TWI490229B - 豬瘟病毒封套醣蛋白Ｅｒｎｓ之特異性單株抗體ＣＷ８１３及其於間接三明治ＥＬＩＳＡ抗體檢測之應用 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種專一性辨識Erns
之單株抗體。特別地，係關於包含該抗體與酵母菌表現之Erns
(yErns
)組成的間接三明治ELISA抗體檢測試劑。
豬瘟病毒(CSFV)或稱豬霍亂，由於具高度的致病性且可造成大量死亡，可能使養豬業遭受嚴重的經濟損失。感染了強毒力CSFV毒株的豬在表現臨床症狀之前即排出大量的病毒，經歷過急性或亞急性豬瘟感染仍能存活的豬可產生抗體，不再傳播病毒。中等毒力、低致病性的毒株則可能導致慢性感染，使豬隻持續性或間歇性排出病毒，直到死亡。先天性的感染可能導致流產、木乃伊胎、死胎及/或弱胎或胚胎畸形。低毒力毒株引起的先天性感染最可能生出持續感染的小豬，沒有症狀的傳播病毒也缺乏免疫反應。所有排毒的動物都需要鑑定並從群體中清除，從而阻止病毒的傳播。
台灣目前對於豬瘟病毒感染採用之防治方法為施打活減毒疫苗，但是傳統所使用之活減毒疫苗因活病毒具備感染能力，常受質疑其安全性及潛伏感染之可能性。新發展中之豬瘟標示疫苗(marker vaccine)為利用能誘發豬隻產生中和抗體之豬瘟病毒醣蛋白E2產製的次單位疫苗，E2次單位疫苗使用上最大的好處是可以用來區別感染豬或是免疫豬，因此被稱為能區別自然感染與免疫之豬瘟疫苗(differentiation of infected from vaccinated animals;DIVA疫苗)。應用重組或次單位疫苗對抗CSFV，藉由使用相容性的ELISA法診斷時，可區分已接種疫苗豬及感染豬，因此現今人們可希望藉由E2次單位疫苗之施打，配合Erns
ELISA診斷套組之血清篩檢，逐步清除受病毒感染之豬隻，以達撲滅豬瘟病毒之目的。
目前商品化之豬瘟病毒Erns
ELISA抗體檢測套組，其抗原盤是在塗覆(coating)經細胞培養之單株抗體後，再給予來自受豬瘟病毒或重組昆蟲桿狀病毒感染之細胞所表現的病毒抗原，並以競爭型ELISA方法進行檢測。此項技術需進行單株抗體及病毒之培養及純化，操作步驟繁瑣、容易污染且成本非常昂貴。
有鑑於此，本發明乃製造一種能辨識由病毒表現之Erns
蛋白及經由酵母菌系統表現之重組Erns
(yErns
)的單株抗體，並利用酵母菌表現系統製備具抗原性之病毒封套醣蛋白(yErns
)，以做為ELISA抗原盤所coating之單株抗體可專一性辨識之抗原，可省卻病毒培養操作步驟而且易於純化，有效降低檢測試劑之製作成本。
於是為達上述目的，本發明之一方面係提供，一種專一性辨識豬瘟病毒封套醣蛋白Erns
之單株抗體CW813，其特徵在於能辨識經由酵母菌系統表現之重組Erns
(yErns
)，且係由寄存編號為BCRC960438之融合瘤細胞株所產生。
本發明之單株抗體CW813之抗體亞型為IgG1，且所辨識之抗原決定位係位於Erns
蛋白的氨基酸序號101至160區域上。
本發明之另一方面係提供一種用於偵測豬隻是否受豬瘟病毒感染之間接三明治ELISA抗體檢測方法，其特徵在於使用本發明製得之單株抗體CW813被覆ELISA抗原盤，以及利用酵母菌表現系統製備具抗原性之病毒封套醣蛋白(yErns
)做為可由該單株抗體專一性辨識的抗原。
本發明之又一方面係提供一種豬瘟病毒Erns
ELISA抗體檢測套組，其包含單株抗體CW813被覆於ELISA抗原盤，以及由酵母菌表現系統製備得之重組yErns
蛋白做為該單株抗體CW813可專一性辨識之抗原。
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，該等根據本發明所呈現的實施範例僅做為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。而下述各種儀器、裝置、方法和其相關結果者，以及實施例中為了方便讀者閱讀所使用的標題或副標題，並不被限制在本發明的範圍之內。
以與等體積弗氏完全佐劑混合成0.5ml混合物之40μg經純化之全長重組Erns
蛋白(全長N227及各缺失突變型重組Erns
