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TWI462744B - 類固醇節約劑及彼之使用方法 - Google Patents

類固醇節約劑及彼之使用方法 Download PDF

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TWI462744B
TWI462744B TW094110385A TW94110385A TWI462744B TW I462744 B TWI462744 B TW I462744B TW 094110385 A TW094110385 A TW 094110385A TW 94110385 A TW94110385 A TW 94110385A TW I462744 B TWI462744 B TW I462744B
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Ivan Lieberburg
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Biogen Idec Inc
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Description

類固醇節約劑及彼之使用方法
本發明係普遍地關於一種類固醇節約劑之使用於用於治療發炎性腸道疾病(IBD,inflammatory bowel diseases)、氣喘、克隆氏症(CD,Crohn's disease)、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graftversus host disease)、宿主抗植體疾病、及不同脊椎關節病變(Spondyloarthropathies)之藥劑的製備，包含有給予需要的病患一種類固醇節約免疫球蛋白或小分子組合物。本發明亦普遍地關於治療此等病症之組合療法。
發炎為血管化組織對於感染或傷害的一種反應及係受白血球黏著至血管的內皮細胞及其滲透入周圍組織而影響。於正常發炎中，滲透的白血球釋放毒性介質殺死入侵的生物，吞噬殘骸及死亡的細胞，及在組織修復及免疫反應上扮演重要角色。然而，於病理的發炎中，滲透的白血球為過度反應及可造成嚴重或致命的損害。見如Hickey,Psychoneuroimmunology II(Academic Press 1990)。
整合素(integrin)為涉及細胞黏著、免疫細胞移動及活化之細胞表面醣蛋白家族。α－4整合素係由除了嗜中性白血球(neutrophils)外之所有循環白血球表現，及與β－1(β1 )或β－7(β7 )整合素次單元結合形成異二聚體受體；α－4β－1(α4 β1 )及α－4β－7(α4 β7 )兩者在白血球穿越血管內皮的移動中扮演重要角色(Springer等人，Cell 1994,76：301－14；Butcher等人，Science 1996,272：60－6)及促成實質組織(parenchyma)內的細胞活化及存活(Damle等人，J.Immunol.1993,151：2368－79；Koopman等人，J.Immunol.1994,152：3760－7；Leussink等人，Acta Neuropathol.2002,103：131－136)。α4 β1 持續性表現於淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜鹼性白血球及嗜酸性白血球上。
α4 β1 (也稱為極遲抗原－4，VLA－4,very late antigen－4)結合至血管細胞黏著分子－1(Lobb等人，J.Clin.Invest.1994,94：1722－8)，其於許多慢性發炎處由血管內皮表現(Bevilacqua等人，1993 Annu.Rev.Immunol.11：767－804；Postigo等人，1993 Res.Immunol.144：723－35)。α4 β1 具有其他配體，包括纖維結合蛋白(fibronectin)及其他細胞外間質(ECM,extracellular matrix)成份。
α4 β7 二聚體與黏膜附素細胞黏著分子(MAdCAM－1,mucosal addressin cell adhesion molecule)相互作用，及調節淋巴細胞歸巢至腸(Farstad等人，1997 Am.J.Pathol.150：187－99；Issekutz,1991,J.Immunol.147：4178－84)。在具有發炎性腸道疾病(IBD,inflammatory bowel diseases)的病患之腸道中發炎處，MAdCAM－1於血管內皮上的表現也為增加(Briskin等人，1997 Am.J.Pathol.151：97－110)。
黏著分子如α4 整合素為治療藥劑的潛在目標。例如，α4 整合素為次單元的VLA－4受體為重要的目標，因為其與存在於腦內皮細胞上的配體相互作用。由於腦發炎產生的疾病及症狀具有特別嚴重的後果。於另一個實例中，α4 β7 整合素二聚體為重要的目標，因為其涉及於消化道中淋巴細胞歸巢及病理性發炎。
α4 β1 整合素係表現於活化的淋巴細胞及單核細胞之細胞外表面上，其已被關連於急性發炎性腦病灶之發病及關於多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)之血腦屏障(BBB,blood brain barrier)損壞(Coles等人，1999 Ann.Neurol.46(3)：296－304)。已於試管內及活體內兩者測試針對α4 整合素的試劑之抗發炎可能性。見Yednock等人，Nature 1992,356：63－66；美國專利編號5,840,299(作者Bendig等人，1998年11月24日公告)及美國專利編號6,001,809(作者Thorsett等人，1999年12月14日公告)。試管內實驗證實α4 整合素抗體阻擋淋巴細胞對腦內皮細胞的連接。測試α4 整合素抗體對於具有人為引發病症模擬多發性硬化症(試驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE,experimental autoimmune encephalomyelitis))之動物的作用之實驗已證實給予抗－α4 整合素抗體於動物中預防腦的發炎及隨後的癱瘓。總而言之，此等實驗確認抗－α4 整合素抗體為有潛力有用的治療藥物於治療多發性硬化症及其他發炎疾病及失調。
類固醇常被處方於治療發炎疾病，但是無法於長時期安全地使用。類固醇降低發炎，其減弱免疫系統。服用類固醇的病患可能變成對類固醇依賴、不耐或有抗藥性。類固醇之實例包括氫化可體松(hydrocortisone)、倍他米松(betamethasone)、氟米龍(fluorometholone)、培尼皮質醇(prednisolone)、皮質醇(prednisone)、甲羥松(medrysone)、地塞米松(dexamethasone)、甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)、利美索龍(rimexolone)及曲安西龍(triamcinolone)。
許多類固醇副作用伴隨類固醇的使用。長期使用類固醇為不允許因為持久的副作用之高危險性。一些普通的副作用包括免疫抑制、糖尿病、體重增加、粉刺、白內障、高血壓、精神病、多毛症、情緒不穩定、胃炎、肌肉虛弱、容易瘀傷、骨質疏鬆、增加的感染危險性及無菌性壞死(aseptic necrosis)。服用類固醇超過兩個月的病患必需常服用鈣及維生素D補充或其他藥物，如雙磷酸鹽類藥物(biphosphonate)以避免骨質疏鬆。兒童長期類固醇使用帶有生長遲緩的危險，以及於成人發生的副作用。
迄今，未曾發現允許安全及有效治療發炎性疾病如克隆氏症、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病、及不同脊椎關節病變之療法而不需類固醇或其允許漸漸減少及/或中止類固醇。需要及持續尋找出發炎性疾病治療用之類固醇節約劑及使用此等藥劑以統計學上有意義的量降低或消除對類固醇治療為無反應、不耐或依賴的個體對類固醇的需要之方法。
基於上述，需要包含類固醇使用治療發炎性疾病之新穎組合物及方法，其將有效地治療或抑制此等疾病使得病患可達到長壽及較佳生活品質。
本發明係普遍地關於一種類固醇節約劑之使用於用於治療發炎性腸道疾病(IBD,inflammatory bowel diseases)、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變之藥劑的製備，包含有給予一種允許類固醇使用得以降低或消除的藥物。
已意外地發現本發明之藥劑為類固醇節約劑。類固醇常被處方於治療發炎疾病，但是無法於長時期安全地使用。類固醇降低發炎，其減弱免疫系統。服用類固醇的病患可能變成對類固醇依賴、不耐或有抗藥性。
於是，本發明的藥劑允許安全及有效治療發炎性疾病如克隆氏症、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變，而不需類固醇或其允許漸漸減少及/或中止類固醇。
於一個具體實施例中，類固醇節約劑可為抗體或其免疫學上活性片段，較佳為抗－α4 免疫球蛋白。抗體或其免疫學上活性片段較佳為那他珠單抗(natalizumab，Tysabri)或其免疫學上活性片段。如此，可將抗－α4 免疫球蛋白給予個體以治療選自發炎性腸道疾病(IBD,inflammatory bowel diseases)、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病、及不同脊椎關節病變組成的族群之疾病。當給予治療有效量，抗－α4 免疫球蛋白允許個體漸漸減少類固醇治療。於是，已意外地發現根據本發明將抗－α4 免疫球蛋白給予個體時，個體需要治療有效量之類固醇少於在沒有給予抗－α4 免疫球蛋白時所需。
於另一個具體實施例中，類固醇節約劑可為如本文中所述的小分子。如此，可將小分子給予個體以治療選自發炎性腸道疾病(IBD,inflammatory bowel diseases)、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host discase)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變組成的族群之疾病。當給予治療有效量，如本文中所述的小分子允許個體漸漸減少類固醇治療。於是，已意外地發現根據本發明將如本文中所述的小分子給予個體時，個體需要的治療有效量之類固醇少於在沒有給予化合物時所需。
本發明亦普遍地關於治療此等病症之組合療法。如此，可將本發明之類固醇節約劑與其他類固醇節約劑組合給予，以及與免疫抑制劑組合，其中免疫抑制劑不是類固醇、抗－TNF組合物、5－ASA組合物及其組合。類固醇節約劑可為如本文中所述的小分子。或者，類固醇節約劑可為針對VLA－4之抗體或其免疫學上活性片段或結合至VLA－4因而避免其結合至同源配體之多肽。
本發明更關於一種醫藥組合物，包含醫藥上可接受的載體及治療有效量之類固醇節約劑，如本文中所述，當給予需要其之個體時允許類固醇使用得以降低或消除。
可將本發明之組合物藉由許多給予模式而給予，包括口服、非經腸胃(如皮下、硬腦膜下(subdural)、靜脈內、肌肉內、椎管內(intrathecal)、腹膜內、大腦內、動脈內、或病灶內給予途徑)、局部外用、小範圍的(如手術實施或手術栓劑)、直腸及肺(如煙霧劑、吸入劑或粉末)。較佳的是，將本發明之組合物非經腸胃給予。
本發明之此等及其他目的、優點及特徵將對熟悉本技藝者於閱讀於下更完全說明之本發明及配方細節時變成更加明白。
在說明本發明及治療藥劑前，應知本發明不限於說明的特定用途及治療藥物，因其當然可以改變。也應知於本文中使用的術語係僅為了說明特定具體實施例，不應視為限制，因此本發明的範圍將僅由隨附的申請專利範圍而限制。
在提供數值範圍的情況中，應知在該範圍的上及下限之間及於該指明的範圍中任何其他指明的或介入的值之各介入的值(至下限單位的十分之一，除非文中清楚地另外指明)係包含於本發明內。此等較小範圍的上及下限可獨立地包含於較小、隸屬於指明的範圍中任何明確排除的界限。當指明的範圍包括此等界限之一或兩者，排除彼等包含的界限兩者其中之一的範圍也包含於本發明中。同樣考慮的是落在引用的範圍內之任何數值。
除非另外定義，於本文中使用的所有技術及科學用詞具有由普通熟悉本發明屬於的技藝者所共同了解的相同意義。雖然於實踐或測試本發明中可使用任何類似或相當於本文中說明的彼等之方法及材料，現在說明較佳的方法及材料。將本文中提到的所有文獻以參考資料併於本文中以揭示及說明方法及/或材料與引用的文獻有關。
1.縮寫及定義 根據此詳細說明，下列縮寫及定義適用。必須注意當於本文中使用，單數形式"一個"、"及"及"此"包括複數指示個體，除非文中清楚地另外指明。因此，例如關於"一個抗體"包括多個此類抗體及關於"此劑量"包括關於一或多個劑量及其熟悉本技藝者已知的相等件，諸如此類。
本文中討論的文獻僅為其揭示先於本申請案之申請日期而提供。不應將本文中的任何敘述視為承認未將本發明定標題以早於由於先前發明之此類文獻。再者，提供的文獻日期可能不同於實際發表日期，其可能需要獨立地確認。
1.1縮寫 本文中已使用下列縮寫。
