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TWI486341B - 抑制ａｔｒ與ｆａｎｃｄ２激活之組成物與方法 - Google Patents

抑制ａｔｒ與ｆａｎｃｄ２激活之組成物與方法 Download PDF

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TWI486341B
TWI486341B TW101117920A TW101117920A TWI486341B TW I486341 B TWI486341 B TW I486341B TW 101117920 A TW101117920 A TW 101117920A TW 101117920 A TW101117920 A TW 101117920A TW I486341 B TWI486341 B TW I486341B
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dna
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atr
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Inventor
Hui Chun Wang
Yang Chang Wu
Fang Rong Chang
Chin Chung Wu
Original Assignee
Univ Kaohsiung Medical
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Description

抑制ATR與FANCD2激活之組成物與方法
本技術係關於式(I)或式(II)之黃酮類架構化合物或所形成之組合物，可抑制ATR與FANCD2激活之功能。
二十世紀中葉抗腫瘤藥物正式運用於臨床，目前惡性腫瘤仍然威脅著人類健康。其中大體上由於腫瘤之發生存在著未明確之機制，以致於所仰賴之化學治療、放射治療或生物治療，均有些無法呈現治癒療效或大幅度延長患者壽命之效果。在現行烷化劑、DNA拓撲異構酶抑制劑、代謝抑制劑、抗腫瘤激素、有絲分裂抑制劑、以及其它雜類等化學治療藥物，涉及腫瘤耐藥性以及DNA損傷，引發治療效果之低落現象。
分層萃取原產於臺灣金星蕨科之粗毛金星蕨(Thelypteris torresiana )植物，經由分離，且運用比色法細胞之毒性篩選，顯示具備治療潛力之先導抗癌化合物。該化合物之結構，以氫核磁共振(1 H-NMR)光譜比對原芹菜素(Protoapigenin)而鑑定其結構係隸屬於黃酮類，或稱為色原酮-4-酮(chromen)類、苯并吡喃-4-酮(benzopyran-4-one)類式(I)所示架構，如原金星蕨酮(Protoapigenone,I-1)，以及 5' ,6' -雙氫基-6' -甲氧基-原金星蕨酮(5' ,6' -Dihydro-6' -methoxy-protoapigenone,I-2)、原芹菜素(Protoapigenin,I-3)，該等化合物揭示於本國專利第I321052號或是美國專利第7550160B2、第7670630B2號以及第7785639B2號。
此外運用合成方法可製備原金星蕨酮(I-1)，或是以半合成方法製備隸屬於式(I)類架構之化合物I-4、I-5、I-6、I-7與I-8等五種化合物，隸屬於式(II)類架構之化合物II-1與II-2等兩種化合物，上述化合物均能針對HepG2與Hep3B人類肝癌細胞株，MCF-7與MDA-MB-231人類乳癌細胞株(and),A549人類肺癌細胞株呈現抑制活性，揭示於本國專利第I324062號及美國專利第7842721號。
上述化合物I-4為原黃烷酮(protoflavonone)，其結構名稱為(2-(1-羥基-4-氧代環己-2,5-二烯基)-4氫-色原-4-酮(2-(1-hydroxy-4-oxocyclohexa-2,5-dienyl)-4H-chromen-4-one)。化合物I-5為5-羥基原黃酮(5-hydroxyprotoflavone)，其結構名稱(2-(1-羥基-4-氧代環己-2,5-二烯基)-5-羥基-4氫-色原-4-酮(2-(1-hydroxy-4-oxocyclohexa-2,5-dienyl)-5-hydroxy-4H-chromen-4-one)。化合物I-6為5-羥基-7-甲氧基原黃酮(5-hydroxy-7-methoxy-protoflavonone)其結構名稱為5-羥基(2-(1-羥基-4-氧代環己-2,5-二烯基)-7-甲氧基-4氫-色原-4-酮(5-hydroxy-2-(1-hydroxy-4-oxocyclohexa-2,5-dienyl)-7- methoxy-4H-chromen-4-one)。化合物I-7與I-8則分別於原黃烷酮(I-4)與5-羥基原黃酮(I-5)第R11位變更為甲氧基之架構。
此外化合物II-1與II-2係隸屬於式(II)β-萘黃酮(β-naphthoflavonone)類架構之化合物，化合物II-1其結構名稱為3-(1-羥基-4-氧代環己-2,5-雙烯)-1-氫基-苯并[f]色原-1-酮(3-(1-hydroxy-4-oxocyclohexa-2,5-dienyl)-1H-benzo[f]chromen-1-one)。化合物II-2則係II-1架構之第R21位變更為甲氧基之1' -甲氧基-β-萘黃酮(1' -methoxy-β-naphthoflavone)。
雖然式(I)之原金星蕨酮(protoapigenone,I-1)與式(II)之II-1化合物已知單獨或與順鉑(cisplatin)併用可抗卵巢癌。然而尚無足夠資訊可評估是否式(I)或式(II)之黃酮類架構化合物或所形成之組合物，與一些化學治療藥物相似，涉及腫瘤耐藥性或DNA損傷。
發明人鑑於習知技術尚有所不完備處，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「抑制ATR與FANCD2激活之組成物與方法」，能夠克服先前技術之不足，以下為本案之簡要說明。
隸屬於磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)之兩個相關蛋白激酶，共濟失調性毛細血管擴張症致病基因(ataxia telangiectasia-mutated,ATM)與Rad3相關性激酶基因(ataxia telangiectasia-mutated Rad3 related,ATR)係擔負著DNA損傷回應(DNA damage response,DDR)之核心協調作用，主要負責細胞週期阻滯(cell-cycle arrest)、DNA修復、轉錄與細胞死亡等訊息之調控機制。DNA鏈斷之主要回應由ATM負責，而由紫外線(UV)或複製阻滯(replication block)造成的DNA損害則由ATR所負責；此兩個監測點激酶互相互補功能，透過活化Chk1與Chk2兩種磷酸激酶而啟動訊息傳遞。相對於ATM，根據報導指出ATR對於細胞生長與存活有其不可或缺之重要性。de KA等人於2000年之Curr Biol以及Brown EJ等人於2000年之Genes Dev分別說明ATR基因剔除小鼠無法倖存，主要因為DNA複製不完全與染色體碎片以至於細胞有絲分裂失敗，導致胚胎早期死亡。除了異型合子(heterozygous variant)或部分功能喪失 (hypomorphic variant)之變異之可殘存，正因為如此，在人群中ATR基因突變的機率很低。西克式症(鳥頭樣侏儒症；Seckel syndrome)患者細胞，即是ATR基因變異造成部分功能缺陷的人類細胞，將這種ATR變異基因轉殖到小鼠胚胎細胞後，由於DNA複製出現壓力並累積致命性染色體斷裂，促使加速細胞老化而死亡。以上顯示ATR基因功能是細胞存活所必需的。
到目前為止，沒有在癌症細胞找到ATR基因突變，也就是說腫瘤細胞的ATR功能是正常的。多數標靶DNA複製細胞之癌症化療藥物在治療時會活化ATR複製監測點之功能，這是一種細胞DNA損傷正常回應，目的是要對抗藥物所引起的傷害，而企圖存活。因此，抑制ATR之訊息傳遞功能是一種能改善目前治療方式之有效且具前瞻性的策略。Cliby WA等人於1998年之EMBO或是Nghiem P等人於2001年之Proc Natl Acad Sci U S A等研究已知抑制癌症之ATR激酶可增進化療或放射療法之療效，而ATR下游訊息Chk1與Chk2等損傷回應(DNA damage response,DDR)相關激酶之抑制劑，Lapenna S等人於2009年之Nat Rev Drug Discov以及Bolderson E等人於2001年之Clin Cancer Res，說明已經成功地單獨或合併其他藥物應用於臨床試驗，但是到目前為止，僅有少數與本案之結構式差異很大之ATR抑制劑剛開始陸續被發現，本技術具新穎與前瞻性。
