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TWI466679B - 環化胜肽之用途 - Google Patents

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TWI466679B
TWI466679B TW99105219A TW99105219A TWI466679B TW I466679 B TWI466679 B TW I466679B TW 99105219 A TW99105219 A TW 99105219A TW 99105219 A TW99105219 A TW 99105219A TW I466679 B TWI466679 B TW I466679B
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Bernhard Fischer
Rudolf Lucas
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Apeptico Forschung & Entwicklung Gmbh
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Description

環化胜肽之用途
本發明係關於一種預防及處理細胞滲漏情形之方法，特別是一種針對上皮及內皮細胞滲漏情形的方法。
內皮及上皮細胞係為構成人體及動物體內各器官的基本構造材料，各具有決定性的功能。內皮層係由一層扁平內皮細胞所組成，主要形成血管內壁，如靜脈及微血管，為血管管腔內血液及其管壁間之障壁，內皮細胞延伸至整個血液循環系統，包含主要血管甚至是最小的微血管；上皮細胞則係形成單層或多層細胞，分布於人體及動物體之體表，上皮細胞主要係由緊密連結的細胞及少量細胞間質所組成，上皮細胞的外層、游離層、內腔及基層，常特化成不同構形，以適應其特殊生理功能，同時，上皮細胞係具有一連結複合體(adhesion complex，又稱junctional complex)，形成細胞之物化障壁及鄰近上皮細胞之連結，該連結複合體係由一閉鎖小帶[zonula occludens，又稱緊密結合(tight junction)]、一黏著小帶[zonula adherens，黏著結合又稱(adhesion junction)及一橋粒[desmosome，又稱黏合斑(macula adherens)]。
由上得知，細胞的完整性及限制性對於人體及生物體各器官之生理功能係具有極為重要的意義，舉例說明之，若血管之內皮細胞或上皮細胞遭受損傷，血管管腔內的液體則會流出至血管外部，嚴重影響生物體之正常生理活 性；再者，若各器官之內皮細胞或上皮細胞遭受損傷，各器官腔室內的體液則會流出至腔室外部，或造成體液滲漏，導致各器官嚴重損害及影響其功能性。一般而言，臨床上由內皮細胞及上皮細胞之損傷而造成液體流出的現象稱為高滲漏(hyperpermeability)，係指血管管腔內的液體不受限制地由血管內流至重要器官及組織；造成高滲漏的原因除了機械性的創傷外，病原菌的感染或是毒素的影響都可能造成高滲漏的現象。
微生物毒素(microbial toxins)係一種由革蘭氏陽性細菌(gram-positive bacteria)所分泌之穿孔性的分子，主要結合於膽固醇，該微生物毒素可以造成細胞膜的階段性穿孔，而使體液自細胞內層釋出。常見的微生物毒素如單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes )所分泌的李斯特菌溶菌素(Listeriolysin；LLO)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )所分泌的鏈球菌溶菌素(Pneumolysin；PLY)，此類微生物毒素可在細胞內形成活性氧分子(reactive oxygen molecules)，造成內皮細胞及上皮細胞之損傷，以致影響其細胞障壁之功能。
一般來說，內皮細胞及上皮細胞為維持細胞障壁之功能，係由相鄰細胞間之蛋白纖維，如肌凝蛋白輕鏈(myosin light chain)相互連結；然而，微生物毒素可造成該肌凝蛋白輕鏈之磷酸化，破壞細胞間的連接關係，造成細胞間隙，以致細胞內的液體嚴重滲漏至細胞外部；再者，內皮細胞及上皮細胞間之屏壁功能係由一蛋白激酶C調控，該蛋白激酶C另含多種異蛋白激酶，如蛋白激酶α 及β ，該異蛋 白激酶可被活性氧分子、過氧化氫、微生物毒素(如李斯特菌溶菌素及鏈球菌溶菌素)及親水性冠狀病毒蛋白刺激而活化，活化後的異蛋白激酶可阻斷上皮鈉離子通道(epithelial sodium channel；ENaC)之表現，影響鈉離子與體液於上皮細胞之流通，造成高滲漏的現象。
