TWI490230B - 卵巢癌專一性寡胜肽及其應用 - Google Patents

Description

卵巢癌專一性寡胜肽及其應用

本發明係關於一種對於卵巢癌具有專一性辨識之新穎胜肽及其應用。

卵巢是女性的生殖器官，其主要功能為製造、儲存及排卵，並產生雌性素、黃體素等荷爾蒙，以提供女性生殖功能，維持子宮和陰道的發育。當卵巢組織發生惡性轉變，即細胞出現異常的分裂並形成腫瘤，則稱之為卵巢癌。卵巢癌是婦科常見的癌症之一，根據統計卵巢癌佔臺灣地區婦女生殖癌症第二位，僅次於子宮頸癌。卵巢癌可發生於各年齡的女性族群，其發生率隨年齡逐年增高，而卵巢上皮細胞瘤，則主要發生於40歲以後的婦女，其中惡性的卵巢生殖細胞腫瘤最易發生於不滿20歲的病人。就早期症狀而言，大部份的卵巢癌在早期並不明顯，故不容易被發現，通常要到後期當腫瘤變大時，才可能會壓迫到大腸，並引起便秘或腹瀉的情形，或出現其他如腹部疼痛或腫脹、噁心、脹氣等現象。然而，早期卵巢癌5年存活率高達70-90%，而晚期病灶，其5年的存活率只有20-50%，故若能及早發現卵巢癌可大幅增加治癒及存活的機會。

目前臨床對卵巢癌的檢測方法包括：婦產科的骨盆腔檢查，其可偵測到卵巢腫瘤的存在，但無法得知該腫瘤的性質，作為卵巢癌的篩 檢特異性和敏感性不足；超音波檢查如陰道超音波與都卜勒超音波，其可測試出卵巢腫瘤血管的分佈以及血流動向，有助於對於腫瘤良性和惡性的鑑定，但因為早期卵巢癌的外形類似於正常大小、外觀的卵巢，故利用超音波篩檢卵巢癌仍有其難度與瓶頸；血清腫瘤標誌，如：CA-125、CA-199、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)、溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)、A型胎兒蛋白(α-fetoprotein，α-FP)、人類絨毛膜性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)、抑制素(inhibin)、苗勒氏抑制物質(Mullerian inhibiting substance)等，雖可提供作為早期卵巢癌的篩檢，但大部分血清腫瘤標誌較佳的效果係偵測手術後復發性腫瘤而非專一性地辨認早期的卵巢癌細胞。

因此，到目前為止，尚缺乏一種檢驗或檢查可提供作為卵巢癌的早期篩檢，而發展具有高專一性的血清腫瘤標記在臨床上具有必要性，因為其不僅可利用作為卵巢癌早期快速檢測，更可進一步增加預後存活率。

有鑑於此，本發明提供一種卵巢癌專一性寡胜肽，係包含一第一基因片段SEQ ID NO：2所編碼的寡胜肽，其中該寡胜肽係為SEQ ID NO：1之胺基酸序列；其中，該寡胜肽係聯結於一磁性粒子。

本發明之又一目的為提供在一檢體中偵測卵巢癌之方法，其步驟包含：使該檢體於一條件下與如申請專利範圍第1項所述之寡胜肽接觸，其中該條件係容許該寡胜肽與卵巢癌細胞結合；其中複數條寡胜肽與一磁性粒子聯結形成一寡胜肽-磁性粒子複合體，且該磁性粒子較佳為一磁 株，該寡胜肽與卵巢癌細胞結合的結合率為至少80%，該條件係為寡胜肽濃度為10pg/mL至10ng/mL，且該寡胜肽係與一標記結合，該標記係螢光標記、化學發光標記、放射性同位素、酶標記或生物素。

本發明亦提供一種微流體晶片，其包含一種卵巢癌專一性之新穎寡胜肽。

經由本發明所採用之技術手段，利用M13噬菌體展示庫與多表皮表面蛋白連結磁株篩選而得的新穎寡胜肽，只需極微量的寡胜肽濃度便與卵巢癌有顯著地高專一性結合，此有助於醫療體系對於癌症的快速檢測，且本發明之寡胜肽對於其他癌症，例如胰臟癌、大腸癌、子宮頸癌及肝癌之結合皆不明顯，因此，對於卵巢癌具有高專一性辨識，其可應用於需要早期檢測、注重健康與疾病防治之重點，可有效達到卵巢癌早期快速檢測而增加卵巢癌的治癒率及存活率。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