ACTH 親腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone)ANA 抗核抗體(Anti－nuclear antibodies)aq或aq. 水溶液BBB 血腦屏障C 免疫球蛋白的固定區域CD 克隆氏症CDAI 克隆氏症活性指數(Crohn's disease activity index)cDNA 互補去氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid)CDR 互補決定區域(complementarity determining region)CDR1 互補決定區域1 CDR2 互補決定區域2 CDR3 互補決定區域3 CNS 中樞神經系統(central nervous system)COX－2 環氧化酶(cyclooxygenase)－2 CRP C－反應性蛋白質(C－Reactive Protein)CS 可凱因症(Cockayne's syndrome)CSF 群落刺激因子(colony stimulating factor)DMSO 二甲基亞碸(dimethylsulfoxide)DNA 去氧核糖核酸EAE 試驗性自體免疫腦脊髓炎EBNA2 艾普司坦－巴氏病毒核抗原(Epstein－Barr virus nuclear antigen)2 ECM 細胞外間質ELAMS 內皮黏著分子(endothelial adhesion molecules)EM 電子顯微鏡(electron microscopy)FACS 螢光活化細胞流式儀(fluorescence activated cell sorter)FR 骨架區(framework region)FR1 骨架區1 FR2 骨架區2 FR3 骨架區3 GM－CSF 顆粒單核細胞群落刺激因子(granulocyte monocyte colony stimulating factor)GVHD 植體抗宿主疾病h或hr 小時(hour)H 免疫球蛋白的重鏈HAMA 人類抗－小鼠抗體(human anti－mouse antibody)H－E 蘇木精－伊紅染色(hematoxylin－eosin)hex A 氨基己糖苷酶A(hexoaminidase A)HIC 疏水性交互作用層析法(hydrophobic interaction chromatography)HIG 人類免疫球蛋白(human immunoglobulin)HMSN IV 遺傳性運動及感覺神經病變(hereditary motor and sensory neuropathy)IV(也稱為遺傳性共濟失調性多發性神經炎(heredopathia atactica polyneuritiformis))H2 O 水ICAM－1 細胞間黏著分子(intercellular adhesion molecule)1 Ig 免疫球蛋白(immunoglobulin)IgG 免疫球蛋白G IgM 免疫球蛋白M IL 介白素(interleukin)IL－1 介白素－1 IL－2 介白素－2 IL－8 介白素－8 IBD 發炎性腸道疾病IBDQ 發炎性腸道疾病問卷Immuno UI 無反應性或不耐免疫抑制的族群ITT 有意治療(包括所有個體隨機選取，無論是否給藥)L 免疫球蛋白的輕鏈LFA－1 淋巴細胞功能相關的抗原(lymphocyte function－related antigen)1－(也稱為β2 整合素、CD11a/CD18及αL β2 )MAbs 單株抗體Mac－1 αM β2 整合素(也稱為CD11b/CD18)MAdCAM－1 黏膜附素細胞黏著分子MALDI/TOF 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀MS (matrix－assisted laser desorption ionization/time－of－flight mass spectrometry)MCP－1 單核細胞趨向蛋白質(Monocyte chemotactic protein)1 MeOH 甲醇MIP－1α 巨噬細胞發炎蛋白質1αMIP－1β 巨噬細胞發炎蛋白質1βMLD 異染性白質退化症(metachromatic leukodystrophy)MS 多發性硬化症N 正常NSAID 非類固醇抗發炎(nonsteroidal anti－inflammatory)PCR 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction)PEG 聚乙二醇(polyethylene glycol)PRU 苯酮尿症(phenylketonuria)PLP 蛋白脂質蛋白質(proteolipid protein)RNA 核糖核酸rt 室溫RT－PCR 反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction)SAE 嚴重不良反應(serious adverse event)SDS PAGE 十二烷基磺酸鈉－聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel)SF－36 生活品質評量SAMIs 選擇性黏著分子抑制劑(selective adhesion molecule inhibitors)sat或sat. 飽和scFv 單鏈Fv片段類固醇UID 對類固醇無反應性、不耐或有依賴性的族群TGF－β 腫瘤生長因子(tumor growth factor)βTLC或tlc 薄層層析法(thin layer chromatography)TNF 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)TNF－α 腫瘤壞死因子αTNF－β 腫瘤壞死因子βVCAM－1 血管細胞黏著分子抑制劑(vascular cell adhesion molecule)1 VH 可變區塊之重鏈VL 可變區塊的輕鏈VLA－4 極遲抗原4(也稱為α－4β－1，α4 β1 )
1.2定義 對於二十個天然出現的胺基酸之縮寫遵照習見用法(IMMUNOLOGY－A SYNTHESIS(第2版，E.S.Golub & D.R.Gren，編著，Sinauer Associtaes,Sunderland,Mass.,1991))。二十個習見胺基酸之立體異構物(如D－胺基酸)、非天然胺基酸如α,α－二取代的胺基酸、N－烷基胺基酸、乳酸、及其他非習見胺基酸也可為本發明多肽之適當成份。非習見胺基酸之實例包括：4－羥基脯胺酸、γ－羧基麩胺酸、ε－N,N,N－三甲基離胺酸、ε－N－乙醯基離胺酸、O－磷絲胺酸(phosphoserine)、N－乙醯基絲胺酸、N－甲醯基甲硫胺酸、3－甲基組胺酸、5－羥基離胺酸、ω－N－甲基精胺酸、及其他類似的胺基酸及亞胺基酸(如4－羥基脯胺酸)。再者，可將胺基酸藉醣化反應、磷酸化反應等改質。
於本文中使用的多肽標記法中，根據標準用法及慣例，左手方向為胺基端方向及右手方向為羧基端方向。類似地，除非另外指明，單股多核苷酸序列之左手端為5'端；將雙股多核苷酸序列之左手方向稱為5'方向。將初生RNA轉錄體之5'至3'加成方向稱為轉錄方向；將於DNA股上具有與RNA相同序列及其為5'對RNA轉錄體的5'端之序列區域稱為「上游序列」；將於DNA股上具有與RNA相同序列及其為3'對RNA轉錄體的3'端之序列區域稱為「下游序列」。
用詞「多核苷酸序列」意指由5'至3'端讀取之去氧核醣核苷酸或核醣核苷酸鹼基之單或雙股聚合物。其包括自身複製的質體、DNA或RNA之傳染性聚合物及無功能的DNA或RNA。
使用下列用詞來說明二或多個多核苷酸之間的序列關係：「參考序列」、「比較窗」、「序列一致性」、「序列一致性百分比」及「大體上一致」。將「參考序列」定義為用來作為序列比較基礎之序列；參考序列可為較大序列之子集合，例如，於序列列表中給予的全長cDNA或基因序列之段落，或可包含完整DNA或基因序列。一般而言，參考序列為至少20個核苷酸長，常為至少25個核苷酸長，及經常為至少50個核苷酸長。因為兩個多核苷酸可能各(1)包含於兩個多核苷酸之間類似的序列(即完整多核苷酸序列之一部份)，及(2)可更包含於兩個多核苷酸之間相異的序列，於二(或多)個多核苷酸之間序列比較通常由經「比較窗」比較兩個多核苷酸序列而進行以確認及比較序列類似性之局部區域。如本文中使用，「比較窗」意指至少20個連續核苷酸位置之概念段落，其中可將多核苷酸序列與至少20個連續核苷酸之參考序列比較及其中當以兩序列之最佳比對與參考序列(其不含添加或缺失)比較時，於比較窗中的多核苷酸序列之部分可包含20%或以下之添加或缺失(即空缺)。藉由Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)之局部同源演算法、藉由Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)之同源比對演算法、藉由Pearson & Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444(1988)之搜尋類似性法(將其各全文為所有目的以參考資料併入)、藉此等演算法之電腦化履行(於Wisconsin Genetics套裝軟體發表7.0,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)、或藉審視可進行比對比較窗之最佳序列比對，及選擇由不同方法產生的最佳比對(即於比較窗造成最高序列相似性百分比)。用詞「序列一致性」意指於比較窗內兩個多核苷酸序列為相同(即基於逐個核苷酸)。用詞「序列一致性百分比」之計算為藉由比較比較窗內兩個最佳比對的序列，決定相同核酸鹼基(如A,T,C,G,U或I)發生於兩者序列之位置的數目而產生相符位置的數目，將相符位置的數目除以比較窗內位置的總數(即窗大小)，及將結果乘以100以產生序列一致性百分比。如本文中使用用詞「大體上一致」代表多核苷酸序列之特性，其中當於至少20個核苷酸位置之比較窗內(常於至少25－50個核苷酸之比較窗內)與參考序列比較時，多核苷酸包含有具有至少85%序列一致性，較佳至少90至95%序列一致性，更常為至少99%序列一致性之序列，其中序列一致性百分比之計算係由比較參考序列與多核苷酸序列，其可包括缺失或添加，其為於比較窗內總計20%或以下之參考序列。參考序列可為較大序列之子集合。
當運用至多肽時，用詞「序列一致性」意指於相對應的位置共有相同胺基酸之胜肽。用詞「序列類似性」意指胜肽具有相同或類似胺基酸(即保留性取代(conservative substitution))於相對應的位置。用詞「大體上一致」意指兩個胜肽序列當最佳比對時，如藉由程式GAP或BESTFIT利用預設間隔權重，共有至少80%序列一致性，較佳至少90%序列一致性，更佳至少95%序列一致性或以上(如99%序列一致性)。較佳的是，不相同的基團位置差異為保留性胺基酸取代。用詞「大體上類似」意指兩個胜肽序列共有相對應的序列類似性百分比。
如本文中使用用詞「大體上類似」係用來意指任何多肽於序列上有改變使得於多肽中一或多個胺基酸被功能上相當的胺基酸取代，因此產生對於多肽的結合性質沒有或較少影響之改變。例如，可將於序列內一或多個胺基酸基團由類似極性或類似大小的另一個胺基酸取代。
用詞「大體上純」意指目標物種為主要物種存在(即以克分子為基礎，其比組合物中任何其他獨立物種更為大量)，及較佳的是大體上經純化的部分為一個組合物，其中目標物種包含所有存在的巨分子物種之至少約50%(以克分子為基礎)。一般而言，大體上純的組合物將包含於組合物中所有存在的巨分子物種之超過約80至90%。最佳的是，將目標物種純化至本質同質性(藉習見偵測方法無法於組合物中偵測到污染物種)，其中組合物實質上游單一巨分子物種組成。
為了分類胺基酸取代為保留性或非保留性，將胺基酸分組如下：第I組(疏水性支鏈)：正白氨酸(norleucine)、met、ala、val、leu、ile；第II組(中性親水性支鏈)：cys、ser、thr；第III組(酸性支鏈)：asp、glu；第IV組(鹼性支鏈)：asn、gln、his、lys、arg；第V組(影響鏈方向之基團)：gly、pro及第VI組(芳香族支鏈)：trp、tyr、phe。保留性取代包含於相同類別中胺基酸之間的取代。非保留性取代構成交換一個此等類別之一員與另一個類別之一員。
將來自免疫球蛋白的成熟重及輕鏈之可變區域的胺基酸分別記為Hx及Lxx，其中「x」為根據卡巴(Kabat)等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)及(1991))之系統代表胺基酸位置之數字(於下文中統稱為「卡巴」，其全文以參考資料併入)。卡巴列出各亞型抗體的許多胺基酸序列，及列出於該亞型中各基團位置最常發出現的胺基酸。卡巴利用於列出的序列中對各胺基酸指定基團數字之方法，及此指定基團數字的方法已變成領域中的標準。藉由比對研究的抗體與卡巴中一個共通序列(consensus sequence)，卡包的系統可擴張至不包含於概要中的其他抗體。利用卡巴編號系統輕易地確認不同抗體中在相當位置的胺基酸。例如，在人類抗體之L50位置的胺基酸佔據小鼠抗體之胺基酸位置L50之相當位置。
使用用詞「試藥」或「藥劑」來代表結合至配體受體之生物活性分子。例如，與VAL－4受體或VCAM－1免疫反應的抗體或其片段可消除對類固醇無反應、不耐或依賴的個體之類固醇需求。也考慮可作用於結合細胞表面受體之胜肽或擬胜肽或相關化合物，及可藉技藝中已知的方法合成製造。也考慮如本文中討論或如對熟悉本技藝者為顯而易見的與VLA－4受體反應之其他試藥。
如本文中使用的「類固醇節約劑」意指以統計學上有意義的量降低或消除對類固醇治療為無反應、不耐或依賴的個體對類固醇的需要之任何藥劑。較佳的是此藥劑包括免疫球蛋白(如抗體、抗體片段、及重組產生的抗體或片段)、多肽(如對整合素之配體蛋白質的可溶形式)及小分子，當將其以有效量給予時，降低或消除對類固醇治療為無反應、不耐或依賴的個體對類固醇的需要。此等藥劑可為抗－α4 整合素藥劑(較佳的是抗－α4 β1 或抗－α4 β7 拮抗劑)及抗－VCAM－1藥劑。然而，參照本發明，此抗－α4 整合素及抗－VCAM－1藥劑僅包括當將其以有效量給予時，降低或消除對類固醇治療為無反應、不耐或依賴的個體對類固醇的需要者。
如本文中使用用詞「抗－α4 整合素藥劑」意指專一地結合至包含α4 次單元之整合素及抑制整合素活性之任何藥劑。
用詞「整合素拮抗劑」包括抑制含α4 次單元之整合素與整合素配體及/或受體結合之任何藥劑。較佳的是，整合素拮抗劑抑制α4 β1 二聚體及/或α4 β7 二聚體結合至其同源配體。此拮抗劑可包括抗－整合素抗體或含類似抗體蛋白質，以及其他分子如對整合素之配體蛋白質的可溶形式。對含α4 次單元之整合素的配體蛋白質之可溶形式包括可溶性VCAM－1、VCAM－1融合蛋白質或雙功能VCAM－1/Ig融合蛋白質。例如，可給予整合素配體之可溶形式或其片段以結合至整合素，及較佳競爭細胞上的整合素結合位置，因而導致類似於給予拮抗劑如抗整合素(如VLA－4)抗體的效果。特別是，將結合配體但是不引發整合素相關的訊號傳遞之可溶性整合素突變體包含於本發明之範圍內。
