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TWI482782B - 架接抗體之雙乳化核殼奈米結構 - Google Patents

架接抗體之雙乳化核殼奈米結構 Download PDF

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TWI482782B
TWI482782B TW102140127A TW102140127A TWI482782B TW I482782 B TWI482782 B TW I482782B TW 102140127 A TW102140127 A TW 102140127A TW 102140127 A TW102140127 A TW 102140127A TW I482782 B TWI482782 B TW I482782B
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double
shell
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pva
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TW102140127A
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TW201444874A (zh
Inventor
Chihsheng Chiang
Shanghsiu Hu
Sanyuan Chen
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Univ Nat Chiao Tung
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Priority to EP14804482.9A priority patent/EP3003280A4/en
Priority to AU2014274028A priority patent/AU2014274028B2/en
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Priority to CN201410238809.8A priority patent/CN104208717B/zh
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Description

架接抗體之雙乳化核殼奈米結構
本發明是有關於一種架接抗體之奈米結構，且特別是有關於一種架接抗體之雙乳化核殼奈米結構。
目前已有一些由有機材料所製得之核殼奈米結構被應用來攜帶藥物，做為藥物的載體。這些有機的核殼奈米結構，例如有由雙脂肪層所構成之微脂體(liposome)或由兩性高分子所構成之微胞(micelle)，但是這些有機的核殼奈米結構通常有結構不穩定，或製程繁雜及不易控制等問題。
因此，本發明之一方面是在提供一種架接抗體之雙乳化核殼奈米結構，其包括一水相核、一油相殼與一抗體。
上述之油相殼包圍該水相核，該油相殼的組成包含一高分子與複數個疏水性磁奈米粒子，但不包含界面 活性劑。上述之高分子可為架橋聚乙烯醇或是聚乙烯醇與一架橋高分子的組合，且該架橋聚乙烯醇與該架橋高分子具有一架橋基。上述之抗體藉由一耦合劑鍵結於該架橋基上。
依據本發明一實施例，其中該架橋基包括羧基、硫醇基、醛基、胺基或羥基。
依據本發明另一實施例，其中該架橋聚乙烯醇為羧甲基化聚乙烯醇、硫醇化聚乙烯醇或聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物。
依據本發明又一實施例，其中該架橋高分子為聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、羧甲基化聚乙烯醇、硫醇化聚乙烯醇、硫醇化聚甲基丙烯酸或聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物。
依據本發明再一實施例，其中該些疏水性磁奈米粒子為表面有疏水性官能基修飾之Fe2 O3 、Fe3 O4 、CoFe2 O4 或MnFe2 O4 微粒。
依據本發明又一實施例，其中該抗體包括乳癌抗體Trastuzumab、大腸癌抗體Cetuximab、表皮生長因子受體的抗體Panitumumab或抑制血管新生的抗體Bevacizumab。
依據本發明又一實施例，其中該相殼包含一疏水性藥物。
依據本發明又一實施例，其中該水相核包含一親水性藥物。
本發明之另一方面為提供上述之雙乳化核殼 奈米結構的製備方法，此製備方法分為單乳化法與雙乳化法。
上述之單乳化製備法包括下述製備步驟。先分 別製備包括該架橋聚乙烯醇的水溶液與包括該些疏水性磁奈米粒子的有機溶液。接著，混合攪拌該水溶液與該有機溶液，以形成一乳液，並於該乳液中形成複數個雙乳化核殼奈米結構。去除有機溶液所用的有機溶劑後，分別製備包括該些雙乳化核殼奈米結構的第一分散液與包括與該耦合劑相接之該抗體的第二分散液。混合攪拌該第一分散液與該第二分散液，讓該架橋聚乙烯醇之該架橋基架接上與該耦合劑相接的該抗體。
依照本發明一實施例，上述之親水性藥物可加 入至該水溶液中。
依照本發明另一實施例，上述之疏水性藥物可 加入至該有機溶液中。
上述之雙乳化製備法包括下述製備步驟。先製 備包括該聚乙烯醇之第一水溶液，再製備包括該些疏水性磁奈米粒子的有機溶液。混合攪拌該第一水溶液與該有機溶液，以形成一油包水乳液。然後，製備包括該架橋高分子的第二水溶液。混合攪拌該油包水乳液與該第二水溶液，以形成一水包油乳液，並於該水包油乳液中形成複數個雙乳化核殼奈米結構。去除有機溶液所用的有機溶劑後，分別製備包括該些雙乳化核殼奈米結構的第一分散液 與包括與該耦合劑相接之該抗體的第二分散液。混合攪拌該第一分散液與該第二分散液，讓該架橋高分子之該架橋基架接上與該耦合劑相接的該抗體。
依照本發明一實施例，上述之親水性藥物可加 入至該第一水溶液中。
依照本發明另一實施例，上述之疏水性藥物可 加入至該有機溶液中。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘 要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施方面。
100‧‧‧雙乳化核殼奈米結構
110‧‧‧油相殼
115‧‧‧高分子
120‧‧‧疏水性磁奈米粒子
125‧‧‧水相核
130‧‧‧架橋基
135‧‧‧抗體
140‧‧‧疏水性藥物
145‧‧‧親水性藥物
202a、202b、212、222、230、235‧‧‧步驟
205a、205b、210、215a、215b、220、225‧‧‧步驟
240a、240b、245、250、255‧‧‧步驟
為讓本發明之下述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附附圖之說明如下：第1A圖係繪示依照本發明一態樣的一種雙乳化核殼奈米結構剖面結構示意圖。
第1B圖係繪示利用雙乳化核殼奈米結構來同時做為親水性藥物以及疏水性藥物載體的剖面結構示意圖。