1‧‧‧卵巢癌細胞

2‧‧‧M13噬菌體展示庫

21‧‧‧M12噬菌體

3‧‧‧多表皮表面蛋白

4‧‧‧磁珠

5‧‧‧磁場

6‧‧‧大腸桿菌

61‧‧‧大腸桿菌之遺傳物質

62‧‧‧直鏈狀DNA分子

63‧‧‧環狀DNA分子

第一圖係結合微流體晶片系統與M13噬菌體展示庫進行卵巢癌細胞專一性腫瘤標誌篩選的流程圖。

第二圖係表示以顯微鏡觀察不同濃度的寡胜肽聯結磁珠對卵巢癌細胞的抓取能力。A圖表示未聯結寡胜肽之磁珠抓取卵巢癌細胞的 能力；B圖表示以10μg/mL寡胜肽聯結之磁珠抓取卵巢癌細胞的能力；C圖表示以10ng/mL寡胜肽聯結之磁珠抓取卵巢癌細胞的能力；D圖表示以10ρg/mL寡胜肽聯結之磁珠抓取卵巢癌細胞的能力。

本發明提供一種卵巢癌專一性寡胜肽，係利用M13噬菌體展示庫與多表皮表面蛋白連結磁株與微流體晶片技術結合篩選而得，其對卵巢癌細胞具有高專一性與高結合率，更進一步將不同濃度的寡胜肽聯結於磁珠上與卵巢癌細胞進行結合，以驗證其對卵巢癌細胞的高專一性；亦將專一性寡胜肽聯結於磁珠上與各種不同的癌細胞進行結合，以驗證其對卵巢癌細胞的高結合率。

定義

「聚核苷酸」、「核苷酸」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸序列」、「聚核苷酸序列」及「核苷酸序列」一詞，在本文中可互換使用，以表示任何長度之核苷酸的聚合物形式。聚核苷酸可包含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其類似物或衍生物。本文所示之核苷酸序列係以5’至3’方向排列。

「寡胜肽」、「胜肽」、及「蛋白」一詞，在本文中可互換使用，以表示任何長度之胺基酸的聚合物形式。

「具專一性」係為當該寡胜肽可與卵巢癌細胞結合或產生交互作用，但未顯著地與其他細胞結合或產生交互作用時，則該寡胜肽可稱為對卵巢癌細胞。

「檢體」一詞，係任何衍生自病患之生物檢體，包括但不限於生物液體，諸如：血液、血清、血漿、尿液、腦脊髓液、淚液、唾液、淋巴、透析液、灌洗液、精液及其他液體樣本，以及生物來源之細胞及組織。該辭彙亦包括細胞或其衍生之細胞及其子代，包括培養物中之細胞、細胞上清液及細胞裂解物。該辭彙亦包括器官或組織培養物衍生的液體、組生檢樣本、腫瘤生檢樣本、糞便樣本、萃取自生理組織之液體以及分離自固態組織、組織切片及細胞裂解物之細胞。此一定義涵括在其獲得之後以任何方式操作之樣本，諸如：以試劑處理、溶解或使其富含某些組成份，諸如：聚核苷酸或胜肽；亦包括病患樣本之衛生物及區份。病患樣本可用於診斷或其他監測分析；亦可應用於來自非人類哺乳動物之生物檢體。該檢體可來自人類病患或非人類哺乳動物。

「癌症」一詞，係任何異常之細胞或組織生長，例如：腫瘤，不論為惡性、前惡性或非惡性，其特微在於不受控制的細胞增殖，其可能會(亦有可能不會)侵襲周圍之組織，並因此可能會(亦有可能不會)轉移至新的身體位置。癌症涵括癌瘤，其係上皮細胞之癌，癌瘤包括鱗狀細胞癌、腺癌、黑素瘤及卵巢瘤。癌症可涉及一或多種瘤細胞類型，包括卵巢癌、大腸癌、子宮頸癌、肝癌及胰臟癌。

「標記」一詞係與本發明之寡胜肽可共軛結合，該標記包括但不限於：FITC、生物素以及放射性同位素，包括，但不限於，⁶⁴ Cu、⁶⁷ Cu、⁹⁰ Y、⁹⁹ mTc、¹¹¹ In、¹²⁴ I、¹²⁵ I、¹³¹ I、¹³⁷ Cs、¹⁸⁶ Re、²¹¹ At、²¹² Bi、²¹³ Bi、²²³ Ra、²⁴¹ Am及²⁴⁴ Cm，具有可偵測性產物之酶(例如，螢光素酶、過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶以及類似物)，螢光劑及螢光標記，電化 學發光化合物，化學發光化合物，例如，發光胺(luminol)、異發光胺(isoluminol)或吖錠鹽(acridinium salts)。

