TWI466897B - 癌細胞之檢測方法、糖鏈之構造解析方法，以及糖鏈衍生物 - Google Patents
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Description
本發明係關於由糖鏈混合物製造糖鏈衍生物之方法以及糖鏈之構造解析方法。尚且亦關於依據本發明之糖鏈衍生物製造方法所製造之新穎糖鏈衍生物。
咸認糖蛋白質中的糖鏈係擔任蛋白質立體構造之保持，防止源自蛋白酶的分解，而獲得抵抗性等作用。最近漸漸了解有關糖蛋白質中之糖鏈參與受精或分化，傳達訊號，癌化，蛋白質於細胞內之輸送及生理活性之調節等生命現象。此外，亦明瞭細胞表面之接著分子或糖蛋白質性荷爾蒙等之糖鏈與其機能的相互關係，而得到糖質科學共同研究開發之構想。目前，糖鏈機能研究中心係成為有關主司其生合成之糖轉移酶(糖鏈基因)的研究重心，惟保存糖轉移酶及基因情報，依據與其他蛋白質之協調作業，而考量生命機能之相關性時，有必要藉由補捉細胞組織中表現之糖鏈的全體像並加以解析之構造醣質體分析(glycomics)方法，進一步解析糖鏈之機能。
於糖鏈科學中構造糖質體分析之角色係網羅式地解析擔任多種生命現象重要角色的糖鏈認識機構，係機能構造醣質體分析不可缺少之要件。構造醣質體分析所要求之技術要件為：高度網羅性，高產率，高敏感度及高精確度。
目前，糖蛋白質糖鏈之構造解析法，係將由蛋白質切出之糖鏈經螢光標示後，使用高速液體層析法(HPLC)或質量分析法(MS)進行解析之方法，由於質量分析顯著的進步而成為有力的手段(非專利文獻1-4)唾液酸(sialo)糖鏈之分離至今係僅使用陰離子交換管柱層析法(非專利文獻5)。
(非專利文獻1)Biomed Chromatogr. 16：103-115(2002年)
(非專利文獻2)Anal Biochem 206:278-287(1992年)
(非專利文獻3)Biochem Soc Trans. 21:121-125(1993年)
(非專利文獻4)Chem Rev. 102:321-369(2002年)
(非專利文獻5)Biochem Biophys Acta. 705:167-173(1982年)
然而，網羅式解析細胞或組織中的糖鏈時，由於有唾液酸或海藻糖等非還原末端修飾之多樣性及糖鏈分支之問題存在，因而混合之糖鏈不能充分分離，而不能得到滿意的結果。特別是，使用離子交換管柱等時，由於不具有特異的分離能力，不僅不能得到充分的分離，且分離操作後必須施予脫鹽處理，不能稱為實用的方法。
因此，考慮這些糖鏈的不均一性情報的同時，熱切期待能夠詳細解析細胞，組織中特徵性糖鏈構造之實用方法。
本發明的課題係由於細胞或組織中如糖鏈般種種糖鏈為混合存在之狀態，而提供將各別糖鏈分離而取得的手段。
再者，本發明的課題為提供解析經分離之各糖鏈化合物構造之手段。
此外，本發明的課題為提供新穎之糖鏈衍生物。
本發明係關於以下之發明。
1.一種糖鏈衍生物之製造方法，係由糖鏈混合物製造糖鏈衍生物之方法，其特徵為具備：(a)將脂溶性基導入糖鏈混合物中的糖鏈而得糖鏈衍生物混合物之步驟，以及(b)以羥色胺(serotonine)親和性管柱層析法處理該糖鏈衍生物混合物之步驟。
2.如上述記載的糖鏈衍生物之製造方法，係於(b)步驟之後，具備(c)以使用胺基管柱或醯胺基管柱之順相層析法進行處理之步驟。
3.如上述記載的糖鏈衍生物之製造方法，係於(c)步驟之前，具備(d)以糖水解酶處理之步驟。
4.一種糖鏈之構造解析方法，係解析糖鏈混合物中糖鏈構造之方法，其特徵為具備：(a)將脂溶性基導入糖鏈混合物中之糖鏈而得糖鏈衍生物混合物之步驟，(b)以羥色胺親和性管柱層析法處理該糖鏈衍生物混合物之步驟，(e)依質量分析法處理之步驟。
5.如上述記載的糖鏈構造解析方法，係於(b)步驟之後，具備(c)以使用胺基管柱或醯胺基管柱之順相層析法處理之步驟。
