TWI487481B

TWI487481B - 培養擬球藻之系統

Info

Publication number: TWI487481B
Application number: TW102116576A
Authority: TW
Inventors: Yu Hsiang Lee; Yu Ling Yeh
Original assignee: Univ Nat Central
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2015-06-11
Also published as: TW201442618A

Description

培養擬球藻之系統

本發明係關於培養擬球藻(Nannochloropsis oculata)之系統。具體而言，本發明係關於以碳氟化合物液體作為攜氧材料的擬球藻培養系統。該系統可有效的移除擬球藻生長時所產生的氧氣，以降低因為高溶氧所導致的生長抑制效果。

在先前技術中，為克服氧氣對擬球藻等微藻生長的抑制效應，有的微藻光生物反應器藉由使用脫氣設備(Degasser)以移除生長環境內所累積的氧氣；有的微藻光生物反應器則本身可以劇烈地打入空氣，藉以移除生長環境內所累積的氧氣，例如氣舉式反應器。但是，上述微藻光生物反應器有以下之缺點：(1)成本高；(2)因大量外界空氣進入會增加培養環境受微生物感染的機會；(3)溶氧透過液氣界面傳遞移除的效率並不高。

此外，研究證實發現對於上述之微藻光生物反應器，由於空氣高速進入培養環境中、空氣氣泡持續在反應器的噴嘴處形成、以及空氣氣泡在培養基中爆破，會在培養環境中產生巨大的剪應力(Shear stress)，反而對所培養的微藻細胞造成嚴重的傷害。

有鑑於此，本案之發明乃分別以四種不同的碳氟化合物液體作為攜氧材料，以改善擬球藻養殖時所產生的氧氣抑制現象，又不至於對所培養的擬球藻細胞造成嚴重的傷害。

本案之一實施例揭露一種培養擬球藻之系統，包括：在一可透光之攪拌槽中置入一氧氣載體以及細胞培養液，其中該氧氣載體為碳氟化合物液體而細胞培養液則為酸鹼值(pH)為8的韋因培養基(Walne’s medium)；二者溶液不互溶而分成下、上兩相。該可透光之攪拌槽具有複數個開口。在使用時，細胞培養液的溫度得控制在25±2℃之下，並且於擬球藻培養期間以照明強度為80μE/m² /s之一光源連續照射之；另外該可透光之攪拌槽內的葉片是以連續攪拌的方式混合該氧氣載體以及該培養液。下方之該氧氣載體將可攜帶上方培養液中生物體所產生的氧氣，並由一幫浦自其中一個開口抽離該可透光之攪拌槽而進入一氣體交換槽，並且在該氣體交換槽內與連續注入之氮氣接觸後再由該幫浦抽離，經由另一開口而再次進入該可透光之攪拌槽的下方。

20、200‧‧‧可透光之攪拌槽(密閉三口瓶)