本技術係提供如式(I)或式(II)之哌嗪基團複合鹽類，其中R3 、R5 、R7 、R11 、R14 、R16 、R21 可為氫基、羥基、甲氧基，或帶有雙鍵之氧基。
根據上述構想，本技術之一面向係提供作為ATR激酶抑制劑(inhibitors of ATR kinase)之色原酮-4-酮(chromen)類化合物式(I)或式(II)化合物，且因此可用於治療或減輕疾病、症狀或病症之嚴重性，其中ATR係與該疾病、症狀或病症有關聯。
本技術之另一面向係提供可用於治療特徵為過度或異常細胞增生之疾病、病症及症狀之色原酮-4-酮(chromen)類化合物。此種疾病包括增生或過高增生疾病。增生與過高增生疾病之實例係包括而不限於癌症與骨髓增生病症。
根據上述構想，係提供一種抑制DNA損傷回應(DNA Damage Response,DDR)缺陷癌症(defective cancers)之色原酮-4-酮類化合物，具有如式(I)或式(II)其中之一結構，且搭配藥學上可接受之載體製備成一種抑制DNA損傷回應(DDR)缺陷癌症之醫藥組合物。或是將隸屬於色原酮-4-酮類化合物與另一種DNA傷害劑(DNA-damaging agents)搭配，可依單一劑型投予此兩種治療劑；亦或作為多重劑型之一部份而個別地投予。
根據上述構想，係提供一種防止因DNA傷害細胞修補之色原酮-4-酮(chromen)類化合物，或是包含：藥學上可接受之載體；以形成之醫藥組合物。
根據上述構想，一種色原酮-4-酮類化合物用於製備醫藥劑型使細胞對DNA傷害劑敏化或是使細胞抑制ATR之用途。
一些具體實施例包括對該病患投予色原酮-4-酮類化合物並搭配選自DNA-傷害劑；其中該DNA-傷害劑係適於被治療之疾病；且該DNA-傷害劑係與該色原酮-4-酮類化合物併用以單一劑型投予，或與該色原酮-4-酮類化合物作為多重劑型一部份，個別地投予。
又另一項具體實施例係提供一種在癌細胞中防止DNA傷害之細胞修補之方法，其包括對病患投予本說明書所述之化合物或包含該化合物之組合物。又另一項具體實施例係提供一種在癌細胞中防止因DNA傷害後所需之DNA修補之方法，其包括對病患投予式(I)或式(II)化合物或包含該化合物之組合物。
又其他具體實施例係提供式(I)或式(II)化合物作為ATR、DNA損傷回應訊息機轉之試劑套組，或試劑組合物。該套組包含與上述化合物結合之組合物及隔室或者使用或處置說明。其中結合組合物包含用於偵測ATR與ATR受體及其代謝物與DNA分解產物之結合組合物，包括拮抗劑，或其同質異形物、代謝物或抗體或抗體片段。該隔室含有ATR或其片段、其結合組合物、或核酸(例如，核酸探針或底塗劑)。用於測定測試化合物之結合套組可包含對照化合物、標記化合物及用於將無標記化合物與經結合之標記化合物分離之方法。
又另一項具體實施例係提供本說明書所述之式(I)或式(II)化合物作為放射-敏化劑或化學-敏化劑之用途。投與化療藥物或放射性療程，併用式(I)或式(II)所製備之組合物，可令癌細胞對於化療藥物或放射性藥物之敏感性增加，間接地 保護正常組織免於化療藥物或放射性藥物之傷害。
而另一項具體實施例係提供一種使細胞對DNA傷害劑敏化之方法，其包括對病患投予本說明書所述之式(I)或式(II)化合物或包含該化合物之組合物。
根據上述構想，係提供一種治療患者對DNA-傷害劑具有抗藥性或治療失效者之色原酮-4-酮(chromen)類化合物，或是包含：藥學上可接受之載體；以形成之醫藥組合物。
在一些具體實施例中，此方法係用於由ATM發出訊息相關回應上具有缺陷之癌細胞。在一些具體實施例中，該缺陷為一或多種下列之改變表現或活性：ATM、CHK1、CHK2、p53腫瘤蛋白(Cellular tumor antigen p53)、腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)、雷帕黴素靶蛋白複合物(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)、金屬應答元件(metal response elemen,MRE)11、P38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、促分裂素原活化蛋白激酶激活之蛋白激酶2(MAPK-activated protein kinase 2,MAPKAPK2)、DNA修復蛋白(DNA Repair Protein RAD50)、Nijmegen斷裂症候群(Nijmegen breakage syndrome 1,NBS1)、p53結合蛋白1(53BP1)、DNA損傷檢測點介質1(mediator of DNA damage checkpoint 1,MDC1)或H2A組蛋白家族成員X(H2A histone family member X,H2AX)。於另一項具體實施例中，該細胞為會表現DNA傷害致癌基因之癌細胞。在一些具體實施例中，該癌細胞具有一或多種下列之改變表現或活性：Ras基因超家族成員如K-Ras、N-Ras、H-Ras，或Raf激酶、Myc、Mos、E2F、Cdc25A、CDC4、CDK2、環素E、環素A及Rb。
又其他具體實施例係提供式(I)或式(II)化合物作為單一藥劑(單一療法)以治療癌症之用途。在一些具體實施例中，式(I)或式(II)化合物係用於抑制DNA損傷回應(DDR)缺陷之罹患癌症病患。在其他具體實施例中，該缺陷為ATM、p53、CHK1、CHK2、MRE11、RAD50、NBS1、53BP1、MDC1或H2AX之突變或損失。
在一些具體實施例中，該DNA-傷害劑係選自可融合蛋白或與核酸相互作用之抗癌藥物。於具體實施例中此等抗癌藥物係係選自烷化劑(Alkylating agent)、抗代謝劑(Antimetabolic agents)、抗生素類抗癌藥物(Antibiotic anti-cacner agents)、拓撲異構酶(Topoisomerase,Topo)之Topo I抑制劑或Topo II抑制劑、抗有絲分裂劑(Anti-mitosis agents)之一或其混合搭配。
在其他具體實施例中，該烷化劑DNA-傷害劑係選自氮芥氣類(Nitrogen mustards)之苯丙氨酸氮芥(Melphalan)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、異磷醯胺(Ifosfamide)、雌二醇氮芥(Estramustine)、酚苄明(phenoxybenzamine)。或選自氮丙啶類(Aziridines)之三胺硫磷(Thiotepa)、卡巴苯醌(Carboquone)。或選自亞硝基脲類(Nitrosoureas)之氯乙亞硝脲(Carmustine)、甲基環己亞硝脲(Semustine)、莫司汀(Iomustine)、嘧啶亞硝脲(Nimustine)、鏈脲佐菌素(Streptozocin)、雷莫司汀(Ranimustine)、氯乙環己亞硝脲(Lomustine)。或選自甲基苄肼與三氮烯類(Procarbazine and triazenes)之氮烯咪胺(Dacarbazine)、替莫唑胺(Temozolomide)、甲基苄肼(Procarbazine)。或選自烷基磺酸類 (Alkyl sulfonate)之二甲磺酸丁酯(Busulfan)。或選自鉑類配合物(Platinum coordination complex)類之順鉑(Cisplatin)、順二氨環丁烷鉑(Carboplatin)、奈達鉑(Nedaplatin)、異丙鉑(Iproplatin)、己草鉑(Oxaliplatin)之一或其混合搭配。
