TWI472298B - 促進鈣吸收的胜肽產物及其製造方法 - Google Patents
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Description
本發明係有關於胜肽產物，且特別有關於可以促進鈣吸收的胜肽產物及其製造方法。
依據中華民國國民營養調查顯示，台灣地區男性平均鈣的攝取量為520 mg，女性則為542 mg，而13-19歲正在發育中的青少年的平均攝取量僅達建議量的51-56%而已，相較於美國RDA(1200 mg)或RDI(1300 mg)的標準來衡量，不到其建議攝取量的一半。而衛生署在2002年剛修訂的「國人膳食營養素參考攝取量」，從原本的成人每天600毫克，提高到800～1000毫克，青少年的提高至1200毫克。
一般較熟悉的鈣來源是由乳製品提供，但許多人有乳醣不耐症，此外，在台灣地區，乳製品的人均消費量較西方國家少很多，此也是降低鈣攝取總量的原因。
研究發現，乳製品中的酪蛋白(casein)在經過胃及腸的蛋白分解酵素分解後會產生抑制鈣離子在鹼性環境下沉澱之胜肽成分，稱之為酪蛋白磷酸肽(Caseinophosphopeptide，CPP)。鈣離子在小腸的吸收，除了在少部份(15-20%重量百分比)在前端的十二指腸部份係需要維生素D的主動運輸，大多數鈣離子進入人體循環系統，靠的是空腸和迴腸段的被動運輸(60-65%重量百分比)(Bronner,F. 1998. Calcium Absorption-A Paradigm for Mineral Absorption J. Nutr. 128: 917-920；Bronner,F. and Pansu,D. 1999. Nutritional Aspects of Calcium Absorption. J. Nutr. 129: 9-12).由於小腸後段的pH值為弱鹼性，因此在含有SerP-SerP-SerP-Glu-Glu序列的CPP胜肽片段存在時，就可維持鈣離子的溶解狀態並進行穿透腸細胞間隙的被動運輸(Ferraretto,A.. Signorile,A Gravaghi,C. Fiorilli,A. and Tettamanti,G. 2001. Casein Phosphopeptides Influence Calcium Uptake by Cultured Human Intestinal HT-29 Tumor Cells J. Nutr. 131: 1655-1661)。為了避免缺乏鈣導致骨質疏鬆等疾病的發生，除了增加鈣的攝取外，增加鈣的吸收率也是一好方法，然而，乳醣不耐症患者不適合利用乳製品中的酪蛋白來促進鈣吸收。
過去已有學者提出以含酪蛋白磷酸肽的起司做為促進鈣吸收的方法(Kato,K.,Takada,Y.,Matsuyama,H.,Kawasaki,Y.,Aoe,S.,Yano,H.,Toba,Y. 2002. Milk calcium taken with cheese increases bone mineral density and bone strength in growing rats. Biosci Biotechnol Biochem. 66:2342-2346)，此方法在提供給乳糖不耐症患者食用時，會造成身體不適的問題。另外尚有學者提出以化學合成產生單一種促鈣吸收胜肽的方式(Galzigna,L.,Domergue,N.,Previero,A. 1998. A synthetic calcium-chelating L-glutamyl-L-serine phosphate(Glu-Ser.P) enhances calcium absorption in the rat. J Pept Res. 52(1):15-18)，然其成本相當高，無法實際運用於產業界。