由「那他珠單抗」或「Tysabri」意指一種人化抗VLA－4抗體，如說明於共同擁有的美國專利編號5,840,299及6,033,665中，將其全文以參考資料併於本文中。同樣於本文中考慮的是其他VLA－4專一抗體。此類固醇節約抗體及免疫球蛋白包括但不限於說明於美國專利編號6,602,503及6,551,593、發表的美國專利申請案編號20020197233(Relton等人)中所述的彼等免疫球蛋白，及如本文中進一步說明。
如本文中使用於長期給藥流程之文中的用詞「效力」意指特定治療流程之效用。基於反應本發明藥劑對疾病進程的改變可測量效力。例如，在MS的治療中，藉由復發－復原MS中復發的頻率，及藉由如利用方法如MRI偵測中樞神經系統中新病灶之存在或消失，可測量效力。
如本文中使用於長期治療流程之文中的用詞「成功」意指特定治療流程之有效。此包括效力、毒性(如一配方或劑量單位之副作用及病患耐受性)、病患依從性(compliance)等之平衡。對於視為「成功」的長期給藥流程，必需平衡不同觀點之病患照護及效力以產生最適合的病患結果。
如本文中使用的用詞「專一地結合」或「結合專一地」意指特定結合對的一員對於非其專一結合個體之分子將不顯示任何顯著結合(如對其結合個體之親和力為約1000×或以上)。於本發明中，小化合物(如N－[N－(3－吡啶磺醯基)－L－3,3－二甲基－4－硫脯醯胺]－O－[1－甲基哌嗪－4－基羰基]－L－酪胺酸異丙基酯)將不會顯示任何顯著結合至除了α4 整合素或含α4 整合素之受體外的任何多肽。例如，將用於本發明方法中的小化合物(其以大於0.3 nM之結合親和力結合至α4 整合素)視為對α4 整合素專一性結合。
於本文中使用的用詞「引發免疫反應」及「引發宿主免疫反應」意指在導入本發明藥劑至個體時於個體中對含α4 整合素之受體產生免疫反應。可將於個體中的免疫反應描繪特徵為與α4 整合素受體之血清反應性為未經處理的個體之至少兩倍，更佳的是未經處理的個體之至少三倍，及再更佳的是未經處理的個體之至少四倍，其中血清免疫反應性係利用大約1：100之血清稀釋測量。
用詞「醫藥上可接受的載體或賦形劑」係用來意指僅用來作為載體(即不是用來本身具有生物活性)之用於形成配方的一部份之任何化合物。醫藥上可接受的載體或賦形劑一般為安全、無毒及不希望有生物或其他不良物。如本說明書及專利申請範圍中使用的醫藥上可接受的載體或賦形劑包括一或多於一種此載體兩者。
於本文中使用用詞「治療」及「療法」等來普遍地意指得到理想藥理學及生理學效果。更明確而言，使用本文中說明的試藥以降低或消除對類固醇治療為無反應、不耐或依賴的個體對類固醇的需要。因此，效果以預防或部分預防疾病、症狀或其狀況而論可為預防性及/或以部分或完全治癒疾病、狀況、症狀或由於與受到治療的症狀或疾病相關的疾病之不良作用而論可為治療性。如本文中使用，用詞「治療」涵蓋治療哺乳類(特別是人類)的疾病，及包括：(a)預防疾病發生於可能有傾向得到此疾病但尚未被診斷為得到此疾病的個體；(b)抑制疾病，即阻止其發展；或(c)緩和疾病，即造成疾病及/或其症狀或狀況的復原。本發明係針對治療患有與病理學發炎相關的疾病之病患。本發明係涉及預防、抑制、或緩和因為病理學發炎於長時期間及/或為由存在於生物系統中不當發炎的生理反應於長時期間引起之不良作用，較佳的是發炎性腸道疾病如克隆氏症、氣喘、MS、RA或不同脊椎關節病變。
由「治療有效量」意指本文中揭示之試藥、藥劑、或藥劑組合的量當給予哺乳類時足以以統計學上有意義的量降低或消除對類固醇治療為無反應、不耐或依賴的個體對類固醇的需要。
由用詞「類固醇節約有效量」意指試藥、藥劑、或組合物的量有效於以統計學上有意義的量降低或消除對類固醇治療為無反應、不耐或依賴的個體對類固醇的需要。「類固醇節約有效量」將視化合物或組合物、受治療的特定疾病及其嚴重性，及受治療哺乳類之年齡體重等而不同。
由「長期給予」意指本發明藥劑、試藥、或組合療法以一量及週期性給予以造成降低或消除對類固醇治療為無反應、不耐或依賴的個體對類固醇的需要。給予較佳為雙週、每週、每月或每兩個月，但可為每天。更佳的是，治療為每週或每月及給予6個月至數年或病患餘生，視受治療的疾病或狀況而定。
關於式I至式IX之化合物的其他定義為如其中定義。
2.本發明之一般觀點 2.1疾病及症狀 利用本發明之類固醇節約劑可治療及/或預防下列疾病及/或症狀。
2.1.1發炎性腸道疾病 發炎性腸道疾病(IBD,inflammatory bowel diseases)為引起腸發炎的疾病之通稱。發炎性腸道疾病包括克隆氏症及潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)。
2.1.1.1克隆氏症 克隆氏症引起小腸中的發炎。克隆氏症通常發生於小腸的下部，即迴腸，但其可影響消化道的任何部分。發炎延伸深入影響的器官內層，造成疼痛及造成小腸時常清空。克隆氏症也可稱為迴腸炎或腸炎。克隆氏症同樣地侵襲男人及女人及可能於一些家族中傳播。約20%具有克隆氏症的人具有與一些形式IBD相關血緣。
克隆氏症的病因尚未確定。一個理論為免疫系統藉由造成小腸中不間斷的發炎反應至病毒或細菌。患有克隆氏症的病患傾向於具有免疫系統的異常，但是不確定此等異常為疾病的起因或結果。
克隆氏症最常見的症狀包括腹部疼痛，常於下右方區域，及腹瀉。直腸出血、體重變輕及發燒也可能發生。出血可能為嚴重及持續，導致貧血。具有克隆氏症的兒童可能遭受延遲發育及發育不良生長。
克隆氏症最常見的併發症為腸閉塞。因為克隆氏症造成腸壁與膨脹及結疤組織增厚，使腸道變窄而發生閉塞。克隆氏症也可能造成疼痛及潰瘍通過侵襲的區域進入周圍的組織如膀胱、陰道或皮膚。通道(稱為瘺管)為常見併發症及常變成受感染。有時候可用藥物治療瘺管，但常需要手術。
營養併發症如蛋白質、卡路里及維生素之不足於克隆氏症中為常見。伴隨克隆氏症之其他併發症包括關節炎、皮膚問題、眼睛或口之發炎、腎結石、膽結石、或肝及膽系統之其他疾病。
克隆氏症之治療視疾病的位置及嚴重性、併發症、及先前治療的反應而定。治療的目標為控制發炎、矯正營養不足、及減輕症狀如腹部疼痛、腹瀉及直腸出血。治療可包括藥物、營養補充、手術或此等選擇之組合。於此時，治療並無痊癒。一些病患有長時期緩解，無症狀。然而，克隆氏症通常於病患的終身期間於許多時間復發。不可能預測何時緩解會發生或何時症狀會回來。
首先用含美沙拉嗪(mesalamine)的藥物治療大部分病患，此物質幫助控制發炎。也常使用磺胺匹林(Sulfasalazine)。沒有由其得益，或無法耐受之的病患可服用其他含美沙拉嗪藥物，一般稱為5－ASA藥劑，如Dipentum或Pentasa。美沙拉嗪製品的可能副作用包括噁心、嘔吐、胃灼熱、腹瀉及頭痛。
給予一些病患類固醇(如布地縮松(budesonide))以控制發炎。此等藥物對活躍的克隆氏症最為有效，但其可造成嚴重副作用，包括更易受到感染。抑制免疫系統之藥物也可用來治療克隆氏症。最常見的包括6－巰嘌呤(mercaptopurine)及硫唑嘌呤(azathioprine)。免疫抑制劑作用為阻擋造成發炎的免疫反應。此等藥物可能引起副作用如噁心、嘔吐及腹瀉，及降低病患對感染的抵抗力。
使用抗生素來治療由狹窄部位、瘺管或先前手術造成之小腸細菌過度生長。為了此常見問題，醫生可開處方抗生素包括安比西林(ampicillin)、磺醯胺(sulfonamide)、頭孢子菌素(cephalosporin)、四環素(tetracycline)或甲硝達唑(metronidazole)。
使用生物製劑於克隆氏症的治療中。將英利昔單抗(infliximab(Remicade)處方於治療對標準療法(即美沙拉嗪物質、皮質類固醇及免疫抑制劑)無反應之中度至嚴重克隆氏症及治療開放、流出的瘺管。英利昔單抗為抗－腫瘤壞死因子(TNF)物質。TNF為由免疫系統製造的蛋白質，其可造成伴隨克隆氏症之發炎。
手術去除部分小腸可幫助克隆氏症但無法治癒之。發炎易於回到相鄰於已去除的腸區域。許多克隆氏症病患需要手術，以減輕對藥物治療無反應的症狀，或以矯正併發症如腸中的閉塞、穿孔、膿瘡或出血。一些病患必需以結腸切除術將其整個結腸去除。見HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE；13版(1994)McGraw Hill,New York,1403－1405頁；THE PHYSICIAN'S DESK REFERENCE；58版(2004)Thomson PDR,Montvale,NJ,402頁、1130頁、2707頁、3153－3155頁、3173頁。
2.1.1.2潰瘍性結腸炎 潰瘍性結腸炎為發生於結腸黏膜之慢性、發炎性及潰瘍性疾病。潰瘍性結腸炎之病因為未知。證據顯示遺傳易感性(genetic predisposition)造成對環境、飲食或感染劑之未受調控的腸免疫反應。然而，未曾確認引發的抗原。
病理學變化開始於在黏膜上皮下方網硬蛋白(reticulin)纖維之退化，上皮下方毛細血管之閉塞，及血漿細胞、嗜酸性白血球、淋巴細胞及肥大細胞逐漸滲透固有層(lamina propria)。隱窩膿瘍(crypt abscesses)、上皮壞死及黏膜潰瘍最後形成。此疾病通常開始於直腸乙狀結腸(rectosigmoid)極可能沿深入整個結腸，或其可包含大部分大腸。
症狀包括出血性下痢(bloody diarrhea)、腹膜炎及重度毒血症。一些於被證實的感染後(即由變形蟲或細菌性痢疾)引起發病。可能出現不舒服、發燒、貧血、食慾缺乏、體重減輕、白血球增多及低白蛋白血症(hypoalbuminemia)。出血為最常見的局部併發症。另一個嚴重併發症、毒性結腸炎發生於當潰瘍擴大造成局部腸閉塞及腹膜炎。當毒性結腸炎發展，結腸失去肌張力及於數小時或數天內開始膨脹。
當橫向結腸之直徑超過6公分時，毒性巨結腸症(或毒性膨脹)存在，造成高燒、白血球增多、腹部疼痛及反彈壓痛(rebound tenderness)。必需於早期給予治療以避免危險的併發症，如穿孔、廣泛性腹膜炎及敗血病。當包含整個結腸及疾病持續超過十年，無論疾病的活性，結腸癌的發生率增加。雖然癌症發生率在整個潰瘍性結腸炎的情況中為最高，隨潰瘍性結腸炎之任何程度超過於乙狀結腸，風險顯著增加。
其他併發症包括週邊關節炎、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、薦腸骨關節炎(sacroilitis)、前葡萄膜炎(anterior uveitis)、紅斑性結節(erythema nodosum)、皮膚併發症及於兒童之生長發育遲緩。肝臟疾病可列入為脂肪肝或更嚴重的為自體免疫肝炎、原發型硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis)或硬化。
潰瘍性結腸炎為具有反覆惡化及減輕之慢性病。幾乎三分之一具有廣泛潰瘍性結腸炎的病患需要手術。全直腸大腸切除(total proctocolectomy)為有療效：將預期壽命及生活品質恢復至正常及消除結腸癌的危險。
潰瘍性結腸炎症狀可能對抗－腹瀉藥物及飲食改變有反應。中度至嚴重的症狀可能需要一或多種藥物。對於僅於直腸的疾病，給予局部療法。遍及結腸的發炎需要作用於全身的藥物，如抑制免疫系統(硫唑嘌呤、6－巰嘌呤、或環孢靈(cyclosporine))及控制發炎(類固醇)的藥物。見HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE；13版(1994)McGraw Hill,New York,1403－1405頁；THE PHYSICIAN'S DESK REFERENCE；58版(2004)Thomson PDR,Montvale,NJ,402頁、1130頁、2707頁、3153－3155頁、3173頁。
2.1.2植體抗宿主疾病(GVHD,Graft versus Host Disease)及宿主抗植體疾病 植體抗宿主疾病(GVHD,Graft versus Host Disease)為一種罕見疾病，其可侵襲免疫系統被抑制及已接受輸血或骨髓移植的人。宿主抗植體疾病發生於具有被抑制的免疫系統及已接受器官移植的病患中。此等疾病的症狀可包括皮疹(skin rash)、類似於結腸炎之腸問題及肝功能異常。
具有GVHD，免疫學上有能力的捐贈者T細胞針對於免疫學上消弱的接受者中的抗原反應。急性GVHD的症狀包括發燒、剝落性皮膚炎(exfoliative dermatitis)、具有高膽紅素血症(hyperbilirubinemia)之肝炎、嘔吐、腹瀉及腹部疼痛(其可能發展至腸閉塞)及體重減輕。GVHD持續為同種異體骨髓移植(BMT,bone marrow transplants)後死亡及嚴重發病之主要病因。
約1/3至1/2骨髓移植接受者形成GVHD之慢性形式。雖然皮膚、肝臟及腸仍為主要侵襲的器官，其他相關區域(即關節、肺臟)也有記錄。最後，20至40%病患死於與GVHD相關的併發症。
治療的一個方法為利用花結法(rosetting)技術或機械分離，在骨髓的再注入前，用單株抗體自捐贈者骨髓去除T細胞。T－細胞消耗已非常有效於降低GVHD的發生率及嚴重性兩者。然而，植入失敗的發生率及復發增加。可能的解釋為植體抗宿主反應中產生的細胞激素促進植入所需之幹細胞繁殖及成熟。用於預防或治療GVHD的其他藥劑包括甲氨蝶呤(methotrexate)、皮質類固醇及針對表現於成熟T細胞上抗原的單株抗體。
於特殊的情況中，GVHD也可於輸血後出現，因為即使少量捐贈者T細胞可引起GVHD。此情況包括子宮內胎兒輸血及於免疫抑制的病患中輸血，如骨髓移植接受者、白血病、淋巴瘤、神經母細胞瘤、何杰金氏病(Hodgkin's)和非何杰金氏淋巴瘤。見THE MERCR MANUAL OF MEDICAL INFORMATION(1997),Merck Research Laboratories,West Point,PA,836－837頁。