60、600‧‧‧幫浦

30、300‧‧‧換氣瓶

50、500‧‧‧光源

10、100‧‧‧電磁攪拌器

40、400‧‧‧溶氧度計

20a、30a‧‧‧全氟碳化物液體

20b、200b‧‧‧韋因培養基

200a、300a‧‧‧氫氟醚化物液體

70、700、90、900‧‧‧管線

300b‧‧‧海水

80、95、800、950‧‧‧開口

1000、2000‧‧‧葉片

1500、2500‧‧‧氧氣體積流量計

圖1A係繪示全氟碳化物(Perfluorocarbon；PFC)光生物反應器實驗裝置圖。

圖1B係繪示氫氟醚化物(Hydrofluoroether；HFE)光生物反應器實驗裝置圖。

圖2係顯示氧氣對擬球藻生長之抑制效果。

圖3係顯示四種碳氟化合物液體對擬球藻的毒性測試結果。

圖4係顯示在高含氧空氣(60% O₂ )持續灌注下，四種光生物反應器培養基中氧氣累積之情形，即四種碳氟化合物吸取上方培養基中溶氧的情形。

圖5係四種光生物反應器內溶氧累積率係數(mass accumulation rate coefficient)之分析曲線。

圖6係擬球藻於高含氧空氣(60% O₂ )持續灌注下在四種光生物反應器內之生長曲線。

首先要說明的是，本案之實施例中所使用的四種不同碳氟化合物液體分別是兩種全氟碳化物以及兩種氫氟醚化物。兩種全氟碳化物分別是全氟溴辛烷(Perfluorooctyl bromide；PFOB)以及全氟萘烷(Perfluorodecalin；PFD)；兩種氫氟醚化物分別是甲氧基-九氟代丁烷(Methoxynonafluorobutane；HFE-7100)以及乙基九氟丁基醚(Ethoxynonafluorobutane；HFE-7200)。目標養殖的生物體為屬於海洋單細胞微藻的擬球藻。培養裝置由密閉三口瓶、流動管件設備與換氣瓶構成。全氟碳化物與氫氟醚化物系統在換器瓶的設置上略有不同。密閉三口瓶內之碳氟化合物液體與細胞培養基係以下、上分層方式於界面接觸。實驗結果顯示4種不同的材料/裝置均可成功地克服由高含氧空氣(60% O₂ )灌注所導致的生長抑制，而使擬球藻順利的生長起來。

接著，根據圖示說明本案之擬球藻培養系統的不同實施例。

圖1A係繪示全氟碳化物光生物反應器實驗裝置圖。該裝置主要由可透光之攪拌槽(例如密閉三口瓶)20、幫浦60、換氣瓶30、電磁攪拌器10、溶氧度計40以及光源50構成，利用全氟碳化物液體20a作為攜氧材料而培養擬球藻。

密閉三口瓶20中置入不互溶且分成下、上兩相的全氟碳化物液體20a以及酸鹼值(pH)為8的韋因培養基(Walne’s medium)20b，作為擬球藻細胞培養瓶。另外，密閉三口瓶20內有一葉片1000得以連續地攪拌全氟碳化物液體20a以及韋因培養基20b。

換氣瓶30被置入全氟碳化物液體30a並被連續注入氮氣，另透過幫浦60連接密閉三口瓶20而形成一循環系統。其中，幫浦60係透過一第一管線70經由密閉三口瓶20的一第一開口80，抽取密閉三口瓶20下方攜氧的全氟碳化物液體20a，並送至換氣瓶30內與全氟碳化物液體30a混合，並藉由上述連續注入之氮氣進行氮-氧氣體交換。之後，幫浦60透過一第二管線90將經過氣體交換後之全氟碳化物液體30a，經由密閉三口瓶20的一第二開口95送回密閉三口瓶20下方。

另外，圖1B係繪示氫氟醚化物光生物反應器實驗裝置圖。在圖1B之實施例中，氫氟醚化物光生物反應器實驗裝置主要由可透光之攪拌槽(例如密閉三口瓶)200、幫浦600、換氣瓶300、電磁攪拌器100、溶氧度計400以及光源500構成，利用氫氟醚化物液體200a作為攜氧材料而培養擬球藻。

密閉三口瓶200中置入不互溶且分成下、上兩相的氫氟醚化物液體200a以及酸鹼值(pH)為8的韋因培養基(Walne’s medium)200b，作為擬球藻細胞培養瓶。另外，密閉三口瓶200內有一葉片2000得以連續地攪拌氫氟醚化物液體200a以及韋因培養基200b。

換氣瓶3O0被置入氫氟醚化物液體300a、海水300b並被連續注入氮氣於氫氟醚化物液體300a中，另透過幫浦600連接密閉三口瓶200而形成一循環系統。其中，幫浦600係透過管線700經由密閉三口瓶200的開口800，抽取密閉三口瓶200下方攜氧的氫氟醚化物液體200a，將其送至換氣瓶300內與氫氟醚化物液體300a混合，並藉由上述連續注入之氮氣進行氮-氧氣體交換。之後，幫浦600透過管線900將經過氣體交換後之氫氟醚化物液體300a，經由密閉三口瓶200的開口950送回密閉三口瓶200下方。請特別注意，換氣瓶300內上方所用的溶液(海水300b)與三口瓶200內的細胞培養基(韋因培養基200b)中的成份海水相同。另外，將氫氟醚化物液體300a抽離換氣瓶300之管線900的管口須置於海水300b與氫氟醚化物液體300a之交界處。