此外亦有學者利用鰻魚骨粉來增加鈣的攝取，然此方法，會隨著鈣量的增加而使吸收率會下降(賴愛姬。1996。鰻骨粉與碳酸鈣為鈣源對老鼠鈣利用效果之比較。臺灣營養學會雜誌。第21卷2期121-131頁)。大陸專利CN1101471C中揭露以大豆為原料進行液態發酵，以得到大豆蛋白胜肽產物。另外，台灣專利TW I298622：提高大豆蛋白營養效率之兩段式發酵方法，其中該說明書揭露一種提高大豆蛋白營養效率之兩段式發酵方法，其係將大豆原料先經前發酵工程(麴菌發酵)處理後，將所得產物再與大豆原料混合，經調整水份後，接種乳酸菌，繼續進行乳酸菌發酵及酵素水解工程，最後可直接利用或經乾燥粉碎，做成粉狀製品，然而上述方法需要經過蒸煮，且並需使用乳酸菌進行後續發酵，步驟較為繁複且成本較高，此外，該案於第二階段發酵時，將水分控制在35-50%，其基本上係呈現一固態狀態，因此水解反應比較無法充分進行，故較難獲得小片段胜肽之大豆蛋白水解液。
綜上所述，人們亟需一種低製造成本，並可以讓乳醣不耐症患者食用之增加鈣的吸收率的產物。
本發明提供一種促進鈣吸收的胜肽產物的製備方法，包括：將一含有大豆蛋白之原料與水混合，以形成一含水量約45%-65%重量百分比的混合物；將一麴菌菌群接種於上述混合物得到一培養物，其中該麴菌菌群包括：Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae、或上述之混合，且該麴菌菌群的接種量佔該大豆蛋白原料重量的約0.006%-0.05%；將上述培養物進行固態發酵得到一發酵產物，其中該固態發酵的條件包括：相對溼度約85%-95%；發酵溫度介於約攝氏23~35度；將上述發酵產物進行水解反應得到一大豆水解液；將上述大豆水解液依序進行固液分離及澄清化處理；以及收集含有該促進鈣吸收的胜肽產物之水解液。
本發明另提供一種做為促進鈣吸收的胜肽產物，其係由上述之方法製備而得。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
本方法係提供一種利用含大豆胜肽的原料來製造促進鈣吸收的胜肽產物之方法，在一實施例中，係將大豆粉以麴菌進行固態發酵分解後，再進行水解反應，然後進行澄清步驟，得到澄清之水解液。實驗證明大豆蛋白被水解後產生的大豆胜肽具有良好的抑制鈣沉澱以及提高鈣吸收的效果，可以提升鈣的吸收率。
本發明是利用大豆來製造大豆胜肽，其原理是利用Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae、或上述菌種之混合的麴菌菌群來處理含有大豆蛋白的原料，以進行固態發酵，其中上述大豆蛋白的來源包括但不限於大豆粉、脫脂大豆粉、脫脂大豆片、大豆分離蛋白、大豆粕、豆餅、或上述之組合。在一實施例中，上述麴菌接種量佔原料總重量的約0.006%-0.05%，較佳約0.008%~0.02%，更佳約0.013%。在上述固態發酵中，可使用各種緩衝液，例如：檸檬酸-檸檬酸鈉、乙酸-乙酸鈉、K2
HPO4
-KH2
PO4
、Na2
HPO4
-NaH2
PO4
、硼酸-氫氧化鈉、三羥甲基甲胺基丙磺酸、N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、N-三-(羥甲基)甲基氨基乙酸、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半鈉鹽、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-(N-嗎非啉)乙磺酸哌嗪-N，N'-二(2-乙磺酸)、二甲基胂酸檸檬酸鈉、2-嗎啉乙磺酸等，調節固態發酵所需的水分，其所需的水分佔原料與水混合物總重的約45%-65%，較佳約50%~60%，更佳約55%。在一實施例中，該固態發酵可在pH值約5~7；相對溼度約85%-95%；發酵溫度介於約攝氏23~35度；發酵的時間約2~5天的條件下進行。