肺細胞之高滲漏現象多由病毒感染造成，如流行性感冒病毒(influenza viruses)，嚴重急性呼吸道症候群相關冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome-associated corona-virus；SARS-CoV)或呼吸道融合瘤病毒(respiratory syncytial virus)，嚴重時更可導致融合瘤肺炎；其中，嚴重急性呼吸道症候群相關冠狀病毒蛋白可刺激異蛋白激酶之活化，影響上皮鈉離子通道之活性及功能，使細胞高滲漏之現象更為嚴重；而由病毒所引起之肺部疾病無法由習用治療藥物如β 2腎上腺素受體激動藥達到治療效果。
承上所述，由革蘭氏陽性細菌所分泌之微生物毒素為可致使內皮細胞及上皮細胞產生大量的活性氧分子，造成肌凝蛋白輕鏈之磷酸化，破壞細胞間之連結關係，為導致細胞高滲漏現象的主因之一；而微生物毒素、活性氧分子及病毒蛋白則可刺激細胞內異蛋白激酶之活化，阻斷上皮鈉離子通道之表現，影響其作用活性，同樣為導致細胞高滲漏現象之主因。
發生於肺組織之高滲漏現象常衍生多種肺部疾病，如急性肺損傷(acute lung injury)、急性呼吸道症候群(acute respiratory distress syndrome；ARDS)及肺炎；然而，現今的醫療體系對於臨床上內皮細胞及上皮細胞之高滲漏現象 卻缺乏一普遍性的治療方式。本發明係藉由提供一種預防內皮細胞及上皮細胞發生高滲漏之方法及手段，以預防或治療如急性肺損傷、ARDS或病毒性肺疾病等疾病，其主要作用機制係以一生物性作用分子(biological effective molecule)預防及治療內皮細胞及上皮細胞之高滲漏現象，進一步達到治療或預防肺部疾病(如ARDS或病毒性肺疾病)之效果，避免肺部損傷及肺炎的發生；其中，該胜肽之序列組成係由7-17相鄰之胺基酸，該胜肽具有一六聚體TX1 EX2 X3 E，而X1 、X2 及X3 可以係任何天然或合成之胺基酸，使該胜肽為一環化且不具腫瘤壞死因子受體結合活性之構形，以預防及治療內皮細胞及上皮細胞之高滲漏現象，進一步說明之，該六聚體之序列可如序列辨識編碼4所示。
更詳言之，具有環化構形之胜肽序列較佳係選自下方序列辨識編碼：
-QRWTPEGAEAKPWY(請參照序列辨識編碼5)
-PKDTPEGAELKPWY(請參照序列辨識編碼6)
-CGQRETPEGAEAKPWYC(請參照序列辨識編碼1)
-CGPKDTPEGAELKPWYC(請參照序列辨識編碼7)
該胜肽係由至少7個胺基酸所組成，其部分片段形成TPEGAE之六聚體，該胜肽可用以製備治療及預防發生於內皮細胞及上皮細胞高滲漏現象之藥物，作為治療或預防肺炎、急性肺損傷、ARDA、病毒性肺疾病(特別係指由流行性感冒病毒、SARS或RSV引發之肺炎)或細菌性肺疾病(特別係指單核球增多性李斯特菌及肺炎鏈球菌所引起之 肺炎)之手段，上述所指之肺炎可以係由單一性病因所引起，如急性或慢性發炎所引起之肺炎，或是由細菌感染、病毒感染、黴漿菌感染、原生體感染、寄生蟲感染及真菌感染所引發之肺炎，也可以係為毒性(如吸入毒性物質)、免疫性或放射性因素(如接受x光照射、或癌症之放射性治療)而導致之肺炎；上述各種肺炎皆可藉由該胜肽達到治療及預防的效果，特別係由吸入毒性物或接受放射性治療而導致肺炎之患者，如老年人、免疫缺乏患者、愛滋病患或器官移植者，藉由該胜肽可以避免或治療因接受放射線治療而引發之肺水腫或肺損傷。
一般造成肺炎之主要病原為肺炎雙球菌、葡萄球菌、噬血桿菌、黴漿菌、退伍軍人菌(退伍軍人症)及病毒(如流感病毒、腺病毒及副流感病毒)；而造成肺炎之次要病原則為疱疹病毒(巨細胞病毒；CMV及單純疱疹病毒；HSV)、衣原體感染、真菌感染、卡氏肺囊蟲感染、原蟲(如弓蟲症)及厭氧細菌等；而習知胜肽，如歐盟專利公告第EP 1 264 599 B1號所揭示，係可以治療上述肺炎所產生之肺水腫，避免液體持續滲漏及累積，使水腫之液體由肺泡組織回收至微血管內，即由肺泡灌出；同時，該胜肽係影響液體之逆向滲漏，使該液體自微血管內皮層逆流至肺上皮層；更詳言之，該胜肽係啟動且完全活化一幫浦作用機制，以便將體液向外輸送，並且避免液體繼續滲漏。
本發明係針對該歐盟專利公告第EP 1 264 599 B1號所揭示之胜肽，提出一習知技術無法達成之技術手段，係針對前述由毒素、活性氧分子、活化蛋白激酶C、肌凝蛋 白輕鏈之磷酸化及上皮鈉離子通道所造成之反應，具有抑制之功效。
本發明係針對該歐盟專利公告第EP 1 264 599 B1號所揭示之肺水腫回收作用僅能針對疾病後期處理的缺點加以改良，提供一種治療高滲漏現象之方法，係遵循完全不同的作用機制，其主要作用原理係以逆向調控之方式將液體注入內皮層及上皮層，並且避免高滲漏現象之惡化以達預防肺水腫之功效。