2.1.3多發性硬化症 多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)為一種慢性神經疾病，其發生於成人早期及於大部分情況中發展至嚴重殘障。僅於美國就有大約350,000個MS病例。外傷外，MS為成人早期至中期神經性殘障的最常見原因。
MS的病因尚未確定。MS之特徵為慢性發炎、髓鞘脫失(demyelination)及膠樣變性(gliosis)(結疤)。髓鞘脫失可能造成軸突傳導的負面或正面效果。正面傳導異常包括減慢的軸突傳導、發生於高但非低頻率刺激系列之存在之可變傳導阻斷或完全傳導阻斷。正面傳導異常包括異常刺激產生，自動或於機械應力之後及於髓鞘脫失的軸突之間異常「對話」。
已觀察到對髓鞘蛋白質(髓鞘鹼性蛋白質(MBP,myelin basic protein)或髓鞘蛋白脂質蛋白質(PLP,proteolipid protein))有反應性的T細胞於試驗性過敏腦脊髓炎中媒介CNS發炎。已觀察到病患為具有升高的CNS免疫球蛋白(Ig)量。也可能於MS中觀察到的部分組織損害係由活化的T細胞、巨噬細胞或星狀細胞(astrocyte)之細胞激素產物媒介。
今天，診斷具有MS的80%病患於發病後活20年。處理MS之療法包括(1)治療目標在於疾病進程的改變，包括治療急性惡化及導入疾病之長期壓制；(2)治療MS的症狀；(3)藥物併發症的預防及治療，及(4)處理二次的個人及社會問題。
MS的開始可能為劇烈或是太溫和以致於不會使病患就醫。最常見的症狀包括一或多肢的虛弱，由於視神經炎造成的視力模糊、感覺減退、複視及運動失調。可將疾病的進程分成三個一般類別：(1)復發的MS，(2)慢性漸進的MS，及(3)不作用的MS。復發的MS之特徵為神經功能異常之重複侵襲。MS侵襲一般發展數天至數週極可能接著完全、部分或無復原。由侵襲復原一般發生於由症狀高峰數週至數個月內，雖然罕有一些復原可持續2或數年。
慢性漸進的MS造成逐漸嚴重的惡化而無穩定或減輕的時期。此形式發生於具有先前復發的MS病歷之病患，雖然於20%病患中，無法記憶任何復發。於漸進的過程期間也可能發生急性復發。
第三種形式為不作用的MS。不作用的MS之特徵為可變強度之固定神經缺損。具有不作用的MS之大部分病患具有先前復發的MS病歷。
疾病進程也與病患的年齡有關。例如，順利的預後因素包括早期開始(除了兒童時期)、一個復發病程，及開始發病5年後極少殘存殘障。相反地，不良預後係與較晚發病年齡(即40歲或更老)及漸進的病程有關。此等變數為互相相關，因為慢性漸進的MS傾向比復發的MS於始於較晚的年齡。來自慢性漸進的MS之殘障通常係由於病患之漸進半身不遂或四肢麻痺(癱瘓)。於本發明的一個觀點中，較佳於病患在疾病之緩解而非於復發時期時治療病患。
短期使用親腎上腺皮質激素或口服皮質類固醇(如口服皮質醇或靜脈內注射甲基培尼皮質醇)為治療急性惡化MS病患之唯一專門的治療方式。
MS的更新療法包括用干擾素β－1b、干擾素β－1a及Copaxone(以前稱為共聚體1)治療病患。此三種藥物已被證實顯著降低疾病的復發率。將此等藥物以肌肉內或皮下自動給予。
2.1.4氣喘 氣喘為呼吸系統之疾病，其包含支氣管或攜帶空氣至肺部的氣道之發炎。氣道對過敏原，以及煙、冷空氣及/或其他環境因素過度反應。氣道狹窄，導致呼吸困難。過敏原可引起慢性發炎。
氣喘常形成於兒童或青少年，為最常見的慢性兒童疾病。大部分氣喘病例可被控制。然而，於嚴重的情況中，氣喘發作可為致命。於過去30年中氣喘病例的數目穩定成長，使其為美國及世界其他國家之一個主要公共健康問題。
氣喘係由遺傳、環境及免疫因素引起，其組合而造成可導致氣喘發作的發炎。於於某些病患中，發炎的氣道對環境中的物質過度反應，如煙或冷空氣。於其他病患中，免疫系統對過敏原反應而釋放引起發炎的細胞。
氣喘可於不同時間及由許多因素而形成。香煙煙霧及空氣污染可能造成侵襲。此外，強烈情緒之表現如用力笑或哭可造成侵襲。
氣喘發作之症狀可為輕微至嚴重及可包括(但不限於)氣喘、咳嗽、胸悶、快速淺呼吸或呼吸困難、呼吸短促及於運動期間快速疲倦。
治療包含服藥以控制發炎及氣喘發作，及避免增加發炎的物質。若發炎未受控制，氣喘可導致支氣管的永久變化。
吸入的皮質類固醇(如布地縮松及氟梯卡松(fluticasone))降低發炎及為持續氣喘的常見治療。於罕見情況中，可使用口服皮質類固醇(如皮質醇及地塞米松(dexamethasone)來幫助控制氣喘。也可處方長效β2－致效劑(如沙美特羅(salmeterol)及福莫特羅(formoterol))。為快速緩解給予的藥物包括短效β2－致效劑(如沙丁胺醇(albuterol)及叔丁喘寧(terbutaline))，及抗膽鹼劑(anticholinergics)(如伊普托品(ipratropium))。見THE MERCK MANUAL OF MEDICAL INFORMATION(1997),Merck Research Laboratories,West Point,PA,133－137頁。
2.1.5風濕性關節炎 風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)為一種慢性併發症狀，特徵為周圍關節之發炎，造成關節及關節周圍結構之逐漸破壞。風濕性關節炎的病因為未知。然而，已確認遺傳體質及於白種人中定位於第II型組織相容基因(histocompatibility gene)之HLA－DR 1基因座中的五胜肽。環境因素可能也扮演重要角色。免疫學變化可能由多重因素啟動。全人類約1%受到侵襲，女性比男性多二至三倍。發病可於任何年齡，常於25及50歲之間。
於發病中可能為重要之顯著的免疫異常包括發現於關節液細胞中及於血管炎(vasculitis)中發現的免疫複合物。血漿細胞產生促成此等複合物的抗體。滲透滑液組織的淋巴細胞主要為T輔助細胞，其可製造促炎性細胞激素(pro－inflammatory cytokine)。增加的黏著分子促進發炎細胞於滑液組織中游出及保留。
類風濕性結節(Rheumatoid nodules)發生於高達30%病患中，通常於慢性刺激處皮下。血管炎可見於RA的嚴重病例之皮膚、神經或內臟器官中，但是僅於一些病例中為臨床上有意義。
發病通常為不知不覺，伴隨逐漸關節牽連，但可被中斷，伴隨於多重關節中的同時發炎。於幾乎所有發炎的關節中之柔軟及滑液稠化為常見。開始的表現可能發生於任何關節。
早晨起床時或在長期不活動後僵硬持續少於30分鐘為常見。皮下類風濕性結節通常不是早期表現。內臟結節、血管炎造成腿潰瘍或多發性單一神經炎(mononeuritis multiplex)、肋膜腔或心包膜積水、淋巴腺病(lymphadenopathy)、弗耳提症候群(Felty's syndrome)、修格蘭氏症候群(Sjgren's syndrome)及上鞏膜炎(episcleritis)為其他表現形式。發燒可能出現。
於疾病第一年期間高達75%病患用保守性治療至症狀性改善。然而，儘管完全治療有少於10%病患最終嚴重地殘障。此疾病大大地影響大部分RA病患的生活。於嚴重疾病之最活躍、痛苦的階段期間偶爾醫囑完全臥床休息短時期。於較不嚴重的情況中，應規定規律休息。
非類固醇抗發炎藥物可能提供重要的症狀緩解極可能足以作為輕微RA的簡單療法，但是其似乎不改變疾病的長期病程。可使用水楊酸鹽，如阿斯匹靈於治療。
除了水楊酸鹽或其他NSAIDs外通常給予金化合物，若前者不足以減輕疼痛或抑制活躍的關節發炎。於一些病人中，金可產生臨床減輕及降低新骨侵蝕的形成。非經腸胃製品包括硫代蘋果酸金鈉或硫代葡萄糖金。當任何上述表現形式出現時應將金中斷。較不嚴重的毒性表現形式(如輕微瘙癢症(pruritus)、輕微出疹)可由暫時不給金療法而消除，而後在症狀已消退後謹慎地重新開始約2週。然而，若毒性症狀發展，應不給金及病患給予皮質類固醇。對於輕微金皮膚炎以分開的劑量給予局部皮質類固醇或口服皮質醇15至20毫克/天；對於血液學併發症可能需要更高劑量。可肌肉內給予金螯合藥物二巰基丙醇(dimercaprol)2.5毫克/公斤於前2天為4至6次/天及在嚴重金反應後給予5至7天。
奎寧(hydroxychloroquine)也可控制輕微或中度活躍RA之症狀。毒性作用通常為輕微及包括皮膚炎、肌病變、及普遍地可回復的角膜混濁(corneal opacity)。然而，也曾報導不可回復的視網膜退化。也可使用柳酸磺胺鈚啶(Sulfasalazine)於RA的治療。
口服青黴胺(penicillamine)可具有類似於金的益處及可用於若金失敗或產生毒性於具有活躍RA的病患中之一些情況中。需要中斷的副作用比用金更常見及包括骨髓抑制、蛋白尿、腎病變、其他嚴重毒性作用(如重症肌無力、天皰瘡、古德巴斯德症候群(Goodpasture's syndrome)、多發性肌炎(polymyositis)、類紅斑性狼瘡症狀(lupus－like syndrome))、出疹及惡臭味。
類固醇為最有效短期抗發炎藥物。然而，其對RA的臨床好處常隨時間減小。類固醇無法可預見地預防關節損害的發展。再者，在停止皮質類固醇後嚴重反彈於活躍的疾病中。類固醇使用的禁忌症包括消化性潰瘍、高血壓、未經處理的感染、糖尿病及青光眼。
漸增地使用免疫抑制藥物於處理嚴重、活躍RA。然而，主要副作用可發生，包括肝病、肺炎、骨髓抑制及在長期使用硫唑嘌呤後惡性腫瘤。
關節夾板降低局部發炎及可減輕嚴重局部症狀。當發炎消退時主動運動以恢復肌肉及保留正常關節運動範圍為重要的，但不應疲勞。當疾病為活躍時可進行手術。
脊椎關節病變 脊椎關節病變為疾病家族包括僵直性脊椎炎、乾癬性關節炎(psoriatic arthritis)、來特氏(Reiter's)症候群及伴隨發炎性腸道疾病之關節炎。
2.1.6.1僵直性脊椎炎 僵直性脊椎炎(AS,Ankylosing Spondylitis)為一種關節炎形式，其為慢性及最常侵襲脊椎。其造成疲勞、疼痛及僵硬，伴隨於下背、中背、頸及屁股腫脹及有限的活動。雖然無法治癒，治療通常控制症狀及預防病況變得更糟。僵直性脊椎炎的併發症包括虹膜炎、由於上身彎曲及胸壁的僵硬而呼吸困難。
有時候，脊椎的韌帶及關節之持續發炎造成脊椎結合在一起(關節僵硬)，導致於頸及下背之運動喪失。當脊椎結合或僵硬，固定的弓身畸形(駝背)可形成，導致嚴重的殘障。僵直性脊椎炎的發炎可侵襲身體的其他部分，最常見於其他關節及眼睛但有時於肺部及心瓣。
每100個人有一個人受到僵直性脊椎炎侵襲。於男性比女性更常見，及症狀通常開始於青少年晚期或成人早期。治療包括運動及物理治療以幫助降低僵硬及維持良好姿勢及移動性，及疼痛及發炎的藥物，包括類固醇。
2.1.6.2乾癬性關節炎 乾癬性關節炎(PsA,Psoriatic Arthritis)特徵為關節之腫脹，其於一些具有牛皮癬之病患中形成。乾癬性關節炎呈現其他類型關節炎之症狀，如僵硬、疼痛及浮腫的關節。未經治療的乾癬性關節炎可造成骨質流失及關節的畸形。乾癬性關節炎之疼痛及腫脹係由過度反應性的免疫系統造成，其使關節周圍的組織發炎。週期性地症狀突然發生及消退。對稱部位的關節炎(symmetric arthritis)為乾癬性關節炎最常見的類型，組成所有病例之約50%。症狀發生於身體的兩側上。症狀類似於風濕性關節炎，及對稱部位的關節可造成關節之永久損壞。乾癬性關節炎第二常見的類型不對稱關節炎為較輕微及僅造成身體一側上的症狀。
乾癬性關節炎之較不常見形式遠端指骨間突出(DIP,distal interphalangeal predominant)侵襲靠近手指甲及腳指甲的關節。指甲也常受此疾病侵襲。脊椎炎常使運動疼痛，特別是在頸及背。其也可造成脊柱的發炎。殘毀性關節炎(arthritis mutilans)為乾癬性關節炎之常見使人衰弱及破壞性形式。其常侵襲手及腳，以及背及頸，及其可造成永久畸形。
乾癬性關節炎的症狀類似於其他種關節炎。其包括關節僵硬、疼痛或關節浮腫、刺激及紅眼。牛皮癬之常見症狀包括皮膚之紅、鱗狀斑點。
常見治療包括非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs,nonsteroidal anti－inflammatory drugs)。其包括許多櫃台銷售疼痛藥物，如阿斯匹靈及異丁苯丙酸(ibuprofen)。然而，此等藥物之長期使用可為危險及造成胃腸問題。Cox－2抑制劑為一類NSAIDs，常用其來治療乾癬性關節炎。副作用包括噁心及頭痛。
免疫抑制劑為更有效的藥物，用於對較溫和藥物無反應的乾癬性關節炎病例。使用此類之藥物於牛皮癬之全身療法，如甲氨蝶呤，其作用為抑制免疫系統。其也可能造成嚴重副作用及提高感染的危險。也常處方柳氮磺胺吡啶(azulfidine)。用於預防瘧疾的某些藥物可幫助此症狀，有時也將其開處方於乾癬性關節炎。
也常指示口服類固醇來幫助清除急性關節疼痛，雖然無法長期安全地使用類固醇。然而，突然停止類固醇治療也可引起症狀的加劇。也使用生物製劑來治療牛皮癬。其作用為攻擊造成牛皮癬症狀的免疫系統反應，預防關節變成發炎。生物製劑藥物也可能使免疫系統更易於受感染。
2.1.6.3來特氏症候群 來特氏症候群(也稱為反應性關節炎)為一種關節炎形式，其除了關節外也侵襲眼睛、尿道及皮膚。
來特氏症候群特徵為在身體不同器官中的許多症狀，其可能或可能不會於同時出現。疾病可能為急性或慢性，與突然消退或復發。來特氏症候群主要侵襲20及40歲之間男性。具有人類免疫不全病毒(HIV,human immunodeficiency virus)者為特別高危險群。
來特氏症候群的病因為未知，但研究顯示疾病係由遺傳體質及其他因素之組合引起。來特氏症候群常跟隨砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)或溶尿尿漿菌(Ureaplasma urealyticum)感染後。
來特氏症候群的第一個症狀為尿道或腸的發炎，之後關節炎。關節炎通常侵襲手指、腳指、足踝、臀部及膝關節。其他症狀包括尿道的發炎，具有排尿時疼痛，口腔潰瘍、眼睛發炎及膿溢性角皮病(Keratoderma blennorrhagica)(鱗狀皮膚之斑點於手掌、腳底、軀幹或頭皮)。
對於來特氏症候群無特定的治療。關節發炎通常用非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs,nonsteroidal anti－inflammatory drugs)治療。皮膚發疹及眼睛發炎可用類固醇治療。來特氏症候群之預後不同。一些病患形成併發症包括心肌的發炎、脊椎硬化的發炎、青光眼、逐漸失明、腳畸形或於肺中積水。