第2A圖係繪示以單乳化法製備表面有架橋基之雙乳化核殼奈米結構的流程示意圖。
第2B圖係繪示以雙乳化法製備表面有架橋基之雙乳化核殼奈米結構的流程示意圖。
第2C圖係繪示表面有架橋基的雙乳化核殼奈米結構與抗體反應的流程示意圖。
第3圖顯示使用不同分子量PVA所合成出之載體的掃描式電子顯微鏡(SEM)圖。
第4A-4B圖分別為架接乳癌抗體前與架接乳癌抗體後的載體之掃描式電子顯微鏡(SEM)影像。
第5A圖為包覆紫杉醇(PTX)且於合成時添加不等量之TPMAA的載體在pH 4下的釋放行為。
第5B圖為包覆小紅莓(Dox)且於合成時添加不等量之TPMAA的載體在pH 4下的釋放行為。
第5C圖為同時包覆親水性小紅莓與疏水性紫衫醇雙藥並於pH 7以及pH 4下之載體的藥物釋放行為。
第6A圖與第6B圖為含PVA/TPMAA混合物(TPMAA的添加量為1wt%)之架接抗體載體分別在pH 7與pH 4下的穿透電子顯微鏡(TEM)影像。
第7A圖顯示使用流式細胞儀檢測架接乳癌抗體Trastuzumab之載體與SKBR3細胞共培養後所測得之螢光量。
第7B圖顯示使用流式細胞儀檢測架接IgG之載體與SKBR3細胞共培養後所測得之螢光量。
第8圖為SKBR3細胞、未被包埋的小紅莓、架接IgG且包埋小紅莓的載體、架接乳癌抗體Trastuzumab且包埋小 紅莓的載體分別與SKBR3細胞共培養後之共軛聚焦顯微鏡的觀察結果。
第9圖為不同樣品與SKBR3細胞共培養後之細胞存活率。
第10A-10B圖分別為裸鼠實驗之第1天與第3天的非侵入式活體影像。
第11圖為以不同樣品治療裸鼠腫瘤後，在不同時間觀察所得之腫瘤體積變化圖。
第12圖為含有PVA/PAA混合物並以EDC/Sulfo-NHS架接乳癌抗體Trastuzumab後之雙乳化核殼奈米結構之外觀SEM影像。
第13A-13C圖分別為分子量25,000、47,000與78,000之含有TPVA載體外觀的SEM影像。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發明的實施方面與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
表面架接抗體之雙乳化核殼奈米結構
請參照第1A圖，其繪示依照本發明一態樣的 一種雙乳化核殼奈米結構剖面結構示意圖。在第1A圖中，雙乳化核殼奈米結構100係由油相殼110包圍水相核125而成，而油相殼110的組成包含高分子115與疏水性磁奈米粒子120。在油相殼110的表面具有架橋基130以及與其相接之抗體135。
上述之高分子115至少含有聚乙烯醇 (polyvinyl alcohol；PVA)，或是至少含有聚乙烯醇經改質後而具有架橋基130的架橋聚乙烯醇。當高分子115中只含有聚乙烯醇時，還需要混合另一種具有架橋基130的架橋高分子。若使用的是架橋聚乙烯醇，則不需額外混合其他高分子。需強調的是油相殼110中不含有任何的界面活性劑。
上述之聚乙烯醇或架橋聚乙烯醇本身可讓自 己的親水官能基旋轉，讓其朝向水相核125內以及油相殼110外的水溶液，所以能在沒有任何界面活性劑的情況下，同時穩定兩個油水界面，形成雙乳化核殼奈米結構100。
上述之架橋基130例如可為羧基(-COOH)、硫 醇基(-SH)、醛基、胺基或羥基。舉例來說，當高分子115含有架橋聚乙烯醇時，架橋聚乙烯醇可為羧甲基化聚乙烯醇(carboxymethylated polyvinyl alcohol；CMPVA)、硫醇化聚乙烯醇(thiolated polyvinyl alcohol；TPVA)或聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物，而不需要混合其他高分子。
當高分子115含有分子量16,000-61,000的聚 乙烯醇時，架橋高分子可以選用聚丙烯酸(polyacrylic acid；PAA)、聚甲基丙烯酸(polymethacrylic acid；PMAA)、羧甲基化聚乙烯醇、硫醇化聚乙烯醇、硫醇化聚甲基丙烯酸(thiolated polymethacrylic acid；TPMAA)或聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物。讓聚乙烯醇與架橋高分子混合後，形成油相殼110內之高分子115。
上述之聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、羧甲基化聚 乙烯醇、硫醇化聚甲基丙烯酸與硫醇化聚乙烯醇的化學結構式列在下面之表一中。
上述之抗體135可為任何所需之抗體，其選擇 視其欲結合的抗原而定。例如，抗體135可為抗乳癌(breast cancer)的抗體Trastuzumab(商品名為Herclon或Herceptin)，其所辨識的抗原為由致癌基因HER2所表現的HER2接受器。其他用來治療癌症的抗體例子還有抗大腸癌(colorectal cancer )的抗體Cetuximab、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor )的抗體Panitumumab或抑制血管新生(angiogenesis inhibitor)的抗體Bevacizumab等。
上述之疏水性磁奈米粒子120的材料例如可為 表面有疏水性官能基修飾之Fe2 O3 、Fe3 O4 、CoFe2 O4 或MnFe2 O4 奈米粒子，上述之疏水性官能基例如可為長鏈烷基或長鏈烯基，例如可為油酸或油胺之類的分子。
疏水性磁奈米粒子120具有穩定油相殼110結 構的功能，使其不易坍塌。此外，除了可作為核磁共振顯影(magnetic resonance imaging；MRI)的顯影劑之外，還可在外加交流磁場(alternative magnetic field；AMF)下，利用磁流體過熱(magnetic fluid hyperthermia；MFH)現象來進行局部加熱，破壞油相殼110的結構。
由於架接抗體之雙乳化核殼奈米結構100具有 油相殼110與水相核125的結構，兩者可以用來分別容納疏水性藥物與親水性藥物。因此，上述雙乳化核殼奈米結構100可應用來做為疏水性藥物、親水性藥物或其任意組合的載體，並利用控制外加交流磁場的強度與開關來控制活性藥物的釋放速率。
請參考第1B圖，其係繪示利用雙乳化核殼奈 米結構來同時做為親水性藥物以及疏水性藥物載體的剖面結構示意圖。在第1B圖中，親水性藥物145容納在雙乳化核殼奈米結構100的水相核125中，疏水性藥物140容納在雙乳化核殼奈米結構100的油相殼110中。舉例來說，親水性藥物145例如可為小紅莓(Doxorubicinl；DOXO)或順鉑(cisplatin)，疏水性藥物140例如可為紫杉醇(Paclitaxel；PTX)、歐洲紫杉醇(Docetaxel)、喜樹鹼(Camptothecin；CPT)或薑黃素(Cururmine)。
表面架接雙乳化核殼奈米結構的製備方法
表面架接有抗體之雙乳化核殼奈米結構的製 備方法，是先以雙乳化法來製備表面有架橋基的雙乳化核殼奈米結構。之後，再與抗體反應，形成表面架接有抗體之雙乳化核殼奈米結構。