6.如上述記載的糖鏈構造解析方法，係於(c)步驟之前，具備(d)以糖水解酶處理之步驟。
7.如上述4項記載的糖鏈構造解析方法，其中，質量分析法係依據MALDI-TOF MS之質量分析法。
8.一種下列通式(1)至(6)所示之糖鏈衍生物[式中R1
表示2-羧基苯基，3-羧基苯基，4-羧基苯基，對-乙氧基羰基苯基，或2-吡啶基；R2
表示羥基，基-Asn或者基-Asn-R3
；於此Asn表示天門冬醯胺醯基，R3
表示胺甲酸系或者醯胺系保護基；Ac表示乙醯基。]
9.一種癌標識物，係由通式(1)至(6)所示之糖鏈衍生物誘導者。
本發明者等精心研究之結果，發現將脂溶性基導入糖鏈作成糖鏈衍生物之後，以與唾液酸(Sialic Acid)具有親和性之羥色胺作為配位體(ligand)的親和性管柱層析法處理，可分離非唾液酸(asialo)糖鏈及唾液酸糖鏈，並可將唾液酸糖鏈中之單唾液酸，二唾液酸，三唾液酸及四唾液酸糖鏈等依唾液酸殘基之數目加以分離。
另發現將以親和性管柱層析法分期而得之流份(fraction)，分別以使用胺基管柱或醯胺基管柱之層析法，即可進一步分離分枝構造不同的糖鏈衍生物，而大量製造單一構造的糖鏈。
再者，發現以適當的糖水解酶對經分離的各糖鏈衍生物作用，並以使用胺基管柱或醯胺基管柱的層析法進行分離，並以質量分析法處理所得到的糖鏈衍生物，即可高精度且網羅性地解析糖鏈構造，遂完成本發明。
在本發明的製造方法中使用的糖鏈混合物中的糖鏈，並無特別限制，包含天門冬醯胺結合型糖鏈(N-糖苷結合型糖鏈)，粘蛋白型糖鏈(O-糖苷結合型糖鏈)，游離型糖鏈，以及如糖鏈結合天門冬醯胺般與胺基酸結合的糖鏈。
此類糖鏈即使是根據化學手法調製的糖鏈亦可，例如源自天然糖蛋白質的糖鏈為非還原末端的糖殘基隨機式欠缺的糖鏈混合物，以使用此類糖鏈混合物為佳。以使用含有於糖鏈殘基中具有唾液酸殘基之糖鏈的糖鏈混合物為佳。
天然糖鏈的混合物，可例舉如天然原料，例如源自乳汁，源自牛之胎球蛋白(Fetuin)，蛋或生物組織或細胞的糖鏈混合物。特別以使用源自癌組織或癌細胞的糖鏈混合物，因為能期待非常有趣的結果而佳。
本發明能使用的天然糖鏈的混合物，以下文所例示的糖鏈混合物為佳，惟以包含唾液酸糖鏈的糖鏈混合物特別佳。
可使用由上述天然原料根據習知的方法，獲得之糖蛋白質及/或糖胜肽的混合物，以蛋白質分解酶等作用而切斷該混合物之胜肽部分，並使用凝膠過濾管柱和離子交換管柱等層析法精製所得的糖鏈結合天門冬醯胺的混合物。
例如可使用生物組織或細胞，特別是培養組織或培養細胞，並均勻化培養液中的組織或細胞，接著離心分離所得的細胞膜流份，以2-巰乙醇處理之後，以N-聚糖酶作用所得的糖鏈混合物。
再者，可使用將培養組織或培養細胞均勻化，並藉由採取離心分離後之上清液而得的游離糖鏈混合物。此類糖鏈中因含有中性糖鏈之高甘露糖型糖鏈和多種類的唾液酸糖鏈，而適合各種糖鏈的製造。
將脂溶性基導入所得糖鏈混合物中之糖鏈中作為糖鏈衍生物的混合物。
脂溶性基係與糖鏈的還原末端的開環醛，糖鏈結合天門冬醯胺的天門冬醯胺之胺基或羧基反應而形成的具有脂溶性的取代基，例如2-，3-或4-羧基苯基胺基，對-乙氧基羰基苯基胺基，2-吡啶基胺基等通常作為螢光標識使用的取代基和9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)基，第三-丁氧基羰基(BOC)基，苄基，烯丙基，烯丙氧基羰基，乙醯基等作為胺甲酸系或醯胺系保護基使用的取代基。
可根據習知的方法進行這些脂溶性基的導入，而就操作的簡便性，所得糖鏈衍生物的安定性而言，由於激發光係對應於水銀燈或雷射光源等，而以使用2-羧基苯基胺基，Fmoc基或BOC基為佳。
例如，使用2-胺基苯甲酸，於氰基硼氫化鈉或二甲基胺化硼等還原劑的存在下與糖鏈反應，即可成為胺基醣醇衍生物。