其他脊椎關節病變包括(但不限於)發炎性腸道疾病之脊椎炎(IBD SpA)、未分化型脊椎關節病變(uSpA)、幼年型脊椎關節病變(JSpA)。
見THE MERCK MANUAL OF MEDICAL INFORMATION(1997),Merck Research Laboratories,West Point,PA,243頁。
3.給藥 在廣義上，本發明之方法不包含任何特定給藥方式，因為給藥方式係視活性藥劑之形式及發展給予活性藥劑之配方而定。給藥的方式包括口服、非經腸胃(如皮下、硬腦膜下、靜脈內、肌肉內、椎管內、腹膜內、大腦內、動脈內、或病灶內給予途徑)、局部外用、小範圍的(如手術實施或手術栓劑)、直腸及肺(如煙霧劑、吸入劑或粉末)。較佳的是，給予途徑為非經腸胃。給藥途徑係基於被給予的組合物(如免疫球蛋白被靜脈內給予與小化合物被口服給予)、組織目標(如椎管內給予以瞄準脊椎神經受傷的位置)等，如普通熟悉本技藝者已知。
此外，可將免疫球蛋白與用來治療、改善或緩和與發炎性腸道疾病如克隆氏症、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病、及不同脊椎關節病變有關的症狀之其他化合物或組合物組合。再者，可將揭示於本文中的化合物單獨給予或與其他藥劑組合，如免疫抑制劑，5－ASAs及抗－TNFs。當組合給予時，可將免疫球蛋白於此等其他化合物或組合物之相同配方中給予，或於分開的配方中，及在用來治療、改善或緩和症狀的其他化合物或組合物之前、之後或同時給予。
5－胺基水楊酸(5－ASAs)為常用來治療發炎性腸道疾病如克隆氏症及潰瘍性結腸炎之一類抗發炎劑。一種常見的5－ASA為美沙拉嗪，包括Pentasa及Rowasa。其他5－ASA，如奧塞拉嗪(osalazine)(Dipentum)於體內轉變成美沙拉嗪。柳酸磺胺鈚啶(Azulfidine)亦常投藥。5－ASAs的副作用包括黑便、頭痛、嘔吐及發疹。
免疫抑制劑減弱或抑制免疫系統，其因而降低發炎。實例包括硫唑嘌呤、6－巰嘌呤、甲氨蝶呤及山喜多(mycophenolate)。最常使用此等藥物來預防身體排斥新移植的器官，或用於對其他治療已無反應的發炎症狀。此等藥物常需數月來改善症狀，及當藥物中斷時疾病常回來。免疫抑制劑的副作用包括噁心、嘔吐、腹瀉、胃潰瘍、發疹、不舒服、肝發炎、骨髓抑制、發燒、胰臟炎及增加某些類型癌症的危險。
也指示抗－TNF藥劑於發炎症狀的治療。腫瘤壞死因子(TNF,tumor necrosis factor)為與發炎相關的免疫系統製造之蛋白質。抗－TNF在TNF到達腸前自血液去除之，因而預防發炎。將英利昔單抗(Remicade)處方於治療對標準療法(即美沙拉嗪物質、皮質類固醇、免疫抑制劑)無反應之中度至嚴重克隆氏症及治療開放、流出的瘺管。
4.治療之指示 包括於由本文中揭示的組合物、化合物及方法治療之發炎性疾病包括發炎性腸道疾病、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變。其他考慮治療的疾病或症狀包括傳統上用類固醇治療者。
5.免疫球蛋白 於本發明的一個明確實施例中，本發明的藥劑為免疫球蛋白，當給予病患時，可用於發炎性腸道疾病、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變之診斷及治療中，使得先前服用類固醇的病患可以逐漸減少類固醇及/或中斷之。此等免疫球蛋白可由選擇性結合至α4 整合素或包含α4 整合素之二聚體，如α4 β1 ，或結合至VCAM－1之免疫球蛋白選出。較佳的是，免疫球蛋白結合α4 β1 或α4 β7 及抑制α4 β1 或α4 β7 活性。免疫球蛋白較佳為抗體或其片段。
由「抗體」意指包括完整免疫球蛋白如IgG1(或任何IgG亞型)或IgM，或由抗體衍生的抑制劑，如那他珠單抗。
由「抗體類似物」意指包括由免疫球蛋白輕及重鏈經由雙硫鍵連接組成的完整抗體。用詞「抗體類似物」以用來包含一種蛋白質，包含有由免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈及能夠結合至一或多個抗原(即整合素或整合素配體)之其抗原結合片段選出之一或多個多肽。可將由多於一個多肽組成的抗體類似物之成份多肽視情況雙硫鍵鍵結或以另外的方式共價鍵交聯。於是，因此，「抗體類似物」包括類型IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及其亞型，如IgG1)之完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白之輕鏈可為κ或λ類型。「抗體類似物」也包括保持抗原結合專一性之完整抗體之部分，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv片段、重及輕鏈單體或二聚體或其混合物。
當本發明的藥劑為抗體，單株抗體為較佳的抗體。相反於多株抗體製品，其通常包括針對不同抗原決定位(epitope)之不同抗體，各單株抗體係針對抗原上的單一抗原決定位。單株抗體的第二個優點為其係由不受其他免疫球蛋白污染的方式合成，如藉由噬菌體呈現或自融合瘤分離。雖然本發明打算包含多株及單株抗體兩者作為本發明的藥劑，單株抗體為較佳，因其為高度專一性，及因此將本發明主要就單株抗體而言討論。
「天然抗體及免疫球蛋白」通常為約150,000道爾頓之異四聚體醣蛋白，由兩個相同的輕(L,light)鏈及兩個相同的重(H,heavy)鏈組成。由一個共價雙硫鍵將各輕鏈連接至重鏈，而雙硫鍵的數目於不同免疫球蛋白同型(isotype)的重鏈間改變。各重及輕鏈也有規律間隔的鏈內雙硫鍵橋。各重鏈於一端具有可變區塊(VH )接著許多固定區塊。各輕鏈於一端具有可變區塊(VL )及固定區塊於其另一端；輕鏈的固定區塊與重鏈的第一個固定區塊對齊，及輕鏈可變區塊與重鏈的可變區塊對齊。吾人相信特定的胺基酸基團形成輕及重鏈可變區域之間的界面(Clothia等人，1985,J.Mol.Biol.,186：651－63；Novotny等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：4592－6)。
此外，利用技藝中可得的技術可確認其他抗體。例如，可將本發明的單株抗體利用噬菌體呈現技術產生。而後分離選擇性結合至α4 整合素或包含α4 整合素之二聚體之抗體片段。經由噬菌體呈現之較佳製造抗體方法之實例係揭示於美國專利編號6,225,447；6,180,336；6,172,197；6,140,471；5,969,108；5,885,793；5,872,215；5,871,907；5,858,657；5,837,242；5,733,743及5,565,332，將其全文為所有目的以參考資料併於本文中。
「變體」抗體於本文中意指藉由添加、缺失及/或取代母抗體序列中一或多個胺基酸基團而於胺基酸序列中與「母」抗體胺基酸序列不同之免疫球蛋白分子。母抗體或免疫球蛋白可為多株抗體、單株抗體、人化抗體、靈長源抗體(primatizedantibody)或任何抗體片段。於較佳具體實施例中，變體包含一或多個胺基酸取代於母抗體的一或多個高變區(hypervariable region)中。例如，變體可包含至少一個(如由約一至約十個，及較佳約二至約五個)取代於母抗體的一或多個高變區中。一般，變體具有將與母抗體重或輕鏈可變區塊序列具有至少75%胺基酸序列一致性之胺基酸序列，更佳的是至少80%，更佳至少85%，更佳至少90%，及最佳至少95%。將關於此序列之一致性或同源性於本文中定義為於候選序列中與母抗體基團一致的胺基酸基團百分比，視需要在對齊序列及導入空缺後以達到最大序列一致性百分比。不應將N端、C端、或內部延長、缺失、或插入胺基酸序列視為影響序列一致性或同源性。變體保持結合受體的能力及較佳具有優於母抗體的性質。例如，變體可能具有較強結合親和力，增強活化受體的能力等。為了分析此性質，應比較變體的Fab形式與母抗體的Fab形式或變體的全長形式與母抗體的全長形式。本文中特別有興趣的變體抗體為與母抗體相較，呈現生物活性增加至少約10倍，較佳至少約20倍，及最佳至少約50倍。本文中的「母」抗體為由用於製備變體之胺基酸序列編碼者。較佳的是，母抗體具有人類骨架區及具有人類抗體固定區域。例如，母抗體可為人化或人類抗體。「分離的」抗體為已確認及已自其天然環境的成分分離及/或回收者。其天然環境的污染成份為會干擾抗體之診斷或治療用途之物質，及可包括酵素、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。於較佳的具體實施例中，將抗體純化(1)至大於95重量%抗體(由勞里法(Lowry method)測定)，及最佳的是大於99重量%，(2)至足以藉由利用旋轉杯定序儀得到N端或內部胺基酸序列至少15個基團之程度，或(3)至同質(由SDS－PAGE於還原或非還原條件下利用考麻薩藍(Coomassie blue)或較佳的是銀染)。分離的抗體包括於重組細胞內原位抗體因為抗體天然環境之至少一個成份將不存在。然而，一般分離的抗體將由至少一個純化步驟製備。
5.1單株抗體 也可將單株抗體利用習見融合瘤方法或基因工程製造。此等方法已廣泛地運用產生分泌高濃度對抗許多專一抗原之單株抗體的融合細胞株，及可用來產生本發明之單株抗體。例如，藉腹膜內注射可將小鼠(如Balb/c小鼠)以抗原α4 抗原決定位接種。充分時間已經過以允許免疫反應後，利用於技藝中已熟知的技術，將小鼠殺死及將得到的脾臟細胞與骨髓癌細胞融合。而後將形成的融合細胞(融合瘤)生長於選擇性培養基中，及利用稀釋條件將存活的細胞生長於此培養基中。在選殖及再選殖後，可分離分泌選擇性結合至目標α4 或含有α4 整合素之二聚體之抗體(例如IgG或IgG型或IgG1亞型)的融合瘤。為了產生專為人類使用的藥劑，而後可將分離的單株抗體用來產生嵌合及人化抗體。也可製備抗體為抗胜肽抗體。此抗胜肽抗體係由針對α4 整合素之胜肽而製備。
用詞「嵌合」當關於本發明藥劑意指藥劑係由具有不同結構及/或不同起源來源之二或多個蛋白質連結(化學交聯或共價鍵或其他類型)組成。因此，嵌合α4 整合素拮抗劑可包括一部份為α4 整合素拮抗劑或片段及另一個部分不是α4 β1 整合素拮抗劑。
一種「嵌合」蛋白質為「融合」或「融合蛋白質」意指二或多個蛋白質或其片段之共線、共價鍵連結經由其各自胜肽骨架，最佳的是經由編碼此等蛋白質的多核苷酸分子之基因表現。因此，較佳的融合蛋白質為嵌合蛋白質，其包括抗體或其片段共價連結至非起源於此抗體(即其衍生自另一種免疫球蛋白或多肽)之第二個部分。本發明之較佳融合蛋白質可包括保留抗原結合專一性的完整抗體部分，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv片段、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、由一個重鏈及一個輕鏈組成的二聚體等。
最佳的融合蛋白質為嵌合及包含一部份融合或以另外的方式連接至免疫球蛋白輕鏈、重鏈、或兩者之鉸鏈(hinge)及固定區域的全部或部分。因此，本發明特別介紹一種分子，其包括：(1)第一個部分，(2)第二個胜肽，如增加溶解度或活體內此部份之壽命者，如免疫球蛋白超家族的一員或片段或其部分，如IgG之部份或片段，如人類IgG1重鏈固定區域，如CH2 、CH3 及鉸鏈區域。明確而言，「類固醇節約/Ig融合」為一種蛋白質，包含有本發明之生物活性類固醇節約部分。一種藥劑為「整合素/Fc融合」，其為一種蛋白質，包含有本發明的類固醇節約免疫球蛋白連接至免疫球蛋白之固定區塊的至少一部份。較佳的Fc融合包含本發明的類固醇節約免疫球蛋白連接至含有重免疫球蛋白鏈之C端區塊抗體片段。
用詞「融合蛋白質」也意指將類固醇節約部分經由單或異功能分子化學連結至非類固醇節約部分的第二個部分(造成「嵌合」分子)及如下述由純化的蛋白質重新製造。因此，化學連結的一個實例，與重組連接相反，嵌合分子為一種融合蛋白質，可包含有：(1)α4 整合素次單元目標部分，如VCAM－1部分，能夠結合至帶VLA－4細胞表面上的VLA－4；(2)第二個分子其增加目標部分之溶解度或活體內壽命，如聚烷二醇聚合物如聚乙二醇(PEG,polyethylene glycol)。α4 目標部分可為任何天然發生的α4 配體或其片段，如VCAM－1胜肽或類似保留性取代的胺基酸序列。
由非人類抗體可產生嵌合、靈長源(primatized)及人化抗體，及可具有與其製造來源的抗體相同或類似的結合親和力。可使用為嵌合抗體之製造發展的技術(Morrison等人，1984 Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851；Neuberger等人，1984,Nature 312：604；Takeda等人，1985 Nature 314：452)藉由來自適當抗原專一性之小鼠抗體分子之基因與來自例如適當生物活性之人類抗體分子之基因一起剪接；此抗體於本發明的範圍內。例如，可將編碼小鼠單株抗體可變(V)區域的核酸連接至編碼人類固定(C)區域，如IgG1或IgG4之核酸連接。因此，形成的抗體為物種混合，一般具有來自非人類抗體之抗原結合區塊及來自人類抗體之C或效應區塊。
人化抗體為具有主要來自人類抗體(接受者抗體)之可變區域的抗體，但其具有互補決定區域大體上來自非人抗體(提供者抗體)。見如Queen等人，1989 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029－33；世界專利90/07861；及美國專利6,054,297；5,693,761；5,585,089；5,530,101及5,224,539。此等抗體之固定區域一般也來自人類抗體。人類可變區塊一般選自具有序列與理想非人可變區域結合區塊呈現高度同源性的人類抗體。重及輕鏈可變基團可由相同抗體或不同人類抗體衍生出。此外，可選擇序列為數個人類抗體之共通序列，如說明於世界專利92/22653中。
基於預測的構造及抗原結合性質，選擇於人類可變區域內的特定胺基酸做取代。利用技術如電腦模擬，預測於可變區域內某位置處胺基酸的行為及結合性質，及觀察取代的效果，可將此決定。例如，當一個胺基酸於非人可變區域及人類可變區域之間不同，可將人類可變區域改變已反應非人可變區域的胺基酸組合物。本文中說明人化抗－α4 抗體之數個實例。