在一些具體實施例中，該抗代謝劑係選自胸腺嘧啶核甘酸合成酶抑制劑(Thymidylate synthase inhibitor)類之氨基蝶呤(Aminopterin)、胺甲蝶呤(Methotrexate)、比曲克辛(Piritrexin)、三甲曲沙(Trimetrexate)、雷替曲塞(Raltitrexed)、培美曲塞(Pemetrexed)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、呋喃氟尿嘧啶(Tegafur)、氟脲苷(Floxuridine)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、截瘤達(Capecitabine)。或選自醯胺磷酸核糖基轉移酶抑制劑(Amidophosphoribosyl transferase inhibitors)類之巰嘌呤(Mercaptopurine)、鳥嘌呤(Thioguanine)、6-疏基嘌呤(Thionosine)。或選自DNA鏈延長抑制劑(DNA chain elongation inhibitors)類之阿糖胞苷(Cytarabine)、環胞苷(Ancitabine)、吉西他濱(Gemcitabine)、氟達拉濱(Fludarabine)、克拉屈濱(Cladribine)、氯法拉濱(Clofarabine)、重氮乙醯絲氨酸(Azaserine)、阿紮胞苷(Azacitidine)、噴司他丁(Pentostatin)、羥基脲(Hydroxyurea,HU)之一或其混合搭配。
在一些具體實施例中，該抗生素類抗癌藥物係選自自由基劑(Free radical agents)類之博來黴素(Bleomycin)、放線菌素(Actinomycin D)。或選自Topo II抑制劑類之紅保黴素(Daunorubicin)、艾黴素(Doxorubicin)、去甲氧柔紅黴素(Idarubicin)、表柔黴素(Epirubicin)、戊柔比星(valrubicin)、吡柔比星(Pirarubicin)、阿柔比星(Aclarubicin)、二羥蔥二酮 (Mitoxantrone)、吡酮蒽酮(Piroxanthrone)。或選自其他類之美諾立爾(menogaril)、普卡黴素(Plicamycin)、阿西維辛(Acivicin)、氨茴黴素(Anthramycin)、噴司他汀(Pentostatin)、卡奇黴素(Calicheamicin)、培洛黴素(Peplomycin)之一或其混合搭配。
在一些具體實施例中，該Topo I抑制劑係選自喜樹鹼(Camptothecin)、抗癌妥(Irinotecan)、拓扑替康(Topotecan)。該Topo II抑制劑係選自鬼臼素酯(Podophyllin)、鬼臼毒素(Podophyllotoxin)、鬼臼乙叉苷(Etoposide)、鬼臼噻吩苷(Teniposide)。該抗有絲分裂劑係選自促進微管聚合作用之紫杉醇(Paclitaxel)、多西紫杉醇(Docetaxel)或選自抑制微管聚合作用之秋水仙素(Colchicine)和長春鹼(Vinblastine)、長春醛鹼(Vincristine)、長春地辛(Vindesine)、長春瑞濱(Vinorelbine)等類之長春花生物鹼之一或其混合搭配。
在一些具體實施例中，上述色原酮-4-酮(chromen)類化合物係選自下列式(I)或式(II)結構之一化合物，具體而言可選自原金星蕨酮(Protoapigenone,I-1)、5' ,6' -雙氫基-6' -甲氧基-原金星蕨酮(5' ,6' -dihydro-6' -methoxy-protoapigenone,I-2)、原芹菜素(Protoapigenin,I-3)、原黃烷酮(protoflavonone,I-4)、5-羥基原黃酮(5-hydroxyprotoflavone,I-5)、5-羥基-7-甲氧基原黃酮(5-hydroxy-7-methoxy-protoflavonone,I-6)、化合物I-7、化合物I-8、3-(1-羥基-4-氧代環己-2,5-雙烯)-1-氫基-苯并[f]色原-1-酮(3-(1-hydroxy-4-oxocyclohexa-2,5-dienyl)-1-H-benzo[f]chromen-1-one,II-1)、化合物II-2。
"癌症"一詞包括但不限於下列人類等哺乳類於各部位、器官或臟器之癌症，在一些具體實施例中，該各部位、器官或臟 器可為心臟之循環器官、肺臟之呼吸、口腔與胃腸之消化器官、尿道之泌尿器官、前列腺之生殖系統、皮膚、骨頭、神經系統、乳房之性器官、甲狀腺之分泌系統等等。
原金星蕨酮(I-1)會誘導染色體之畸變，但並不會產生明顯之DDR
損傷DNA係癌症治療藥物之開發過程，一種廣泛性深思熟慮之戰略。Chiu CC等人於2009年DNA Cell Biol報導，已經證明原金星蕨酮(I-1)和化合物II-1於肺癌、前列腺癌可引起DNA鏈斷裂與細胞之凋亡，顯示色原酮-4-酮(chromen)類化合物誘導之DNA損傷可能係此類化合物抗癌作用潛力之主要機制。因此本研究進而探討原金星蕨酮(I-1)對倉鼠卵巢細胞株(CHO)之細胞遺傳學效應。如第一圖所示，正常(第一圖A)和第一圖B、第一圖C畸變染色體之代表性結構，於該細胞投與原金星蕨酮之濃度對染色體的影響，如表一測試結果所示，發現投與高劑量之原金星蕨酮(I-1)無法觀察到完整 之有絲分裂染色體，代表著細胞遭逢有絲分裂時的致命傷害；然而低濃度原金星蕨酮(I-1)可以觀察到染色體有斷裂、三輻射體(triradial)、四輻射體(quadriradial)和第一圖D染色體多倍體(polyploidy)等畸變的現像，並隨劑量增加而增加染色體結構之變化現象。這樣致畸變的作用與絲裂黴素C(mitomycin C,MMC)的作用相似。由於MMC是DNA傷害劑，會誘導許多癌細胞之DDR現象，因此探討原金星蕨酮(I-1)啟動何種之DDR訊息。經由隨實驗所定時間以10μM原金星蕨酮投與HEK293T細胞，測定細胞DDR包括活化ATM(ATMp1981)、Chk1(Chk1-pS345)、Chk2(Chk2-pT68)、P53(P53-S15p)、P38 MAPK(P38-T180p/Y182p)和MAPKAPK2(MK2-T334p)等之磷酸化作用，並且以0.1m之過氧化氫(H2 O2 )處理細胞30分鐘，作為陽性對照組。頗為意外，HEK293T細胞測試高劑量之原金星蕨酮(I-1)並沒有觀察到依賴ATM之Chk2和依賴ATR之Chk1磷酸化活化，如第二圖所示，原金星蕨酮(I-1)確實無法顯著地誘發預期之DDR現象。磷酸化p53 Ser15殘基是DDR重要指標，然而，原金星蕨酮(I-1)沒有明顯活化磷酸化p53 Ser15殘基，推論原金星蕨酮(I-1)不直接造成脫氧核糖核酸(DNA)之損傷，導致少量p53蛋白質之累積可能係其他複雜的蛋白質轉譯後修飾(posttranslational modification)之結果。雖然本研究與Chang HL等人於2008年J Pharmacol Exp Ther、Cancer Lett以及Chen HM等人於2011年Free Radic Biol Med已報導原金星蕨酮(I-1)啟動p38 MAPK之情況類似，然而第二圖呈現p38 MAPK下游目標MAPKAPK2在原金星蕨酮(I-1)投與後2小時開始被磷酸化現象，係此次實驗所發現部分。
為證實色原酮-4-酮類化合物並無造成明顯DDR之疑慮，分別以肺癌細胞株A549和乳癌細胞株MDA-MB-231，重複投與兩種色原酮-4-酮類化合物之實驗。如第三圖(a)和第三圖(b)所示，兩種色原酮-4-酮類化合物分別以較高劑量之I-1以及II-1投與8小時，Chk1和Chk2確實無明顯磷酸化訊息出現。為排除可能係色原酮-4-酮類化合物之化性穩定性或細胞株之特異性，使色原酮-4-酮類化合物之作用喪失。因此，設計檢測此類化合物之細胞毒性實驗。於乳癌細胞株MDA-MB-231和肺癌細胞株A549，投與原金星蕨酮(I-1)和化合物II-1培養48小時後，經由3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴(MTT)分析法測定細胞毒性。然而如第四圖所示，於MDA-MB-231細胞株其數據表明細胞殘存之IC50 值與I-1先前0.41%，II-1之IC50 值先前0.12%之報告範圍均類似，證實此類化合物之化性穩定，且不直接地造成DNA損傷。
原金星蕨酮(I-1)和化合物II-1會抑制DNA損傷所引起Chk1之磷酸化回應
雖然之前報導原金星蕨酮(I-1)可導致DNA斷裂，且如第一圖所示原金星蕨酮(I-1)可導致染色體DNA畸變。然而，色原酮-4-酮類化合物並無誘發明顯之DDR，因此釐清此類化合物導致染色體斷裂以及染色體畸變的原因，便能找到該化合物之作用基因標的。染色體不穩定原本就癌症的一個特徵，已知係監測點或DNA修復基因之功能不良所造成。因此本研究假設DNA損壞監測點和/或DNA修復作用之基因，也許係此類化合物之作用標的。為測試此假設，觀察此類化合物對過氧化氫(H2 O2 )誘發氧化性壓力與DNA鏈斷之影響。
