於60℃下攪拌均勻，以得到透明的水膠。

於本發明中，醯胺鍵之形成亦可不需於催化劑之存在下進行，舉例來說，醯胺鍵之形成可於高溫與減壓之環境下進行而不使用催化劑。此外，為提高交聯反應的進行，N,N-(3-二甲胺丙基)-N’-乙基-碳二亞胺以及N-羥基-琥珀醯亞胺較佳係溶解於乙醇之中。

於本發明中，所使用的幾丁聚醣/二元酸或其酸酐之重複單元比例可為90/10至50/50，但不以此為限，如80/20、75/25、70/30、67/33、60/40等。為便於說明，以下乃列出製備不同重複單元比例之水膠所使用的幾丁聚醣及二元酸之重量以及水膠之凝膠率(gel fraction)，其中C50S50代表幾丁聚醣(chitosan，以C代表)對於丁二酸(succinic acid，以S代表)之重複單元比例為50:50，C80S20代表幾丁聚醣對於丁二酸之重複單元比例為80:20，C50G50代表幾丁聚醣對於麩胺酸(glutamic acid，以G代表)之重複單元比例為50:50，依此類推；且凝膠率係以下式計算而得

凝膠率=(水膠原始重量-水膠浸泡水中三天後烘乾的重量)÷水膠原始重量。

性質分析

為分析不同重複單元比例之幾丁聚醣/丁二酸水膠、幾丁聚醣/丁二酸酐水膠以及幾丁聚醣/麩胺酸水膠之物化性質，乃對所製得之各種水膠進行以下分析：

A. FTIR光譜

使用FTIR光譜儀(Perkin-Elmer Spectrum RX1 System)對所製得之水膠進行分析，以檢驗其成分中胺基與羧基的信號變化。

檢驗結果顯示經交聯之水膠在1631cm^-1 與1587cm^-1 處均有出現吸收峰，此可確認醯胺鍵係於交聯過程中形成。

B.　膨脹率

先將所製得之水膠浸入0.05M之磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液(PBS)中，待達到穩態後，以濾紙吸去表面的液體，進而量測膨脹後水膠之濕重，並以下式計算水膠之膨脹率：

膨脹率=(濕重-乾重)÷乾重

其中乾重與濕重分別代表水膠浸入PBS前、後所量測得的重量。

結果顯示所有的水膠於浸入PBS三小時後即達到穩態，且膨脹率隨著重複單元比例增加而增加。換言之，幾丁聚醣/交聯劑為80/20之水膠的膨脹率大於幾丁聚醣/交聯劑為50/50之水膠。當重複單元比例為50/50時，由於所形成之交聯數量最多，其所含有之孔隙較少而吸收較少之水分，且膨脹率最低。此外，量測結果顯示含有幾丁聚醣/麩胺酸(pKa為2.10與4.07)之水膠，相較於幾丁聚醣/丁二酸(pKa為4.20與5.60)與幾丁聚醣/丁二酸酐，具有較低之膨脹率。此外，測試結果也發現，以二元酸與二元酸酐作為交聯劑所得到的水膠具有大致相同的膨脹率。

C.　壓縮模數

使用通用試驗機來量測水膠之壓縮模數。於測試過程中，水膠係以0.5mm/min之速率進行壓縮，並取壓縮應力-應變(stress-strain)圖中5%-35%形變之斜率進行分析。

分析結果顯示，幾丁聚醣之壓縮強度會因為交聯結構之形成而增加，且幾丁聚醣/交聯劑為50/50之水膠顯示最高的壓縮模數，此結果與前述膨脹率之分析結果一致，即幾丁聚醣/交聯劑為50/50之水膠因為交聯度最高而具有最小之孔徑度。此外，由於反應性與交聯度較高，幾丁聚醣/麩胺酸顯示出較高的壓縮模數。

D.　熱性質分析

D1.　熱重分析(TGA)

以Perkin Elmer 7系列之熱重分析儀分析水膠之裂解溫度，溫度係以10℃/分鐘之速率由100℃升高至800℃，且於過程中持續記錄溫度及樣本質量。

分析結果顯示，隨著鍵結的形成，水膠的重量損失也由二階段轉變成一階段。此外，由於二元酸之熱穩定性較幾丁聚醣差，5%裂解溫度隨著二元酸數量之增加而降低，且殘重亦與二元酸數量呈反比。

D2.　示差掃描熱析(DSC)

以Perkin Elmer之Pyris 6示差掃描熱析儀繪製水膠之溫度記錄圖，量測過程係於10℃/分鐘之加熱速率下進行並配合氮氣吹洗，溫度係由50℃升高至200℃。

由DSC溫度記錄圖可觀察到，水氣之重量損失隨著二元酸比例之增加而增加，此乃由於二元酸較幾丁聚醣更為親水所致。此外，由峰值偏移的現象來看，可知材料的含水量有增加的情形。由溫度記錄圖中亦可發現，當交聯密度增加時，材料之玻璃轉移溫度Tg也會增加或消失，此係因為交聯結構破壞了幾丁聚醣之排列。

E.　生物降解分析

於模擬之生理條件下，量測樣本重量隨著時間的變化，藉此評估樣本的生物降解速率。在量測樣本之初始重量後，於37℃下將樣本浸入20ml、含有58,100單位/ml溶菌酶的0.1M PBS中28天，之後計算重量損失百分比。