由「人化抗體類似物」意指由重組DNA技術產生之抗體類似物，其中對抗原結合不需要之人類免疫球蛋白輕或重鏈的部份或所有胺基酸已用來自非人類哺乳類免疫球蛋白輕或重鏈之相對應胺基酸取代。「人類抗體類似物」為一種抗體類似物，其中免疫球蛋白輕或重鏈的所有胺基酸(無論其是否為抗原結合所必須)係衍生自人類來源。
於明確實施例中，使用於本發明長期給藥流程之抗體為人化抗體，如揭示於美國專利5,840,299中，將其以參考資料併於本文中。
於另一個具體實施例中，可將含有人類抗體基因之基因轉殖小鼠用抗原α4 結構接種及可使用融合瘤技術來產生選擇性結合至α4 之人類抗體。
藉由重組表現，如於人類融合瘤中表現(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan P.Liss,77頁(1985))、於骨髓瘤細胞中或於中國倉鼠卵巢(CHO,Chinese Hamster Ovary)細胞中，可產生嵌合、人類及/或人化抗體。或者，可將編碼抗體序列併入適合導入動物基因組的載體內，因而產生基因轉殖動物。一個實例為產生此抗體於基因轉殖動物如牛的乳汁中。見如美國專利5,849,992及5,304,489。適當轉殖基因包括轉殖基因具有來自哺乳類腺體專一的基因之啟動子及/增強子，例如酪蛋白或β－乳球蛋白。
5.2人化及靈長源(Primatized )抗體 於本發明的一個具體實施例中，提供對VLA－4之α4 次單元專一的人化(及靈長源)免疫球蛋白(或抗體)，當以有效量給予時，可使用其於治療及診斷發炎性腸道疾病如克隆氏症、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變使得不需要類固醇。人化及靈長源(primatized)抗體為動物(通常為哺乳類)來源之抗體，利用基因工程技術已將其改質。使用此技術來用人類序列取代固定區域及/或可變區域骨架序列，而保留抗體之原始抗原專一性。一般人化及靈長源(primatized)抗體衍生自對人類抗原(如人類VCAM－1或人類VLA－4)有專一性之齧齒類(如小鼠及倉鼠)抗體。藉由改造提供者抗體(將抗原給予之動物的抗體)以具有來自將給予抗體作為治療目的之動物的序列，於給予抗體時動物將有降低的宿主反應。僅Fc區域或除了互補決定區域(CDR,complementarity determining region)外所有區域可用接受者區塊取代，其中接受者為要將改造的抗體給予的動物(如哺乳類如人類、馴養的動物、農用動物等)。
結合至VLA－4之α4 次單元的抗體當以有效量給予病患時，其治療發炎性腸道疾病、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變為較佳。
典型而言，將鼠科抗體的CDR移植入人類抗體中的相對應區域，因為其為CDR(即三個於抗體重鏈中，三個於輕鏈中)為小鼠抗體(或任何其他動物抗體)之區域，其結合至專一的抗原。藉基因工程達到CDR移植，藉以藉選殖鼠科重及輕鏈可變(V)區域基因片段決定CDR DNA序列，及而後藉定位突變法轉移至相對應的人類V區域。於製程的最後階段，加入理想同型之人類固定區域基因段落(通常CH為γI及CL為κ)及將人化的重及輕鏈基因共同表現於哺乳類細胞以產生可溶的人化抗體。
此等CDR轉移至人類抗體於此抗體上賦予原始鼠科抗體之抗原結合性質。於鼠科抗體中的六個CDR係結構上裝在V區域「骨架」區域上。CDR移植成功的原因為小鼠及人類抗體之間的骨架區可能具有非常類似3－D結構與類似CDR接觸點，使得可將CDR交換。可將此人化抗體類似物製備，如舉例於，如Jones等人，1986,Nature 321：522－5；Riechmann等人，1988,Nature 332：323－7；Queen等人，1989,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：10029；及Orlandi等人，1989,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：3833。
但是，於骨架區內的某些胺基酸被視為與CDR交互作用及影響整體抗原結合親和性。由鼠科抗體直接轉移CDR以產生重組人化抗體而無任何修改於人類V區域骨架常造成結合親和力之部分或完全喪失。於數個情況中，改變接受者抗體(如人類抗體)骨架區的基團以便得到結合活性似乎為關鍵。
Queen等人(於前)及世界專利90/07861(Protein Design Labs)已說明藉由合併鼠MAb(抗－Tac)之CDR與人類免疫球蛋白骨架及固定區域製備人化抗體於接受者抗體骨架區中含有改質的基團。一個解決結合親和力喪失的問題而不改變任何人類V區域骨架區的方法包含兩個主要步驟。首先，藉由電腦分析對原始鼠科抗體之V區域骨架的最佳蛋白質序列同源性選擇人類V骨架區。於第二個步驟中，藉電腦模擬鼠科V區域的三級結構以便想像可能與鼠科CDR交互作用的骨架胺基酸基團。而後將此等鼠科胺基酸基團重疊於同源的人類骨架上。其餘的細節，見美國專利5,693,762；5,693,761；5,585,089及5,530,101(Protein Design Labs)。
某些有用於本發明之含α4 次單元整合素拮抗劑包括嵌合及人化重組抗體類似物(即其完整免疫球蛋白及其部分)與B抗原決定位專一性，其已被製備及說明於美國專利編號5,932,214(Mab HP1/2)。用於製備嵌合(小鼠可變－人類固定)及人化抗整合素抗體類似物之起始材料可為如前述鼠科單株抗體抗整合素抗體，一種市面上可購得的單株抗－整合素抗體(如HP2/1,Amae International,Inc.,Westbrook,Me)。其他較佳的人化抗－VLA－4抗體類似物係由Athena Neurosciences,Inc.於PCT/US95/01219(1995年7月27日)、美國專利編號5,840,299及6,033,665中所述。將5,932,214、5,840,299及6,033,665專利全文以參考資料併於本文中。
此等人化抗－VLA－4抗體包含人化輕鏈及人化重鏈。人化輕鏈包含具有來自小鼠21.6免疫球蛋白輕鏈相對應互補決定區域胺基酸序列之三個互補決定區域(CDR1、CDR2及CDR3)及來自人類κ輕鏈可變區域骨架序列的可變區域骨架除了在最後面位置中將胺基酸位置以於小鼠21.6免疫球蛋白輕鏈可變區域骨架相等位置中存在的相同胺基酸佔據。人化重鏈包含具有來自小鼠21.6免疫球蛋白重鏈相對應互補決定區域胺基酸序列之三個互補決定區域(CDR1、CDR2及CDR3)及來自人類重鏈可變區域骨架序列的可變區域骨架除了於至少一個位置中將胺基酸位置以於小鼠21.6免疫球蛋白重鏈可變區域骨架相等位置中存在的相同胺基酸佔據。見美國專利編號5,840,299及6,033,665。
由重組方法、由蛋白質水解消化、或藉利用熟悉本技藝者已知的方法化學合成，可有效率地製造分離的α4 整合素拮抗劑片段(如本文中說明之抗體類似物片段)。於重組方法中，藉去除編碼分離的刺蝟(hedgehog)多肽之DNA序列一端(為末端片段)或兩端(為內部片段)一或多個核苷酸可產生多肽之內部或末端片段。突變DNA的表現產生多肽片段。用某些核酸內切酶之消化也可產生編碼一系列片段之DNA。藉隨機剪切、限制消化或其組合也可產生編碼蛋白質片段的DNA。由完整蛋白質可直接產生蛋白質片段。藉蛋白質水解酵素，包括(但不限於)血纖維蛋白溶酶(plasmin)、凝血酶(thrombin)、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或胃蛋白酶(pepsin)可將胜肽專一地切斷。此等酵素各為對其攻擊的胜肽鍵類型專一。胰蛋白酶催化胜肽鍵水解，其中羰基為來自鹼性胺基酸，通常為精胺酸或離胺酸。胃蛋白酶及胰凝乳蛋白酶催化來自芳香族胺基酸的胜肽鍵水解，如色胺酸、酪胺酸及苯丙胺酸。切斷的蛋白質片段之其他組合係由避免在異於受蛋白質水解酵素分解的位置而產生。例如，於微鹼性溶液中使離胺酸的ε－胺基基團與三氟硫代醋酸乙酯反應產生阻擋的胺基酸基團，其相鄰的胜肽鍵不再易受到胰蛋白酶水解。可將蛋白質改質以產生易受到蛋白水解酵素水解之胜肽鍵結。例如，用β－鹵化乙基胺烷基化半胱氨酸(cysteine)基團產生受胰蛋白酶水解的胜肽鍵結(Lindley,1956,Nature 178：647)。此外，可使用在特定基團切斷胜肽鏈的化學試劑。例如，溴化氰在甲硫胺酸基團切斷胜肽(Gross等人，1961,J.Am.Chem.Soc.83：1510)。因此，藉由用改質劑、蛋白質水解酵素及/或化學試劑之不同組合處理蛋白質，可將蛋白質分成不具重疊片段之理想長度的片段，或分成理想長度之重疊片段。
5.3那他珠單抗及相關人化抗體 本發明提供利用專一結合至VLA－4配體之人化免疫球蛋白單獨或組合來診斷及/或治療發炎性腸道疾病如克隆氏症、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病、及不同脊椎關節病變之方法用於此治療方法及於藥物中的一個較佳抗體包括說明於美國專利編號5,840,299(Elan Pharmaceuticals)中者，將其全文併於本文中。另一個觀點考慮使用此等抗體之片段如於活體內評估。
人化抗體包含有人化輕鏈及人化重鏈。於一個觀點中，人化輕鏈可包含具有來自小鼠21－6免疫球蛋白輕鏈相對應互補決定區域胺基酸序列之三個互補決定區域(即CDR1、CDR2及CDR3)及來自人類κ輕鏈可變區域骨架序列的可變區域骨架除了在由位置L45、L49、L58及L69組成的第一個族群選出的至少一個位置中，其中將胺基酸位置以於小鼠21.6免疫球蛋白輕鏈可變區域骨架相等位置中存在的相同胺基酸佔據。
人化重鏈包含具有來自小鼠21－6免疫球蛋白重鏈相對應互補決定區域胺基酸序列之三個互補決定區域(即CDR1、CDR2及CDR3)及來自人類重鏈可變區域骨架序列的可變區域骨架除了在由H27、H28、H29、H30、H44、H71組成的族群選出的至少一個位置中，其中將胺基酸位置以於小鼠21－6免疫球蛋白重鏈可變區域骨架相等位置中存在的相同胺基酸佔據。免疫球蛋白專一地結合至VLA－4，其親和力具有下限約107 M－ 1 及上限約小鼠21－6免疫球蛋白之親和力約五倍。
通常，人化輕及重鏈可變區域骨架分別來自RE1及21/28'CL可變區域骨架序列。當人化輕鏈可變區域骨架來自RE1，將至少兩個骨架胺基酸取代。一個胺基酸為來自如前述位置之第一個族群。另一個位置為來自由位置L104、L105及L107組成的第三個族群。將此位置以來自人類免疫球蛋白非RE1之κ輕鏈相等位置中存在的相同胺基酸佔據。
一些人化免疫球蛋白具有記為La或Lb之成熟輕鏈可變區域序列，或記為Ha、Hb或Hc之成熟重鏈可變區域序列。較佳的人化免疫球蛋白包括具有La輕鏈及Ha、Hb或Hc重鏈者。
人化免疫球蛋白具有實質上來自人類免疫球蛋白(稱為接受者免疫球蛋白)之可變骨架區域及實質上來自小鼠免疫球蛋白稱為mu MAb 21.6(稱為提供者免疫球蛋白)之互補決定區域。若存在固定區域，也實質上來自人類免疫球蛋白。人化抗體呈現對VLA－4專一結合親和力至少為107 、108 、109 或101 0 M－ 1 。通常人化抗體對VLA－4之結合親和力上限為mu MAb 21.6的結合親和力(約109 M－ 1 )之三或五倍內。通常結合親和力的下限也於mu MAb 21.6的結合親和力之三或五倍內。
可將人化抗體製造如例如以小鼠MAb 21.6單株抗體舉例。製造人化抗體之起始材料為mu MAb 21.6。此抗體之分離及性質係說明於美國專利編號6,033,655(讓渡給Elan Pharmaceuticals,Inc.)，將其全文為所有目的以參考資料併於本文中。簡而言之，mu MAb 21.6專一於VLA－4的α4 次單元及已證實抑制人類淋巴細胞結合至用腫瘤壞死因子刺激之大鼠腦細胞的組織培養。由N端至C端，輕及重鏈兩者皆包含區塊FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。各區塊之胺基酸分派係根據卡巴之標號慣例。
下一步包含選擇人類抗體以供應骨架基團。若人類可變區塊骨架採取與CDR來源的小鼠可變骨架相同或類似構造’取代小鼠CDR進入人類可變區塊骨架最可能造成其正確空間方位之保留。藉由得到來自人類抗體之人類可變區塊，其骨架序列與衍生CDR之鼠科可變骨架區塊呈現高度序列一致性，而將此達成。可將重及輕鏈可變骨架區衍生自相同或不同人類抗體序列。人類抗體序列可為天然發生的人類抗體序列或可為數個人類抗體之共通序列。見Kettleborough等人，Protein Engineering 4：773(1991)；Kolbinger等人，Protein Engineering 6：971(1993)。
藉由電腦比較小鼠可變區域之胺基酸序列與已知人類抗體之序列，確認適當的人類抗體序列。分別對重及輕鏈進行比較，但對各鏈之原理為類似。此比較顯示mu 21.6輕鏈與亞型κ1之人類輕鏈呈現最大序列一致性；mu 21.6重鏈與亞型1之人類重鏈呈現最大序列一致性，如前文由卡巴定義。因此，通常將輕及重鏈骨架區衍生自此等亞型之人類抗體，或自此亞型之共通序列。顯示與來自mu MAb 21.6相對應區域有最大序列一致性之較佳的輕及重鏈人類可變區域分別為RE1及21/28'CL。
而後可使用電腦模擬進一步增強人化抗體結合其同源抗原之能力。鼠科CDR區域與人類可變骨架區的不自然並列可造成不自然結構限制，其除非由某些胺基酸基團之取代矯正，導致結合親和力喪失。部分由電腦模擬決定取代用的胺基酸基團之選擇。用於產生免疫球蛋白分子三度空間影像之電腦硬體及軟體為廣泛可獲得。一般而言，分子模型係由免疫球蛋白鏈或其區塊已解出的結構而開始產生。將欲模擬的鏈與已解出三度空間結構的鏈或區塊比較胺基酸序列類似性，將顯示最大序列類似性之鏈或區塊選擇作為建立分子模型之起始點。例如，對於mu MAb 21.6之輕鏈，模擬骨架區、CDR1及CDR2區域的起始點為人類輕鏈RE1。對於CDR3區域，起始點為來自不同人類抗體HyHEL－5之輕鏈的CDR3區域。將解出的起始結構修改以允許被模擬的免疫球蛋白鏈或區塊中實際胺基酸及於起始結構中的胺基酸之間差異。而後將修改的結構組合入複合免疫球蛋白中。最後，藉由能量最小化及藉由證實所有原子彼此於適當距離內及鍵長度及角度於化學上可接受的限制內，將模型精製。