如第五圖(a)所示之抗體免疫印漬結果顯示之DDR作用，原金星蕨酮(I-1)可抑制以0.1mM過氧化氫處理A594細胞2小時後Chk1之磷酸化，同時促進Chk2之磷酸化；但不影響ATM之自體磷酸化(autophosphorylation)作用。顯示，原金星蕨酮(I-1)阻止Chk1因氧化損傷之活化作用。如第五圖(b)所示10焦耳/平方米(J/m2 )能量紫外光照射1小時誘發之DDR，以黑海棉酸(OA)或蛋白酶體抑制劑MG132(Z-Leu-Leu-Leu-al)預處理細胞，皆無法逆轉原金星蕨酮(I-1)抑制Chk1之磷酸化作用，表示該抑制作用並非因為激活磷酸酶或蛋白酶體(proteasome)之降解作用而導致。進一步針對ATR活化作用探討，如第六圖所示，經由紫外光照射誘發之Chk1磷酸化，色原酮-4-酮類化合物於不同細胞第六圖(a)之A549細胞與第六圖(b)之MDA-MB-231細胞內，皆呈現劑量依賴性(dose-dependent effect)之抑制現象。
根據文獻報導，FANCD2之K561會有單泛素化(monoubiquitinated)作用做為DNA損傷的回應，其作用在刺激修復DNA之雙鏈斷裂(double-strand break,DSBs)；單泛素化FANCD2(FANCD2-Ub)之活化是依賴ATR的。如第五圖(a)和第六圖所示，FANCD2-Ub亦可被色原酮-4-酮類化合物所抑制。因此，可證實此類化合物阻斷ATR訊息傳導之活化作用。事實上如第七圖所示，以目前之常見癌症化學療法製劑如艾黴素(doxorubicin)、鬼臼乙叉苷(etoposide)、喜樹鹼(camptothecin)、絲裂黴素C(mitomycin C)處理細胞，可觀察到此類化合物抑制Chk1，而非Chk2磷酸化。此結果表明此類化合物，可在各類型DNA損傷後調控ATR訊息傳遞。由於第六圖和第四圖顯示，化合物II-1比原金星蕨酮(I-1)在 Chk1磷酸化和細胞存活呈現更具有抑制潛力，推測A圓環附有共軛芳香環萘黃酮(naphthoflavone)結構之化合物II-1，可呈現ATR抑制之作用。
原金星蕨酮(I-1)和化合物II-1調控ATR抑制訊息具有特異性
為闡明色原酮-4-酮類化合物擁有調控ATR抑制訊息之特異性作用，本研究比較此類化合物處理和ATM特定抑制劑KU55933處理對DDR變化的差異。發現在MDA-MB-231細胞過氧化氫(H2 O2 )，能顯著地誘發Chk2之磷酸化以及較小程度之Chk1磷酸化，在此顯示ATM屬於主要回應者(responder)。如第八圖(a)所示色原酮-4-酮類化合物抑制ATR依賴Chk1磷酸化，對ATM依賴的Chk2磷酸化沒有影響；但以10μM KU55933預處理30分鐘明確地強烈抑制著Chk2磷酸化，而對於Chk1磷酸化之作用較小。相反地，以2mM複製阻斷劑羥基脲(hydroxyurea,HU)處理，能顯著地誘發Chk1之磷酸化，而較小對於Chk2磷酸化之誘發作用，在此顯示該階段ATR屬於主要回應者。如第八圖(b)所示，此類化合物顯著地抑制Chk1之磷酸化卻僅略微抑制Chk2之磷酸化。
運用藥學藥理研究方法，已經顯示色原酮-4-酮類化合物對於DDR抑制作用之特異性，完全不同於KU55933。為加強該化合物作用的特異性，在暴露於紫外光(UV)照射或過氧化氫(H2 O2 )之前，先已抑制ATM、ATR和DNA蛋白激酶(DNA protein kinase,DNA-PKcs)之催化次單元體(catalytic subunit)表現之干擾核酸(siRNA)導入人類腎臟胚胎(human embryo kidney cells,HEK)293T細胞。如第九圖，經由RNA干擾方法(RNA interference method)48小時之後ATM、ATR和 DNA-PKcs之表現減少。顯示說明HEK293T細胞經紫外光照射1小時ATR所誘發Chk1之磷酸化被化合物II-1所抑制；而處以化合物II-1會促進Chk2磷酸化，表示化合物II-1因抑制ATR訊息而可能導致基因損傷增加。
第十圖所示，色原酮-4-酮類化合物可完全地抑制第十圖(a)之過氧化氫或第十圖(b)之紫外光誘發之Chk1磷酸化，其方式頗類似於siRNA剔除ATR表現，但並非ATM或DNA-PKcs剔除所能呈現；siRNAs剔除ATM和DNA-PKcs會減低UV或過氧化氫誘發之Chk2磷酸化，雖然原金星蕨酮(I-1)之添加未能因而改變，然而如第十圖(C)所示投與化合物II-1可增加誘發Chk2磷酸化之效果。ATM和ATR之siRNA以及DNA-PKcs均不足以影響Chk2磷酸化之增加。如第三圖(a)與第三圖(b)所示，因為高劑量之化合物II-1，本身略微可誘發Chk2之活化作用，該增加Chk2之磷酸化乃因DNA傷害之協同作用。
辨認造成原金星蕨酮(I-1)進行啟動ATR激酶之調控者
根據文獻，有些基因被鑑定可以調控ATR激酶之激活作用；ATR可以到達損傷之DNA位置是靠著其互動蛋白ATRIP(ATR-interating protein)，與DNA單鏈(single-strandedss DNA,ssDNA)-複製蛋白質A(Replication protein A,RPA)相結合。ATR激酶活性亦可受到TopBP1刺激而獨立活化而不需要RPA-ssDNA。此外，claspin可以動員Chk1到損傷的DNA位置並促進ATR對Chk1的磷酸化作用。如第十一圖顯示之結果，ATRIP或拓撲異構酶結合蛋白1(TopBP1)之過度表現並未逆轉原金星蕨酮(I-1)經紫外光照射HEK293T細胞1小時所誘發Chk1磷酸化之抑制作用，然而claspin或ATR之過度 表現則呈現逆轉現象。此等結果推測，回應DNA損傷時，ATR與claspin之間分子互動或者ATR激酶本身遭受原金星蕨酮(I-1)所影響。
原金星蕨酮(I-1)與化合物II-1可抑制DNA損傷監測點活化和DNA修復之功能
之前，已知ATR激活S/M和G2 /M監測點，以回應各類型之DNA損傷。由於ATM和ATR共同介入G2 /M監測點，而S/M監測點單獨地受ATR所調控。在DNA複製期，DNA複製不全或DNA損傷未修復之情形下，ATR能防止過早之有絲分裂，以維護基因之完整。為評估色原酮-4-酮類化合物呈現作用特異性之影響與ATR有關之DNA損傷監測點。觀察色原酮-4-酮類化合物，經投與複製阻斷劑羥基脲(Hydroxyurea；HU)或cisplatin處理後對細胞進入有絲分裂之影響(G2 /M checkpoint)。如第十二圖(a)所示，螢光激活細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS)於MDA-MB-231細胞，添加70nM有絲分裂抑制劑噻氨酯噠唑(nocodozole,Methyl(5-[2-thienylcarbonyl]-1H-benzimidazol-2-yl)用來捕捉有絲分裂期的細胞。比較羥基脲(HU)或順鉑(cisplatin)合併添加10μM KU55933，4μM原金星蕨酮或者0.4μM化合物II-1培養16小時之後，有絲分裂期細胞的數量是否改變。HU和cisplatin顯著地減少有絲分裂細胞量，表明在MDA-MB-231細胞之S/M和G2 /M監測點充分發揮作用。
如表二與第十二圖(a)所示之有絲分裂期細胞之百分比。經由順鉑(cisplatin)處理之細胞，色原酮-4-酮類化合物或KU55933增加有絲分裂細胞量之百分率，顯示該等均可抑制損傷誘發之G2 /M監測點。然而，色原酮-4-酮類化合物顯著地增加羥基脲(HU)誘發之有絲分裂，但是ATM之抑制劑KU55933則否，表明ATR之一個特定監測點作用-S/M監測點明確地被色原酮-4-酮類化合物削弱。
ATR之功能不僅經由連繫標的在DNA損傷監測點發揮作用，且亦與DNA修復有關
