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TWI486451B - 經分離之人類肝癌細胞株及化合物篩選方法 - Google Patents

經分離之人類肝癌細胞株及化合物篩選方法 Download PDF

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TWI486451B
TWI486451B TW102145618A TW102145618A TWI486451B TW I486451 B TWI486451 B TW I486451B TW 102145618 A TW102145618 A TW 102145618A TW 102145618 A TW102145618 A TW 102145618A TW I486451 B TWI486451 B TW I486451B
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ling mei Wang
Ching Huai Ko
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Chun Chung Wang
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Description

經分離之人類肝癌細胞株及化合物篩選方法
本發明是有關於一種經分離之人類肝癌細胞株及化合物篩選方法。
與其他癌症的治療相比，肝癌對諸如阿黴素(doxorubicin)與順鉑(cisplatin)等傳統化學藥物的反應率不到20%，因此肝癌的治療效果非常有限，且目前尚未有經臨床試驗而確認可延長病人存活的傳統化學藥物。再者，美國食品藥品管理局於西元2007年核准的肝癌標靶藥物蕾莎瓦(Nexavar)在第三期人體臨床試驗中也僅能延長病人存活時間3個月，因而亟需開發出具有療效的肝癌藥物。
肝癌的致病機轉相當複雜，主要的致病原因為B型與C型肝炎病毒感染、黃麴毒素(aflatoxin)、酒精(alcohol)以及任何可能引起肝硬化的因子。其中，雖然C型肝炎引起的肝癌在台灣地區僅佔所有肝癌的15-20%，但卻是美國及日本等地區最主要的肝 癌成因。因此，隨著全世界的肝癌發生率逐年上升，研究C肝肝癌(HCV-related HCC)的致病機轉以及開發C肝肝癌的治療藥物，已是刻不容緩的重要課題。然而，綜觀國際知名細胞儲存庫ATCC及JCRB所擁有的肝癌細胞株，大多屬於與HBV相關(HBV-related)或HBV陰性(HBV-negative)的肝癌細胞株，而尚未有從C肝肝癌病患的肝癌組織中成功建立的相關細胞株。因此，此領域亟需與HCV相關的肝癌細胞株來供研究，以利於藉由測試及篩選來開發C肝肝癌藥物，補足肝癌藥物開發細胞平台的缺口。
本發明提供一種經分離之人類肝癌細胞株，可應用於與人類C肝肝癌相關的研究。
本發明另提供一種化合物篩選方法，利用經分離之人類肝癌細胞株進行化合物篩選，可以開發與肝癌、肝功能或肝癌幹細胞相關的藥物。
本發明的經分離之人類肝癌細胞株，其命名為ITRI-H16，ITRI-H16細胞株已於100年11月07日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960432。
本發明的化合物篩選方法，包括以下步驟。首先，提供一經分離之人類肝癌細胞株，其命名為ITRI-H16，ITRI-H16細胞株已於100年11月07日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960432。接著，將一化合物處理經分離之人類肝 癌細胞株，以判定該化合物對經分離之人類肝癌細胞株的作用。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
圖1A至圖1C分別為人類肝癌細胞株ITRI-H16於位相差顯微鏡下以40X、100X以及200X的倍率所觀察到之單層細胞形態圖。
圖2顯示人類肝癌細胞株ITRI-H16之生長曲線。
圖3顯示實驗組、刺激劑處理組、抑制劑處理組以及對照組的人類肝癌細胞株ITRI-H16的CYP3A4的活性。