本發明係針對該歐盟專利公告第EP 1 264 599 B1號所揭示之胜肽，提出一習知技術無法達成之技術手段，本發明所載明之胜肽對前述微生物由毒素造成生理反應、活性氧分子、活化蛋白激酶C、肌凝蛋白輕鏈的磷酸化及上皮鈉離子通道所造成之反應有所影響，具有抑制之功效。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：
提供一種胜肽，包含有7-17個相鄰之胺基酸，且該胜肽具有一六聚體TX1 EX2 X3 E，其中，X1 、X2 及X3 係任何天然或合成之胺基酸，且該胜肽為一環化且不具腫瘤壞死因子受體結合活性之構形，係具有預防及治療內皮細胞及上皮細胞之高滲漏現象的用途。
提供一種胜肽，包含有7-17個相鄰之胺基酸，及該胜肽具有一六聚體TPEGAE，且該胜肽為一環化且不具腫瘤壞死因子受體結合活性之構形，係具有預防及治療內皮細 胞及上皮細胞之高滲漏現象的用途。
提供一種環化胜肽，其序列組成為以下所述之連續片段：
-QRETPEGAEAKPWY
-PKDTPEGAELKPWY
-CGQRETPEGAEAKPWYC
-CGPKDTPEGAELKPWYC
該片段係包含至少7個胺基酸，及該胺基酸片段具有一六聚體TPEGAE，係具有製備預防及治療內皮細胞及上皮細胞高滲漏現象之藥物化合物的用途。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
本發明之胜肽，係包含CGQRETPEGAEAKPWYC之胺基酸序列，其中，以位於第1個及第17個之半胱胺酸(cysteine，縮寫為C)形成環化，本發明之胜肽的環化得藉由該胜肽之N端和C端上兩個半胱胺酸之間的雙硫鍵直接形成，或藉由前後端兩個半胱胺酸連結至一載體。因此，本發明之胜肽所用以連結之半胱胺酸，較佳位於該胜肽前端及後端。此外，亦可使用其他產生環化的官能基，如具有酸性官能基的醯胺化合物或以胺類或醇類形成封閉的酯環，舉例來說，胺基酸中，天冬胺酸(asparatic acid)和麩胺酸(glutamic acid)可以和分子內的絲胺酸(serine)、酥胺酸 (threonine)、酪胺酸(tyrosine)、天冬醯胺(asparagine)、麩醯胺酸(glutamine)或離胺酸(lysine)形成分子內鍵結，如下述本發明進一步所提之序列辨識編碼：
-CGQKETPEGAEAKPWYC(請參照序列辨識編碼8)
-CGQRETPEGAEARPWYC(請參照序列辨識編碼9)
-CGQRETPEGAEAKPC(請參照序列辨識編碼10)
-CQRETPEGAEAKPWYC(請參照序列辨識編碼11)
-CGQRETPEGAEAKFWYC(請參照序列辨識編碼12)
就本發明之載體而言，任何藥理上一般使用之載體形式皆可應用於此，該載體較佳係具有與半胱胺酸上之硫氫基(SH-)形成共價鍵的能力，如鱟血清蛋白(keyhole limpet hemocyanin；KLH)和破傷風毒素(tetanus toxin)。另外，鄰近且具兩種功能的殘基(residue)亦可應用在本發明之載體上，如胺基或醇類旁的酸基(acid group)；在此種連結方式中，該胜肽之分子內連結所形成的環化以及與載體之交互作用關係(自該胜肽之N端和C端與載體連結)係具有重要性，而此，該胜肽之環化可形成一環化的三級結構而具有穩定性。
本發明之胜肽，較佳係應用於內皮及上皮細胞之保護，以對抗由活性氧分子或細菌性毒素所導致的高滲漏現象，該胜肽亦可用以抑制肌凝蛋白輕鏈的磷酸化、抑制蛋白激酶C活化，或用來增加上皮鈉離子通道的表現；由此，該胜肽可用來治療由活性氧分子、細菌性毒素、革蘭氏陽性菌或肺病毒感染所引發的高滲漏。
本發明之藥物化合物係包含：一如前所述之胜肽(或由 混合本發明之多種胜肽而得的組合物)以及一藥物載劑。根據本發明之藥物化合物是應用於預防及治療由肺炎、急性肺損傷、ARDS或病毒性肺疾病所引發之高滲漏，特別係指由單核球增多性李斯特菌、肺炎鏈球菌、SARS、RSV或流行性感冒病毒(特別係指A型感冒病毒)所引起之感染。本發明之藥物化合物係為任一包含前述胜肽之藥物組成，可用以預防、治療或可用以增進抑制前述情形之現象；該藥物化合物係為該前述胜肽與一藥物載劑、一佐劑或兩者之組合物。