又，例如可使用9-茀基甲基-N-琥珀醯亞胺基碳酸酯，於碳酸氫鈉存在下，與糖鏈結合天門冬醯胺反應，即可於天門冬醯胺的胺基導入如胺甲酸酯般結合的Fmoc基。
依以上的操作，可得到導入脂溶性基的糖鏈衍生物的混合物。
以羥色胺親和性管柱層析法分離所得之糖鏈衍生物的混合物。
本發明的羥色胺親和性管柱層析法係使用與唾液酸具有親和性的羥色胺作為配位體的親和性管柱。
羥色胺親和性管柱，可使用在填充劑中使羥色胺固定化而作成者，也可使用市販管柱。市販管柱可列舉如LA-羥色胺管柱(J-OIL MILLS公司製)等。
層析法的分離條件係適宜地設定，舉一例而言，使用螢光檢測器，以激發波長350nm，螢光波長425nm,流速0.5ml/min，並使用超純水和乙酸銨水溶液作為移動相進行直線梯度溶出即可達成分離。
藉由羥色胺親和性管柱層析法，可將糖鏈衍生物的混合物依據唾液酸殘基的數目進行分離，不具有唾液酸殘基的非唾液酸糖鏈衍生物最早溶出，接著依單唾液酸糖鏈衍生物，二唾液酸糖鏈衍生物的情形而與唾液酸殘基數目的增加成比例的分離溶出。
如上述，將經羥色胺親和性管柱分離的糖鏈衍生物，以使用聚合物基材的胺基管柱或氧化矽基材的醯胺管柱之順相HPLC處理，即可進行極為出色的糖鏈衍生物間的分離。所謂順相層析法，是使用胺基，胺基丙基，丙烯醯胺基等極性固定相作為填充劑的層析法，係按照相對於樣品成分的固定相-移動相的樣品成分之分配度的差異而達成分離。基本上為按照糖鏈的親水性而分離的方式，也可較佳地使用於結合唾液酸的糖鏈的異構體的分離。同時，也可較佳地使用於經稀酸或神經胺酸酶(neuraminidase)處理的非唾液酸型糖鏈的分離。
所使用的聚合物基材的胺基管柱，係使用使胺基與聚乙烯醇系基材凝膠等聚合物結合之固定相作為填充劑的管柱，可以自行製作，或可以使用市販的管柱。
市販的胺基管柱，可例舉Asahi Shodex NH2P-50 4E(昭和電工公司製)。
氧化矽基材的醯胺基管柱，係以化學結合將丙烯醯胺等醯胺基導入以氧化矽作為固定相的填充劑的管柱，可以自行製作，亦可使用市販管柱。
市販的醯胺基管柱，可列舉TSK-GEL醯胺-80(TOSOH公司製)。
層析法的分離條件係適當地設定，舉一例而言，使用螢光檢測器，於激發波長350nm，螢光波長425nm，流速1ml/min，以含有乙酸的乙腈和含有乙酸及三乙胺的水溶液作為移動相進行直線梯度溶出，即可分離。
如以上分離所得的糖鏈衍生物，藉由適當使用糖水解酶，質量分析法的分析，即可解析其糖鏈構造。
糖水解酶，可使用習知酵素，例如可列舉唾液酸酶，半乳糖苷酶，甘露糖苷酶，N-乙醯基葡萄糖胺酶，岩藻糖酶等。
質量分析方法係根據採用以往習知的質量分析法之分析裝置測定，特別以近年來用於糖鏈分析的MALDI-TOF MS測定為佳。
於解析糖鏈構造時，使與特定的糖水解酶作用後，以使用聚合物基材的胺基管柱或氧化矽基材的醯胺管柱之順相HPLC處理，所得之流份進行質量分析，考慮消失的質量份及水解酶的特性，更進一步重覆此操作，即可解析糖鏈構造。
所得的糖鏈衍生物，藉由除去其脂溶性基，即可人工地容易而且大量的得到種種糖鏈。
脂溶性基的去除可使用以往習知的方法。
例如，2-羧基苯基胺基的去除係於乙酸中與過氧化氫在室溫反應而達成，可容易地回收游離型糖鏈。
Fmoc基的去除係於N,N-二甲基甲醯胺中，於糖鏈衍生物中加入嗎福啉使反應而達成，BOC基的去除係與弱酸反應而達成。
糖鏈係以糖鏈結合天門冬醯胺時，使與無水肼反應後，進行乙醯化的方法；或於鹼性水溶液中加熱回流後，進行乙醯化的方法等，即可除去天門冬醯胺殘基。
該糖鏈類，在醫藥品開發等領域中非常有用，可列舉如癌疫苗合成，將所得到的糖鏈類以組合化學反應或糖轉移酶的反應等，合成新穎糖殘基而衍生物化，而能開發新穎疫苗。
本發明者等，根據本發明的構造解析方法及製造方法，於各種癌細胞中成功的分離至今未發現到的下列通式(1)至(6)所示之糖鏈。
[式中R1