「微流體晶片」、「微流體裝置」、及「晶片」在本文中可互換使用，以表示一獨立的整合單元，其具有一微流體反應器、一個或多個微流體流道、及一個或多個閥門(valve)。微流體晶片亦典型地具有其他微流體組件，例如：泵浦(pump)、槽(column)、混合器(mixer)、及其類似的組件。微流體晶片通常係由合成橡膠(elastomer)、玻璃(glass)、或矽(silicon)製成。典型地，微流體晶片係為具有一高度相較於長度及寬度為短的盒狀物，然而，晶片亦可為任意形狀，例如：立方體、圓柱體、或其他。

製備對卵巢癌細胞具專一性之寡胜肽之方式

本發明之寡胜肽可使用技藝中已知方法製備。基於細胞之方法以及無細胞之方法皆可用於製備本發明之寡胜肽。基於細胞之方法一般而涉及在活體外將核酸引入宿主細胞，再於適合表現之條件下培養該宿主細胞，接著收取該寡胜肽，其可由培養基中或自該宿主細胞中(例如：藉由破壞該宿主細胞)或自兩者中收取。適當的宿主細胞包括原核或真核細胞，其包括，例如：細菌、酵母菌、真菌、植物、昆蟲及哺乳動物細胞。

本發明亦提供使用無細胞之活體外轉錄/轉譯方法而製備寡胜肽之方法，其係本發明技術領域所熟知。

此外，可在該等胜肽上添加胜肽分子部分及/或純化標記。此等區域可在胜肽之最終製備前除去。在胜肽上添加胜肽分子部分，以引起分泌或排泄、改良安定性及加速純化，舉例說明，其均為技藝中熟悉及慣常之技術。適當之純化標記包括，舉例而言，V5、聚組胺酸、親和素及 生物素。胜肽與諸如生物素之共軛作用可使用技藝中所熟知之技術完成。胜肽亦可共軛結合於螢光標記、化學發光標記、放射性同位素及酶標記，可使用技藝中已知之技術達成。

本發明之胜肽亦可使用技藝中已知之技術，以化學方式合成。舉例而言，可藉由使用胜肽合成儀或經由使用本發明技術領域中已知之固相方法而合成。

本發明之胜肽可以標準方法，自化學合成及重組細胞培養物中回收及純化，其包括，但不限於，硫酸銨或乙醇沈澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水交互作用層析、親和層析、氫氧磷灰石層析及凝集素層析。最佳者，本發明係使用高效液相層析(HPLC)進行純化。當胜肽在分離及/或純化之過程中變性時，可使用既有熟知的再折疊蛋白技術重建其活性構形。

診斷方法

疾病專一性生物標記之偵測提供一種有效之篩選策略。早期偵測不僅可提供早期診斷，就癌症而言，亦可提供篩選多形性及偵測手術後殘餘腫瘤細胞與隱匿性轉移(腫瘤復發之早期指標)之能力。因此，疾病專一性生物標記之早期偵測可在接受治療之同時以及在緩解之同時，改善病患之存活。

本發明之胜肽可用於卵巢癌之診斷。該等胜肽可作為診斷劑，其方式包括但不限於ELISA、西方墨點法、螢光、免疫螢光、免疫組織化學或自動放射線攝影術。

實施例1：結合微流體系統與M13噬菌體展示庫進行卵巢癌細胞專一性腫瘤標誌篩選 A、細胞系及細胞培養

使用BG1(人類卵巢癌細胞系)，將BG1維持在DMEM/F12培養基及10%胎牛血清(FBS)中，其他條件為37℃、空氣中5% CO₂ 之溼潤大氣。

其他可用之細胞系包括：BxPC3(胰臟癌細胞系)、HCT8(大腸癌細胞系)、HeLa(子宮頸癌細胞系)、HepG2(肝癌細胞系)。

B、分離可結合BG1卵巢癌細胞之噬菌體

第1圖係為使用微流體晶片系統與M13噬菌體展示庫(M13 phage display library)進行卵巢癌細胞專一性腫瘤標誌篩選的流程圖。專一性腫瘤標誌篩選時，首先將M13噬菌體展示庫與卵巢癌細胞共同培養於37℃、5% CO₂ 之大氣環境中30分鐘(如步驟1)，接著於微流體晶片系統內以多表皮表面蛋白(epithelial-enrich)連結磁珠抓取卵巢癌細胞(如步驟2)；以磁力架(DynaMag^TM -2；Invitrogen co.,USA)抓取M13噬菌體-卵巢癌細胞-表皮表面蛋白連結磁珠複合體，並以滅菌去離子水清洗與去除游離的M13噬菌體或低親和力的M13噬菌體，並將該複合體與大腸桿菌培養於LB(lysogeny broth)培養液中，並置於37℃、一般大氣環境中16小時(如步驟3)；其後，待M13噬菌體侵入大腸桿菌細胞質內，進行複製而後從大腸桿菌釋出(如步驟4)，該釋出M13噬菌體再經pCR^® 2.1-TOPO^® 載體(Invitrogen co.,USA)選殖後，利用M13 reverse primer(5’caggaaacagctatgac 3’)進行核酸定序。其中該M13噬菌體展示庫的建立、磁珠製備及微流體晶片系統請參 見中華民國專利公開號第201200874號。