一般而言，常用的藥物載劑或佐劑通常為生理食鹽水、林洛氏液(Ringer’s solution)、葡萄糖液(dextrose solution)、漢克氏透析液(Hank’s solution)、固定用油(fixed oils)、油酸乙酯(ethyl oleate)、含有5%葡萄糖之生理食鹽水(5% dextrose in saline solution)、用以增加藥物滲透壓及化學穩定性之溶質，緩衝性溶液和保存溶劑。較佳之載體選擇係採用不具個體抗原性的載體，如蛋白質、多醣類、聚乳酸(polylactic acids)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid)、胺基酸聚合物(polymeric amino acid)和胺基酸多聚體(amino acid copolymers)，以避免於使用後引發個體產生有害的抗體反應。而本發明之胜肽係以共價鍵結合選用載體形成環化，由此，任何熟悉該領域之專業人員得以任何方式進行該藥物化合物之施用，又以非口服途徑(parenteral)之使用為佳，特別係以噴霧器吸入或靜脈注射。以非口服方式之施用為例，係將本發明之藥物化合物配製成一注射劑型，如一溶液、乳狀液體或懸浮液的型態， 以配合上述載體之使用。
該胜肽之劑量及使用劑型應對應施用個體之不同而有所差異，一般來說，本發明之胜肽所施用的劑量為1μg/kg~10μg/kg之間，更佳係以10μg/kg~5mg/kg之間，或以0.1~2mg/kg之間，多以藥錠形式施藥；另外，也可以持續性給藥方式施藥。本實施例係採用每分鐘5~20μg/kg，更佳係每分鐘7~15μg/kg之高劑量。
本發明之胜肽係含有如序列辨識編碼1所示之胜肽序列：
為證實本發明之胜肽的確具有降低活性氧分子、抑制高滲漏現象之活性及減少肌凝蛋白輕鏈的磷酸化等作用，進行以下試驗：
首先，測定人類肺內皮細胞中活性氧分子的濃度，發現該肺內皮細胞在含氧量正常(21% oxygen,normoxic gas mixture)之培養環境(為一常氧環境)下僅會產生少量活性氧分子；然而當該肺內皮細胞處於一缺氧環境(0.1% oxygen,hypoxic gas mixture)，則可產生三倍濃度的活性氧分子。若將本發明之胜肽(特別係如序列辨識編碼1所示之胜肽)與該肺內皮細胞共同培養，即使係培養於該缺氧環境則仍未見有活性氧分子之產生，因此可證實本發明之胜肽具有抑制內皮細胞產生活性氧分子之功效。
又，分別以電子細胞基質阻抗判斷分析(electrical cell-substrate impedance analysis；ECSI)測試人類肺內皮及 人類肺上皮細胞層在加入微生物毒素(鏈球菌溶菌素和李斯特菌溶菌素)共同培養的前、中及後期所得之電阻差異。
由所測得之電阻差異顯示，人類肺內皮細胞於添加125ng/ml和250ng/ml李斯特菌溶菌素後發生高滲漏現象，其中以添加250ng/ml李斯特菌溶菌素後，該人類肺內皮細胞有更明顯的持續滲漏現象；另外，添加62.5ng/ml鏈球菌溶菌素後，該人類肺內皮細胞也有高滲漏現象，且添加125ng/ml鏈球菌溶菌素後有更明顯持續滲漏的現象；然而，該滲漏現象在添加本發明之胜肽(50μg/ml)後得以抑制，特別是添加本發明如序列辨識編碼1所示之胜肽，因此得知，本發明之胜肽具有抑制由微生物毒素所引發的高滲漏現象之功效。
由上述結果得知，微生物毒素可引發人類肺上皮細胞之高滲漏現象，由此，人類肺上皮細胞與1μg/ml李斯特菌溶菌素共同培養後，該人類肺上皮細胞即出現高滲漏現象，然而，該滲漏現象可在添加本發明之胜肽後得以抑制，特別是添加50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽。
再進一步試驗，將人類肺內皮細胞加入微生物毒素後引發肌凝蛋白輕鏈磷酸化之現象。添加125ng/ml李斯特菌溶菌素，人類肺內皮細胞之肌凝蛋白輕鏈磷酸化含量增加，接著提高微生物毒素之濃度，添加250ng/ml李斯特菌溶菌素及125ng/ml鏈球菌溶菌素，該肌凝蛋白輕鏈磷酸化含量增加的現象更甚；此外，添加62.5ng/ml鏈球菌溶菌素，人類肺內皮細胞之肌凝蛋白輕鏈磷酸化含量亦增加，然而，由上述二種微生物毒素所引發肌凝蛋白輕鏈磷酸化 含量增加之現象皆可在添加本發明之胜肽後得以抑制，特別是添加50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽。
更進一步利用動物模式進行試驗，係將微生物毒素以氣管內投藥的方式(intratracheal application)施與數隻實驗小鼠，引發該實驗小鼠肺細胞的高滲漏，再由伊凡氏藍染劑自血管滲入肺組織的程度檢視滲漏現象。由上述試驗得知，將本發明之胜肽(50μg)以氣管內投藥的方式投至該實驗小鼠，特別是如序列辨識編碼1所示之胜肽，可有效抑制由內毒素引發之高滲漏現象。
更詳言之，以上述機制將250ng的鏈球菌溶菌素投至該實驗小鼠肺部，除了引發高滲漏的情形之外，同時可發現該實驗小鼠支氣管肺泡液中的白血球數量增加，而藉由本發明胜肽之投予(50μg)，特別是序列辨識編碼1所示之胜肽，可同時抑制由微生物毒素所引發的高滲漏現象，以及，抑制因微生物毒素所引發支氣管肺泡液白血球數增加之情形。