表示2-羧基苯基，3-羧基苯基，4-羧基苯基，對-乙氧基羰基苯基，或2-吡啶基。R2
表示羥基，基-Asn或基-Asn-R3
。於此，Asn表示天門冬醯胺醯基，R3
胺甲酸系或表示醯胺系保護基。Ac表示乙醯基]。
咸認這些新穎糖鏈係於癌細胞中特異性地表現者，可利用這些糖鏈作為癌標記。
例如製作與這些癌細胞中的特異性糖鏈特異性地辨識的多株抗體或單株抗體，並根據免疫學手法即可進行該糖鏈的檢測。
多株抗體係以該糖鏈或該糖鏈的不完全抗原(hapten)與蛋白質等高分子化合物(載體)結合之結合體作為抗原，使小鼠，田鼠，天竺鼠，雞，大鼠，兔子，狗，山羊，羊，牛等哺乳動物進行免疫過敏反應，從該哺乳動物採取血液，即可調製含有多株抗體的抗血清。
單株抗體例如，可調製以抗體產生細胞和骨髓瘤的細胞融合所得之融合瘤細胞而得。培養如上述操作而得到的融合瘤細胞，而可純化所得的單株抗體。
以下表示參考例及實施例，然而，本發明不受限於下列實施例。
實施例1 以羥色胺親和性層析法分離源自人類血清之[1-酸性糖蛋白質(AGP)]糖鏈將源自人類血清的AGP(Sigma-Aldrich Japan製)1mg溶解於20mM磷酸緩衝溶液(pH7.5)50μl，加入N-聚糖酶F(2單位，4μl)，37℃下反應12小時。反應後以100℃煮沸3分鐘並回收離心分離後之上清液。
溶解2-胺基苯甲酸(2AA)和氰基硼氫化鈉於2%硼酸，4%乙酸鈉之混合液(500μl)中使分別成為3%添加該溶液100μl至回收之上清液中，於80℃反應1小時。使用以50%甲醇水溶液平衡化之Sephadex LH-20管柱(0.7cm i.d.,30cm)對反應混合物進行區分，用分光光度計(日立製，F-4010型)，以激發波長335nm，螢光波長410nm測定各流份，回收最初溶出的螢光性流份，作為糖鏈衍生物的混合物。
製得的混合物提供於羥色胺親和性管柱層析，而得分離的糖鏈衍生物。第1圖表示以親和性管柱層析法的分離結果。
管柱：LA-羥色胺管柱(4.6×150mm,Japan Oil mills製)
泵：JASCO PU-980型
流速：0.5ml/min
檢測器：JASCO FP-920型螢光檢測器
激發波長：350nm
螢光波長：425nm
移動相：以超純水作為溶液A，40mM乙酸銨水溶液作為溶液B。
梯度條件：以樣品注入後2分鐘溶液B為5%，37分後乙酸銨濃度為30mM，進行直線梯度溶出，然後以10分鐘成為40mM進行溶出。
再者，羥色胺親和性層析法的分離條件係以下的實施例中亦同。
使用人類腎腺癌細胞ACHN，人類肺癌細胞A549，人類胃癌細胞MKN45及人類組織球性淋巴腫U937。使用含10%將ACHN及A549預先以50℃加熱30分鐘使不活化的牛血清[NEWBORN CALF SERUM(NCS)，Sigma-Aldrich Japan製]的DMEM(Dulbecco’s修飾Eagle培養液，Sigma-Aldrich Japan製)，U937及MKN45係採用包含10%NCS的RPMI-1640(Sigma-Aldrich Japan製)，於5%CO2
存在下37℃下於組織培養皿中培養。將去除U937之細胞在80%群集(confluent)狀態下，以等張化磷酸緩衝液(PBS)洗淨培養中的細胞後，加入胰蛋白酶溶液，以37℃處理5分鐘之後，回收脫離的細胞，以PBS洗淨後進行繼代培養。
細胞膜流份的製作係使用80%群集狀態的細胞，採用細胞刮片，自培養皿回收。回收的細胞以PBS洗淨後，使於含1%蛋白酶抑制劑的10mM Na2
HPO4
(pH7.5)中成為1×108
細胞/5ml的濃度，以玻璃均化器均化後，添加包含0.5M蔗糖的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)10ml，於4℃，以3000rpm離心分離15分鐘後回收上清液後，於4℃，以19000rpm離心分離，以所得的沉澱作為細胞膜流份。