圖4顯示經不同濃度蕾莎瓦處理後的各組人類肝癌細胞株ITRI-H16的細胞存活率。
圖5顯示經慢病毒基因載體轉染的人類肝癌細胞株ITRI-H16的冷光表達量。
圖6為人類肝癌細胞株ITRI-H16培養於超低貼附培養皿5天後於位相差顯微鏡下所觀察到之細胞形態圖。
圖7顯示將100顆及10000顆的ITRI-H16細胞接種至免疫缺陷小鼠體內後，腫瘤發生率與植入時間的關係圖。
本案是由肝癌組織分離培養出人類肝癌細胞株，其命名為ITRI-H16，ITRI-H16細胞株已於100年11月07日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960432。由ITRI-H16細胞株的細胞外觀型態、生長曲線、同功異構酶分析、基因分型(genotyping)、細胞基因分析(cytogenic analysis)、分泌蛋白質種類以及分泌酵素活性可知，此人類肝癌細胞株確實源自C肝肝癌病人的肝臟組織、具有癌細胞特性且為新建立之細胞株。在癌幹細胞特性分析結果顯示，ITRI-H16細胞株高度表達癌幹細胞分子，可形成球體(spheroid)結構，且對免疫缺陷小鼠具有高致癌力，顯示ITRI-H16具有癌幹細胞潛質。另外，化合物篩選實驗之結果顯示所建立之人類肝癌細胞株ITRI-H16對癌症藥物具有感受性，故可應用於癌症藥物篩選。此外，已建立ITRI-H16冷光表達系統，在建構小鼠移植模型(xenograft model)時，可於活體影像系統(IVIS Imaging system)中進行活體影像觀察。對於肝癌藥物開發及療效評估，此發明同時提供了活體內與體外(in vivo and in vitro)的分析平台，亦可運用此發明於C肝病毒致癌機轉等研究。
以下對人類肝癌細胞株ITRI-H16之建立方法以及相關測試方法詳盡說明如下：
實施例1
人類肝癌細胞株ITRI-H16之建立
本案是由C肝肝癌病人之肝癌組織，分離培養出人類肝 癌細胞株ITRI-H16，且此細胞株於中華民國100年11月07日寄存在食品工業發展研究所之寄存號碼為BCRC960432。
取得C肝肝癌病人之肝癌組織後，將其浸泡於Hank平衡鹽溶液(HBSS solution)中。接著，以無菌刀將肝癌組織剪切成5mm*5mm以下的尺寸。然後，於37℃培養環境下，利用包含分散酶(dispase)、膠原酶(collagenase)以及DNA酶(DNase)三種酶的組合溶液對肝癌組織塊進行處理，以消化結締組織，使得肝癌細胞在損傷程度較低的狀況下從組織中釋放出來。接著，將含有細胞之消化液，以具有100um之篩網之過濾器進行過濾，過濾後所得之細胞懸浮液移至50ml離心管後，以1000rpm離心5分鐘後移除上清液，再加入5ml紅血球溶解緩衝液(RBC lysis buffer)作用3分鐘以去除紅血球，接著以1000rpm離心5分鐘後移除上清液，將細胞放置在10ml肝細胞培養液(Xenotech,K2300)中於5%CO2 、37℃之定溫培養箱中進行初代培養。
繼代培養(subculture)
當初代培養之細胞已長滿培養皿底部，先吸除舊培養液，接著以PBS緩衝液進行清洗，再以胰蛋白酶(Trypsin)進行消化，分解細胞與細胞間或瓶壁上的附著蛋白，使細胞自瓶壁脫落，再依照細胞與培養液為1：3~1：4的比例，加入新的培養液進行後續的培養。其後，每隔4天進行一次繼代培養，取得純度較高且型態均一的ITRI-H16細胞株。
如此，成功地建立人類肝癌細胞株，其於財團法人食品 工業發展研究所之寄存號碼為BCRC960432，並進行後續相關測試。另一方面，本案所建立之人類肝癌細胞株，並不以說明書中所述ITRI-H16細胞株為限，凡是自該ITRI-H16細胞株中再選殖(subclone)或單株化(monoclone)而得之細胞株，或是其他具有相同於ITRI-H16細胞株的任一可辨識特徵之細胞株，皆屬於本發明欲保護之範圍。
特別說明的是，在純化腫瘤細胞的過程中，常常會造成細胞的大量損傷，此外，從腫瘤組織分離腫瘤細胞時，參雜的細胞(諸如淋巴細胞、纖維母細胞、壞死的腫瘤細胞)都將嚴重的干擾腫瘤細胞的生長，使得腫瘤細胞純化分離相當不易，因此過去腫瘤細胞原代培養的成功率低。為了避免其他非腫瘤細胞的參雜干擾腫瘤細胞的增殖，進而影響癌細胞株的建立，發明人使用一種無血清培養液，藉由去除培養液中對於纖維母細胞而言具有成長優勢的血清，使得無血清培養液利於癌細胞生長。如此一來，不僅大幅降低癌細胞建立過程中夾雜有纖維母細胞的疑慮，且利於癌細胞增殖，因而成功地建立人類肝癌細胞株ITRI-H16。