第2A圖係繪示以單乳化法製備表面有架橋基 之雙乳化核殼奈米結構的流程示意圖。在第2A圖中，先分別製備含有架橋聚乙烯醇的水溶液(步驟202a)與含有疏水 性磁奈米粒子的有機溶液(步驟202b)。然後，取多量的水溶液與少量的有機溶液，將兩者混合攪拌後(步驟212)，形成含有雙乳化核殼奈米結構的乳液(步驟222)。接著，去除乳液中的有機溶劑(步驟230)，得到雙乳化核殼奈米結構(步驟235)。
在上述步驟202a之水溶液中，可選擇再添加至 少一種的親水性藥物。在上述步驟202b之有機溶液中，可選擇再添加至少一種的疏水性藥物。
當有機溶液只含有疏水性磁奈米粒子時，其所 用之有機溶劑較佳為符合下述特性者：可有效地溶解或分散疏水性磁奈米粒子、與水不互溶及沸點較低。當有機溶液也含有疏水性藥物時，除了上述特性外，所用有機溶劑較佳為還可同時有效地溶解或分散疏水性藥物。
上述選用沸點較低的有機溶劑之因為可在不 需加熱的情況下，輕易地去除有機溶劑，以免對雙乳化核殼奈米結構的外形造成不可控制之不良影響。例如可選擇沸點在90℃以下的有機溶劑，如三氯甲烷、二氯甲烷、三氯乙烷或乙腈。
在上述步驟212中，混合攪拌方法例如可為超 音波震盪法。在上述之步驟230中，去除有機溶劑的方法，例如可為室溫揮發法或減壓蒸餾法。
第2B圖係繪示以雙乳化法製備表面有架橋基 之雙乳化核殼奈米結構的流程示意圖。在第2A圖中，先分別製備含有聚乙烯醇的第一水溶液(步驟205a)與含有疏水 性磁奈米粒子的有機溶液(步驟205b)。取少量的第一水溶液與多量的有機溶液，讓兩者進行第一混合攪拌後(步驟210)，形成油包水的乳液(步驟215a)。此為第一階段的乳化步驟。
在上述步驟205a之第一水溶液中，可選擇再添 加至少一種的親水性藥物。在上述步驟205b之有機溶液中，可選擇再添加至少一種的疏水性藥物。有機溶液的選擇方法如同第2A圖中步驟202b中所述，因此不再贅述之。
接著，製備含有架橋高分子的第二水溶液(步驟 215b)。讓油包水乳液與第二水溶液進行第二混合攪拌步驟後(步驟220)，形成含有表面有架橋基之雙乳化核殼奈米結構的水包油乳液(步驟225)。此為第二階段的乳化步驟。
上述步驟210的第一混合攪拌方法與步驟220 的第二混合攪拌方法，例如可為超音波震盪法。在上述之步驟230中，去除有機溶劑的方法，例如可為室溫揮發法或減壓蒸餾法。
第2C圖係繪示表面有架橋基的雙乳化核殼奈 米結構與抗體反應的流程示意圖。在第2C圖中，先製備表面有架橋基的雙乳化核殼奈米結構的分散液(步驟240a)。接著，製備與耦合劑相接之抗體的分散液(步驟240b)，抗體通常是利用其自由一級胺基與耦合劑相接。
上述與抗體相接的耦合劑例如可為列在下面 表二中之各種耦合劑，其選擇視上述之架橋基為何來決定，以利於讓耦合劑與架橋基形成化學鍵結。例如當架橋 基為硫醇基時，耦合劑可以選用下面表二中之SMCC或SPDP。而當架橋基為羧基時，耦合劑可以選用下面表二中之EDC與Sulfo-NHS來一起做為耦合劑。
在上述步驟240a中製備表面有架橋基的雙乳化核殼奈米結構的分散液與步驟240b中製備與耦合劑相接之抗體的分散液所用之溶劑，是以所選耦合劑來決定之。例如，若選用SMCC為耦合劑，則可選用3mL的PBS緩衝液做為分散液的溶劑，其含有0.1M的磷酸鈉與0.15M的NaCl，pH值為7.4。若選用EDC與Sulfo-NHS為耦合劑時，則可選用MES緩衝液做為分散液的溶劑，其含有0.1M的2-[嗎嚇代]乙磺酸[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid；MES]以及0.5M NaCl，pH值為6.0。
然後讓上述兩種分散液混合後，一起反應(步驟245)，製備出架接抗體的雙乳化核殼奈米結構。接著，以離心方法移除未鍵結之自由抗體分子(步驟250)，得到架接抗體的雙乳化核殼奈米結構(步驟255)。
在下面的實施例中，為了簡化文字敘述起見，將「雙乳化核殼奈米結構」簡稱為「載體」。
實施例一：製備包覆有油酸的Fe 3 O 4 奈米微粒
在此實施例中，製備粒徑為約5nm之包覆有油酸(Oleic acid)的Fe3 O4 奈米微粒(以下簡稱為IO-OA奈米微粒)，其例示之製備方法簡述如下。此外，製備方法的參考文獻為Sun,S.H.；Zeng,H.；Robinson,D.B.；Raoux,S.；Rice,P.M.；Wang,S.X.；Li,G.X.Journal of the American Chemical Society,2004,126(1),273-279。
於三頸瓶中加入0.708克Fe(acac)3 、2.58克之 1,2-十六烷二醇(1,2-Hexadecanediol)、0.565克油酸、0.535克油胺(Oleylamine)、20mL芐醚(Benzyl Ether)。讓上述混合物在冷卻水迴流及氮氣環境下經過三步驟加熱(第一段為100℃，持溫30分鐘；第二段為200℃，持溫60分鐘；第三段為285℃，持溫30分鐘後，冷卻至室溫)，形成IO-OA奈米微粒。接著，讓IO-OA奈米微粒分散在乙醇中，再以6000rpm離心，去除上面的溶液，重複數次後，讓IO-OA奈米微粒保存於乙醇中。
實施例二：製備硫醇化聚甲基丙烯酸
在此實施例中，製備硫醇化聚甲基丙烯酸 (thiolated polymethacrylic acid；TPMAA)，其例示之製備方法簡述如下，並亦請同時參考下面的合成方案一。
取250mg的30wt%的PMAA水溶液，依序 加入5mL之pH 8的PBS緩衝液、75mg之催化劑EDC與40mg之催化劑Sulfo-NHS。混合攪拌15分鐘後，加入5毫克之半胱胺(Cysteamine)，並混合攪拌至隔日，讓半胱胺的一級胺基與PMAA的羧基反應形成醯胺鍵結，得到TPMAA的產物。接著，利用透析法去除催化劑EDC和Sulfo-NHS後，利用冷凍乾燥設備去除水分，得到TPMAA的結晶。
實施例三：製備聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物
在此實施例中，製備聚乙烯醇(PVA)-硫醇化聚甲基丙烯酸(TPMAA)的共聚物，其例示的製備方法簡述如下。
將上述所得之TPMAA與PVA混合，加入濃硫酸，反應成PVA-TPMAA共聚物以及副產物水。接著，以飽和碳酸鈉溶液分離PVA-TPMAA共聚物以及反應物TPMAA和PVA，得到PVA-TPMAA共聚物的產物。
實施例四：製備硫醇化聚乙烯醇
在此實施例中，製備硫醇化聚乙烯醇(thiolated polyvinyl alcohol；TPVA)，其例示製備方法簡述如下，並亦請同時參考下面的合成方案二。製備方法的參考文獻為 Gupta B,Anjum S and Ikram S.Preparation of thiolated polyvinyl alcohol hydrogels.Journal of Applied Polymer Science. 2013；129 ：815-21。
讓PVA溶解於去離子水中，形成2wt%的PVA 水溶液。將20-99%(v/v)的乙硫醇酸水溶液和0.1-1wt%的硫酸水溶液緩慢的倒入PVA水溶液中，在油浴環境下加熱，以進行酯化反應。接著，再將甲醇緩緩倒入上述PVA酯化反應的溶液中，使其產生沉澱。收集此沉澱產物並重複以甲醇純化數次，得到粉體。然後，讓粉體進行冷凍乾燥，得到白色結晶粉體TPVA。
實施例六：製備羧甲基化聚乙烯醇