再者，微生物毒素亦會對人類肺內皮細胞造成異蛋白激酶α的活化，然而添加本發明之胜肽，特別是序列辨識編碼1所示之胜肽，可抑制異蛋白激酶α的活化，並且增加該上皮細胞中鈉離子通道的表現；同理可證，將本發明之胜肽，特別是如序列辨識編碼1所示之胜肽，投至以微生物毒素處理後之人類肺上皮細胞，可增加該上皮細胞中鈉離子通道的表現。
1A、合成如序列辨識編碼1所示之胜肽
利用Fmoc固相胜肽合成法(Fmoc solid phase synthesis) 自動合成如序列辨識編碼1所示之胜肽，其步驟如第1表：
而後，將如序列辨識編碼1所示之胜肽上位置1和17半胱胺酸之支鏈氧化形成雙硫鍵，形成一環狀胜肽。利用逆向高效液相層析儀(reverse HPLC)定性該胜肽，結果如第1a圖所示，且該胜肽純度高於95%。
1B、合成如序列辨識編碼2所示之胜肽
如序列辨識編碼2所示之胜肽序列如下：
該序列辨識編碼2所示之胜肽係具有由位置1的離胺酸支鏈與位置19的麩胺酸之羰基所形成的醯胺鍵。
利用Fmoc固相胜肽合成法(Fmoc solid phase synthesis)自動合成如序列辨識編碼2所示之胜肽，其步驟如第2表：
環化發生於如序列辨識編碼2所示之胜肽位置1的離胺酸上ε位胺基及位置19的麩胺酸上γ位羰基間的醯胺鍵結。利用二環己基碳二亞胺(dicyclohexylcarboniimide；DHC)將麩胺酸的γ位羰基傳送到活化的酯基，該酯基係自發地與離氨酸的ε位胺基反應，進而封閉形成環化。進一步利用逆向高效液相層析儀定性如序列辨識編碼2所示之胜肽，結果如第1b圖所示，且該胜肽純度高於95%。
1C、合成如序列辨識編碼3所示之胜肽
如序列辨識編碼3所示之胜肽序列如下：
利用Fmoc固相胜肽合成法(Fmoc solid phase synthesis)自動合成如序列辨識編碼3所示之胜肽，其步驟如第3表：
而後，將如序列辨識編碼3所示之胜肽上位置1和17 半胱胺酸之支鏈氧化形成雙硫鍵，形成一環狀胜肽。使用逆向高效液相層析儀定性如序列辨識編碼3所示之胜肽，結果如第1c圖所示，且該胜肽純度高於95%。
如序列辨識編碼3所示之胜肽與如序列辨識編碼1所示之胜肽之不同在於，如序列辨識編碼1所示之胜肽之位置6的酥胺酸、位置8和位置11的麩胺酸置換成丙胺酸，即如序列辨識編碼3所示之胜肽。
2.如序列辨識編碼1所示之胜肽對活性氧分子之影響
A.人類肺內皮細胞之培養
培養人類肺內皮細胞，該培養條件分別為無添加任何胜肽、添加50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽及添加50μg/ml如序列辨識編碼3所示之胜肽。為產生活性氧分子，將該內皮細胞培養在缺氧(hypoxic gas mixture)環境中，其氣體組成百分比為0.1%氧氣、5%一氧化碳和94.9%氮氣，以引發活性氧分子之產生；另操作一對照組係將該內皮細胞培養於一常氧(normoxic gas mixture)環境，其氣體組成百分比為21%氧氣、5%一氧化碳和74%氮氣。
經過90分鐘的缺氧培養，將該內皮細胞移至該常氧環境下繼續培養30分鐘後，添加20μl之藥物溶液，該藥物溶液包含濃度25μM的鐵離子螯合劑(desferrioxamine)、20μM的磷酸緩衝溶液(DPBS)、5μM的二乙基二硫基氨基甲酸鹽(diethyldithiocarbamate；DTC)和20μM的CHM(1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine)，以及2μl的DMSO至細胞中。
B.細胞之胰蛋白酶消化法(trypsinization)
待細胞培養之後，添加一般實驗室常用胰蛋白酶溶液，以35μl溶液沖洗並懸浮細胞，該溶液包含25μM的鐵離子螯合劑、5μM的DTC和磷酸緩衝溶液。
C.電子順磁共振(electron paramagnetic resonance；EPR)量測活性氧分子
電子順磁共振，又稱電子自旋共振(electron spin resonance；ESR)，用來研究物質的順磁性，例如，偵測活性氧分子的不成對電子(氧分子上的自由基)。將前述處理過的細胞移至50μl毛細管中，並以電子自旋共振儀(MiniScope MS200 ESR Magnettech；Berlin,Germany)偵測活性氧分子，設定40微瓦(mW)之微波，調幅3000微高斯(mG)，調頻100千赫茲(kHz)。
如第2a及2b圖所示，培養於無添加任何胜肽之人類肺內皮細胞，於該常氧環境中形成少量的活性氧分子，而該人類肺內皮細胞於該缺氧環境中所形成的活性氧分子量則是於該常氧環境下形成活性氧分子的3倍；培養於添加如序列辨識編碼1所示之胜肽之人類肺內皮細胞於該缺氧環境下不會產生活性氧分子；添加如序列辨識編碼3所示之胜肽之人類肺內皮細胞者於該缺氧環境下則無法抑制活性氧分子之產生。