實驗例2
人類肝癌細胞株ITRI-H16之細胞外觀形態觀察
將人類肝癌細胞株ITRI-H16置於相位差倒立顯微鏡(Nikon eclipseTi-S )之視野下，分別以40X、100X以及200X的倍率下，觀察其細胞形態，其結果如圖1A至圖1C所示。
請參照圖1A至圖1C，其分別為人類肝癌細胞株ITRI-H16 於位相差顯微鏡下以40X、100X以及200X的倍率所觀察到之單層細胞形態圖。由圖1A至圖1C可知，人類肝癌細胞株ITRI-H16之單層細胞會附著在塗附有1%膠原的培養皿上，呈現核質比大的細胞外觀，當長滿時，細胞與細胞界線變的不清楚，肝細胞聚集排列的型態類似肝島(hepatocyte island)，以上特性皆顯示ITRI-H16屬於中度分化程度之肝癌細胞。
實驗例3
人類肝癌細胞株ITRI-H16之生長曲線測定
此試驗選自已連續繼代培養約12代之人類肝癌細胞株ITRI-H16，以測定期生長曲線。於6孔細胞培養皿(6 well plate)內接種1×105 的ITRI-H16細胞株，並在培養皿內添加無血清之肝細胞培養液(Xenotech,K2300)，於5%CO2 、37℃之定溫培養箱中進行培養。每隔24小時取出培養皿，於顯微鏡下計數細胞數量，並計算細胞之族群倍增時間(population doubling time)，其結果如圖2所示。
請參照圖2，其顯示人類肝癌細胞株ITRI-H16之生長曲線。由圖2可知，人類肝癌細胞株ITRI-H16之族群倍增時間為34.0小時，換言之，ITRI-H16細胞株的生長速度快速，為癌細胞特徵之一。此外，經由此實驗可知，無血清培養液適於ITRI-H16細胞株的長期培養。
實驗例4
人類肝癌細胞株ITRI-H16之同功異構酶分析
為了確認ITRI-H16細胞株是源自於人類且未被其他細胞汙染，本實驗使用AuthentiKitTM (Innovative Chemistry Marshfield，MA)並根據其使用指示對ITRI-H16細胞株的以下7種同功異構酶進行酵素圖譜分析：核酸磷酸化酶(nucleside phosphorylase，NP)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)、蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase，MD)、甘露糖磷酸異構酶(mannose phosphate isomerase，MPI)、肽酶B(peptidase B，PepB)、天冬氨酸轉胺酶(aspartate aminotransferase，AST)以及乳糖脫氫酶(lactate dehydrogenase，LD)，以計算各同功異構酶的電泳條帶的校正泳動距離(corrected migration distances，CMD)。同時，以293HEK細胞作為人類控制組，以及以PK 15豬細胞作為豬類對照組，並提供一般人類的該些同功異構酶的電泳條帶的校正泳動距離資料作為參考值，而其結果如以下表1所示。
表1顯示ITRI-H16細胞株、293HEK細胞株以及PK 15細胞株之同功異構酶的校正泳動距離。由表1可知，經由比較 ITRI-H16細胞株、293HEK細胞株以及PK 15細胞株的7種同功異構酶之酵素圖譜可知，ITRI-H16細胞株與人類293HEK細胞株具有相近的酵素圖譜，且ITRI-H16細胞株與PK 15細胞株之酵素圖譜明顯不同。由此可知，ITRI-H16細胞株與人類細胞株具有相同來源，也就是ITRI-H16細胞株為人類細胞。
實驗例5
人類肝癌細胞株ITRI-H16之基因分型