關於圖1A、圖1B之光生物反應器實驗裝置的操作條件如下：

(1)碳氟化合物液體與細胞培養液之比例(體積比)=1：5。

(2)光生物反應器中葉片的攪拌速率=100rpm。

(3)碳氟化合物液體進出系統(三口瓶與換氣瓶)之流速=6mL/min。

(4)含60%氧氣之混合空氣的供應流速=5mL/min(由鋼瓶外接之氧氣流量計(1500、2500)控制)

(5)微藻培養之溫度=25±2℃；光度=80μE/m² /s(以光源(50、500)於擬球藻培養期間連續照光)。

接著，根據圖2說明氧氣對微藻生長之抑制效果；以及根據圖3~圖6說明圖1A、圖1B之碳氟化合物光生物反應器的各項能力之實驗結果。

圖2係顯示氧氣對擬球藻生長之抑制效果。由圖2可以看出，當培養基被連續注入含60%氧氣之混合空氣情形下(模擬細胞於高含氧環境下生長)，擬球藻的生長幾乎完全被抑制。比較於在氧氣濃度為0%的情況下(即不另外注入含氧空氣之情形下)，擬球藻生長情形明顯相對良好。證明了高氧環境對擬球藻生長的抑制效果。

圖3係顯示四種碳氟化合物液體的毒性測試結果。由比較對照組(圖中標示對照組(無碳氟化合物))的生長曲線可以看出，四種碳氟化合物液體對擬球藻均不具有任何毒性。

圖4係顯示在持續灌注含60%氧氣之混合空氣下，四種光生物反應器內氧氣在培養基中累積之情形。由圖4可以看出，在高氧氣體持續灌注的同等條件下，無論是使用全氟溴辛烷、全氟萘烷、甲氧基-九氟代丁烷、或乙基九氟丁基醚作為攜氧材料的光生物反應器，氧氣之累積量均較未使用上述攜氧材料者大幅減少。

圖5係四種光生物反應器內溶氧累積率係數之分析曲線。圖5的結果顯示，在持續灌注含60%氧氣之混合空氣的同等條件下針對細胞培養液進行氧氣累積率係數(K _L a ^ac )的評估，其中全氟溴辛烷組具有最低的K _L a ^ac 值，表示其擁有最佳的氧氣質傳能力，即能夠提供最高的氧氣消除效率。四種碳氟化合物液體氧氣移除效率由高至低順序為全氟溴辛烷>全氟萘烷>甲氧基九氟代丁烷>乙基全氟丁基醚。四種系統的K _L a ^ac 值均明顯低於未使用上述攜氧材料者。

圖6係擬球藻於含60%氧氣之混合空氣持續灌注下在四種光生物反應器內之生長曲線。根據結果顯示，高氧氣濃度環境嚴重抑制了擬球藻的生長。但是，於擬球藻培養時添加全氟溴辛烷、全氟萘烷、甲氧基九氟代丁烷、或乙基全氟丁基醚的生物反應器即使在同時灌注高氧的環境下，所有的細胞仍可成功地生長起來。如圖6所示，各組5天後生物質量由高至低順序為全氟溴辛烷>全氟萘烷>甲氧基九氟代丁烷>乙基全氟丁基醚。此順序與材料移除氧氣能力的高低一致。

相較於現行的微藻培養生物反應器，本案之裝置設計概念不複雜，且所使用的氧氣攜帶材料(PFC或是HFE液體)均可回收使用，因此在使用上成本可作有效控制，具有高度經濟性。

本案之裝置在實際操作上可將生物的培養環境設定為完全密閉，唯一有進出系統的只有碳氟化合物液體，而微生物不易生長於該種碳氟材料中，因此在本裝置操作下可大大的避免系統受到外界感染的機率。