如序列辨識編碼3所示之胜肽與如序列辨識編碼1所示之胜肽之不同在於，如序列辨識編碼1所示之胜肽之位置6的酥胺酸、位置8和位置11的麩胺酸置換成丙胺酸，即如序列辨識編碼3所示之胜肽。
3.如序列辨識編碼1所示之胜肽抑制人類肺內皮及人類肺上皮細胞之高滲漏現象
A.材料
本實施例採用H441型人類肺上皮細胞，係購自ATCC公司；本實施例採用人類肺內皮細胞，係購自龍沙公司(Lonza)，且該人類肺內皮細胞係自肺部微血管分離而得；本實施例採用李斯特菌溶菌素及鏈球菌溶菌素係取得於德國吉森(Giessen)大學。
B.細胞培養
H441型人類肺上皮細胞及自肺部微血管分離出來的人類肺內皮細胞，以一般實驗室常用細胞培養法培養，其中H441型人類肺上皮細胞以商用的RPMI 1640培養基培養，該培養基另外添加有2mM L-麩醯胺酸、1.5g/l碳酸鈉、4.5g/l葡萄糖、10mM赫爾佩斯緩衝溶液(HEPES buffer,pH7.4)、10%牛血清。ECIS實驗則在無血清培養基中進行。
C.高滲漏
為了製造人類肺上皮細胞及人類肺內皮細胞之損傷，進而引發高滲漏現象，將該人類肺上皮細胞及該人類肺內皮細胞以一般實驗室培養方式進行培養，使該人類肺上皮細胞形成一連續細胞層，並且分別添加李斯特菌溶菌素及鏈球菌溶菌素。
D.測定人類肺內皮細胞層之電阻
利用電子細胞基質阻抗判斷分析(ECSI)在該人類肺內皮細胞添加微生物毒素的前、中、後期分別測量該細胞層之電阻。
如第3a圖所示，添加125ng/ml李斯特菌溶菌素至該人類肺內皮細胞，其電阻值下降，表示發生高滲漏現象；添加李斯特菌溶菌素之濃度增加為500ng/ml，該現象更甚。
如第3b圖所示，添加62.5ng/ml鏈球菌溶菌素至該人類肺內皮細胞，其電阻值下降，表示發生高滲漏現象；添加鏈球菌溶菌素濃度增加為250ng/ml，該現象更甚。
如第3c圖所示，添加125ng/ml鏈球菌溶菌素至該人類肺內皮細胞，其電阻值下降，表示發生高滲漏現象；添加125ng/ml鏈球菌溶菌素及50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽，可抑制由鏈球菌溶菌素所造成的高滲漏現象。
如第3d圖所示，添加500ng/ml李斯特菌溶菌素至該人類肺內皮細胞，其電阻值下降，表示發生高滲漏現象；添加500ng/ml李斯特菌溶菌素及50μg/ml序列辨識編碼1所示之胜肽，可抑制由李斯特菌溶菌素所造成的高滲漏現象。
如第3e圖所示，添加1μg/ml李斯特菌溶菌素至該人類肺內皮細胞，其電阻值下降，表示發生高滲漏現象；添加1μg/ml李斯特菌溶菌素及50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽，可抑制由李斯特菌溶菌素所造成的高滲漏現象。
4.如序列辨識編碼1所示之胜肽抑制肌凝蛋白輕鏈的磷酸化
A.材料
本實施例採用人類肺內皮細胞，係購自龍沙公司(Lonza)，且該人類肺內皮細胞係自肺部微血管分離而得；本實施例採用李斯特菌溶菌素及鏈球菌溶菌素係取得於德 國吉森(Giessen)大學。
B.細胞培養
該人類肺內皮細胞係分離自肺部微血管，且該人類肺內皮細胞以一般實驗室常用細胞培養法培養。
C.測定肌凝蛋白輕鏈的磷酸化
為了測量該人類肺內皮細胞中肌凝蛋白輕鏈的磷酸化及如序列辨識編碼1所示之胜肽對其之影響，以磷酸緩衝溶液(pH7.4)清洗該人類肺內皮細胞，且該磷酸緩衝溶液含有1mM釩酸(orthovanadate)。細胞裂解(cell lysed)是將該人類肺內皮細胞培養在含有20mM Tris緩衝溶液(Tris buffer,pH7.4)，150mM氯化鈉，1mM二價離子螯合劑(EDTA)，1mM鈣離子螯合劑EGTA，2.5mM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，1mM釩酸鈉(sodiumvanadate)，1mM甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate)，1ug/ml蛋白質分解酶抑制劑(leupeptine)，1mM苯甲基磺醯化氟(phenyl-methylsulfonylfluoride；PMSF)及1%非離子型界面活性劑Triton X-100的溶液。此外，利用超音波震盪器震碎該人類肺內皮細胞，離心取得一細胞均質液(cell lysate)中可溶於水的內容物，進行變性電泳分離技術(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel；SDS-PAGE)依據不同分子量的蛋白質進行分離。將膠體上的蛋白質轉漬到硝化纖維膜(nitrocellulose membrane)上得到一蛋白漬(protein blot)，以一般實驗室處理方式將該蛋白漬浸潤在含有0.1% Tween 20和5%乾牛奶粉末溶液中一小時後，再將該蛋白漬移至含有與肌凝蛋白輕鏈或磷酸化之肌凝蛋白輕鏈相對應之抗 體溶液中浸泡，使該抗體與該蛋白漬上肌凝蛋白輕鏈或磷酸化之肌凝蛋白輕鏈相結合。為觀察該肌凝蛋白輕鏈是否產生磷酸化之情形，以一般實驗室之所使用化學冷光(chemiluminescence)感光底片診斷與該蛋白漬結合的抗體所發出之訊號，再以光密度計(densitometry)分析該抗體訊號的強弱。