為了證實人類肝癌細胞株ITRI-H16來源於所切割的病人肝癌組織，本實驗使用AmpFISTR Identifiler PCR Amplification Kit套組分析ITRI-H16細胞株的DNA，以進行ITRI-H16細胞株的DNA指紋(DNA fingerprinting)確認。詳細地說，分析ITRI-H16細胞株的以下15個短縱列重複序列(short tandem repeat，STR)：D831179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D5S18與FGA，以及X-Y同源基因(Amelogenin)的片段的對偶基因型式。同時，以相同方法分析病人的周邊血單核細胞(PBMC)及實驗例1中所切割的肝癌組織的對偶基因型式，其結果如以下表2所示。
表2
表2顯示ITRI-H16細胞株、病人的周邊血單核細胞以及所切割的肝癌組織的基因分型數據。由表2可知，ITRI-H16細胞株與病人的周邊血單核細胞及肝癌組織具有相同(identical)、特有(unique)且一致的基因分型，且其STR-PCR圖譜不存在於現有的資料庫中。因此，ITRI-H16細胞株確實來源於病人肝癌組織。
實驗例6
人類肝癌細胞株ITRI-H16之細胞基因分析
委託彰化基督教醫院的遺傳諮詢中心對ITRI-H16細胞株進行細胞基因分析。在所檢查的20個細胞中，染色體數目的變化範圍為60-95(為四倍體)，顯示細胞的染色體數目異常。同時，觀察到以下與染色體數目與結構相關的異常表現：(1)以下染色體的缺失(loss of chromosome)：Y、1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21以及22；(2)等臂染色體(isochromosomes)：8q、14q、17q以及21q；(3)由以下染色體異常重接所形成的衍生染色體(derivative chromosome)：包括由11 號染色體的長臂與15號染色體的長臂組成的衍生染色體以及由17號染色體的長臂與21號染色體的長臂組成的衍生染色體；(4)位於12號染色體的短臂上的未知來源附加物(additional material of unknown origin)；以及(5)存在有1~8條標記染色體(marker chromosome)。
另一方面，使用Spectral karyotyping probe kit(ASI,Inc.)套組對ITRI-H16細胞株進行光譜核型分析(SKY analysis)。在所檢查的10個分裂中期相細胞(metaphase cell)中，每個細胞的染色體型式(chromosomal pattern)都是獨特的。此外，核型具有以下一致的變化：66~72、XX、-X、-X、-Y、-Y、-Y、+1、der(3)、+3、+5、+6、+7、der(8)、+8、-11、der(12)t(Y；12)x2、+12、-13、der(14)、der(15)、der(17)t(17；21)、+der(170t(10；17)、-19、der(20)x3、+20、-21以及-22[cp 10]。
根據以上實驗結果，染色體異常分離及多套染色體顯示人類肝癌細胞株ITRI-H16具有癌細胞特性。
實驗例7
人類肝癌細胞株ITRI-H16之分泌蛋白功能
追溯ITRI-H16細胞株來源的C肝肝癌患者的臨床記錄，得知患者血清中表達高量的甲型胎兒蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)及抗HCV抗體，代表此肝癌患者曾經受到HCV的感染。然而，藉由抽取ITRI-H16細胞株的上清液及細胞溶解物(cell lysate)中的RNA進行病毒檢測時，未測得HCV RNA的存在，也就是確認 ITRI-H16細胞株目前未帶有HCV病毒。
對ITRI-H16細胞株進行AFP與白蛋白的分泌分析實驗。在此實驗中，將2×105 之ITRI-H16細胞培養於6孔細胞培養皿內，並在培養皿內添加無血清之肝細胞培養液(Xenotech,K2300)，於5%CO2 、37℃之定溫培養箱中進行培養。接著，在培養後的24小時與48小時分別檢測ITRI-H16細胞株的上清液的AFP與白蛋白的量。同時，以相同細胞數目的Huh-7細胞株作為對照組，其結果如以下表3所示。
表3顯示ITRI-H16細胞株與Huh-7細胞株的AFP與白蛋白的分泌量。由表3可知，ITRI-H16細胞株在體外培養一段時間後仍具有高量表達的AFP。此外，由於白蛋白由肝細胞所合成，因此可以知道ITRI-H16細胞株具有合成與釋放白蛋白的能力。由上述結果可知，在特殊的無血清培養環境下，ITRI-H16細胞株能維持與C肝肝癌患者體內相似的AFP與白蛋白的表達功能。