在此實施例中，製備羧甲基化聚乙烯醇 (carboxymethylated polyvinyl alcohol；CMPVA)，其例示製備方法簡述如下，並亦請同時參考下面的合成方案三。製備方法的參考文獻為Yu C.and Li B.Preparation and characterization of carboxymethyl polyvinyl alcohol-graphite nanosheet composites.Polymer Composites. 2008；29 ：998-1005。
首先，將PVA配製成2wt%的水溶液後，加入 氫氧化鈉來活化PVA的醇基。再將氯乙酸(ClCH2 COOH)溶於乙醇後，以氫氧化鈉中和，形成氯乙酸鈉(ClCH2 COONa)的乙醇溶液。讓上述二溶液混合反應形成CMPVA，五小時後，添加適量鹽酸以調整酸鹼值至pH為6。接著，加入過量酒精使CMPVA析出，並重複以酒精純化產物數次。
實施例七：含PVA/TPMAA混合物之架接抗體的雙乳化核殼奈米結構(載體)
在此實施例中，利用第2B圖之雙乳化法製備 含有PVA/TPMAA混合物之架接抗體的載體，藥物分子則以親水性之小紅莓(Doxorubicin；Dox)與順鉑(Cisplatin)以及疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)與喜樹鹼(Camptothecin；CPT)為例，兩者皆為常見的癌症化療藥物。然後再以第2C圖之方法，在含有PVA/TPMAA混合物的載體殼層表面架接上抗體。
先分別配製親水性藥物/PVA水溶液、IO-OA奈 米微粒/疏水性藥物的CHCl3 溶液以及PVA/TPMAA水溶液。在親水性藥物/PVA水溶液中，PVA的濃度為20mg/mL，親水性藥物(小紅莓或順鉑)的濃度為8mg/mL。在IO-OA奈米微粒/疏水性藥物的CHCl3 溶液中，IO-OA奈米微粒的濃度為20mg/mL，當疏水性藥物為紫杉醇時，紫杉醇濃度為30mg/mL，當疏水性藥物為喜樹鹼時，喜樹鹼濃度為5mg/mL。在PVA/TPMAA水溶液中，PVA的濃度為20mg/mL，TPMAA的濃度為2mg/mL。上述之PVA的平均分子量分別為16,000、25,000、31,000及47,000。
取0.2mL之DOXO/PVA水溶液與0.5mL之 IO-OA奈米微粒/PTX氯彷溶液，讓兩者混合，利用20kHz超音波震盪器讓混合液乳化。當乳化完成，再加入1.5mL之PVA/TPMAA的水溶液，再次以超音波震盪器乳化，得到含PVA/TPMAA混合物之載體。最後置於開放空間中，等待CHCl3 揮發完全。CHCl3 揮發時的溫度高低會影響載體的形貌。再讓含PVA/TPMAA混合物之載體分散於3mL的PBS 緩衝液(含0.1M磷酸鈉與0.15M的NaCl)中。
當以上述做法只包覆單一藥物時，上述四種測 試藥物的包覆率及載體大小如下面表三所示。由下面表三可知，疏水性藥物的包覆率通常大於親水性藥物的包覆率，因此包覆疏水性藥物的載體尺寸也通常較大。此外，以目前的實驗數據看來，親水性藥物的包覆率在75%以上，顯示以雙乳化法來合成包覆藥物的載體之包覆效率相當好。
取1毫克乳癌抗體Trastuzumab與4.8毫克之 耦合劑SMCC分別各自溶於2mL與5mL的PBS緩衝液(含0.1M磷酸鈉與0.15M的NaCl)中，然後讓兩者混合，於4℃下反應2小時，得到架接有SMCC之乳癌抗體Trastuzumab。利用透析離心管於8000rpm下，去除未反應之耦合劑SMCC，並將架接有SMCC之乳癌抗體Trastuzumab重新分散於1mL之PBS緩衝液(含0.1M磷酸 鈉與0.15M的NaCl)中。
混合含有上述之載體與架接有SMCC之乳癌抗 體Trastuzumab的PBS分散液，於4℃下反應2小時。再離心，以去除未反應之乳癌抗體Trastuzumab分子，並將產物重新分散於4mL之二次水中。
上述之耦合劑SMCC成為TPMAA的-SH架橋 基以及乳癌抗體Trastuzumab上的-NH2 官能基的架接橋樑，讓乳癌抗體Trastuzumab透過SMCC與TPMAA的-SH架橋基鍵結，接在載體殼層的外側。
第3圖顯示使用不同分子量PVA所合成出之空 載體的掃描式電子顯微鏡(SEM)圖。在第3圖中，含有分子量為16k、25k、31k及47k之PVA的空載體(即不含DOXO與PTX)的平均直徑分別為140、130、130、125nm。顯示PVA的分子量越大，架接乳癌抗體的載體之平均直徑有減少的趨勢。
第4A-4B圖分別為架接乳癌抗體前與架接乳癌 抗體後的載體之掃描式電子顯微鏡(SEM)影像，其中所用之PVA的分子量為16k。第4A圖顯示混合TPMAA與PVA後合成的載體在經由去離子水清洗並重新分散後，利用真空乾燥後所攝得之影像仍維持中空的球體結構。第4B圖顯示同一批載體在架接乳癌抗體後的形貌因為經歷了表面改質，因此型態有些轉變。
實施例八：溶液酸鹼值對含PVA/TPMAA混合物之架接抗 體的雙乳化核殼奈米結構(載體)釋放藥物的影響
在此實施例中，測試溶液酸鹼值對架接抗體之 載體釋放藥物的影響。在此所用載體之殼層為分子量16k之PVA與TPMAA之混合物，其中TPMAA在製備時的添加量最多為1wt%。
TPMAA是將高分子PMAA修飾後帶有硫醇官 能機之高分子，而PMAA為一種酸鹼敏感性的高分子，其支鏈上的羧基和烷基為PMAA在不同酸鹼環境下展現不同外型的主要因素。當其在中性環境下時，高分子鏈呈現舒展的結構；然而，當環境轉變為酸性時，PMAA將會轉變成扎實的疏水蜷曲結構。利用這種特性，將PMAA上的羧基部分取代為硫醇鍵，希望修飾成為TPMAA仍保有酸鹼敏感性的特質，且同時可以利用改質後的硫醇鍵來架接具有標靶作用的乳癌抗體Trastuzumab分子。為了要探討這種酸鹼敏感性的特質，將合成後同時包覆有雙藥之載體分別置於中性pH 7以及酸性pH 4的環境之中，以觀察其藥物釋放的變化。
第5A圖為包覆紫杉醇(PTX)且於合成時添加不 等量之TPMAA的載體在pH 4下的釋放行為。第5B圖為包覆小紅莓(Dox)且於合成時添加不等量之TPMAA的載體在pH 4下的釋放行為。由第5A-5B圖可知，在pH 4的酸性環境中，當增加TPMAA在合成時的添加量時，小紅莓以及紫杉醇的釋放量將明顯的增加，顯示TPMAA在酸性環境下有 加速藥物自載體內向外釋放的的能力。
第5C圖為同時包覆親水性小紅莓與疏水性紫 衫醇雙藥並於pH 7以及pH 4下之載體的藥物釋放行為，製備載體時TPMAA的添加量為1wt%。由第5C圖可知，載體在pH 4酸性環境中之釋放藥物量遠大於在pH 7中性環境下的藥物釋放量。而在pH 4酸性環境中，油溶性之紫杉醇的釋放率比水溶性小紅莓的釋放率還大。
第6A圖與第6B圖為含PVA/TPMAA混合物 (TPMAA的添加量為1wt%)之架接抗體載體分別在pH 7與pH 4下的穿透電子顯微鏡(TEM)影像。第6A圖顯示，在中性環境下的載體，球狀的殼層結構相當明顯。第6B圖顯示，在酸性環境下的載體，殼層遭受擠壓而變形。
這樣的藥物釋放特性，與上述TPMAA在酸性 環境下會收縮並轉變成疏水性之性質相符合。當遭遇到環境有大量的氫離子時，位在載體的殼層處之與PVA混合交纏並與PVA互相形成氫鍵的TPMAA將會開始收縮，使得載體變形而擠壓殼層。因此在酸性環境下，處於殼層處之油相藥物的釋放量會較水相藥物的釋放量多。