於細胞膜流份(1×107
細胞)中加入1%SDS溶液40μl，添加成為1%之2-巰乙醇後，在100℃的沸騰水浴上加熱5分鐘進行可溶解化。將包含膜流份的溶液冷卻至室溫，加入NP-40使成為1%，加入磷酸緩衝液(pH7.5)使其最終濃度成為20mM。並且，加入N-聚糖酶F4μl(2單位，Roche Diagnostics製)，37℃下培養一夜，在100℃的沸騰水浴上煮沸5分鐘，加入95%乙醇使其最終濃度成為75%後，於4℃，以15000rpm離心分離，並將上清液減壓乾燥成固體，即為源自細胞膜之糖鏈。
調製的各種源自細胞膜的糖鏈，與上述實施例1同樣地導入2-AA後，用羥色胺親和性管柱層析法處理，得到各糖鏈衍生物的流份。第2圖表示以管柱層析法的分離結果。
將實施例2所得各流份的源自癌細胞之糖鏈衍生物(相當於1×107
細胞)，以20mM乙酸緩衝液(pH5.0)20μl溶解，加入唾液酸酶4μl(2 mU,Markin Bio製)以37℃反應24小時。反應後以100℃煮沸3分鐘，回收離心分離後之上清液。
所得的上清液供至使用醯胺基管柱的順相HPLC，分別取得糖鏈衍生物。第3圖至第7圖表示以HPLC分離之結果。
HPLC條件
管柱：TSK-GEL醯胺-80(TOPOH公司,Japan;4.6×250mm)
管柱溫度：40℃
泵：JASCO PU-980型
流速：1ml/min
檢測器：JASCO FP-920型螢光檢測器
激發波長：350nm
螢光波長：425nm
移動相：使用含有0.2%乙酸的乙腈溶液作為溶液A，含有0.1%乙酸及0.1%三乙基胺的水溶液作為溶液B。
梯度條件：以樣品注入2分鐘後溶液B成為30%，60分後溶液B成為65%進行直線梯度溶出。
將源自U937的波峰31的糖鏈衍生物以20mM檸檬酸緩衝液(pH3.5)20μl溶解，添加β-半乳糖酶1μl(25 mU，生化學工業公司製)以37℃反應24小時。反應後以100℃煮沸3分鐘並回收離心分離後之上清液。將所得上清液供至使用醯胺基管柱的順相HPLC所得之一部份流份，以MALDI-TOF MS進行分析。結果，得到分子量2718之糖鏈衍生物(a)。
以20mM檸檬酸緩衝液(pH5.0)20μl溶解上述糖鏈衍生物(a)，加入β-N-乙醯基己醣胺酶(hexaminidase)1μl(10 mU,生化學工業公司製)以37℃反應24小時。反應後以100℃煮沸3分鐘並以離心分離回收上清液，所得之上清液與上述同樣進行分析的結果，得到分子量1906之糖鏈衍生物(b)。
再以β-半乳糖酶處理糖鏈衍生物(b)的結果，得到分子量1582的糖鏈衍生物(c)。
由以上的結果，判定波峰31係下式所示的糖鏈衍生物。
相同地，波峰35的糖鏈衍生物，以β-半乳糖酶、β-N-乙醯基己醣胺酶，接著以β-半乳糖酶處理，也判定為下式所示的糖鏈衍生物。
關於其他波峰的衍生物，適宜地使用水解酶，進行MALDI-TOF MS分析等，將相當於第3圖至第7圖所示波峰的糖鏈構造示於表1至5。再者，表1至14中的分子量表示2-胺基苯甲酸結合在糖鏈還原末端狀態的分子量(MW)，記號係如下示。
Gal:D-半乳糖，GlcNAc:N-乙醯基葡萄糖胺(acetyl glucosamine)，Man:D-甘露糖，Fuc：海藻糖，2-AA:2-胺基苯甲酸，NeuAc：唾液酸。
於此，2-胺基苯甲酸結合於糖鏈還原末端的糖鏈，例如，如下式表示的糖鏈部分構造，係以-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-2-AA表示。
使用Voyager DE-PRO(PE Biosystems,Framingham,MA)裝置，以線性-/負離子型式測定。以加速電壓20kV，柵極電壓96.3%，延遲時間1000 nsec，Lens Off set 1.25，雷射強度(氮雷射)2700測定之。溶解於水中的樣品0.5μL與2,5-二羥基苯甲酸(DHB)的20mg/mL甲醇溶液0.5μL混合，乾燥後，作為測定用樣品。