請參閱第1圖，經過五至六次循環篩選，收集該所篩選到的M13噬菌體進行選殖與基因定序。經上述五至六次循環篩選後所得之M13噬菌體並進行基因選殖與定序，發現出現頻率最高(16.53%)之核酸序列，係為：5’-ATGCCGCATCCTACGAAGAATTTTGATTTGTATGTG-3’(SEQ ID NO：2)。該核酸序列所表現之寡胜肽：N’-MPHPTKNFDLYV-C’(SEQ ID NO：1)，即為本發明之對卵巢癌細胞具有高專一性辨識之寡胜肽。

實施例2：本發明之寡胜肽對卵巢癌細胞的專一性

請參閱第2圖，該圖係表現寡胜肽聯結磁珠對卵巢癌細胞的抓取能力。將本發明之寡胜肽以不同的濃度聯結於磁珠上，該濃度係為：10μg/mL、10ng/mL、及10ρg/mL，並與10⁵ 個卵巢癌細胞進行結合反應(capturing test)。

於顯微鏡下觀察，上述各濃度的專一性寡胜肽聯結於磁珠上可與卵巢癌細胞進行結合反應，結果顯示，僅需10ρg/mL的專一性寡胜肽聯結於磁珠上即可與卵巢癌細胞有效結合，證實本發明之專一性寡胜肽對於卵巢癌細胞具有高專一性。

實施例3：本發明之寡胜肽對卵巢癌細胞的結合率

以濃度為10ng/mL的本發明之專一性寡胜肽聯結於磁珠上並與不同的癌細胞進行結合反應，除卵巢癌細胞(BG1)外，該些不同的癌細胞包括：胰臟癌細胞(BxPC3)、大腸癌細胞(HCT8)、子宮頸癌細胞(HeLa)、肝癌細胞(HepG2)。其結果如表1所示。

結果顯示，本發明之專一性寡胜肽對卵巢癌細胞具有80.38%之高結合率，相對於其他種癌細胞的結合率平均僅有大約20%，具有明顯的差異。

綜上所述，本發明之一種寡胜肽，其對卵巢癌細胞具有高達大約80%的結合率，明顯高於其對於其他種癌細胞平均只有大約20%的結合率，並且僅需微量(ρg)即可與卵巢癌細胞有效結合，顯示其對卵巢癌細胞具有高度的專一性，適用於卵巢癌細胞的快速檢測。

<110> 國立清華大學

<120> 卵巢癌專一性寡胜肽及其應用

<160> 2

<210> 1

<211> 12

<212> 胺基酸

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

1‧‧‧卵巢癌細胞

2‧‧‧M13噬菌體展示庫

21‧‧‧M12噬菌體

3‧‧‧多表皮表面蛋白

4‧‧‧磁珠

5‧‧‧磁場

6‧‧‧大腸桿菌

61‧‧‧大腸桿菌之遺傳物質

62‧‧‧直鏈狀DNA分子

63‧‧‧環狀DNA分子

Claims (9)

1. 一種卵巢癌漿液性細胞專一性寡胜肽，係包含一第一基因片段SEQ ID NO：2所編碼的寡胜肽，其中該寡胜肽係為SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述之寡胜肽，其中該寡胜肽係聯結於一磁性粒子。
3. 一種在一檢體中偵測卵巢癌之方法，其步驟包含：使該檢體於一條件下與如申請專利範圍第1項所述之寡胜肽接觸，其中該條件係容許該寡胜肽與卵巢癌漿液性細胞結合。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中複數條寡胜肽與一磁性粒子聯結形成一寡胜肽-磁性粒子複合體。
5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該磁性粒子為一磁珠。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該寡胜肽與卵巢癌漿液性細胞結合的結合率為至少80%。
7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該條件係為寡胜肽濃度為10pg/mL至10μg/mL。
8. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該條件係為寡胜肽濃度為10pg/mL。
9. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該寡胜肽係與一標記結合，該標記係螢光標記、化學發光標記、放射性同位素、酶標記或生物素。