實施例九：架接乳癌抗體之雙乳化核殼奈米結構(載體)對HER2過度表現細胞的識別效果
在此實施例中，驗證架接乳癌抗體之載體對HER2過度表現的細胞是否具有標定的作用。在此所選用 HER2過度表現的細胞株為SKBR3。所用之載體之殼層為分子量16k之PVA與TPMAA之混合物，其中TPMAA的添加量為1wt%。
首先，讓含有親水性藥物小紅莓的載體分別架接乳癌抗體Trastuzumab與對SKBR3細胞株不具有專一性的IgG。接著，讓上述兩者與SKBR3細胞株共培養30分鐘。由於小紅莓具有螢光性質(激發光波長488nm，放光波長580nm)，所以可利用流式細胞儀(flow cytometer)來檢測經由抗體-抗原作用而貼附在細胞表面的螢光強度。
第7A圖顯示使用流式細胞儀檢測架接乳癌抗體Trastuzumab之載體(以符號T代表)與SKBR3細胞共培養後所測得之螢光量。第7B圖顯示使用流式細胞儀檢測架接IgG之載體(以符號IgG代表)與SKBR3細胞共培養後所測得之螢光量。上述兩圖之控制組為沒有架接任何抗體，但有包埋小紅莓的載體。流式細胞儀的光激發波段為480nm，放光偵測波段為580nm。
第7A圖顯示，當架接乳癌抗體之載體的添加量越多時，就有越多的細胞帶有越強的螢光，顯示架接有乳癌抗體Trastuzumab之載體對於SKBR3細胞株有明顯的標靶作用。但是，第7B圖顯示，不論架接IgG的載體的添加量為多少，帶有不同螢光強度的細胞數目皆差不多，顯示架接IgG的載體對於SKBR3細胞株沒有任何的標靶作用。
為了更加確定這個結果，讓架接乳癌抗體 Trastuzumab且包埋小紅莓的載體與架接IgG且包埋小紅莓的載體與SKBR3細胞共培養30分鐘後，以染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole；DAPI)將細胞核染色，在共軛聚焦顯微鏡下觀察具有螢光特性之小紅莓與細胞的位置分佈圖。此外，還加入單純的SKBR3細胞以及未被包埋的小紅莓，也以共軛聚焦顯微鏡來進行觀察。所得的結果顯示在第8圖上。
在第8圖中，每欄上方所標示之「細胞」、 「Dox」、「IgG-Dox」與「T-Dox」分別代表SKBR3細胞、未被包埋的小紅莓、架接IgG且包埋小紅莓的載體、架接乳癌抗體Trastuzumab且包埋小紅莓的載體等樣品。第一列與第二列右方標示之「細胞核」與「Dox」分別代表細胞核與小紅莓所在位置的影像圖，而第三列之「影像重疊」則代表將第一列與第二列的影像重疊後所得的影像圖。
第8圖的結果顯示，對SKBR3細胞具有專一性 標定功用的乳癌抗體Trastuzumab載體，其細胞核與小紅莓的影像有多個重疊處，顯示架接乳癌抗體Trastuzumab載體可以清楚地辨識出SKBR3細胞。但是，其他樣品幾乎只有細胞核的影像，而沒有小紅莓的影像與其重疊。這表示，其他樣品幾乎都沒有附著在SKBR3細胞表面，也就是無法辨識出SKBR3細胞。
實施例十：架接乳癌抗體之雙乳化核殼奈米結構(載體)對HER2過度表現細胞的毒殺效果
在此實施例中，將探討包覆藥物之架接乳癌抗 體的載體對於HER2過度表現細胞的毒殺效果。在此所用之載體之殼層為分子量16k之PVA與TPMAA之混合物，其中TPMAA的含量為1wt%。
因此，將上述載體分別以未經任何處理(控制 組)、包覆紫杉醇(PTX)、包覆小紅莓(Dox)、架接乳癌抗體Trastuzumab(T)、包覆紫杉醇後架接乳癌抗體Trastuzumab(T-PTX)、包覆雙重藥物(PTX-Dox)以及包覆雙重藥物後架接乳癌抗體Trastuzumab(T-PTX-Dox)各種不同方式處理後，加入至細胞培養液中，再加入至培養皿中，與培養皿內的SKBR3細胞株在37℃下，共培養24小時。接著，以MTT法檢測，以確定細胞毒殺效果。所得結果顯示在第9圖以及下面的表四中。
由上述結果可知，控制組的載體對於細胞的存 活率沒有太大的影響，代表其安全性足夠。但是，架接抗體後，存活率下降至75%左右。比較包覆小紅莓之架接乳癌抗體前後之兩者數據，其存活率亦從35%左右下降至29%左右，顯示架接抗體後，存活率下降至未接抗體前之82%。比較包覆紫衫醇之架接乳癌抗體前後之兩者數據，其存活率亦從56%左右下降至27%左右，顯示架接抗體後，存活率下降至未接抗體前之47.7%。再比較同時包覆小紅莓與紫衫醇之架接抗體前後的數據，可知架接抗體後之存活率為架接抗體前之存活率之59.1%。由這些比較可知，不論是何種形式的載體，在架接乳癌抗體Trastuzumab後，對於HER2過度表現之SKBR3細胞的毒殺效果，都有增強作用之功效。
實施例十：架接乳癌抗體之雙乳化核殼奈米結構(載體)之動物實驗
在此實施例中，使用患有腫瘤之裸鼠來進行架 接乳癌抗體之載體的動物實驗。在此所用載體之殼層為分子量16k之PVA與TPMAA之混合物，其中TPMAA的添加量為1wt%，且殼層表面架接有生物染劑Cyanine 5.5(縮寫為Cy5.5)。
首先，先觀測載體在生物體內的分佈情形。在 實驗過程中，以非侵入式活體影像系統(non invasion in vivo imaging system；IVIS)的探測器來觀測載體在裸鼠體內的分佈狀況。為了觀察外加磁場對帶有IO-OA奈米微粒之載體分布的影響，裸鼠左側的腫瘤黏貼磁力為3700G的磁鐵，右側腫瘤則沒有貼附任何磁鐵。注射載體後之第1天與第3天的觀測結果顯示在第10A-10B圖中。
在第10A圖第1天的影像中，可以觀察到裸鼠 左右兩側腫瘤110a、120a皆累積了大量的載體。但是到了第3天，由第10B圖的影像可知，裸鼠左側腫瘤110b之載體的累積量遠多於右側腫瘤120b之載體的累積量，約為兩倍左右。由此可看出外加磁場的確可以影響磁敏感載體在生物體內的分佈狀況。
接著，以裸鼠之異位腫瘤模型來檢驗各種載體 的治療效果。在實驗過程中，先分別在第1、5、9、13天 對患有腫瘤之裸鼠以靜脈注射方式注入各種欲測試之載體，進行治療。再以IVIS的探測器來觀測注射後之第1-30天的腫瘤尺寸。所得結果顯示在第11圖中。
在第11圖中之各實驗組，靜脈注射的內容物分 別有鹽水、沒有包埋藥物與架接抗體之載體(在圖中記做空載體)、包覆紫杉醇之載體(PTX)、包覆小紅莓之載體(Dox)、包覆紫杉醇後架接乳癌抗體之載體(T-PTX)、包覆小紅莓與紫杉醇後架接乳癌抗體之載體且沒有外加磁場(T-PTX-DOX No MT)、包覆小紅莓與紫杉醇後架接乳癌抗體之載體(T-PTX-DOX)。在上述各組實驗中，裸鼠的腫瘤處皆貼附有2000G的磁鐵，只有其中一組實驗(T-PTX-Dox No MT)之裸鼠在腫瘤處沒有貼附磁鐵。
由第11圖的結果可知，在裸鼠的腫瘤處貼附磁 鐵，且注射了包覆小紅莓與紫杉醇後架接乳癌抗體之載體(T-PTX-DOX)的實驗組，其治療效果最佳，到注射藥物後之第30天，腫瘤的尺寸才增長為原來的約1.96倍而已。但是，注射鹽水者的腫瘤，到了第30天，已經為原來的約17.6倍。
實施例十一：含PVA/PVA-TPMAA共聚物的混合物之架接抗體雙乳化核殼奈米結構(載體)
在此實施例中，利用第2B圖之雙乳化法製備含有PVA/PVA-TPMAA共聚物之混合物的雙乳化核殼奈米結構，藥物分子則以親水性之小紅莓(Dox)與疏水性紫杉醇 (PTX)為例，兩種皆為常見的癌症化療藥物。然後再以第2C圖之方法，在含有PVA/PVA-TPMAA共聚物的載體殼層表面架接上抗體。