人類胃癌細胞MKN45以PBS洗淨後，使成為1×108
細胞/5ml的濃度並使用玻璃均化器，於含1%的蛋白酶抑制劑的10mM Na2
HPO4
(pH7.5)中均化後，加入含0.5M蔗糖的20mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)10ml，於4℃，以3000rpm離心分離15分鐘後，收集上清液，並且，於4℃，以19000rpm離心分離，並將上清液減壓至乾固，得到游離型糖鏈混合物。
所得的游離型糖鏈混合物與實施例1記載的方法相同地，導入2-AA而得游離型糖鏈衍生物的混合物，用羥色胺親和性管柱層析法進行區分而得游離型糖鏈衍生物。
第8圖表示以親和性管柱層析的分離結果。
以使用胺基管柱之順相HPLC分離所得的各流份，得到游離型糖鏈衍生物。
HPLC條件
管柱：Asahi Shodex NH2P-50 4E(Showa Denko,Tokyo,
Japan;4.6×250mm)
管柱溫度：50℃
泵：JASCOPU-980型
流速：1ml/min
檢測器：JASCO FP-920型螢光檢測器
激發波長：350nm
螢光波長：425nm
移動相：溶液A使用含有2%乙酸的乙腈溶液，溶液B使用含有5%乙酸及3%三乙基胺的水溶液。
梯度條件：以樣品注入後2分鐘溶液B成為30%，80分後溶液B成為95%進行直線梯度溶出，至100分鐘止保持溶液B為95%。
所得之游離型糖鏈衍生物以糖水解酶(唾液酸酶，α-甘露糖酶，β-半乳糖酶，β-N-乙醯基己醣胺酶等)適宜地作用，並以使用上述胺基管柱之順相HPLC分離後，凍結乾燥所得到的流份後，以MALDI-TOF MS分析，以解析游離型糖鏈衍生物的構造。
α-甘露糖酶的處理，係將糖鏈衍生物溶解於20mM檸檬酸緩衝液(pH4.5)20μl中，加入α-甘露糖酶2μl(10mU,生化學工業公司製)以37℃反應24小時，反應後以100℃煮沸3分鐘，回收離心分離後之上清液。以其他糖水解酶的處理係與上述實施例的記載相同。所得的糖鏈衍生物示於表6及7。
表6及7之游離型糖鏈係新穎化合物，例如編號1之分子量1321的糖鏈衍生物係如下式所示。
替代人類胃癌細胞MKN45而使用人類T細胞淋巴腫瘤Jurkat27(糖鏈導入細胞株)之外，與實施例4同樣地操作而得游離型糖鏈混合物。
與實施例1記載的方法同樣的導入2-AA於所得之游離型糖鏈混合物，而得到游離型糖鏈衍生物的混合物，用羥色胺親和性管柱層析法進行區分而得到游離型糖鏈衍生物。
以使用醯胺管柱之順相HPLC分離所得的各流份，而得游離型糖鏈衍生物。
HPLC條件
管柱：TSK-GEL醯胺-80(TOSOH CORPORATION,Japan;4.6
×250mm)
管柱溫度：40℃
泵：JASCOPU-980型
流速：1ml/min
檢測器：JASCO FP-920型螢光檢測器
激發波長：350nm
螢光波長：425nm
移動相：使用含有1%乙酸的乙腈溶液為溶液A，含有0.2%乙酸及0.2%三乙基胺的水溶液為溶液B。
梯度條件：以樣品注入2分鐘後溶液B成為30%，60分後溶液B成為65%進行直線梯度溶出。
HPLC的分離結果示於第9圖。
將所得的游離型糖鏈衍生物與實施例4同樣操作，解析游離型糖鏈衍生物的構造。所得之糖鏈衍生物示於表8。
將人類子宮頸癌細胞HeLa以含10%預先以50℃加熱30分鐘使不活化的NCS之DMEM進行培養。在80%群集狀態中，以PBS洗淨培養中的細胞後，加入胰蛋白酶溶液，以37℃處理5分鐘後，回收脫離的細胞，以PBS洗淨後進行繼代培養，以與實施例2記載的細胞膜流份的製作，及自細胞膜流份分離糖鏈的同樣操作進行處理，獲得源自細胞膜的糖鏈混合物，並與上述實施例1同樣地導入2-AA後，以羥色胺親和性管柱層析進行處理，而得各糖鏈衍生物之流份。