結果顯示，幾丁聚醣在未進行交聯時，其降解情形最為嚴重，重量損失約為33%，且降解速率相當穩定。相較之下，幾丁聚醣/交聯劑為50/50之水膠則沒有明顯的降解現象，原因可能有二：一、幾丁聚醣與交聯劑形成緊密的交聯結構；二、材料的孔徑較小，故其接觸溶菌酶的表面積亦較小。

動物實驗

A.　切傷實驗

先將ICR雄鼠(30-35g)以乙醚麻醉，於剃毛後以剪刀於鼠背部形成1cm寬的傷口，並將前述幾丁聚醣/交聯劑為50/50之水膠敷材以及由未經交聯之純幾丁聚醣製成的敷材放置於傷口上，觀察傷口之變化。

第1圖係為第三天傷口以H＆E染色法進行染色所得之照片，其中第1a圖為控制組，即未使用任何敷材者；第1b圖為使用未進行交聯之幾丁聚醣敷材者；第1c~1e圖則分別為使用50/50之幾丁聚醣/麩胺酸敷材、50/50之幾丁聚醣/丁二酸酐敷材以及50/50之幾丁聚醣/丁二酸敷材者。於圖中，Epi表示表皮層；K表示角質；N表示新生血管；F表示毛囊；In表示發炎細胞；而箭頭所指處為角質。

由第1圖中可以發現，於傷口形成後第三天，使用50/50之幾丁聚醣/麩胺酸敷材之傷口處的表皮層與角質層較其他敷材來得厚，且血管的出現代表已開始進行血管新生，相較之下，控制組的傷口處則觀察不到前述現象。對於幾丁聚醣/麩胺酸敷材而言，由於麩胺酸具有帶正電的胺基，故可讓細胞更容易附著至敷材上，進而加速組織的修復與再生。

B.燙傷實驗

於ICR雄鼠(30-35g)背部形成2cm×1.5cm的中度燙傷傷口，並分別將不同重複單元比例之幾丁聚醣/麩胺酸敷材放置於傷口上，觀察傷口之變化。

第2圖係為第六天傷口以H&E染色法進行染色所得之照片，其中第2a圖為控制組，即未使用任何敷材者；第2b圖為使用未進行交聯之幾丁聚醣敷材者；第2c~2f圖則分別為使用80/20、75/25、67/33、50/50之幾丁聚醣/麩胺酸敷材者。

由第2圖中可以發現，於傷口形成後第六天，比起控制組，所有敷上幾丁聚醣/麩胺酸敷材的傷口，角質層的修復均較完整(厚)，而敷上純幾丁聚醣敷材的傷口角質層的修復則仍在進行中(薄)。此外，控制組上有傷口浸潤的現象(發炎細胞)，而其他五組則均已消退。若比較敷上幾丁聚醣/麩胺酸敷材的傷口，可以發現75/25、67/33、50/50的真皮層均在修復的過程中，且又以CS50/G50的真皮層最完整。

本發明在上文中已以較佳實施例揭露，然本領域具有通常知識者應理解的是，該實施例僅用於描述本發明，而不應解讀為限制本發明之範圍。應注意的是，舉凡與該實施例等效之變化與置換，均應視為涵蓋於本發明之範疇內。因此，本發明之保護範圍當以下文之申請專利範圍所界定者為準。

第1a圖至第1e圖係為第三天傷口以H&E染色法進行染色所得之照片；第2a圖至第2f圖係為第六天傷口以H&E染色法進行染色所得之照片。

Claims

一種經交聯之多醣，其單體包括葡萄糖胺及N-乙醯葡萄糖胺，且單體間彼此以β(1-4)糖苷鍵相連接，其中至少部分葡萄糖胺單體與交聯劑形成醯胺鍵。
如申請專利範圍第1項所述之經交聯之多醣，其中該交聯劑包括二元酸或其酸酐。
如申請專利範圍第1項所述之經交聯之多醣，其中該交聯劑係選自丙二酸、丁二酸、丁二酸酐、戊二酸、戊二酸酐、天門冬酸、麩胺酸以及具有至少兩個羧基之聚乳酸所組成之群組。
一種水膠，包含幾丁聚醣，其中至少部分葡萄糖胺單體與交聯劑形成醯胺鍵。
如申請專利範圍第4項所述之水膠，其中該交聯劑係選自丙二酸、丁二酸、丁二酸酐、戊二酸、戊二酸酐、天門冬酸、麩胺酸以及具有至少兩個羧基之乳酸寡聚物所組成之群組。
一種經交聯之幾丁聚醣，具有如式I所示之部分結構：其中X為經取代或未經取代之C₁ -C₅ 伸烷基。
如申請專利範圍第6項所述之經交聯之幾丁聚醣，其中X係為胺基所取代。
一種製備經交聯之幾丁聚醣之方法，包括：利用二元酸或二元酸酐使幾丁聚醣藉由醯胺鍵之形成產生交聯結構。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中交聯結構之產生係於N,N-(3-二甲胺丙基)-N’-乙基-碳二亞胺以及N-羥基-琥珀醯亞胺之存在下進行。
如申請專利範圍第9項所述之方法，其中N,N-(3-二甲胺丙基)-N’-乙基-碳二亞胺以及N-羥基-琥珀醯亞胺係溶於乙醇中。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該二元酸或二元酸酐係選自丙二酸、丁二酸、丁二酸酐、戊二酸、戊二酸酐、天門冬酸、麩胺酸以及具有至少兩個羧基之聚乳酸所組成之群組。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中二元酸或二元酸酐係加入幾丁聚醣溶液中以形成交聯結構。
一種根據申請專利範圍第8-12項中任一項所述之方法製得之經交聯之幾丁聚醣。