如前所述，本發明之人化抗體包含實質上來自人類免疫球蛋白之可變骨架區域及實質上來自小鼠免疫球蛋白稱為mu MAb 21.6之互補決定區域。已確認mu MAb 21.6之互補決定區域(CDR)及適當人類接受者免疫球蛋白，下一步為決定來自此等成份之何者(若有)基團應被取代以最佳化形成的人化抗體之性質。一般而言，應將人類胺基酸基團以鼠科取代減至最少，因為鼠科基團的導入增加抗體引發HAMA反應於人類的危險。基於其於CDR結構及/或對抗原結合上的可能影響選擇取代的胺基酸。此可能的影響之研究為藉由模擬、檢查胺基酸於特定位置之特性、或實驗觀察取代或突變特定胺基酸之作用。
當胺基酸不同於mu MAb 21.6可變骨架區及相當的人類可變骨架區之間，通常應將人類骨架胺基酸以相當的小鼠胺基酸取代，若合理地預期胺基酸：(1)非共價地直接鍵結抗原(如胺基酸於mu MAb 21.6之位置L49、L69)，(2)相鄰於CDR區域、為於由Chothia等人(於前)提出之另一定義下之CDR區域之部分、或以其他方式與CDR區域交互作用(如為與CDR區域為約3埃內)(如胺基酸於mu MAb 21.6之位置L45、L58、H27、H28、H29、H30及H71)，或(3)參與VL －VH 界面(如胺基酸於mu MAb 21.6之位置H44)。
取代的其他候選者為對於人類免疫球蛋白在該位置為不常見之接受者人類骨架胺基酸(如胺基酸於mu MAb 21.6之位置L104、L105及L107)。可將此等胺基酸用來自相當位置之更典型人類免疫球蛋白的胺基酸取代。或者，可將來自於小鼠MAb 21.6相當位置之胺基酸導入人類骨架區，當此胺基酸於此相當位置為典型人類免疫球蛋白。
一般而言，希望取代所有或大部分滿足上述標準之胺基酸。然而，有時候有一些含糊於是否特定胺基酸符合上述標準，及產生可選擇的變體免疫球蛋白，其中一者有此特定取代，另一者則否。人化抗體通常將含有人類輕鏈骨架基團用相對應mu MAb 21.6基團之取代於至少1、2或3個，更常為4個下列位置：L45、L49、L58及L69。人化抗體通常將含有人類重鏈骨架基團之取代於至少1、2、3、4或5個，及有時6個下列位置：H27、H28、H29、H30、H44及H71。偶爾，也可將H36取代。於較佳具體實施例中，當人類輕鏈接受者免疫球蛋白為RE1時，輕鏈也含有取代於至少1或2個，更常為3個下列位置：L104、L105及L107。將此等位置用來自具有更典型胺基酸基團之人類免疫球蛋白之相當位置胺基酸取代。
通常人化抗體中的CDR區域實質上為相同，及更通常相同於mu MAb 21.6抗體中相對應之CDR區域。然而，偶爾希望改變CDR區域中的一個基團。胺基酸類似性存在於mu MAb 21.6 CDR3及VCAM－1配體之間。此觀察建議人化抗體之結合親和力可由重新設計重鏈CDR3區域再更像VCAM－1而改善。於是，可將CDR3區塊的一或多個胺基酸用VCAM－1結合區塊的胺基酸取代。雖然不是通常希望，有時能夠做CDR基團之一或多個保留性胺基酸取代而不明顯地影響形成的人化免疫球蛋白之結合親和力。
除了上述特定胺基酸取代外，人化免疫球蛋白之骨架區通常實質上相等，及更通常，相等於將其衍生自的人類抗體之骨架區域。當然，於骨架區中的許多胺基酸對抗體之專一性或親和力有極少或無直接貢獻。因此，可容忍骨架基團之許多個別保留性取代而無明顯改變形成的人化免疫球蛋白之專一性或親和力。然而，一般而言，此取代為不希望有的。
5.3.1可變區域之製造 已概念上選擇人化免疫球蛋白之CDR及骨架成份，許多方法可用於製造此免疫球蛋白。因為密碼的簡併，許多合酸序列將編碼各免疫球蛋白胺基酸序列。藉由固相DNA新合成或藉由PCR突變先前製備的理想多核苷酸變體，可製造理想的合酸序列。寡核苷酸媒介的突變為製備目標多肽DNA之取代、缺失及插入變體的較佳方法。見Adelman等人，DNA 2：183(1983)。簡而言之，將目標多肽DNA改變係藉由雜交編碼理想突變的寡核苷酸與單股DNA模板。雜交後，使用DNA聚合酶來合成模板之整個第二條互補股，其併入寡核苷酸引子，及編碼於目標多肽DNA中選定的改變。
5.3.2固定區域之選擇 如前述製造的人化抗體之可變段落通常連接至免疫球蛋白固定區域(Fc)之一部份，通常為人類免疫球蛋白的部分。根據已熟知的程序由許多人類細胞可分離出人類固定區域DNA序列，但較佳為永生化B細胞(見Kabat等人，同前，及世界專利87/02671)(將其各全文為所有目的以參考資料併入)。通常，抗體將含有輕鏈及重鏈兩者固定區域。重鏈固定區域通常包括CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區域。
人化抗體包括具有所有類型固定區域之抗體，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何同型，包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。當希望人化抗體呈現細胞毒性活性時，固定區塊通常為補體結合的固定區塊及類別通常為IgG1 。當此細胞毒性活性為不希望有的，固定區塊可為IgG2 類別。人化抗體可包含來自多於一種類別或同型之序列。
5.3.3其他抗－VLA－4抗體 其他抗－VLA－4抗體包括但不限於HP1/2、HP－2/1、HP2/4、L25及P4C2。此將此等抗體以有效量給予以診斷及/或治療發炎性腸道疾病，如熟悉本技藝者如本文中所討論及如技藝中一般已知將會輕易地領會。
經常，將小鼠中建立的單株抗體隨後人化以避免人類抗小鼠抗體(HAMA,human anti－mouse antibody)免疫反應於用小鼠抗體注射的人類個體中。此由CDR移植或改造產生。因此，通常抗體首先為小鼠單株抗體，經過CDR移植或改造變成人化，如對21.6抗體之討論。
明確而言，人化抗體具有對VLA－4專一性及有能力診斷及/或治療發炎性腸道疾病。此等抗體係由來源(如典型為小鼠)衍生，其可變區塊之至少一或多個互補決定區域(CDR,complementarity determining region)係衍生自提供者非人抗－VLA－4抗體，及其中可能有或無最小改變接受者抗體重及/或輕鏈可變骨架區域以便保留提供者抗體結合專一性。較佳的是，CDR移植重鏈可變區塊之抗原結合區域包含相當於位置31－35(CDR1)、50－65(CDR2)及95－102(CDR3)之CDR。於較佳具體實施例中，重鏈更包括非人基團於骨架位置27－30(卡巴編號)。重鏈可更包括非人基團於骨架位置75(卡巴編號)。重鏈可更包括非人基團於骨架位置77－79或66－67及69－71或84－85或38及40或24(卡巴編號)。較佳的是，CDR移植輕鏈可變區塊之抗原結合區域包含相當於位置24－34(CDR1)、50－56(CDR2)及89－97(CDR3)之CDR。於較佳具體實施例中，輕鏈更包括非人基團於骨架位置60及67(卡巴編號)。此等基團命名係根據卡巴編號而編號(Kabat等人，第5版，第4冊，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,U.S.Department of Health Human Services,NIH,USA(1991))。
小鼠抗體HP1/2之合成及人化。HP1/2為針對VLA－4之另一個抗體。製備此抗體之人化形式以用於人類個體的方法係說明於本文中及進一步說明於美國專利編號6,602,503(讓渡給Biogen,Inc.)中，及為所有目的將其全文以參考資料併入。提供人化抗體之序列如下。HP1/2 VH DNA序列及其轉譯的胺基酸序列為：
HP1/2 VH 之間兩序列及家族IIC之共通序列比較顯示唯一奇特的基團為在胺基酸位置80及121(即於卡巴編號中79、94及121)。雖然Tyr－80於子群IIC中為不變的，其他定序的鼠科VH 區域具有其他芳香族胺基酸於此位置，雖然沒有一個有Trp。人類及鼠類VH 之大多數有精胺酸基團於卡巴位置94。於HP1/2 VH 中Asp－94之存在為極罕見；僅一個報導的實例有負電荷基團於此位置。脯胺酸於卡巴位置113也為奇特但於CDR結構中不可能為重要因為其距離遙遠。已發現組成CDR1之胺基酸於三個其他定序的鼠科VH 區域中。然而，CDR2及CDR3對HP1/2為獨特及未曾發現於任何其他報導的鼠科VH 中。
HP1/2 VK DNA序列及其轉譯的胺基酸序列為如下：
HP1/2 VK 為卡巴家族V之一員(Kabat等人，第5版，第4冊，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,U.S.Department of Health Human Services,(1991))及無奇特的基團。CDR1及CDR3之胺基酸為獨特。曾報導組成CDR2之胺基酸於另一個鼠科VK 區域中。
CDR－移植的抗－VLA－4抗體之設計。為了設計CDR－移植的抗－VLA－4抗體，必需決定鼠科HP1/2之何基團構成輕及重鏈之CDR。在較不可變骨架序列之中發現三個高變區於輕及重鏈兩者上(Wu及Kabat,J.Exp.Med.132：211－250(1970)；Kabat等人(1991))。於大部分情況中，此等高變區相當於(但可能延伸超過)CDR。根據Kabat等人(1991)藉比對其他VH 及VK 序列將鼠科HP1/2之CDR說明。將鼠科HP1/2 VH 之CDR確認及相當於在人化VH 序列中確認的基團如下：CDR1 AA3 1 －AA3 5 CDR2 AA5 0 －AA6 6 CDR3 AA9 9 －AA1 1 0 此等於卡巴編號中分別相當於AA3 1 －AA3 5 、AA5 0 －AA6 5 及AA9 5 －AA1 0 2 。將鼠科HP1/2 VK 之CDR確認及相當於在人化VK 序列中確認的基團如下：CDR1 AA2 4 －AA3 4 CDR2 AA5 0 －AA5 6 CDR3 AA8 9 －AA9 7 此等於卡巴編號中相當於相同編號的胺基酸。因此，僅VK (但非VH )CDR的邊界相當於卡巴CDR基團。重及輕鏈選擇接受HP1/2(提供者)CDR的人類骨架分別為NEWM及RE1。NEWM及RE1序列已發表於Kabat等人(1991)中。
人化HP1/2抗體之人化重鏈可變區域的DNA及相對應的胺基酸序列為：
人化HP1/2抗體之人化輕鏈可變區域的DNA及相對應的胺基酸序列為：
除了上述人化HP1/2抗體輕鏈及重鏈外，也可使用其他接受者重及輕鏈區域於插入提供者HP1/2區域。所有下列構體含有Ser－75(卡巴編號)。STAW構體更含有Gln至Thr於位置77，Phe至Ala於位置78，及Ser至Trp於位置79(卡巴編號)。將VH DNA序列及其轉譯後胺基酸序列於下說明：
KAITAS構體含有其他的改變為Arg至Lys(位置66)，Val至Ala(位置67)，Met至Ile(位置69)，Leu至Thr(位置70)及Val至Ala(位置71)(卡巴編號)。將KAITAS VH DNA序列及其轉譯後胺基酸序列於下說明：
SSE構體含有其他的改變為Ala至Ser(位置84)及Ala至Glu(位置85)(卡巴編號)。將SSE VH DNA序列及其轉譯後胺基酸序列於下說明：
KRS構體含有其他的改變為Arg至Lys(位置38)及Pro至Arg(位置40)(卡巴編號)。將KRS VH DNA序列及其轉譯後胺基酸序列於下說明：
AS構體含有改變為Val至Ala於位置24(卡巴編號)。AS VH DNA序列及其轉譯後胺基酸序列為：
人化輕鏈一般需要極少(若有)修改。然而，在人化抗－VLA－4抗體之製備中，數個經驗上的改變確實改善抗體對其配體之免疫活性。例如，具有Ser突變的人化重鏈與鼠科輕鏈比鼠科HP1/2低約2.5倍效力。相同人化重鏈與人化輕鏈為約4倍低效力。
人化VK 構體(VK1)含有Ser至Asp取代於位置60，及Ser至Tyr於位置67。將DNA序列及其轉譯後胺基酸序列於下說明：
另一個VK 構體(即VK2)具有原始RE1骨架恢復的DQMDY序列。將DNA序列及相對應的胺基酸序列提供於下：
第三種VK 構體為VK3，其具有SVM相對於DQM於胺基端及兩個其他基團改變。DNA序列及相對應的胺基酸序列為：
關於此等輕及重鏈序列各為如何製備之細節係提供於美國專利編號6,602,503中，將其全文為所有目的以參考資料併於本文中。基於如技藝中已知之電腦模擬可製備上述輕及重鏈之不同組合。
辨識及結合至α4 整合素之其他抗體為技藝中已知。此等包括但不限於GG5/3(Keszthelyi等人，Neurology 47(4)：1053－1059(1996))、FW3－218－1(ATCC No.：HB－261；一種針對羊α4 整合素之IgG2b抗體)及R1－2(ATCC No.：HB－227；於溝鼠(Rattus norvegicus)中形成的IgG2b抗體)。無論是否將抗體形成於小鼠或其他動物中，基於技藝中已知及用電腦模擬之助，可將各序列基因工程使其成為人化。而後可將抗－α4整合素人化抗體於本發明揭示之試管中及活體內測試中評估其診斷及/或治療發炎性腸道疾病的能力。
5.4抗體片段 同樣考慮用於診斷及/或治療發炎性腸道疾病的是結合至抗－α4或VCAM－1之抗體的抗體片段，使得其抑制VLA－4及VCAM－1交互作用。抗體片段包括Fab、F(ab')2 、scFv及Fv片段，可將其用於本文中揭示的組合物中。
如本文中使用的用詞「Fab片段」意指含有單一抗原結合區域之部分抗體分子，其由分子之重及輕鏈兩者之部分組成。
如本文中使用的用詞「F(ab')2 片段」意指含有兩個抗原結合區域之部分抗體分子，及其由分子之輕鏈及一部份重鏈組成。
如本文中使用的用詞「Fv片段」意指涉及抗原辨識及結合之抗原分子的部分。