實驗例8
人類肝癌細胞株ITRI-H16之CYP3A4的分泌功能
CYP3A4是由肝細胞表達的藥物代謝酵素，其在肝細胞代謝藥物的功能中扮演舉足輕重的角色。因此，對ITRI-H16細胞株進行CYP3A4的分泌分析實驗。在此實驗中，將1×105 之ITRI-H16細胞培養於96孔細胞培養皿內，並在培養皿內添加無血清之肝細胞培養液(Xenotech,K2300)，於5%CO2 、37℃之定溫培養箱中進行培養，且將細胞株分為四組：第一組為未經處理的實驗組；第二組為在其中加入立復黴素(Rifampicin(為CYP3A4刺激劑))處理組，並使其最終濃度為10uM；第三組為在其中加入克康那坐(Ketoconazole(為CYP3A4抑制劑))處理組，並使其最終濃度為10uM；第四組為對照組，在其中加入DMSO並使其最終濃度為0.1%。在上述各組的ITRI-H16細胞株生長48小時後，以P450-GLOTM CYP3A4檢測法，測得CYP3A4的活性，其結果如圖3與以下表4所示。
請參照圖3與表4，其顯示實驗組、刺激劑處理組、抑制劑處理組以及對照組的人類肝癌細胞株ITRI-H16的CYP3A4酵素的活性。由圖3與表4可知，ITRI-H16細胞株能表達CYP3A4，且所表達之CYP3A4的活性會因刺激劑作用而增加也會因抑制劑作用而降低。也就是說，ITRI-H16細胞株所表達之CYP3A4具有正常功能。
實驗例9
人類肝癌細胞株ITRI-H16之化合物篩選應用
在本實驗中，準備已接種於培養皿且數目為1×104 之多組ITRI-H16細胞株，接著以30、15、7.5、3.75、1.88、0.94uM等不同濃度的蕾莎瓦(sorafenib)處理該些細胞株。然後，於處理48小時後，以Alarmablue法測量各組別的細胞存活率，結果如圖4所示。
圖4顯示經不同濃度蕾莎瓦處理後的各組人類肝癌細胞株ITRI-H16的細胞存活率。藉由對圖4的結果進行計算，得到蕾莎瓦對於ITRI-H16細胞的IC50 約為14.02±1.45，以及統計P值為0.01。由上述結果可知，人類肝癌細胞株ITRI-H16對於C肝肝癌藥物具有感受性，因此可應用於C肝肝癌藥物的篩選。此外，經由前述實驗例可知ITRI-H16細胞株具有肝細胞特性，因此應可廣泛地用於肝功能藥物的篩選。
實驗例10
人類肝癌細胞株ITRI-H16之載體表達系統的建立
在本實驗中，準備已接種有2×105 個第4代ITRI-H16細胞的之6孔盤培養皿。接著，將培養液換成含有5ug/ml聚凝胺(polybrene)之轉染溶液，並以每1000個細胞加入1ul之轉染溶液(Firefly Luciferase(FLuc)Lentivirus with Puro Selection)的比例將轉染溶液加至ITRI-H16細胞中，將培養皿放置於5%CO2 、37℃之定溫培養箱中進行培養，經16小時的轉染，移除轉染溶液並加入細胞培養 液，接著再以5ug/ml濃度之嘌呤霉素(puromycin)進行篩選，在含有嘌呤霉素的培養液繼代培養4代以後，使用ONE-GloTM 冷光素酶檢測系統(ONE-GloTM Luciferase assay)測定該些細胞的冷光值，結果如圖5所示，而未經轉染之細胞僅測得幾乎可以忽略的冷光值。
請參照圖5，其顯示經慢病毒基因載體轉染的人類肝癌細胞株ITRI-H16的冷光表達量。由圖5可知，ITRI-H16細胞株的平均冷光值為385.1±23.1，也就是說，ITRI-H16細胞株能表達冷光素酶基因。由此實驗可知，已建立ITRI-H16冷光表達系統，可於活體影像系統(IVIS Imaging system)進行活體影像觀察。對於肝癌藥物開發及療效評估，此發明可提供活體內的分析平台。
實驗例11
人類肝癌細胞株ITRI-H16之癌幹細胞分子的表現
在此實驗中，以特異性表現於癌幹細胞(cancer stem cell)上的標記物CD13、CD24、CD44、CD133、EpCAM以及OV6作為目標，使用免疫螢光染色法對ITRI-H16細胞表面的該些標記物進行染色。接著，利用流式細胞儀偵測被染色的ITRI-H16細胞的數量，以得到總細胞中表現特定標記物的細胞比例(%)，其結果如以下表5所示，其中以白蛋白的表現作為對照組。