蛋白N190、N160、N100與N50之片段長度如圖1所示)做為抗原，分別免疫五隻6週齡BALB/c小鼠，並於兩週後以相同劑量(與弗氏不完全佐劑混合)進行追加免疫，再經3週後將小鼠以腹膜內注射方式，施予0.5ml之40μg經純化之重組Erns
蛋白(不添加任何佐劑)進行最後一次追加免疫。五天後挑選抗體反應較佳之小鼠進行融合瘤實驗。收取培養上清液進行分析，以篩選出能分泌特異性抗體之融合瘤細胞。所得之融合瘤細胞經擴大培養後進行細胞冷凍保存，並進行細胞單株化，建立一株穩定的融合瘤細胞株命名為CW813，寄存編號為BCRC960438。
進一步以西方墨點法分析單株抗體MAb CW813之特異性，顯示能辨識病毒表現之Erns
蛋白及酵母菌表現之Erns
(yErns
)的單體和雙體形式(參見圖2a)。此外，能辨識經由大腸桿菌表現之重組Erns
蛋白的N190與N160片段，但不會辨識重組Erns
蛋白的N100與N50片段(參見圖2b)，表示Erns
蛋白之抗原決定位乃位於胺基酸序號101至160之區域上。單株抗體CW813之抗體亞型為IgG1。
本發明特點之一即在於，利用酵母菌表現系統製備具抗原性之病毒封套醣蛋白(yErns
)，做為ELISA抗原盤所被覆之單株抗體可專一性辨識的抗原。因此，首先進行豬瘟病毒封套蛋白之表現與大量生產。
本實驗室構築之酵母菌重組表現質體pGAPZαC/E0含有豬瘟病毒全長Erns
基因序列(參見，Huang C等人,(2006)J Virol Methods 132
:40-47)。表現質體DNA以電孔作用進行酵母菌勝任細胞P. pastoris
之轉形作用，並利用PCR檢測重組菌株染色體DNA，以確認具有正確之醣蛋白基因片段。將重組酵母菌株分別劃於含100 μg/ml Zeocin之YPD培養基上於30℃培養2~3天形成單一菌落，小量培養後經蛋白質電泳分析，挑選產量最佳之菌株進行大規模生產yErns
重組蛋白。
將重組酵母菌株培養至1 ml YPD液態培養基中，於30℃、250 rpm下培養16個小時後，取0.1 ml的培養液加至含有50 ml的新鮮YPD液態培養液之baffled flask中，繼續培養4天後，以12,000×g轉速、在4℃下離心20分鐘收集培養上清液。進一步以Vivaspin 20濃縮管柱(Sartorius)，及後續對磷酸鹽緩衝之食鹽水(PBS)透析而進行上清液中Erns
蛋白的純化，並以Bradford蛋白質分析套組(Bio-Rad)進行蛋白濃度的定量分析，再保存於-80℃備用。
間接三明治Erns
ELISA抗體檢測方法：將融合瘤CW813細胞上清液以被覆緩衝液coating buffer(碳酸鹽緩衝液，pH 9.6)2倍稀釋後，於每孔加入100 μl該稀釋溶液，並於4℃進行coating隔夜，製備成具捕捉抗原能力之測定盤。移除溶液後，以3% BSA/PBS於37℃進行填補作用(blocking) 1小時，之後每孔加入50 μl 20倍稀釋之yErns
蛋白(35 μg/ml)提供給抗體捕捉並於37℃作用2小時，經過清洗後，將待測血清50倍稀釋後每孔加入50 μl並於37℃作用1小時，再經過清洗後，加入經適當稀釋之peroxidase labeled goat-anti-swine corjugate做為二次抗體，並於37℃作用45分鐘。經過清洗後加入呈色劑，再置於室溫暗處呈色15分鐘，並利用ELISA Reader進行波長405 nm之吸光值測定。以陰性對照血清平均反應吸光值加上兩個或三個標準偏差值(平均值+2 SD或平均值+3 SD)做為判定值(cutoff)。
自中興大學獸醫學院動物疾病診斷中心(Animal Disease Diagnostic Center,College of Veterinary Medicine,National Chung Hsing University，台灣)收集得54個豬隻血清樣本，其中包括8個SPF血清、9個施打桿狀病毒表現之E2疫苗(BacE2)、19個施打LPC減毒疫苗(LPC)的豬隻、以及8個呈陰性(Erns
-)與10個呈陽性(Erns
+)之田間豬隻的血清樣本，先以市售的Erns