管柱層析的分離結果示於第10圖。
將所得到的唾液酸糖鏈衍生物流份，單唾液酸糖鏈衍生物流份及二唾液酸糖鏈衍生物流份以唾液酸酶處理之後，以使用胺基管柱之順相HPLC分離，得到糖鏈衍生物。HPLC條件與實施例4相同。
得到的糖鏈衍生物以糖水解酶(唾液酸酶，α-甘露糖酶，β-半乳糖酶，β-N-乙醯基己醣胺酶等)適宜地作用，並以使用上述胺基管柱之順相HPLC分離後，凍結乾燥得到的流份後，進行MALDI-TOF MS分析，以解析糖鏈衍生物的構造。
得到的糖鏈衍生物示於表9至12。
蛋白質A-洋菜糖(Agarose)50μl(Sigma-Aldrich Japan製)以PBS 200μl洗淨後，加入PBS 50μl和抗CD98抗體10μg/10μl，於室溫反應60分鐘。反應後，以PBS 1ml除去非吸著成分，而得抗CD98抗體固定化洋菜糖。對抗CD98抗體固定化洋菜糖，以1% NP-40(400μl)添加可溶化之HeLa細胞的膜流份(2×107
細胞)，用旋轉振盪器(Rotary shaker)以4℃培養一夜。此後，以1m1PBS洗淨，除去非吸著成分，離心分離後，對抗CD98抗體固定化洋菜糖加入離解溶液(250mM Tris-HCl緩衝液pH6.8/4.6%SDS,20%甘油)及2-巰乙醇的9:1混合液20μl，煮沸5分鐘，以15000rpm離心的上清液作為CD98-HC，供至SDS-PAGE。
凝膠電泳裝置及電源均同採用Bio Rad製品。電泳凝膠使用7.5%凝膠。電泳緩衝液使用25mM Tris,198mM甘油，1%(w/v)SDS進行。最初的1小時每片凝膠以5mA，繼之以10mA進行電泳至凝膠下部。
考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色SDS-Page結束後，於40%(v/v)甲醇，10%(v/v)乙酸/0.2%考馬斯亮藍R250中，進行蛋白質染色。1小時後，用甲醇：乙酸：水(=4:1:5)脫色。
將SDS-PAGE後的凝膠以BIO-RAD製半乾式吸墨(hemidry bloting)裝置(半乾轉印槽)，將凝膠中的蛋白質樣品轉印至PVDF膜。PVDF(Polyvinylidene Difluoride)膜係預先以甲醇浸泡60秒，然後使用48mM Tris,39mM甘胺酸，20%甲醇(pH9.0)浸泡1小時者，以100mA固定電流施加電壓1小時進行轉印。轉印後，以含5%脫脂乳及0.05%Tween 20的PBS對PVDF膜進行阻斷操作之後，加入含有抗CD98抗體5μg之0.05%Tween 20/PBS(5ml)使其反應一夜。反應後，以含0.05%Tween 20的PBS(20ml)洗淨PVDF膜4次後，加入含HRP標識蛋白質A5μl之0.05%Tween 20/PBS(5ml)，使其反應1小時。反應後，以含0.05%Tween 20的PBS(20ml)洗淨PVDF膜4次，加入含0.05%DAB(3,3’-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽)，0.0031%過氧化氫溶液20ml,使其發色。
以CBB染色確認染色帶之後，以水取代染色液，切下目標帶，放入微試管內。然後加入乙腈100μl放置30分鐘使凝膠脫水，除去乙腈後加入含2單位N-聚糖酶F的Tris-HCl緩衝液(pH7.5)100μl，37℃下培養一夜後，切出糖鏈。然後，回收提取液再加入水200μl攪拌30分鐘，由凝膠得到糖鏈混合物。
於以上所得的糖鏈混合物中，與上述實施例1相同地導入2-AA後，以羥色胺親和性管柱層析法處理，而得各糖鏈衍生物之流份。
管柱層析法的分離結果示於第11圖。