表5
表5顯示ITRI-H16細胞株的細胞表面表達癌幹細胞標記物的程度。由表5可知，60%以上的ITRI-H16細胞都表現CD24與OV6，以及CD133與EpCAM的表現並不明顯。由上述結果可知，ITRI-H16細胞株具有癌幹細胞潛質。
實驗例12
人類肝癌細胞株ITRI-H16之癌幹細胞型態
癌幹細胞是存在於腫瘤中一群具有自我更新能力的細胞，目前癌幹細胞除了對於腫瘤的增殖扮演重要角色，其對於治療的抗藥性、癌症的復發及轉移亦扮演相當重要的角色。一般來說，癌幹細胞的顯型是以幹細胞球體形成(sphere formation)來作為評估。
在本實驗中，將2×105 之ITRI-H16細胞株接種至超低貼附6孔細胞培養皿(ultra low attachment flask)中，於5%CO2 、37℃之定溫培養箱中進行懸浮培養5天。在培養5天後，將ITRI-H16 細胞株置於相位差倒立顯微鏡(Nikon EclipseTi-S )之視野下，以100X倍率觀察其細胞形態，其結果如圖6所示。
請參照圖6，其為人類肝癌細胞株ITRI-H16培養於超低貼附培養皿5天後於位相差顯微鏡下所觀察到之細胞形態圖。由圖6可知，ITRI-H16細胞株於超低貼附培養皿上形成幹細胞球體結構。因此，ITRI-H16細胞株具有癌幹細胞潛質。
實驗例13
人類肝癌細胞株ITRI-H16對於免疫缺乏小鼠之致癌力
首先，準備免疫缺陷小鼠(SCID mice)，其為購自樂斯科公司的週齡為6-8週的雌性小鼠(品系為CB17/Icr-Prkdcscid/CrlBltw)。接著，以皮下異體接種方式分別將100顆及10000顆的ITRI-H16細胞接種免疫缺陷小鼠體內，其中ITRI-H16細胞皆為第2代與第7代的混合細胞。於接種小鼠後，每週測量小鼠的皮下腫瘤體積三次，以計算免疫缺陷小鼠的腫瘤發生率。
請參照圖7，其顯示將100顆及10000顆的ITRI-H16細胞接種至免疫缺陷小鼠體內後，腫瘤發生率與植入時間的關係圖。一般來說，高致癌力(tumorigenicity)為腫瘤幹細胞的重要評估標準之一，也就是可以藉由少量癌細胞來建構一個新的腫瘤的能力，表示此腫瘤幹細胞具有自我更新與增殖的能力。由圖7可知，當於免疫缺陷小鼠體內植入10000顆的ITRI-H16細胞時，植入30週後的腫瘤發生率可達75%，當於免疫缺陷小鼠體內植入100顆 的ITRI-H16細胞時，植入12週後的腫瘤發生率可達50%。由此可知，ITRI-H16細胞具有癌幹細胞潛質之高致癌能力。
經由以上實驗結果可知，以特殊分離條件成功地分離出ITRI-H16細胞株，且以無血清培養液的特殊培養條件使得ITRI-H16細胞株可以在體外持續且穩定地增殖與繼代，並保留肝癌細胞的特性與功能，諸如產生甲型胎兒蛋白以及表現肝細胞白蛋白。此外，ITRI-H16細胞株具有癌幹細胞型態，以及免疫分析結果顯示ITRI-H16細胞株表現CD24與CD44等癌幹細胞標記物。特別是，分析ITRI-H16細胞株於免疫缺陷小鼠的致癌能力，發現使用少量ITRI-H16細胞就能使小鼠發生腫瘤，也就是說，ITRI-H16細胞株的致癌程度遠高於一般肝癌細胞株(諸如Huh-7、PCL/PRF/5、HepG2以及Hep3B)，充分顯示ITRI-H16細胞株為極具癌幹細胞潛質的細胞株。另一方面，ITRI-H16細胞株對於肝癌藥物開發提供了C肝肝癌藥物療效評估的體外分析平台，且由ITRI-H16細胞株的上述特性可知，其亦適用於肝功能藥物與肝癌幹細胞藥物等藥物篩選中。
ITRI-H16細胞株為首次由C肝肝癌患者的組織中建立之肝癌細胞株，因此補足了目前僅有HBV相關或HBV陰性的肝癌細胞株為主的肝癌藥物開發平台的缺口，可預期ITRI-H16細胞株將對於C肝肝癌研究領域而言將扮演相當重要的角色。透過以上一系列的分析，瞭解ITRI-H16細胞株的生理特性及其運用於分子醫學上的特性，可知ITRI-H16細胞株可廣泛地運用於C肝病毒的 致癌病理機制、肝功能藥物篩選、肝癌藥物開發、肝癌幹細胞藥物開發、藥物代謝等研究中。