接著將上述發酵產物進行水解反應，以得到大豆水解液。在一實施例中，上述水解反應的進行步驟包括：將上述發酵產物與水以重量比約1:1~1:3的比例混合，較佳約1：2；水解的時間為約3-24小時，較佳約6小時；水解溫度介於約攝氏30-65度，較佳約攝氏45度。之後，再提高反應溫度至約攝氏90-95度以抑制酵素活性。
之後再將上述大豆水解液進行固液分離等澄清化處理。例如，可先使用壓榨機，以油壓方式使之固液分離。然後液體加熱90℃、10分鐘後產生的沉澱，再以高速離心機去除沉澱，最後使用板框式壓濾機或是使用微過濾膜過濾水解液，並收集含有該含有促進鈣吸收的胜肽之水解液。應可瞭解的是，本領域技術人員亦可使用任何其他適當的固液分離方式，以及其他適當的過濾手段所得的大豆胜肽產物經體外(in vitro
)試驗證實，具有抑制碳酸鈣沉澱之效果；動物餵養試驗的結果也顯示，在餵食含此大豆胜肽之食物，可有效提高動物的鈣吸收率。
本發明所提供之促進鈣吸收的胜肽產物之製備方法採用的大豆蛋白原料取得容易且成本低廉，另外，在有關大豆胜肽之生產上，液態發酵之製程雖比較容易控制，但其產率普遍較固態發酵低，且液態發酵設備成本也較高。並且在本發明所提供之實施例中，省略了高溫高壓滅菌的步驟，因此，本發明所得之胜肽產物具有低製造成本、且可為乳糖不耐症患者食用等優點。
以脫脂大豆粉為原料，接種Aspergillus sojae，其中麴菌接種量為大豆原料總重量的0.013%，以重量百分濃度0.25%的CH3
COONa/0.25% HNaSO3
、pH=5.8之緩衝液調節水分至55%，在25~30℃、相對濕度95%以上之環境培養2天。
接著進行水解反應，將大豆麴加水混合，其中大豆麴與水的比例為1：2，水解時間為6小時，水解溫度45℃，再提高溫度至90-95℃，維持10分鐘，以抑制酵素活性。
接著進行水解液的澄清化處理，先使用壓榨機，將大豆水解物置於濾袋中，平鋪於壓榨槽，以油壓方式使之固液分離。然後液體加熱90℃、10分鐘後產生的沉澱，再以遠心高速離心機(轉速16000rpm，台中，泉泰公司製造)去除沉澱，最後使用板框式壓濾機過濾(Seitz Orion,德國製造)或是使用微過濾膜(0.3μm)過濾水解液，得到澄清之大豆水解液。
根據Jin等人(J. Agnc. Food Chem. 2000)碳酸鈣結晶實驗略加修改，將1 ml樣品與1 ml濃度40 mM的氯化鈣和1.2 ml蒸餾水混合，然後加入0.8 ml濃度40 mM碳酸氫鈉後反應1小時，並使用0.1N氫氧化鈉滴定維持pH=8.5。將結束反應的混合液進行離心(離心力為2000 g)，取上清液使用測鈣試劑組(台灣默克公司產物)測量鈣濃度，此為可溶鈣含量。
抑制碳酸鈣結晶實驗中，由實施例1所得之大豆蛋白水解液對於碳酸鈣結晶有抑制效果，此效果的評估是在鹼性條件(pH=8.5)下，完全抑制碳酸鈣結晶的最低樣品濃度，如果發生碳酸鈣沉澱，上清液的鈣含量則降低；反之，上清液的鈣含量則不變。第1圖係為大豆蛋白水解液與酪蛋白磷酸肽比較其抑制碳酸鈣結晶之效果，其結果顯示有助鈣吸收的酪蛋白磷酸肽蛋白(CPP)最低抑制濃度為1.76x10-4
%，而本發明之大豆蛋白水解液的蛋白最低抑制濃度為2.16 x10-3
%。
在本實施例中，選擇不同蛋白來源物質做比較，將1 ml樣品與1 ml濃度40 mM的氯化鈣和1.2 ml蒸餾水混合，然後加入0.8 ml濃度40 mM碳酸氫鈉後反應1小時，並使用0.1N氫氧化鈉滴定維持pH=8.5。將結束反應的混合液進行離心(離心力為2000 g)，取上清液使用測鈣試劑組(台灣默克公司產物)測量鈣濃度，並在鹼性條件(pH=8.5)下，完全抑制碳酸鈣結晶的最低樣品濃度作為可溶鈣含量的評估標準。