含有PVA/PVA-TPMAA共聚物之混合物的載體 製備方法與實施例七的含有PVA/TPMAA混合物之載體的製備方法類似。唯一不同處為在要進行第二次乳化步驟時，將PVA/TPMAA水溶液替換成2wt%之PVA-TPMAA共聚物的水溶液。最後讓所得架接乳癌抗體Trastuzumab之含PVA/PVA-TPMAA共聚物之混合物的載體分散於二次水中。
首先，先探討PVA-TPMAA共聚物中TPMAA 含量對所得載體之抗體架接率、載體粒徑與藥物包覆率的影響。所得結果如下面表五所示。由表五數據可知，當TPMAA的含量越多時，抗體架接率就越高，因為抗體的架接需要TPMAA的硫醇基。而且，由於抗體的架接率越高，使得載體的粒徑也越大。至於疏水性紫衫醇與親水性小紅莓的包覆率，則與TPMAA含量多少的關係不大，顯示藥物包覆率不太會受到抗體架接的影響，可能是在進行抗體架接反應之前，藥物就已經包埋在載體內之故。
再來，探討在製備載體過程中，有機溶劑氯彷 的揮發溫度與揮發時間對載體粒徑以及藥物包覆率的影響。在此，PVA-TPMAA共聚物之PVA/TPMAA的莫耳數比例為6：1。所得結果列在下面的表六中。由表六的數據可知，在55℃以下，有機溶劑氯彷的揮發溫度與揮發時間對載體粒徑以及藥物包覆率的影響並不明顯。
接著，探討製備載體過程中，乳化時間對於所 得載體之粒徑以及藥物包覆率的影響。在此，PVA-TPMAA共聚物之PVA/TPMAA的莫耳數比例為6：1。所得結果列在下面的表七中。由表七的數據可知，第一次與第二次乳化時間的長短對載體粒徑以及藥物包覆率的影響並不明顯。
再來，探討PVA分子量以及PVA-TPMAA共聚 物中TPMAA含量對雙乳化法所得產物外型的影響。所得結果列在下面的表八中。由表八的數據可知，當PVA分子量由25,000增加至61,000時，隨著PVA-TPMAA共聚物中TPMAA的含量增加，具有核殼結構之載體粒徑也跟著增加。其中，使用分子量47,000之PVA來進行製備所得之產物，還約有半數具有核殼結構。到了使用分子量61,000之PVA來進行製備時，只剩下少數產物具有核殼結構。到了使用分子量78,000的PVA來進行合成時，就沒有觀察到任何具有核殼結構的產物了。顯示當PVA的分子量太大時，將不利於具有核殼結構的產物生成。
實施例十二：含PVA/TPVA混合物之架接抗體的雙乳化核殼奈米結構(載體)
在此實施例中，利用第2B圖之雙乳化法製備 含有PVA/TPVA之混合物的雙乳化核殼奈米結構，藥物分子則以親水性之小紅莓(Doxorubicin；Dox)與疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)為例，兩種皆為常見的癌症化療藥物。然後再以第2C圖之方法，在含有PVA/TPVA混合物的載體殼層表面架接上抗體。
含有PVA/TPVA混合物之載體製備方法與實施 例七的含有PVA/TPMAA混合物之載體的製備方法類似。唯一不同處為在要進行第二次乳化步驟時，將PVA/TPMAA水溶液替換成2wt%之TPVA的水溶液。最後讓所得架接乳癌抗體Trastuzumab之含PVA/TPVA混合物的載體分散於二次水中。
首先，先探討TPVA含量對所得載體之抗體架 接率、載體粒徑與藥物包覆率的影響。所得結果如下面表九所示。由表九數據可知，當TPVA的含量越多時，抗體架接率就越高，因為抗體的架接需要TPVA的硫醇基。而且，由於抗體的架接率越高，使得載體的粒徑也越大。至於疏水性紫衫醇與親水性小紅莓的包覆率，則與TPVA含量多少的關係不大，顯示藥物包覆率不太會受到抗體架接的影響，可能是在進行抗體架接反應之前，藥物就已經包埋在載體內之故。
接著，探討製備載體過程中，乳化時間對於所 得載體之粒徑以及藥物包覆率的影響。在此，TPVA的含量為30mol%，在此所用之PVA的分子量為16,000。所得結果列在下面的表十中。由表十的數據可知，第一次與第二次乳化時間的長短對載體粒徑以及藥物包覆率的影響並不明顯。
再來，探討PVA分子量以及TPVA含量對雙乳 化法所得產物外型的影響。所得結果列在下面的表十一中。由表十一的數據可知，當PVA分子量由25,000增加至61,000時，隨著TPVA含量增加，具有核殼結構之載體粒徑也跟著增加。其中，使用分子量47,000之PVA來進行製備所得之產物，還約有半數具有核殼結構。到了使用分子量61,000之PVA來進行製備時，只剩下少數產物具有核殼結構，而且還摻雜粒徑較小之實心球體的產物。到了使用分子量78,000的PVA來進行合成時，就沒有觀察到任何具有核殼結構的產物了。顯示當PVA的分子量太大時，將不利於具有核殼結構的產物生成。
實施例十三：含PVA/PAA混合物之架接抗體的雙乳化核殼 奈米結構(載體)
在此實施例中，利用第2B圖之雙乳化法製備 含有PVA/PAA混合物的載體，藥物分子則以親水性之小紅莓(Doxorubicin；Dox)與疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)為例，兩種皆為常見的癌症化療藥物。然後再以第2C圖之方法，在含有PVA/PAA混合物的載體殼層表面架接上抗體。
含有PVA/PAA混合物之載體製備方法與實施 例七的含有PVA/TPMAA混合物之載體的製備方法類似。第一個不同處為在要進行第二次乳化步驟時，將PVA/TPMAA混合物的水溶液替換成PVA/PAA混合物的水溶液。在PVA/PAA混合物的水溶液中，PVA的濃度為20mg/mL，而PAA的濃度為2mg/mL。第二個不同處為乳癌抗體Trastuzumab所使用之耦合劑從SMCC替換成EDC/sulfo-NHS，以連接PAA的羧基與乳癌抗體Trastuzumab上的-NH2 基。在此所用之PVA的分子量為16,000。
在讓乳癌抗體Trastuzumab與耦合劑反應過程 中，先配製0.1M之MES緩衝液，其含有0.1M的MES與0.5M的NaCl，pH值為6.0。然後在3mL之MES緩衝液中，依序添加載體、50μg之EDC和60μg之Sulfo-NHS，於室溫下混合攪拌讓其反應15分鐘。接著，加入1μL的2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)至上述之MES緩衝液中，中止EDC的活化反應。然後，再加入高濃度的PBS，將前述 MES緩衝液的酸鹼值調整至大於7後，加入500μg之乳癌抗體Trastuzumab。在室溫下反應兩小時，完成架接反應，讓乳癌抗體Trastuzumab架接至載體上。
讓所得之架接有乳癌抗體Trastuzumab的載體，加入二次水，再以7000rpm離心後，移除未反應的試劑。重複上述步驟數次後，讓所得之架接有乳癌抗體Trastuzumab的載體再分散於溶劑中，例如食鹽水。
第12圖為含有PVA/PAA混合物並以EDC/Sulfo-NHS架接乳癌抗體Trastuzumab後之載體結構之外觀SEM影像。從第12圖可知，架接了乳癌抗體Trastuzumab的載體外型會由一般常見的球體轉變為不規則的形狀，推測其因是抗體鍵結於載體的表面，使得載體不再是球體形狀。但是，仍可藉由其邊界之黑白對比看出其仍具有中空的結構。而且所得架接乳癌抗體之含有PVA/PAA混合物載體可均勻地分散在溶液中而沒有沉澱。因此，架接乳癌抗體之含有PVA/PAA混合物載體基本上與實驗例七架接乳癌抗體之含PVA/TPMAA混合物載體類似。