綜上所述，本發明的人類肝癌細胞株為首次由C肝肝癌患者的組織中所分離之細胞研究材料，其能作為C肝肝癌的病理機制與肝癌相關藥物篩選的研究平台。詳細地說，透過一系列的實驗來揭示ITRI-H16細胞株的生理特性及其運用於分子醫學上的特性，包括ITRI-H16細胞株能在無血清培養液的培養條件下穩定地增殖與繼代、保留肝癌細胞的特性與功能、表達載體以及具有癌幹細胞潛質。如此一來，可預期ITRI-H16細胞株能廣泛地運用於C肝肝癌相關研究領域中，進而提升C肝肝癌的治癒機率。
基於上述，本發明的經分離之人類肝癌細胞株為由C肝肝癌患者的組織中所分離之細胞株，其具有肝癌細胞特性與癌幹細胞潛質。因此，本發明的經分離之人類肝癌細胞株適於作為C肝肝癌的病理機制的研究材料，以及用作與肝癌或肝功能相關的藥物篩選平台。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
【生物材料寄存】
經分離之人類肝癌細胞株已於100年11月07日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960432。

Claims (19)

  1. 一種經分離之人類肝癌細胞株，其命名為ITRI-H16，該ITRI-H16細胞株已於100年11月07日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960432。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的經分離之人類肝癌細胞株，其中該ITRI-H16細胞株是建立自C肝肝癌病人之肝癌組織，且該C肝肝癌病人的血清中含有抗HCV抗體。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的經分離之人類肝癌細胞株，其中該ITRI-H16細胞株分泌甲型胎兒蛋白與白蛋白。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的經分離之人類肝癌細胞株，其中該ITRI-H16細胞株具有癌幹細胞潛質。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的經分離之人類肝癌細胞株，其中該ITRI-H16細胞株表現CD24與OV6。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的經分離之人類肝癌細胞株，其中該ITRI-H16細胞株於低貼附培養皿中形成幹細胞球體結構。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的經分離之人類肝癌細胞株，其對免疫缺乏小鼠具有致癌力。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的經分離之人類肝癌細胞株，其中該ITRI-H16細胞株於無血清培養液中生長增殖。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的經分離之人類肝癌細胞株，其中該無血清培養液為無血清之肝細胞培養液(Xenotech,K2300)。
  10. 如申請專利範圍第1項所述的經分離之人類肝癌細胞株，其中該ITRI-H16細胞株進一步包含一報導基因。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的經分離之人類肝癌細胞株，其中該報導基因表現螢光或冷光反應。
  12. 一種化合物篩選方法，包括： 提供一經分離之人類肝癌細胞株，其命名為ITRI-H16，該ITRI-H16細胞株已於100年11月07日寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存號碼為BCRC960432；以及將一化合物處理該經分離之人類肝癌細胞株，以判定該化合物對該經分離之人類肝癌細胞株的作用。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的化合物篩選方法，其中該化合物包括一C肝肝癌藥物。
  14. 如申請專利範圍第12項所述的化合物篩選方法，其中該化合物包括一肝功能藥物。
  15. 如申請專利範圍第12項所述的化合物篩選方法，其中該化合物包括一肝癌幹細胞藥物。