查核色原酮-4-酮類化合物是否會影響ATR與Chk1之同源重組修復(homologous recombination repair,HRR)功能，於HeLa細胞執行HRR分析。HRR修復染色體之斷裂，如表三與第十二圖(b)所示，FACS點印跡法分析綠色螢光蛋白(GFP)細胞之百分比代表染色體同源重組修復之結果，原金星蕨酮(I-1)於低濃度(2μM)呈現藥量依賴之抑制現象。而化合物II-1以十分之一比原金星蕨酮(I-1)更低劑量，即能顯現類似程度之作用。由於監測點和DNA修復機制，係受色原酮-4-酮類化合物所影響，假設DNA損傷後，細胞會帶有未修復之DNA進入有絲分裂。以螢光免疫檢驗法分析有絲分裂細胞DNA損傷標誌γ-H2AX，進行查證。如第十三圖，果然γ-H2AX焦點，很少於HU-或者順鉑(cisplatin)處理之有絲分裂細胞和未加藥細胞被發現。但是添加色原酮-4-酮類化合物後，有絲分裂細胞之γ-H2AX焦點之數量增加。顯示此類化合物投與細胞後，造成損傷或不完整之DNA進入有絲分裂。然而經免疫組織化學法(immunohistochemical)將有絲分裂之標誌染色後觀察，投與此類化合物造成染色體扁平且緊聚，不同於分裂中期之正常染色體係呈現三維立體狀和毛髮狀般。運用免疫組織化學法(immunohistochemical)染色有絲分裂之標誌，磷酸化組蛋白H3(phospho-histone H3)染成紅色以標的有絲分裂細胞，DNA損傷標誌gamma-H2AX染成綠色，而MDA-MB-231細胞因為4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4' ,6' -diamidino-2-phenyl-indole,DAPI)讓DNA呈現藍色螢光。
原金星蕨酮(I-1)與化合物II-1提高化療藥物之敏感性(chemosensitivity)
監測點和修復機制之抑制，導致化療藥物於癌症患者之敏感性。查證色原酮-4-酮類化合物，是否可能成為化療之致敏劑(sensitizer)。Cisplatin已經證實可誘發ATR活化和修復DNA交聯修復(crosslink repair)之關鍵活化步驟-FANCD2之單泛素化(monoubiquitination)。如第十四圖所示此類化合物對cisplatin誘發DDR之影響，原金星蕨酮(I-1)和化合物II-1在第十四圖(a)之A549細胞、第十四圖(b)之U2OS細胞以及第十四圖(C)之MDA-MB-231細胞，均可減少cisplatin誘發之Chk1磷酸化和FANCD2之單泛素化。以同樣之劑量，化合物II-1不僅抑制FANCD2之單泛素化，且能影響其蛋白質之穩定性；此等數據強調化合物II-1比原金星蕨酮(I-1)，具有更強烈之抑制作用。
Chirnomas D等人於2006年Mol Cancer Ther之研究，已知化學製劑可應用於抑制範可尼貧血途徑(Fanconi anemia/BRCA pathway,FA pathway)，因而提高cisplatin之敏感性。而DNA交聯修復(crosslink repair)之關鍵步驟-FANCD2之單泛素化，係與ATR有關，推論經由色原酮-4-酮類化合物所抑制誘發ATR活化，進而抑制FANCD2之單泛素化，可增敏cisplatin於癌症之治療，係讓損壞之DNA維持著未修復之狀態。以A549和MDA-MB-231細胞細胞投與cisplatin以及多種劑量組合之色原酮-4-酮類化合物處理6小時進行實驗，計數細胞群落數量以確定cisplatin造成損傷後細胞之存活能力。在體外投與藥物如第十五圖、第十六圖所示，以奈米濃度(nanomolar,10-9 )添加此類化合物6小時後即能減少單獨cisplatin處理之A549細胞(第十五圖)和MDA-MB-231細胞(第十六圖)其存活細胞群落數量。推論此類化合物誘發ATR 訊息傳遞之抑制，造成cisplatin對細胞的敏感性之增加。雖然過去已知色原酮-4-酮類化合物可分別減少卵巢癌和前列腺癌腫瘤之大小。然而以上述數據加以證實，此類化合物更係運用提高化療藥物之敏感性(chemosensitivity)。
運用人類MDA-MB-231細胞於裸鼠進行腫瘤異種移植(xenograft)以查核活體內色原酮-4-酮類化合物是否呈現化療藥物之敏感性作用。
如第四圖和第十七圖所示，相較於A549細胞，MDA-MB-231細胞株可對cisplatin呈現較高之耐受性(resistance)，而且對於此類化合物有較高之敏感性。如第十八圖所示，對MDA-MB-231異種移植腫瘤體內之作用，每隔4天於老鼠腹膜注射投與2mg/kg cisplatin與化合物II-1之組合後，抑制腫瘤作用比2mg/kg cisplatin單獨療法更為顯著，然而單獨投與0.2mg/kg之化合物II-1後，MDA-MB-231腫瘤之大小並無任何減少現象。
如前所述，ATR參與DNA複製功能。如第十九圖之原金星蕨酮(I-1)和第二十圖之化合物II-1在非毒性之低劑量情況下即能抑制A549及MDA-MB231細胞生長，成劑量依賴性關係。第二十一圖以雙周期胸腺嘧啶核苷酸同步化法，其中第二十一圖(a)細胞未同步化；第二十一圖(b)97.95之細胞同步化，在DNA複製前期將細胞周期同步化後，第二十二圖洗去胸腺嘧啶核苷酸後6小時細胞進入DNA複製期(S)，不論是否處以試驗藥物，差異不大；然而9小時之後(第二十三圖)，對照組53.54%之細胞由DNA複製期準備進入細胞分裂期(G2M)，而處以4μM原金星蕨酮(I-1)和0.4μM化合物II-11分別僅6.46%和20.45%細胞準備進入細胞分裂期，大 部分的細胞都處於DNA複製期，證實原金星蕨酮(I-1)和化合物II-11會造成細胞複製期進行之阻滯現象；第二十四圖以胸腺嘧啶核苷酸類似物5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)摻入法(incorporation)標定DNA複製之數量，色原酮-4-酮類化合物4μM原金星蕨酮(I-1)和0.4μM化合物II-1，證實會減少EdU摻入代表DNA複製停止，此現象和細胞處以複製阻斷劑羥基脲(Hydroxyurea,HU)類似，經換算色原酮-4-酮類化合物減少EdU摻入之比率(第二十五圖)，證實色原酮-4-酮類化合物會抑制DNA複製。
上述賦形劑或稱為『藥學上可接受之載體或賦形劑』、『生物可利用之載體或賦形劑』，係包括溶媒、分散劑、包衣、抗菌或抗真菌劑，保存或延緩吸收劑等任何習知用於製備成劑型之適當化合物。通常此類載體或賦形劑，本身不具備治療疾病之活性，且將本技術所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，製備之各劑型，投與動物或人類不致於造成不良反應、過敏或其它不適當反應。因而本技術所揭示之衍生物， 搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，係適用於臨床及人類。"有效劑量"係代表足以改善或防止醫學症狀或生物體狀態之劑量。有效劑量亦說明投與化合物之劑量足供用於診斷之劑量。除非說明書另有敘述，否則『活性化合物』以及『醫藥活性化合物』於此均可替換使用，係指稱一具有製藥學、藥理學或治療效果之物質。
運用本化合物之劑型經由靜脈、口服、吸入或經由鼻、直腸、陰道等局部或舌下等方式投藥，可達到治療效果。對於不同病症之患者，約每日投與0.1mg至100mg之活性成份。
該載體隨各劑型而不同，無菌注射之組成物可將溶液或懸浮於無毒之靜脈注射稀釋液或溶劑中，此類溶劑如1,3-丁二醇。其間可接受之載體可為甘露醇(Mannitol)或水。此外固定油或以合成之單或雙甘油酯懸浮介質，係一般習用之溶劑。脂肪酸，如油酸(Oleic acid)、橄欖油或蓖麻油等與其甘油酯衍生物，尤其經多氧乙基化之型態皆可作為製備注射劑並為天然醫藥可接受之油類。此等油類溶液或懸浮液可包含長鏈酒精稀釋液或分散劑、羧甲基纖維素或類似之分散劑。其他一般使用之介面活性劑如Tween、Spans或其他相似之乳化劑或是一般醫藥製造業所使用於醫藥可接受之固態、液態或其他可用於劑型開發之生物可利用增強劑。
用於口服投藥之組合物則係採用任何一種口服可接受之劑型，其型式包括膠囊、錠劑、片劑、乳化劑、液狀懸浮液、分散劑、溶劑。口服劑型一般所使用之載體，以錠劑為例可為乳糖、玉米澱粉、潤滑劑，如硬脂酸鎂為基本添加物。而膠囊使用之稀釋液包括乳糖與乾燥玉米澱粉。製成液狀懸浮液或乳 化劑劑型，係將活性物質懸浮或溶解於結合乳化劑或懸浮劑之油狀介面，視需要添加適度之甜味劑，風味劑或是色素。
鼻用氣化噴霧劑或吸入劑組成物，可根據已知之製劑技術進行製備。例如，將組成物溶於生理食鹽水中，添加苯甲醇或其他適合之防腐劑，或促吸收劑以增強生物可利用性。本技術所揭示化合物之組合物亦可製成栓劑，進行經直腸或陰道之投藥方式。
本技術所揭示化合物亦可運用『靜脈投藥』，其係包括經由皮下、腹腔、靜脈、肌肉，或關節腔內、顱內、關節液內、脊髓內注射，主動脈注射，胸腔注射，疾病部位內注射，或其他適合之投藥技術。