如第4a圖所示，添加125ng/ml李斯特菌溶菌素至人類肺內皮細胞，其肌凝蛋白輕鏈磷酸化之量增加；添加濃度增加為250ng/ml，該現象更甚。
如第4b圖所示，添加62.5ng/ml鏈球菌溶菌素至人類肺內皮細胞，其肌凝蛋白輕鏈磷酸化之量增加；添加濃度增加為125ng/ml，該現象更甚。
如第4c圖所示，添加125ng/ml李斯特菌溶菌素至人類肺內皮細胞，其肌凝蛋白輕鏈磷酸化之量增加；添加50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽，對肌凝蛋白輕鏈磷酸化量之改變並無影響；將添加李斯特菌溶菌素濃度提高為250ng/ml，且添加50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽，其肌凝蛋白輕鏈磷酸化之量增加的情形便得以抑制；至於添加如序列辨識編碼3所示之胜肽對於抑制李斯特菌溶菌素所造成肌凝蛋白輕鏈磷酸化之量沒有顯著影響。
如第4d圖所示，添加62.5ng/ml鏈球菌溶菌素至人類肺內皮細胞，其肌凝蛋白輕鏈磷酸化之量增加；添加50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽，對肌凝蛋白輕鏈磷酸化之量並無影響；將添加鏈球菌溶菌素濃度提高為 125ng/ml，且添加50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽，其肌凝蛋白輕鏈磷酸化之量增加的情形便得以抑制；至於添加如序列辨識編碼3所示之胜肽對於抑制鏈球菌溶菌素所造成磷酸化之肌凝蛋白輕鏈量沒有顯著影響。
如序列辨識編碼3所示之胜肽與如序列辨識編碼1所示之胜肽之不同在於，如序列辨識編碼1所示之胜肽之位置6的酥胺酸、位置8和位置11的麩胺酸置換成丙胺酸，即如序列辨識編碼3所示之胜肽。
5.在動物模式中如序列辨識編碼1所示之胜肽對高滲漏與急性肺損傷之影響
A.誘發實驗小鼠的高滲漏
利用氣管內投藥裝置給予數隻實驗小鼠吸入性麻醉劑(isoflurance)與氧氣混合，靜脈注射100ul麻醉劑ketamine/rompun(1.33：1)至該實驗小鼠體內進行麻醉。為引發肺的高滲漏現象，用皮下注射器將25μl不同條件之溶液呈噴霧狀注入體內，該溶液分別為重量百分濃度0.9%之生理食鹽水、250ng鏈球菌溶菌素或250ng鏈球菌溶菌素及50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽等不同條件。
B.使用伊凡氏藍染劑觀察高滲漏現象
該實驗小鼠給予250ng鏈球菌溶菌素經過5.5個小時後，透過靜脈注射重量百分濃度0.9%之生理食鹽水，該生理食鹽水係含有伊凡氏藍染劑，且該注射量為100mg/kg。經過30分鐘後，將心臟刺穿回收血液，並取下肺部，以1mM EDTA磷酸緩衝溶液(pH 7.4)清洗後，以液態氮急速冷凍。為測定伊凡氏藍染劑在肺組織中的含量，取肺組織放 入冷的磷酸緩衝溶液中均質(每100mg的組織加1ml的緩衝溶液)，並浸入福馬林溶液18個小時後，以5000g之轉速離心30分鐘取其上清液，以分光光度計測定該上清液於620nm和740nm之吸收值。
以伊凡氏藍染劑溶於福馬林溶液之吸收值作為參考背景值，並且扣除血紅素吸收光之基礎值後，得到肺組織中伊凡氏藍染劑之含量。將肺部微血管滲漏伊凡氏藍染劑之量與血清中含有伊凡氏藍染劑的量相比，評估由鏈球菌溶菌素引起高滲漏之表現。
如第5a圖所示，以氣管內投藥裝置給予該實驗小鼠250ng和500ng鏈球菌溶菌素後，測量到通過肺部微血管進入肺組織中之血液帶有伊凡氏藍染劑，故該染劑之吸收值增加，證實以氣管內投藥裝置給予該實驗小鼠鏈球菌溶菌素確實造成高滲漏現象。
如第5b圖所示，以氣管內投藥裝置給予該實驗小鼠250ng鏈球菌溶菌素後，測量到通過肺部微血管進入肺組織中之血液帶有伊凡氏藍染劑，故該染劑之吸收值增加，證實以氣管內投藥裝置給予該實驗小鼠鏈球菌溶菌素確實造成高滲漏現象；利用同一裝置給予50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽，則抑制該高滲漏現象。