第2圖係為不同蛋白源物質其抑制碳酸鈣結晶之效果。其中游離氨基酸如麩氨酸鈉鹽(monosodium glutamate,MSG)、甘氨酸(glycine)抑制效果較差；接著是蛋白質如大豆分離蛋白(isolated soy protein,ISP)、酪蛋白(casein)，雞精(essence of chicken，市售產物，為雞肉蛋白抽取物)，其抑制碳酸鈣沉澱之效果優於前兩類；而本發明之大豆蛋白水解液(soy hydrolysate)最佳。可見單一的游離氨基酸或者是完整蛋白質與鈣離子螯合的情形不如蛋白質水解物，蛋白質經過程度不同的水解後，它們具有較好的抑制鈣沉澱效果。因此以胜肽型式的蛋白食材例如雞精，還有本發明利用麴菌酵素分解大豆蛋白水解液皆是不錯的抑鈣沉澱輔劑。
實驗方式類似賴愛姬的論文(臺灣營養學會雜誌，第21卷2期，1996)，但略做修改，採用成年雌性鼠(Bltw:SD；購自樂斯科生物科技股份有限公司)飼養於各自獨立的代謝籠中，室溫維持在23±2℃，光照12小時，禁食一天待體內食物排除後，分別提供添加大豆分離蛋白為對照組或促鈣吸收胜肽做為實驗組，每組樣本數各為10隻，令動物任意攝食，每日收取糞便，6天後取走飼料，秤其所吃的總量，再等待一天排除吃的飼料後，收集及分析其排出糞便中的鈣含量。鈣的分析法為以硝酸做硝化反應後，以原子吸光儀測定。
鈣的總攝取量以吃的飼料量乘飼料中鈣的含量推估。鈣的吸收率為(總攝取量-糞便中的鈣含量)/總攝取量。
第3圖顯示餵食促鈣吸收胜肽與大豆蛋白飼料老鼠的鈣吸收率。比較大豆蛋白或促鈣吸收胜肽的吸收率發現，促鈣吸收胜肽的吸收率顯著的較大豆蛋白高，平均值±95%信任區間，兩者間具有顯著差異(p<0.05)。
表1、大豆分離蛋白(對照組)及促鈣吸收胜肽(實驗組)之飼料配方(每2000克飼料中，各成分的量，單位為克)。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖係為大豆蛋白水解液與酪蛋白磷酸肽比較其抑制碳酸鈣結晶之效果。
第2圖係為不同蛋白源物質其抑制碳酸鈣結晶之效果。
第3圖顯示餵食促鈣吸收胜肽與大豆蛋白飼料老鼠的鈣吸收率，平均值±95%信任區間，兩者間具有顯著差異(p<0.05)。
Claims (4)
- 一種促進鈣吸收的胜肽產物的製備方法，包括：將一含有大豆蛋白之原料與水混合，以形成一含水量約45%-65%重量百分比的混合物；將一麴菌菌群接種於上述混合物得到一培養物，其中該麴菌菌群包括：Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae、或上述之混合，且該麴菌菌群的接種量佔該大豆蛋白原料重量的約0.006%-0.05%；將上述培養物進行固態發酵得到一發酵產物，其中該固態發酵的條件包括：相對溼度約85%-95%；發酵溫度介於約攝氏23~35度；發酵時間約2~5天；在pH值約5~7下進行；將上述發酵產物進行水解反應得到一大豆水解液，其中在該水解反應中，該發酵產物與水混合重量比為約1：1~1：3，該水解反應的水解時間為約3-24小時，該水解反應的水解溫度介於約攝氏30-65度；將上述大豆水解液依序進行澄清化處理及固液分離；以及收集含有該促進鈣吸收的胜肽產物之水解液。
- 如專利申請範圍第1項所述之促進鈣吸收的胜肽產物的製備方法，其中該含有大豆蛋白之原料包括大豆粉、脫脂大豆粉、脫脂大豆片、大豆分離蛋白、大豆粕、 豆餅、或上述之組合。
- 如專利申請範圍第1項所述之促進鈣吸收的胜肽產物的製備方法，其中在該水解反應完成後，更包括提高反應溫度至約攝氏90-95度以抑制酵素活性。
- 一種做為促進鈣吸收的胜肽產物，其係由申請專利範圍第1項所述之方法製備而得。
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