試劑套組之載體或賦形劑，係指用於該試劑套組以偵測受體及其代謝物、蛋白質之分解產物，且可與相關拮抗劑，或其同質異形物、代謝物、抗體或抗體片段相結合之組合物。必要時亦可添加運用放射性免疫檢定(RIA)、ELISA及在碎片上實驗等各種檢定形式，所必須之顯色劑、螢光劑。可用於診斷套組係可藉由諸如活細胞、細胞提取物、細胞溶離物、固定細胞、細胞培養物、體液或法醫樣本之生物體進行診斷檢定。而試劑組合物之載體或賦形劑，係指運用於該試劑以偵測受體及其代謝物、蛋白質之分解產物，且可與相關拮抗劑，或其同質異形物、代謝物、抗體或抗體片段相結合之組合物。運用於試劑套組或試劑組合物，可採用任何一種可接受之劑型，其型式可包括膠囊、錠劑、片劑、乳化劑、液狀懸浮液、分散劑、溶劑、液劑、膠劑、泡沫膠劑、霜劑，亦可採用紙片、膠片、纖維或任何支撐物附著之型態，亦可採用玻璃、金屬管、纖維、晶片等任何可裝填之容器呈現。
本案所提出之「抑制ATR與FANCD2激活之組成物與方法」將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本技術所揭示之範圍。因此，本案揭示之創新技術，已深具產業價值，援依法提出申請。
實驗材料及方法：
裸鼠(BALB/cAnN-Foxnlnu/CrlNarl)係購自臺灣國科會實驗動物中心(National Science Council Animal Center,Taiwan)。
質粒(plasmid)與小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNAs)
質粒、ATR、ATR干擾蛋白(ATR-interacting protein,ATRIP)，與claspin係美國加州斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institute,TSRI)之吳博士(Dr.X.Wu)所提供。而拓撲異構酶結合蛋白1(topoisomerase binding protein 1,TopBP1)，則由德克薩斯大學安德森醫學癌症中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center,Houston,Texas)之陳博士(Dr.J.Chen)所提供。
標的ATM之小分子干擾RNA(siRNA)序列(5' -AAGCGCCTGATTCGAGATCCT-3' )、ATR之序列(5' -CCTCCGTGATGTTGCTTGATT-3' )(Sigma-Proligo)、DNA蛋白激酶(DNA-PKcs)之序列 (5' -GATCGCACCTTACTCTGTTGA-3' )，以及作為對照組之隨機序列(5' -AAGTCAATATGCGACTGATGG-3' )均購自Sigma-Proligo公司。
Chk1之初級抗體(sc-8408),Chk2(sc-17747)、FANCD2(SC-20022)、phospho-ATM Ser1981(sc-47739)，以及Myc(sc-40)購自Santa Cruz公司。
Phospho-histone H3 Ser10(06-570)與H2AX Ser139(05-636)抗體則購自Millipore公司。
Claspin(2880)、phospho-Chk1 Ser345(2348)、phospho-Chk2 Thr68(2661)、phospho-P53 Ser15(9286)、P38 MAPK Thr180/Tyr182(9216)以及MAPKAPK2 Thr334(3007)則購自Cell Signaling公司。
Actin(A2066)、flag(F1804)與hemagglutinin(H9658)抗體則購自Sigma-Aldrich公司。
ATR(A300-137A)、ATRIP(A300-095A)與TopBP1(A300-111A)抗體則購自Bethyl公司；而anti-ATM(GTX70103)抗體則購自Gene Tex公司。
DNA重組pHPRT-DRGFP基質(substrate)之結構內I-SceI點，插入1複製之2突變串聯重複(mutated tandem repeated)GFP 基因，以及I-SceI之核酸內切酶表現載體pCBASceI，最初係M.Jasin博士所製備，經由S.Y.Shieh博士所轉贈。
細胞之培養與處理
將人類乳癌細胞株(MDA-MB-231)、人類肺腺癌細胞株(A549)、人類骨肉瘤細胞株(U2OS)、人類子宮頸癌細胞株 (HeLa)，人類胚腎細胞株(HEK293T)，分別培養於DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，並於其中添加10%胎牛血清(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA)。
收集細胞之前1小時，先將新鮮稀釋之過氧化氫(H2 O2 )(Merck,Germany)添加到培養基，再誘發DNA損傷回應(DDR)
進行紫外線照射處理，收集細胞之前1小時以10焦耳/平方米(J/m2 )照射能量之交聯儀(UVP LLC,Upland,CA)。
原金星蕨酮(Protoapigenone,I-1)與化合物II-1分別如上述方法分離或合成。黑海棉酸(okadaic acid,OA)調控細胞蛋白質之磷酸化/去磷酸化機制最佳之探針，與蛋白酶體抑制劑(MG132)購自Sigma-Aldrich公司。DNA損傷回應誘導前30分鐘，分別添加所需之化學品到培養基。
細胞毒殺實驗3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)方法
分別將乳癌細胞株MDA-MB-231和肺癌細胞株A549培養於密度5,000-10,000cells/well之96孔槽組織培養皿。第二天，以受測化合物以及順鉑(cisplatin)進行處理細胞，並繼續培養48小時後，將細胞培養液換成含MTT的培養液繼續培養4小時，之後移除培養液，留下藍色甲臢(Formazan)結晶，再將甲臢結晶溶解於DMSO，以微量效價盤判讀儀(microplate reader)於550nm分析試驗結果之吸光度，以檢視受測化合物對各細胞株之毒殺效果。生物試驗結果以IC50 值代表可抑制 50%細胞生長之化合物濃度，以具有毒殺癌症細胞活性之順鉑作為正控制組(positive control)。
體外測定化療增敏作用檢測法(In vitro chemosensitization assay)
評估體外化療增敏作用(chemosensitization)，實驗前1天將細胞接種於6孔培養盤中，密度為100-400細胞/井，投予藥品培養6小時，並以新鮮之磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered Saline,FBS)更換。菌落清澈，7-10天後使用0.1%結晶紫(crystal violet)染色，以CCD影像擷取系統(LAS 4000mini；Fujifilm產品)拍照。
流式細胞儀(Flow cytometry)
評估DNA損傷監測點啟動細胞週期分佈之影響，於指定之時間點以甲醇固定後2小時收下細胞，經DNA碘化丙啶(propidium iodide,PI)溶液染色與核糖核酸酶A(RNase A)消化。以螢光標記之細胞，選用適當之激發與發射波長，隨後經BD LSR II流式細胞儀分析。使用WinMDI 2.9換算不同螢光細胞之百分比。
體外染色體畸變試驗(chromosome aberration test)。
簡言之，5×105 中國倉鼠卵巢細胞株(Chinese Hamster Ovary,CHO)，實驗前1天植入60毫米之培養皿。原金星蕨酮(Protoapigenone,I-1)誘導染色體結構變化後20小時，與培養於2μM絲裂黴素C(mitomycin C,MMC)之細胞進行比較。在原金星蕨酮(I-1)誘導18小時後，添加0.1μg/ml秋水 仙鹼(colchicine)作用2小時，以震搖培養皿收集分裂中期(metaphase)之細胞。有絲分裂(mitotic)細胞運用0.5%氯化鉀處理10分鐘，以甲醇之冰醋酸(3：1)混合溶液固定。然後以5%姬姆薩(Giemsa)溶液噴染細胞之染色體。然後，在100×油浸200已染色(well-spread)分裂中期細胞後進行分析染色體結構，其中100分裂中期進行實驗。
HEK293T細胞內質粒與siRNA之轉染，分別由磷酸鈣共沉澱法(calcium phosphate precipitation)以及運用脂質體(Lipofectamine)2000(Invitrogen產品)進行。
西方免疫印漬法(Western immunoblotting)
細胞蛋白質溶解物運用Wang HC等人於2006年Cancer Res之方法製備。