  16. 如申請專利範圍第12項所述的化合物篩選方法，其中判定化合物作用包含檢測該經分離之人類肝癌細胞株50%細胞抑制濃度(IC50 )。
  17. 如申請專利範圍第12項所述的化合物篩選方法，其中判定化合物作用包含其代謝分析。
  18. 如申請專利範圍第12項所述的化合物篩選方法，其中該ITRI-H16細胞株進一步包含一報導基因。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的化合物篩選方法，其中該報導基因表現螢光或冷光反應。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017079632A1 (en) * 2015-11-04 2017-05-11 Cedars-Sinai Medical Center Patient-derived ctc-xenograft models
KR20190003549A (ko) * 2016-04-04 2019-01-09 휴멜티스 암 케어에서 환자 특이적 치료학적 판단을 위한 진단 방법
US11291164B2 (en) 2018-08-24 2022-04-05 Seoul Viosys Co., Ltd. Light source for plant cultivation

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101693886A (zh) * 2009-08-10 2010-04-14 北京肿瘤医院 一种肝癌细胞系及其应用
US8017391B2 (en) * 2006-03-16 2011-09-13 Univesity of Florida Research Foundation, Inc. Human liver cancer cell line
CN103320385A (zh) * 2013-05-06 2013-09-25 南方医科大学南方医院 人源性高分化肝癌细胞株hl1017及其构建方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1170848C (zh) * 2000-04-17 2004-10-13 上海市肿瘤研究所 新的人肝癌相关蛋白及其编码序列
ES2344518T3 (es) * 2005-01-14 2010-08-30 Glaxosmithkline Istrazivacki Centar Zagreb D.O.O. 9a-carbamoil-gamma-aminopropil- y 9a-tiocarbamoil-gamma-aminopropil-azalidos con actividad antimalarica.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017391B2 (en) * 2006-03-16 2011-09-13 Univesity of Florida Research Foundation, Inc. Human liver cancer cell line
CN101693886A (zh) * 2009-08-10 2010-04-14 北京肿瘤医院 一种肝癌细胞系及其应用
CN103320385A (zh) * 2013-05-06 2013-09-25 南方医科大学南方医院 人源性高分化肝癌细胞株hl1017及其构建方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ko CH. et al. "Differential proteomic analysis of cancer stem cell properties in hepatocellular carcinomas by isobaric tag labeling and mass spectrometry." J Proteome Res. 2013 Aug,12(8):3573-85. 第3574頁左欄第5段、圖1、表1 *

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