實施例十四：含PVA/PMAA混合物之架接抗體的雙乳化核殼奈米結構(載體)
在此實施例中，利用第2B圖之雙乳化法製備含有PVA/PMAA之混合物的載體，藥物分子則以親水性之小紅莓(Doxorubicin；Dox)與疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX) 為例，兩種皆為常見的癌症化療藥物。然後再以第2C圖之方法，在含有PVA/PMAA混合物的載體表面架接上抗體。
含有PVA/PMAA混合物之載體製備方法與實施例十三的含有PVA/PAA混合物之載體的製備方法類似。唯一不同處為在要進行第二次乳化步驟時，將PVA/PAA混合物的水溶液替換成PVA/PMAA混合物的水溶液。在此所用之PVA的分子量為16,000。
所得架接乳癌抗體之含有PVA/PMAA混合物載體，在SEM下外型也是由球體轉變成不規則形狀，但是仍然保有中空結構。此外，架接乳癌抗體之含有PVA/PMAA混合物載體也可均勻地分散在溶液中而沒有沉澱。因此，架接乳癌抗體之含有PVA/PMAA混合物載體與實驗例七架接乳癌抗體之含PVA/TPMAA混合物載體類似。
實施例十五：含PVA/CMPVA混合物之架接抗體的雙乳化核殼奈米結構(載體)
在此實施例中，利用第2B圖之雙乳化法製備含有PVA/CMPVA之混合物的載體，藥物分子則以親水性之小紅莓(Doxorubicin；Dox)與疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)為例，兩種皆為常見的癌症化療藥物。然後再以第2C圖之方法，在含有PVA/CMPVA混合物的載體表面架接上抗體。
含有PVA/CMPVA混合物之載體製備方法與實施例十三的含有PVA/PAA混合物之載體的製備方法類似。 唯一不同處為在要進行第二次乳化步驟時，將PVA/PAA混合物的水溶液替換成PVA/CMPVA混合物的水溶液。在此所用之PVA的分子量為16,000。
首先，先探討CMPVA含量對所得載體之抗體架接率、載體粒徑與藥物包覆率的影響。所得結果如下面表十二所示。由表十二數據可知，當CMPVA的含量越多時，抗體架接率就越高，因為抗體的架接需要CMPVA的羧基。而且，由於抗體的架接率越高，使得載體的粒徑也越大。
至於疏水性紫衫醇與親水性小紅莓的包覆率，則與CMPVA含量多少的關係不大，顯示藥物包覆率不太會受到抗體架接的影響，可能是在進行抗體架接反應之前，藥物就已經包埋在載體內之故。但是，與含PVA/TPVA混合物的載體相比(請同時參考表八與表十二)，由於CMPVA之羧基易解離出質子而帶有負電荷，因此使得帶正電荷之小紅莓包覆率提升了5-10%。
接著，探討製備載體過程中，乳化時間對於所 得載體之粒徑以及藥物包覆率的影響。在此，TPVA的含量為30mol%，在此所用之PVA的分子量為16,000，CMPVA含量為50mol%。所得結果列在下面的表十三中。由表十三的數據可知，第一次與第二次乳化時間的長短對載體粒徑以及藥物包覆率的影響並不明顯。
再來，探討PVA分子量以及CMPVA含量對雙 乳化法所得產物外型的影響。所得結果列在下面的表十四中。由表十四的數據可知，當PVA分子量由25,000增加至 61,000時，隨著CMPVA含量增加，具有核殼結構之載體粒徑也跟著增加。其中，使用分子量61,000之PVA來進行製備時，只剩下少數產物具有核殼結構。到了使用分子量78,000的PVA來進行合成時，就沒有觀察到任何具有核殼結構的產物了。顯示當PVA的分子量太大時，將不利於具有核殼結構的產物生成。
實施例十六：含PVA-TPMAA共聚物之架接抗體的雙乳化核殼奈米結構(載體)
在此實施例中，以第2A圖之單乳化法製備含 有PVA-TPMAA共聚物的載體，藥物分子則以親水性之小紅莓(Doxorubicin；Dox)與疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)為例，兩種皆為常見的癌症化療藥物。然後再以第2C圖之方法，在含有PVA-TPMAA共聚物的載體架接上抗體。
先分別配製PVA-TPMAA共聚物/Dox水溶液與 IO-OA奈米粒子/PTX的CHCl3 有機溶液。在PVA-TPMAA共聚物/Dox水溶液中，PVA-TPMAA共聚物的濃度為20mg/mL，Dox的濃度為8mg/mL。在IO-OA奈米粒子/PTX的CHCl3 有機溶液中，IO-OA奈米粒子的濃度為20mg/mL，PTX的濃度為30mg/mL。
取2.5mL之PVA-TPMAA共聚物/Dox水溶液與 1mL之IO-OA奈米微粒/PTX的CHCl3 有機溶液，讓兩者混合。利用20kHz超音波震盪器讓混合液乳化，而後置於開放空間中，等待CHCl3 揮發完全。CHCl3 揮發時的溫度高低會影響載體的形貌。再讓含PVA-TPMAA共聚物之載體於離心後重新分散於3mL的PBS緩衝液(含0.1M磷酸鈉與0.15M的NaCl)中。
接著，以實施例七中之架接乳癌抗體的方法， 讓抗乳癌體Trastuzumab架接至含PVA-TPMAA共聚物之載體的表面上。
接著，探討在含PVA-TPMAA共聚物之載體 中，TPMAA含量對所得載體之抗體架接率、載體粒徑與藥物包覆率的影響，所得結果如下面表十五所示。由表十五的數據可知，當共聚物中TPMAA的含量越多時，抗體架接率會因為架接所需硫醇基之增加而跟著增加。另外，載體的粒徑也因為分子量較大的TPMAA之量的提升和抗體的架接率越高，使得載體的粒徑也越大。至於疏水性紫衫醇與親水性小紅莓的包覆率，則與TPMAA含量多少的關係不大，顯示藥物包覆率不太會受到抗體架接的影響。這可能是在進行抗體架接反應之前，藥物就已經包埋在載體內之故。
實施例十七：含TPVA之架接抗體的雙乳化核殼奈米結構(載體)
在此實施例中，以第2A圖之單乳化法製備含有TPVA的載體，藥物分子則以親水性之小紅莓(Doxorubicin；Dox)與疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)為例，兩種皆為常見的癌症化療藥物。然後再以第2C圖之方法，在含有TPVA的載體殼層表面架接上抗體。
架接抗體的含有TPVA載體的製備方法與實施例十六之含有PVA-TPMAA共聚物載體的方法類似，唯一不同處為PVA-TPMAA共聚物/Dox水溶液換成TPVA/Dox水溶液。在TPVA/Dox水溶液中，TPVA的濃度為20mg/mL，Dox的濃度為8mg/mL。
第13A-13C圖分別為分子量25,000、47,000與78,000之含有TPVA載體外觀的SEM影像。由第13A-13C圖可知，隨著分子量的提升，載體團聚的情況逐漸明顯。其可能因為TPVA分子量增加，使得載體的疏水性上升之故。尤其當分子量來到78k時，TPVA分子量已經過高，因而無法形成空心的載體。
接著，探討在含TPVA之載體中，TPVA含量對所得載體之抗體架接率、載體粒徑與藥物包覆率的影響。以分子量16,000之PVA改質而得的為例，所得結果如下面表十六所示。由表十六的數據可知，當PVA的改質比 例越高時，抗體架接率會因為架接所需硫醇基之增加而跟著增加。另外，載體的粒徑也因為抗體的架接率越高，使得載體的粒徑也越大。至於疏水性紫衫醇與親水性小紅莓的包覆率，則與TPVA含量多少的關係不大，顯示藥物包覆率不太會受到抗體架接的影響。這可能是在進行抗體架接反應之前，藥物就已經包埋在載體內之故。