如第5c圖所示，以氣管內投藥裝置給予該實驗小鼠250ng鏈球菌溶菌素引起高滲漏，造成支氣管肺泡液中白血球數量增加；利用同一裝置給予50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽，則抑制該高滲漏現象且支氣管肺泡液中白血球數量明顯地減少。
6.如序列辨識編碼1所示之胜肽抑制蛋白激酶C的活化
A.材料
本實施例採用人類肺內皮細胞，係購自龍沙公司(Lonza)，且該人類肺內皮細胞係自肺部微血管分離而得；本實施例採用李斯特菌溶菌素及鏈球菌溶菌素係取得於德國吉森(Giessen)大學。
B.細胞培養
該人類肺內皮細胞係分離自肺部微血管，且該人類肺內皮細胞以一般實驗室常用細胞培養法培養，其培養過程中分別添加250ng/ml鏈球菌溶菌素或250ng/ml鏈球菌溶菌素和50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽。
C.測定活化的異蛋白激酶α的含量
利用酵素免疫分析(ELISA)測定活化的異蛋白激酶α(phospho-threonine 638 protein kinase Cα)之抗體含量，同時以商品化的ELISA套組測定異蛋白激酶α總量。
如第6圖所示，由於鏈球菌溶菌素的影響，與異蛋白激酶α總量相比有很高的異蛋白激酶α被活化，而另外再添加如序列辨識編碼1所示之胜肽，該人類肺內皮細胞之異蛋白激酶α被活化的比例明顯地減少。
7.如序列辨識編碼1所示之胜肽促進人類肺上皮細胞鈉離子通道的表現
A.材料
本實施例採用H441型人類肺上皮細胞，係購自ATCC公司。
B.細胞培養
H441型人類肺上皮細胞，以一般實驗室常用細胞培養法培養。培養基為商品化的RPMI 1640培養基，其中添加2mM L-麩胺醯胺、1.5g/l碳酸鈉、4.5g/l葡萄糖、10mM赫爾佩斯緩衝溶液(HEPES buffer,pH7.4)及10%牛血清。
C.證明人類肺上皮細胞鈉離子通道(ENaC)的表現
培養3組人類肺上皮細胞，分別為無添加任何胜肽、添加50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽及添加50μg/ml如序列辨識編碼3所示之胜肽。利用即時定量聚合酶鏈鎖反應(Real-Time PCR)分別測定上述不同條件之鈉離子通道的表現。
如第7圖所示，當添加50μg/ml如序列辨識編碼1所示之胜肽，該上皮細胞之鈉離子通道的表現為無添加任何胜肽的三倍；然而，添加50μg/ml如序列辨識編碼3所示之胜肽其鈉離子通道的表現則無顯著影響。
如序列辨識編碼3所示之胜肽與如序列辨識編碼1所示之胜肽之不同在於，如序列辨識編碼1所示之胜肽之位置6的酥胺酸、位置8和位置11的麩胺酸置換成丙胺酸，即如序列辨識編碼3所示之胜肽。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1a圖：如序列辨識編碼1所示之胜肽之高效液相層析儀分析結果。
第1b圖：如序列辨識編碼2所示之胜肽之高效液相層析分析儀結果。
第1c圖：如序列辨識編碼3所示之胜肽之高效液相層析分析儀結果。
第2a圖：人類肺內皮細胞之電子順磁共振圖譜。
第2b圖：人類肺內皮細胞中活性氧分子含量示意圖。
第3a圖：李斯特菌溶菌素誘發人類肺上皮細胞電阻改變之示意圖。
第3b圖：鏈球菌溶菌素誘發人類肺上皮細胞電阻改變之示意圖。
第3c圖：鏈球菌溶菌素誘發人類肺上皮細胞電阻改變之又一示意圖。
第3d圖：李斯特菌溶菌素誘發人類肺上皮細胞電阻改變之又一示意圖。
第3e圖：李斯特菌溶菌素誘發人類肺上皮細胞電阻改變之再一示意圖。
第4a圖：李斯特菌溶菌素誘發人類肺內皮細胞中肌凝蛋白輕鏈磷酸化之示意圖。
第4b圖：鏈球菌溶菌素誘發人類肺內皮細胞中肌凝蛋白輕鏈磷酸化之示意圖。
第4c圖：李斯特菌溶菌素誘發人類肺內皮細胞中肌凝蛋白輕鏈磷酸化之又一示意圖。
第4d圖：鏈球菌溶菌素誘發人類肺內皮細胞中肌凝蛋白輕鏈磷酸化之示意圖。
第5a圖：實驗小鼠肺組織之伊凡氏藍染色結果圖。
第5b圖：實驗小鼠肺組織之伊凡氏藍染色結果圖。
第5c圖：實驗小鼠支氣管肺泡液之白血球含量示意圖。
第6圖：人類肺內皮細胞中活化異蛋白激酶之含量示意圖。
第7圖：人類肺上皮細胞中鈉離子通道表現之定量結果。

Claims (1)

  1. 一種環化胜肽之用途，係用以製備預防肺水腫之藥物，該環化胜肽係減少內皮細胞及上皮細胞損傷所造成之高滲漏現象，以預防肺水腫；其中，該環化胜肽係具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列，且由位置1及17半胱胺酸之支鏈氧化形成雙硫鍵所形成。
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