本案之裝置中所使用的四種氧氣攜帶材料(PFOB、PFD、HFE-7100、HFE-7200)均有極佳的溶氧性質，且氧氣傳遞處在於同相之間(液液界面)。實驗證明本案之裝置搭配任一種攜氧材料均具有優異的氧氣移除能力。

根據本案之裝置的設計，碳氟化合物液體位於細胞培養液下方，並於光生物反應器的底部進出系統，完全不會在生物培養環境中產生剪應力，因此可避免在前述現行裝置上所發生的缺點。未來在實際操作上若有需要補充培養液中擬球藻呼吸所需的氣體(如CO₂ )，可設定以定時定量低速的方式進行，以降低對細胞的傷害。

本案之裝置中使用的PFOB與PFD為2項在醫學與生物技術上最為廣泛應用的全氟碳化物。因此均具有極佳的生物可相容性。未來本系統具有擴展應用至動物細胞養殖上之潛力。

本案之光生物反應器所使用的HFE已被研究證實是一種對於環境、生態與人體健康均無害的物質。就所使用的 HFE-7100與HFE-7200而言，溶氧度均優於PFC，價格也較PFC便宜許多。

另外，本案之光生物反應器裝置體積不大，可以達成小空間而高密度的微藻細胞養殖要求。

20‧‧‧可透光之攪拌槽(密閉三口瓶)

60‧‧‧幫浦

30‧‧‧換氣瓶

50‧‧‧光源

10‧‧‧電磁攪拌器

40‧‧‧溶氧度計

20a、30a‧‧‧全氟碳化物液體

20b‧‧‧韋因培養基

70、90‧‧‧管線

80、95‧‧‧開口

1000‧‧‧葉片

1500‧‧‧氧氣體積流量計

Claims

一種培養擬球藻之系統，其設置上包括：一可透光之攪拌槽，具有至少三個開口且透過一第一開口置入一氧氣載體以及一細胞培養液，其中該氧氣載體為碳氟化合物液體且與該細胞培養液不互溶而分成下、上兩相。其中該細胞培養液係酸鹼值(pH)為8的韋因培養基(Walne’s medium)且溫度控制在25±2℃，且其中該可透光之攪拌槽內的葉片連續地攪拌該氧氣載體以及該細胞培養液；一光源，以80μE/m² /s之照明強度，於擬球藻培養期間連續照射該細胞培養液；以及一幫浦，將該可透光之攪拌槽下方之該氧氣載體攜帶上方之該培養液中生物體所產生的氧氣自該可透光之攪拌槽的一第二開口抽離而進入一換氣瓶，並且在該換氣瓶內與連續注入之氮氣接觸後再由該幫浦抽離，經由該可透光之攪拌槽的一第三開口而再次進入該可透光之攪拌槽的下方。
如申請專利範圍第1項所述之培養擬球藻之系統，其中該葉片位於該細胞培養液與該氧氣載體之界面處，同時攪拌速率為100rpm。
如申請專利範圍第1項所述之培養擬球藻之系統，其中該氧氣載體為全氟溴辛烷(Perfluorooctyl bromide；PFOB)、全氟萘烷 (Perfluorodecalin；PFD)、甲氧基-九氟代丁烷(Methoxynonafluorobutane；HFE-7100)、或乙基九氟丁基醚(Eethoxynonafluorobutane；HFE-7200)。
如申請專利範圍第1項所述之培養擬球藻之系統，其中該細胞培養液與該氧氣載體的體積比為5：1。
如申請專利範圍第1項所述之培養擬球藻之系統，其中該氧氣載體循環於該可透光之攪拌槽與該換氣瓶間之流速係根據本身的溶氧度以及上方該細胞培養液內的氧氣累積率而設定。
如申請專利範圍第3項所述之培養擬球藻之系統，其中該氧氣載體為甲氧基-九氟代丁烷(Methoxynonafluorobutane；HFE-7100)或乙基九氟丁基醚(Ethoxynonafluorobutane；HFE-7200)時，該換氣瓶內須置入一海水，且該海水與作為該韋因培養基之成份海水相同，另外，將該氧氣載體抽離該換氣瓶的管口須置於該海水與甲氧基-九氟代丁烷或乙基九氟丁基醚之交界處。