實施例十八：含CMPVA之架接抗體的雙乳化核殼奈米結構(載體)
在此實施例中，以第2A圖之單乳化法製備含有CMPVA的載體，藥物分子則以親水性之小紅莓(Doxorubicin；Dox)與疏水性紫杉醇(Paclitaxel；PTX)為例，兩種皆為常見的癌症化療藥物。然後再以第2C圖之方法，在含有TPVA的載體架接上抗體。
前半段含有TPVA載體的製備方法與實施例十 六之含有PVA-TPMAA共聚物載體的方法類似，唯一不同處為PVA-TPMAA共聚物/Dox水溶液換成CMPVA/Dox水溶液。在CMPVA/Dox水溶液中，CMPVA的濃度為20mg/mL，Dox的濃度為8mg/mL。後半段架接抗體的部分，則與實施例十三之含有PVA/PAA混合物的載體類似，選擇EDC/sulfo-NHS為耦合劑，以連接CMPVA的羧基與乳癌抗體Trastuzumab上的-NH2 基。
接著，探討在含CMPVA之載體中，CMPVA含 量對所得載體之抗體架接率、載體粒徑與藥物包覆率的影響。以分子量16,000之PVA改質而得的為例，所得結果如下面表十七所示。由表十七的數據可知，當PVA的改質比例越高時，抗體架接率會因為架接所需羧基之增加而跟著增加。另外，載體的粒徑也因為抗體的架接率越高，使得載體的粒徑也越大。
至於疏水性紫衫醇與親水性小紅莓的包覆 率，則與CMPVA含量多少的關係不大，顯示藥物包覆率不太會受到抗體架接的影響。這可能是在進行抗體架接反應之前，藥物就已經包埋在載體內之故。但是，與實施例十五之架接抗體的含PVA/CMPVA混合物的載體相比，由於單乳化法只使用單一CMPVA，因此在載體的內外表面上都會分佈有羧基。又，由於羧基容易解離出質子而帶負電，因此可增加水相核內的小紅莓包覆量，使小紅莓的包覆率提升了1-5%。
由上述可知，可以使用單乳化法直接讓架橋聚 乙烯醇形成雙乳化核殼奈米結構，讓所得之雙乳化核殼奈米結構的殼層內外表面展現架橋基。也可以使用雙乳化法在原先的水溶性高分子中摻入架橋高分子，在所得之雙乳化核殼奈米結構的殼層外表面展現架橋基。再利用此架橋基與所需之抗體結合，則可讓抗體架接在雙乳化核殼奈米結構的殼層外表面。因此，包覆藥物與疏水性磁奈米粒子的雙乳化核殼奈米結構不但可以辨識特定細胞，進行標靶治療，而且還可以進一步利用外加磁場來增加治療標靶處之藥物累積量與其治療效果。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非 用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之 保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
100‧‧‧雙乳化核殼奈米結構
110‧‧‧油相殼
115‧‧‧高分子
120‧‧‧疏水性磁奈米粒子
125‧‧‧水相核
130‧‧‧架橋基
135‧‧‧抗體
140‧‧‧疏水性藥物
145‧‧‧親水性藥物

Claims (12)

  1. 一種架接抗體之雙乳化核殼奈米結構，其包括：一水相核；一油相殼，其包圍該水相核，該油相殼的組成包含聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物或是聚乙烯醇與一架橋高分子的組合與複數個疏水性磁奈米粒子，但不包含界面活性劑，其中該架橋高分子為聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、羧甲基化聚乙烯醇、硫醇化聚乙烯醇、硫醇化聚甲基丙烯酸或聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物，且該聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物與該架橋高分子具有一架橋基；以及至少一抗體，其藉由一耦合劑鍵結於該架橋基上。
  2. 如請求項1所述之雙乳化核殼奈米結構，其中該架橋基包括羧基、硫醇基、醛基、胺基或羥基。
  3. 如請求項1所述之雙乳化核殼奈米結構，其中該些疏水性磁奈米粒子為表面有疏水性官能基修飾之Fe2 O3 、Fe3 O4 、CoFe2 O4 或MnFe2 O4 微粒。
  4. 如請求項1所述之雙乳化核殼奈米結構，其中該抗體包括乳癌抗體Trastuzumab、大腸癌抗體Cetuximab、表皮生長因子受體的抗體Panitumumab或抑制血管新生的抗 體Bevacizumab。
  5. 如請求項1所述之雙乳化核殼奈米結構，其中該油相殼包含一疏水性藥物。
  6. 如請求項1所述之雙乳化核殼奈米結構，其中該水相核包含一親水性藥物。
  7. 一種製備如請求項1-4任一項所述之雙乳化核殼奈米結構的方法，包括：製備一水溶液，其包括聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物；製備一有機溶液，其包括疏水性磁奈米粒子；混合攪拌該水溶液與該有機溶液，以形成一乳液，並於該乳液中形成複數個雙乳化核殼奈米結構；去除該有機溶液所用的有機溶劑，以得到該些雙乳化核殼奈米結構；製備一第一分散液，其包括該些雙乳化核殼奈米結構；製備一第二分散液，其包括與耦合劑相接的抗體；以及混合攪拌該第一分散液與該第二分散液，讓該聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物之架橋基架接上與該耦合劑相接的該抗體。
  8. 如請求項7所述之製備雙乳化核殼奈米結構的方法，其中於製備該水溶液時，包括加入一親水性藥物。
  9. 如請求項7所述之製備雙乳化核殼奈米結構的方法，其中於製備該有機溶液時，包括加入一疏水性藥物。
  10. 一種製備如請求項1-4任一項所述之雙乳化核殼奈米結構的方法，包括：製備一第一水溶液，其包括聚乙烯醇；製備一有機溶液，其包括疏水性磁奈米粒子；混合攪拌該第一水溶液與該有機溶液，以形成一油包水乳液；製備一第二水溶液，其包括架橋高分子，其中該架橋高分子為聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、羧甲基化聚乙烯醇、硫醇化聚乙烯醇、硫醇化聚甲基丙烯酸或聚乙烯醇-硫醇化聚甲基丙烯酸共聚物；混合攪拌該油包水乳液與該第二水溶液，以形成一水包油乳液，並於該水包油乳液中形成複數個雙乳化核殼奈米結構；去除該有機溶液所用的有機溶劑，以得到該些雙乳化核殼奈米結構；製備一第一分散液，其包括該些雙乳化核殼奈米結構；製備一第二分散液，其包括與耦合劑相接的抗體；以及 混合攪拌該第一分散液與該第二分散液，讓該架橋高分子之架橋基架接上與該耦合劑相接的該抗體。
  11. 如請求項10所述之製備雙乳化核殼奈米結構的方法，其中於製備該第一水溶液時，包括加入一親水性藥物。
  12. 如請求項10所述之製備雙乳化核殼奈米結構的方法，其中於製備該有機溶液時，包括加入一疏水性藥物。
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