所得之單唾液酸糖鏈衍生物流份及二唾液酸糖鏈衍生物流份經唾液酸酶處理之後，以使用胺基管柱之順相HPLC分離，獲得糖鏈衍生物。HPLC條件係與實施例4相同。HPLC的分離結果示於第12圖。
得到的糖鏈衍生物以糖鏈水解酶(唾液酸酶，α-甘露糖酶，β-半乳糖酶，β-N-乙醯基己醣胺酶等)適當地作用，以上述使用胺基管柱的順相HPLC分離後，凍結乾燥所得的流份後，以MALDI-TOF MS分析，解析糖鏈衍生物的構造。
得到的糖鏈衍生物示於表13至14。
依據本發明的方法，特別可詳盡地分離細胞或組織中的糖鏈混合物，而可網羅性地解析其糖鏈構造，而可探求以往未知的糖鏈及其機能，對今後的糖鏈研究亦可期待有很大的貢獻。
第1圖是實施例1所得糖鏈衍生物的親和性管柱層析圖。
第2圖是實施例2所得糖鏈衍生物的親和性管柱層析圖。
第3圖是實施例3所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。
第4圖是實施例3所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。
第5圖是實施例3所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。
第6圖是實施例3所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。
第7圖是實施例3所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。
第8圖是實施例4所得糖鏈衍生物的親和性管柱層析圖。
第9圖是實施例5所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。
第10圖是實施例6所得糖鏈衍生物的親和性管柱層析圖。
第11圖是實施例7所得糖鏈衍生物的親和性管柱層析圖。
第12圖是實施例7所得糖鏈衍生物的HPLC的層析圖。
Claims (6)
- 一種檢測癌細胞的方法，係藉由式(1)至(6)所示之糖鏈衍生物進行檢測，式中R1 表示2-羧基苯基，3-羧基苯基，4-羧基苯基，對-乙氧基羰基苯基，或2-吡啶基；R2 表示羥基，基-Asn-或者基-Asn-R3 ；於此Asn表示天門冬醯胺基，R3 表示胺甲酸系或者醯胺系保護基；Ac表示乙醯基：
- 一種源自癌細胞之糖鏈構造之解析方法，係解析源自癌細胞之糖鏈混合物中糖鏈構造之方法，其特徵為具備：(a)於源自癌細胞之糖鏈混合物之糖鏈中導入脂溶性基而得糖鏈衍生物的混合物之步驟，(b)以羥色胺親和性管柱層析法處理該糖鏈衍生物混合物之步驟，(e)以質量分析法處理之步驟，且該源自癌細胞之糖鏈為下述式(1)至(6)所示之糖鏈衍生物式中R1 表示2-羧基苯基，3-羧基苯基，4-羧基苯基，對-乙氧基羰基苯基，或2-吡啶基；R2 表示羥基，基-Asn-或者基-Asn-R3 ；於此Asn表示天門冬醯胺基，R3 表示胺甲酸系或者醯胺系保護基；Ac表示乙醯基
- 如申請專利範圍第2項所述的糖鏈構造之解析方法，係於(b)步驟之後，具備(c)以使用胺基管柱或醯胺基管柱之順相層析法處理之步驟。
- 如申請專利範圍第2項所述的糖鏈構造之解析方法，係於(c)步驟之前，具備(d)以糖水解酶處理之步驟。
- 如申請專利範圍第2項所述的糖鏈構造之解析方法，其中，該質量分析法係依據MALDI-TOF MS之質量分析法。
- 一種糖鏈衍生物，係由下表所示糖鏈衍生物所成群組選出者式中R4 表示2-羧基苯基，3-羧基苯基，4-羧基苯基，對-乙氧基羰基苯基，或2-吡啶基，羥基，基-Asn-或者基-Asn-R5 ；於此Asn表示天門冬醯胺基，R5 表示胺甲酸系或者醯胺系保護基；Ac表示乙醯基：
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