blocking ELISA kit(IDEXX)進行測試。測試結果，所有SPF與BacE2血清被歸類為陰性血清，而LPC血清被歸類為陽性血清。
將上述54個豬血清樣本，以本發明之間接三明治Erns
ELISA抗體檢測方法進行測試，圖4列示各樣本於波長405 nm所測得之吸光值(OD405
)。8個SPF血清之OD405
平均值為0.1936，標準偏差為0.0287。由表一之結果可知，當以陰性對照血清平均吸光值加上三個標準偏差值(平均值+3 SD)做為判定值時，25個陰性血清皆呈現陰性反應，特異性為100%；而29個陽性血清則檢出率(靈敏度)可達96.6%(28/29)。顯示，本發明利用單株抗體CW813及重組yErns
抗原製備成抗原盤，而建立之間接三明治ELISA抗體檢測方法，確實具有良好的特異性與敏感度。
綜合上述，本發明利用單株抗體CW813與yErns
蛋白所建立之間接三明治ELISA檢測方法，可有效區別不同來源的豬隻血清，且具有操作簡單及降低成本之優點。
本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。於是，本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。
從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。
圖1顯示經由大腸桿菌表現之重組全長Erns
蛋白(N227)，及缺失突變型Erns
蛋白片段(N190、N160、N100與N50)。位於各橫柱圖兩端點之數字，係代表各片段的起始與終點胺基酸殘基位置。
圖2顯示以西方墨點法分析MAb CW813之特異性及其抗原決定位所在的區域。(a)為有(lane 1)或無(lane 2)β-巰基乙醇存在之酵母菌表現系統製備得之yErns
蛋白以MAb CW813辨識的結果；(b)為對於全長Erns
N227(lane 1)及缺失突變型N190、N160、N100與N50片段(lanes 2-5)之反應活性。
圖3顯示取自不同來源的豬血清於本發明之間接三明治ELISA檢測方法中，對於yErns
之反應活性。其中包含25個陰性血清(Erns
-、BacE2與SPF)；及29個陽性血清(Erns
+與LPC)。
Claims (8)
- 一種專一性辨識豬瘟病毒封套醣蛋白Erns 之單株抗體CW813，其特徵在於能辨識由病毒表現之Erns 蛋白及經由酵母菌系統表現之重組Erns (yErns )，且係由寄存編號為BCRC960438之融合瘤細胞株所產生。
- 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體，其所辨識之抗原決定位係位於Erns 蛋白的胺基酸序號101至160區域上。
- 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體，其中該單株抗體CW813之抗體亞型為IgG1。
- 一種用於偵測豬隻是否受豬瘟病毒感染之間接三明治ELISA抗體檢測方法，其包含：(a)將如申請專利範圍第1項所述之單株抗體CW813被覆(coating)於ELISA抗原盤；(b)使用重組Erns 蛋白做為抗原與被覆於ELISA抗原盤上之單株抗體結合；(c)將待測豬血清加入該含有重組Erns 蛋白之抗原盤；(d)使用抗豬血清之二次抗體與呈色劑進行呈色；及(e)於波長405nm下測定吸光值。
- 如申請專利範圍第4項所述之抗體檢測方法，其中該重組Erns 抗原係由酵母菌表現系統所製備得者。
- 如申請專利範圍第4項所述之抗體檢測方法，其係用於篩檢已接受施打E2次單位疫苗仍被病毒感染之豬隻。
- 如申請專利範圍第6項所述之抗體檢測方法，其中該疫苗為豬瘟病毒E2醣蛋白次單位疫苗。
- 一種豬瘟病毒Erns ELISA抗體檢測套組，其特徵在於包含以如申請專利範圍第1項所述之單株抗體CW813進行塗覆(coating)之 抗原盤，及由酵母菌表現系統製備得之病毒封套醣蛋白(yErns )做為該單株抗體可專一性辨識之抗原。
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