免疫印漬法，變性蛋白質以鈉十二烷基硫酸鹽聚丙烯醯胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)分離，經由免疫印漬裝置(immersion blotting apparatus；Bio-Rad Laboratories產品)而轉印至硝酸纖維素(nitrocellulose)膜(PerkinElmer Life Sciences產品)。在室溫纖維素膜以含有1%脫脂牛奶之磷酸鹽-吐溫緩衝液(PBS-T)阻斷30分鐘，其中磷酸鹽-吐溫緩衝液係以1×磷酸緩衝液混合0.05%吐溫(Tween-20)之溶液。初級抗體(Primary antibodies)以含有1%脫脂牛奶之磷酸鹽-吐溫緩衝液(PBS-T)培養2小時，與山葵過氧化酶耦合二級抗體(horseradish peroxidase-coupled secondary antibodies；Jackson Immuno Research Laboratories產品)結合而檢測確認，隨即添加增強化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL；Millipore產品)， 經由冷光影像分析儀(luminescent image analyzer；LAS 4000 mini,Fujifilm產品)分析非飽和帶之圖像。
DNA同源重組修復分析(homologous recombination repair assay)
在核酸內切酶I-SceI辨認切點，插入1個具有2個突變串聯重複(mutated tandem repeated)GFP 基因構建成為DNA重組pHPRT-DRGFP基質(substrate)。pCBASceI是I-SceI之核酸內切酶表現載體。在HeLa細胞染色體中穩定置入pHPRT DRGFP序列，透過I-SceI核酸內切酶表現在細胞內，切斷染色體而造成染色體雙股斷裂，再加以評估細胞重組修復能力。
PCBASceI進入細胞6小時後，以添加或不添加原金星蕨酮(I-1)或化合物II-1之細胞培養液更換。藥物作用48小時後，以流式細胞術評估含有綠色螢光蛋白(green fluorescent protein,GFP)細胞之百分率，以獲得染色體同源重組修復(homologous recombination repair,HRR)之效果。
異位移植人類腫瘤(Human xenograft tumors)於裸鼠體內
注射藥品之製備，順鉑溶於二甲基甲醯胺(dimethylformamide,DMF)形成20毫克/毫升溶液，以5%葡萄糖等張溶液(D5W)稀釋100倍；化合物II-1溶於二甲亞碸(dimethylsulfoxide,DMSO)形成1mg/ml溶液，以5%葡萄糖等張溶液稀釋50倍；控制組(溶劑)以2%二甲亞碸、1%二甲基甲醯胺溶於97%之5%葡萄糖等張溶液，每20g老鼠之重 量投與0.2ml溶液。
經培養獲得人乳腺癌細胞株(MAD-MB-231)，再懸浮於無血清培養基形成1×108 細胞/毫升，皮下注射0.1毫升該懸浮溶液於一股雌性裸鼠之右脅腹(right flank)。
小鼠成功地增長50-100mm3 面積腫瘤後隨機被分配到各組(n=8-11)，進行實驗。控制組(溶媒)、2毫克/公斤順鉑(cisplatin)或0.2毫克/公斤之化合物II-1均以腹腔投與每天4次(q4d)方式進行整個實驗。每週測量腫瘤尺寸(寬度與長度)、老鼠之重量3次，使用公式計算體積。體積=(寬度)2 ×長度/2。
其他之實施例
1.一種抑制DNA-傷害回應(DNA Damage Response,DDR)缺陷癌症之組合物，包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之色原酮-4-酮(chromen)類化合物主成分。
2.一種防止因DNA傷害細胞修補之醫藥組合物，包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之色原酮-4-酮類化合物主成分。
3.一種使細胞抑制ATR複製監測點之醫藥組合物，包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之色原酮-4-酮類化合物主成分。
4.如上述之醫藥組合物，其中色原酮-4-酮(chromen)類化合物，係選自式(I)或式(II)之一； 其中R21 可為氫基、羥基、甲氧基，或帶有雙鍵之氧基。
5.如上述之醫藥組合物，其中式(I)或式(II)係選自下列之一化合物，原金星蕨酮(Protoapigenone,I-1)、5' ,6' -雙氫基-6' -甲氧基-原金星蕨酮(5' ,6' -Dihydro-6' -methoxy-protoapigenone,I-2)、原芹菜素(Protoapigenin,I-3)、原黃烷酮(protoflavonone,I-4)、5-羥基原黃酮(5-hydroxyprotoflavone,I-5)、5-羥基-7-甲氧基原黃酮(5-hydroxy-7-methoxy-protoflavonone,I-6)、化合物I-7、化合物I-8、3-(1-羥基-4-氧代環己-2,5-雙烯)-1氫基-苯并[f]色原-1-酮(3-(1-hydroxy-4-oxocyclohexa-2,5-dienyl)-1H-benzo[f]chromen-1-one,II-1)、化合物II-2。
6.一種抑制DNA-傷害回應(DNA Damage Response,DDR)缺陷癌症之組合物，其中如上述之主成分與另一種適於被治療疾病之治療劑搭配，可依多重劑型之一部份，或該化合物與另一治療劑，可依單一劑型個別地投予。
7.一種防止因DNA傷害細胞修補之醫藥組合物，其中如上述之主成分與另一種適於被治療疾病之治療劑搭配，可依多重劑型之一部份，或該化合物與另一治療劑，可依單一劑型個別地投予。
8.一種使細胞抑制ATR複製監測點之醫藥組合物，其中如上述之主成分與另一種適於被治療疾病之治療劑搭配，可依多重劑型之一部份，或該化合物與另一治療劑，可依單一劑型個別地投予。
9.如上述之醫藥組合物，其中另一種適於被治療疾病之治療劑，係選自可融合蛋白或與核酸相互作用之抗癌藥物之一或其混合搭配。
10.如上述之醫藥組合物，其中可融合蛋白或與核酸相互作用之抗癌藥物係選自烷化劑(Alkylating agent)、抗代謝劑(Antimetabolic agents)、抗生素類抗癌藥物(Antibiotic anti-cacner agents)、拓撲異構酶(Topoisomerase,Topo)之Topo I抑制劑或Topo II抑制劑、抗有絲分裂劑(Anti-mitosis agents)之一或其混合搭配。
11.一種使細胞對DNA傷害劑敏化之醫藥組合物，包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之色原酮-4-酮類化合物主成分。
12.如申請專利範圍第11項之醫藥組合物，其中細胞對DNA 傷害劑敏化係ATM、p53、CHK1或CHK2之突變或損失形成之缺陷。
13.一種色原酮-4-酮類化合物，用於製備醫藥劑型使細胞對DNA傷害劑敏化或是使細胞抑制ATR之用途。
14.一種使細胞抑制ATR之醫藥組合物，包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量之色原酮-4-酮類化合物主成分。
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第一圖 原金星蕨酮(Protoapigenone,I-1；WYC02)導致染色體畸變但無明顯明顯之DNA損傷反應(DDR)，於CHO細胞投與原金星蕨酮觀察有絲分裂期細胞之染色體，圖片顯示從200個有絲分裂細胞篩選不同類型之畸變細胞染色體。
A-正常染色體
B-四輻射體(quadriradial)
C-三輻射體(triradial)
D-多倍體(polyploidy)染色體
第二圖 原金星蕨酮(I-1,10μM)投與HEK293T細胞，測試DDR之免疫印漬(immunoblot)。以測試ATM、Chk1、Chk2、和p53之磷酸化為DDR之代表
A-過氧化氫
第三圖 於乳癌細胞株MDA-MB-231和肺癌細胞株A549，投與原金星蕨酮(I-1)和化合物II-1培養後測試DDR之免疫印漬(immunoblot)，以測試Chk1和Chk2之磷酸化為DDR之代表。
第三圖(a) MDA-MB-231細胞株之免疫印漬
第三圖(b) A549細胞株細胞株之免疫印漬
A-過氧化氫
B-紫外光
第四圖 原金星蕨酮(I-1)和化合物II-1之細胞殘存IC50 值
A-MDA-MB-231細胞株
B-A549細胞株
第五圖 色原酮-4-酮類化合物抑制DNA損傷誘發之DDR，以黑海棉酸(OA)或蛋白酶體抑制劑MG132預先處理。
第五圖(a) 過氧化氫(H2 O2 )處理誘發DDR
第五圖(b) 紫外光(UV)處理誘發DDR
A-過氧化氫
B-紫外光
第六圖 色原酮-4-酮類化合物(左)和化合物II-1(右)抑制紫外光誘發之Chk1磷酸化作用。
第六圖(a) 於A549細胞抑制磷酸化作用
第六圖(b) 於MDA-MB-231細胞抑制磷酸化作用
A-A549細胞
B-MDA-MB-231細胞
C-紫外光(UV)
第七圖 色原酮-4-酮類化合物抑制癌症化學療法製劑處理細胞誘發之Chk1磷酸化作用。
A-艾黴素(doxorubicin)
B-表鬼臼毒吡喃葡萄糖苷(etoposide)
C-喜樹鹼(camptothecin)
D-絲裂黴素C(mitomycin C)
第八圖 色原酮-4-酮類化合物抑制ATR依賴Chk1磷酸化。
第八圖(a) 過氧化氫誘發DNA損傷回應
第八圖(b) 羥基脲(HU)誘發DNA損傷回應
A-0.1mM過氧化氫
B-2mM羥基脲
第九圖 RNA干擾方法剔除ATR基因表現，化合物II-1影響HEK293T細胞經紫外光照射誘發Chk1磷酸化
A-紫外光(UV)
第十圖 RNA干擾方法剔除ATR基因表現，色原酮-4-酮類化合物抑制DNA損傷誘發之Chk1磷酸化
第十圖(a) 原金星蕨酮(I-1)抑制過氧化氫誘發之磷酸化
A-過氧化氫
第十圖(b) 原金星蕨酮(I-1)抑制紫外光誘發之磷酸化
A-紫外光
第十圖(c)化合物II-1增加誘發Chk2磷酸化之效果A-過氧化氫
第十一圖 原金星蕨酮(WYC02)抑制HEK293T細胞紫外光誘發Chk1之磷酸化
細胞轉染對照載體(Vector)、ATR、TOPBP1或claspin基因後，觀察原金星蕨酮(I-1)經紫外光照射HEK293T細胞所誘發Chk1磷酸化抑制作用之逆轉
A-紫外光
B-載體(Vector)
第十二圖 色原酮-4-酮類化合物抑制DNA損傷監測點及染色體修復
第十二圖(a) 分析DNA複製期後知有絲分裂標誌之比率
第十二圖(b) FACS點印漬法分析綠色螢光蛋白(GFP)細胞之比率
A-載體
第十三圖 以2mM羥基脲(HU)或80μM cisplatin誘發監測點活化，有絲分裂之標誌與DNA損傷標誌經免疫組織化學法(immunohistochemical)染色。磷酸化組蛋白H3(phospho-histone H3)染成紅色，磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)染成綠色，DNA細胞核處呈現藍色螢光。
第十四圖 色原酮-4-酮類化合物抑制cisplatin誘發之Chk1磷酸化和FANCD2之單泛素化
第十四圖(a) 於549細胞之作用
A-549細胞 D-順鉑(cisplatin)
第十四圖(b) 於U2OS細胞之作用
B-U2OS細胞 D-順鉑(cisplatin)
第十四圖(c) 於MDA-MB-231細胞之作用
C-MDA-MB-231細胞 D-順鉑(cisplatin)
第十五圖 在體外投與藥物影響A549細胞存活细胞群數量
第十五圖(a) 原金星蕨酮(I-1)之作用
第十五圖(b) 化合物II-1之作用
A-順鉑(cisplatin)
第十六圖 在體外投與藥物影響MDA-MB-231細胞存活细胞群數量
第十六圖(a) 原金星蕨酮(I-1)之作用
第十六圖(b) 化合物II-1之作用
A-順鉑(cisplatin)
第十七圖 MDA-MB-231細胞和A549細胞對色原酮-4-酮類化合物之耐受性
第十七圖(a) 原金星蕨酮(I-1)之作用
第十七圖(b) 化合物II-1之作用
第十八圖 對MDA-MB-231異種移植腫瘤體內之作用
0.2mg/kg低劑量化合物II-1可以增加腫瘤對cisplain 的敏感性
A-順鉑(cisplatin)2mg/kg
B-順鉑+化合物II-1 0.2mg/kg
C-化合物II-1 0.2mg/kg
第十九圖 原金星蕨酮(I-1)抑制細胞生長
第十九圖(a) 抑制A549細胞之生長
第十九圖(b) 抑制MDA-MB231細胞之生長
A-對照組
B-0.25μM化合物I-1
C-0.5μM化合物I-1
D-1μM化合物I-1
第二十圖 化合物II-1抑制細胞生長
第二十圖(a) 抑制A549細胞之生長
第二十圖(b) 抑制MDA-MB231細胞之生長
A-對照組
B-0.1μM化合物II-1
C-0.2μM化合物II-1
D-0.4μM化合物II-1
第二十一圖 雙周期胸腺嘧啶核苷酸同步化法
第二十一圖(a) 未同步(unsynchronized)細胞之生長
G1：42.51% S：30.26% G2M：24.75%
第二十一圖(b) 抑制MDA-MB231細胞之生長
G1：70.95% S：24.00% G2M：1.29%
第二十二圖 細胞解除同步化6小時後細胞進入DNA複製期
第二十二圖(a) 對照組
G1：18.29% S：75.63% G2M：0.63%
第二十二圖(b) 原金星蕨酮(I-1)之作用
G1：25.45% S：69.13% G2M：0.41%
第二十二圖(c) 化合物II-1之作用
G1：21.72% S：72.01% G2M：4.59%
第二十三圖 細胞解除同步化9小時後原金星蕨酮(I-1)化合 物II-1造成細胞複製阻滯
第二十三圖(a) 對照組
G1：20.94% S：25.53% G2M：53.54%
第二十三圖(b) 原金星蕨酮(I-1)之生長
G1：21.41% S：60.89% G2M：16.46%
第二十三圖(c) 化合物II-1之作用
G1：15.50% S：63.06% G2M：20.45%
第二十四圖 色原酮-4-酮類化合物減少5-乙炔基-2'脫氧尿嘧
啶核苷(EdU)之摻入(a)(b)(c)
第二十四圖(a) 二甲亞碸(DMSO)
第二十四圖(b) 羥基脲(Hydroxurea)
第二十四圖(c) KU55933
第二十四圖(d) 原金星蕨酮(I-1)之作用
第二十四圖(e) 化合物II-1之作用
第二十五圖 色原酮-4-酮類化合物減少EdU摻入之比率
A-二甲亞碸(DMSO)對照組
B-羥基脲(Hydroxurea)
C-KU55933
D-原金星蕨酮(I-1)
E-化合物II-1

Claims (8)

  1. 一種包含式(I)或式(II)化合物以及藥學上可接受之載體的組合物之用途，用於製備抑制DNA-傷害回應(DNA Damage Response,DDR)之藥物， 其中R3、R5、R7、R11、R14及R16分別選自由氫基、羥基、甲氧基所組成的群組其中之一，R21選自由氫基、羥基及甲氧基所組成的群組其中之一。
  2. 一種抑制DNA-傷害回應(DNA Damage Response,DDR)缺陷癌症之組合物，包含如申請專利範圍第1項之式(I)或式(II)化合物與可融合蛋白或與核酸相互作用之抗癌藥物之一。
  3. 如申請專利範圍第2項之醫藥組合物，其中可融合蛋白或與核酸相互作用之抗癌藥物係選自烷化劑(Alkylating agent)、抗代謝劑(Antimetabolic agents)、抗生素類抗癌藥物(Antibiotic anti-cacner agents)、拓撲異構酶(Topoisomerase,Topo)之Topo I抑制劑或Topo II抑制劑、抗有絲分裂劑(Anti-mitosis agents)之一或其混合搭配。
  4. 一種包含如申請專利範圍第1項之式(I)或式(II)化合物以及藥學上可接受之載體的組合物之用途，用於製備抑制DNA-傷害回應(DNA Damage Response,DDR)之藥物，該藥物的一投藥對象為患有一DNA-傷害回應(DNA Damage Response,DDR)缺陷癌症的一個體。
  5. 一種包含如申請專利範圍第1項之式(I)或式(II)化合物以及藥學上可接受之載體的組合物之用途，用於製備使細胞抑制ATR複製監測點之藥物。
  6. 一種包含如申請專利範圍第1項之式(I)或式(II)化合物以及藥學上可接受之載體或賦形劑的組合物之用途，用於製備干擾DNA損傷回應訊息機轉之藥物。
  7. 一種包含如申請專利範圍第1項之式(I)或式(II)化合物以及藥學上可接受之載體的組合物之用途，用於製備使細胞對DNA傷害劑敏化之藥物。
  8. 如申請專利範圍第7項之用途，其中細胞對DNA傷害劑敏化係ATM、p53、CHK1或CHK2之突變或損失形成之缺陷。
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