如本文中使用的用詞「scFv」意指單鏈Fv(scFv)片段。此等scFv片段為重組抗體衍生物，其僅由抗體重及輕鏈的可變區塊組成，由彈性的連結子連接。scFv抗體片段包含有抗體之VH 及VL 區塊，其中此等區塊係呈現於單一多肽鏈中。一般而言，Fv多肽更包含一個多肽連結子於VH 及VL 區塊之間，其使得scFv形成抗原結合用之理想結構。關於scFv之回顧見Pluckthun於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113冊，269－315(Rosenburg and Moore編，Springer－Verlag,New York 1994)。
也包括於抗體片段中的是雙價抗體(diabody)。用詞「雙價抗體」意指具有兩個抗原結合位置之小抗體片段，其片段包含重鏈可變區塊(VH )連接至輕鏈可變區塊(VL )於相同多肽鏈(VH －VL )中。藉由利用太短的連結子以使相同鏈上的兩區塊之間無法成對，強迫區塊與另一鏈的互補區塊成對及產生兩個抗原結合位置。雙價抗體更完全地說明於例如歐洲專利404,097；世界專利93/11161及Hollinger等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444－8。
抗體片段也包括直線抗體。當於本申請案全文中使用時，措詞「直線抗體」意指說明於如Zapata等人，1995 Protein Eng.8(10)：1057－62中之抗體。簡而言之，此等抗體包含一對串聯Fd段落(VH －CH 1－VH －CH 1)，其形成一對抗原結合區域。直線抗體可為雙專一性或單專一性。
抗體之木瓜酵素(Papain)消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，各具有單一個抗原結合位置，及殘餘「Fc」片段，其名稱反應其很快地結晶之能力。木瓜酵素處理產生F(ab')2 片段，其具有兩個抗原結合位置及仍有交聯抗原的能力。
先前已說明數種小鼠抗－VLA－4單株抗體。見如美國專利編號6,602,503；6,033,665及5,840,299，如本文中進一步說明及將其全文為所有目的以參考資料併入本文中；Sanchez－Madrid等人，1986,Eur.J.Immunol.16：1343－9；Hemler等人，1987,J.Biol.Chem.262：11478－85；Pulido等人，1991,J.Biol.Chem.,266：10241－45；Issekutz等人，J.Immunol.,147：109(TA－2 MAb)。能夠辨認VLA－4之α及/或β鏈之此等抗－VLA－4單株抗體及其他抗－VLA－4抗體(如美國專利編號5,888,507－Biogen,Inc.及於其中引用的參考資料)將有用於根據本發明之治療方法中。辨識涉及結合至VCAM－1及纖維結合蛋白配體之VLA－4α4 鏈抗原決定位之抗－VLA－4抗體(即可結合至VLA－4於涉及配體辨識及阻擋VCAM－1及纖維結合蛋白結合之抗體)為較佳。該等抗體已界定為B抗原決定部位一專一性抗體(B1或B2)(前述Pulido等人，1991)且亦為本發明抗VLA－4抗體。
針對VLA－4之完整人類單株抗體類似物為另一個較佳結合藥劑，其可於本發明方法中阻止或塗佈VLA－4配體。以其完整形式，可將其利用試管內致敏人類脾細胞製備，如由Boerner等人，1991,J.Immunol.,147：86－95所述。或者，可將其藉由全套選殖(repertoire cloning)製備，如由Persson等人，1991,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,88：2432－36或由Huang等人，1991,J.Immunol.Meth.,141：227－236所述。美國專利編號5,798,230(1998年8月25日，「人類單株抗體之製備方法及其用途」)說明由人類B細胞製備人類單株抗體。根據此方法，藉由用表現艾普司坦－巴氏病毒核抗原2(EBNA2,Epstein－Barr virus nuclear antigen 2)之艾普司坦－巴氏病毒或其衍生物感染使產生人類抗體B細胞永生。隨後永生所必須之EBNA2功用關掉，其造成抗體產生之增加。其他方法為技藝中已知。
對於再另一個製造完整人類抗體之方法，見如美國專利編號5,789,650，其說明能夠產生異源抗體之基因轉殖非人動物及具有去活化內生免疫球蛋白基因之基因轉殖非人動物。藉由反意義多核苷酸及/或藉由針對內生免疫球蛋白之抗血清將內生免疫球蛋白基因抑制。異源抗體係由正常不見於該種非人動物基因組內之免疫球蛋白基因編碼。將含有未重排異源人類免疫球蛋白重鏈序列之一或多個轉殖基因導入非人動物因而形成基因轉殖動物，其能夠功能上重排基因轉殖免疫球蛋白序列及產生由人類免疫球蛋白基因編碼之全套許多同型抗體。此異源人類抗體係製造於B細胞中，之後將其永生化，如藉由與永生細胞株如骨髓瘤融合或藉由其他技術操縱此B細胞以使能夠產生單株、異源、完整人類抗體類似物之細胞株永生。也可使用大的無接種的人類噬菌體呈現庫來分離高親和力抗體，利用標準噬菌體技術可將其發展為人類醫藥。
在真正「嵌合抗體」(即整個固定及整個可變區域衍生自不同來源)之早期製備方法後，一種新的方法說明於歐洲專利0239400(Winter等人)，藉以將抗體藉對一個物種以另一個物種取代(於特定可變區域內)其互補決定區域(CDR,complementarity determining region)而改變。可使用此方法，例如，於用來自鼠科可變區域區塊之另外的CDR取代來自人類重及輕鏈Ig可變區域區塊之CDR。隨後可將此等改變的Ig可變區域與人類Ig固定區域合併以產生抗體，其除了取代的鼠科CDR，在構成上係完整人類。可預期此CDR取代的抗體相較於真正嵌合抗體較不可能於人類中引發免疫反應，因為CDR取代的抗體含有較少非人類成份。經由CDR「移植」之人化單株抗體之方法被稱為「改造」(Riechmann等人，1988,Nature 332：323－7及Verhoeyen等人，1988,Science 239：1534－6)。
5.5抗體純化 當利用重組技術，可將抗體產生於細胞內、胞質間間隙(periplasmic space)或直接分泌入培養基。若將抗體產生於細胞內，作為第一步，藉由例如離心或超過濾將微粒殘渣(宿主細胞或分解的片段)去除。Carter等人，Bio/Technology 10：163－7(1992)說明分離抗體之程序，將其分泌至大腸桿菌之胞質間間隙。簡而言之，將細胞糊在醋酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯氟(PMSF,phenylmethylsulfonylfluoride)存在下解凍約30分鐘。藉由離心可將細胞殘骸去除。當將抗體分泌至培養基的情況中，一般首先利用市售蛋白質過濾膜，例如Amicon或Millipore Pellicon超過濾單元將由此表現系統之上層清液濃縮。可將蛋白酶抑制劑如PMSF包括於任何前述步驟中以抑制蛋白質水解及可將抗生素加入以避免外來的污染物生長。
較佳將由細胞製備的抗體組合物經過至少一個純化步驟之後做LPHIC。適當純化步驟之實例包括氫氧磷灰石(hydroxylapatite)色層分析法、膠體電泳、透析及親和力色層分析法，其中親和力色層分析法為較佳的純化技術。蛋白質A作為親和力配體之適用性視存在於抗體中任何免疫球蛋白Fc區塊之物種及同型而定。可使用蛋白質A來純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人，1983,J.Immunol.Meth.62：1－13)。建議蛋白質G於所有小鼠同型及人類γ3(Guss等人，1986 EMBO J.5：1567－75)。親和力配體連接之基質最常為瓊膠糖(agarose)，但其他基質也可取得。物理上穩定的基質如控制孔洞玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯比用瓊膠糖可達到者允許較快的流速及較短的處理時間。在抗體包含CH 3區塊的情況，Bakerbond ABXT M 樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)有用於純化。其他蛋白質純化技術如在離子交換管柱上組份分離、乙醇沉澱、逆相HPLC、於矽膠上色層分析、於肝素(heparin)SEPHAROSET M 上色層分析、於陰離子或陽離子交互樹脂上色層分析(如聚天冬胺酸管柱)、層析聚焦(chromatofocusing)、SDS－PAGE及硫酸銨沉澱也可取得，視欲回收的抗體而定。
在初步的純化步驟後，將包含有所需抗體及污染物的混合物經過LPHIC。通常，待純化的抗體組合物將存在於來自前面純化步驟的緩衝液中。然而，在LPHIC步驟前可能必須加入緩衝液至抗體組合物。許多緩衝液為可利用及由常規實驗可選擇。將包含欲純化的抗體及至少一種污染物之混合物pH值於載入緩衝液(loading buffer)中利用酸或鹼(視開始的pH而定)調整至約2.5－4.5之pH值。較佳的是，載入緩衝液具有低鹽濃度(即小於約0.25 M鹽)。
將混合物載入HIC管柱上。HIC管柱通常包含一種基礎基質(如交聯的瓊膠糖或合成的共聚體材料)，將疏水性配體(如烷基或芳基基團)連結於其上。較佳的HIC管柱包含有用苯基基團取代的瓊膠糖樹脂(如苯基SEPHAROSET M 管柱)。許多HIC管柱為市面上可購得。實例包括(但不限於)具有低或高取代之苯基SEPHAROSE 6 FAST FLOWT M 管柱(Pharmacia LKB Biotechnology,AB,Sweden)；苯基SEPHAROSET M 高效管柱(Pharmacia LKB Biotechnology,AB,Sweden)；辛基SEPHAROSET M 高效管柱(Pharmacia LKB Biotechnology,AB,Sweden)；FRACTOGELT M EMD丙基或FRACTOGELT M EMD苯基管柱(E.Merck,Germany)；MACRO－PREPT M 甲基或MACRO－PREPT M 三級丁基支柱(Bio－Rad,Calfornia)；WP HI－丙基(C3 )T M 管柱(J.T.Baker,New Jersey)及TOYOPEARLT M 醚、苯基或丁基管柱(TosoHaas,PA)。
利用沖提緩衝液將抗體自管柱沖出，其通常與載入緩衝液相同。利用常規實驗可選擇沖提緩衝液。沖提緩衝液pH值為約2.5－4.5之間及具有低鹽濃度(即小於約0.25 M鹽)。已發現不需要使用鹽梯度來沖提所需抗體；理想產物於流過的組份中回收，其不顯著地結合至管柱。
LPHIC步驟提供一種方式自不要的污染物(如不正確結合的輕及重片段)取出正確摺疊及雙硫鍵結的抗體。特別是，方法提供一種方式實質上去除本文中描繪為正確摺疊的抗體片段，其輕及重鏈無法經由雙硫鍵結結合之雜質。
藉由提供抗體組合物以生理上可接受的載體之形式可製造純化蛋白質之診斷或治療配方，將其實例提供於下。
為了自HIC管柱去除污染物(如未摺疊的抗體及不正確結合的輕及重片段)以便可將其再利用，可將包括尿素的組合物(如6.0 M尿素、1% MES緩衝液pH 6.0,4 mM硫酸銨)流過管柱。其他方法為技藝中已知。
5.6免疫球蛋白配方 可將具有理想治療作用的抗體及免疫球蛋白於生理上可接受的載體中給予至個體。可將抗體以許多方式給予，包括但不限於非經腸胃給予，包括皮下、硬腦膜下、靜脈內、肌肉內、椎管內、腹膜內、大腦內、動脈內、或病灶內給予途徑、小範圍的(如手術實施或手術栓劑)、及肺(如煙霧劑、吸入劑或粉末)及如下進一步說明。
視導入的方式而定，可將免疫球蛋白以許多方式配製。治療上有活性的免疫球蛋白於配方中的濃度(即足以診斷及/或治療發炎性腸道疾病之配方)可由約1毫克/毫升至約1克/毫升不等。較佳的是，當給予需要的個體時，免疫球蛋白組合物於個體中達到免疫球蛋白之血液濃度為約10 ng/毫升以上。
較佳的是，將免疫球蛋白為非經腸胃給予配製於適當惰性載體中，如無菌生理食鹽水溶液。例如，於載體溶液中免疫球蛋白之濃度典型於約1－100毫克/毫升之間。給予的劑量將由給予途徑而決定。較佳給予途徑包括非經腸胃或靜脈內給予。
對於非經腸胃給予，可將本發明抗體以物質於生理上可接受的稀釋劑與可為無菌液體如水或油之醫藥載體中及有或無添加界面活性劑之可注射的溶液或懸浮液劑量給予，其他醫藥製品為石油、動物、植物或合成來源者，例如花生油、大豆油及礦物油。一般而言，二元醇(glycols)如丙二醇或聚乙二醇為較佳液體載體，特別是對於可注射的溶液。可將本發明抗體以持續性注射(depot injection)或植入注射之形式給予，可將其以允許活性成份持久釋放之方式配製。較佳的組合物包含5毫克/毫升單株抗體，配製於由50 mM L－組胺酸、150 mM NaCl組成的水性緩衝液中，用HCl調整至pH 6.0。
根據本發明的一個重要特徵，可將辨識及結合至VLA－4之免疫球蛋白單獨給予，或與通常用來治療發炎性腸道疾病如克隆氏症、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變之另一種藥劑組合。此等藥劑之給予可發生於給予免疫球蛋白之前、同時或之後。較佳的是，其他藥劑不是類固醇。
藉由與對於已知抗體已建立的有效劑量，與對於那他珠單抗在活體內及試管中模型兩者中得到的資料一起，可估計抗體或免疫球蛋白如那他珠單抗之治療有效量。特別較佳的是，資料係來自治療發炎性腸道疾病如克隆氏症、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變之研究(視何者適用而定)。如技藝中已知，劑量之調整可能為必需，因為免疫球蛋白變性或代謝、全身與小範圍的傳遞，以及年齡、體重、健康概況、性別、飲食、給予之時間、藥物交互作用及給予免疫球蛋白的個體之症狀嚴重性。由熟悉本技藝者通過常規實驗可決定此調整及適當劑量。
藉由混合具有理想純度程度之免疫球蛋白與選擇的生理上可接受載體、賦形劑或安定劑，製備儲存用的免疫球蛋白治療配方(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，A.Osol編著，1980及更近的版本)，成為冷凍乾燥餅或水溶液之形式。可接受的免疫球蛋白載體、賦形劑或安定劑為在使用的劑量及濃度下對接受者無毒、無療效及/或無產生免疫性，包括緩衝液如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小於約10個基團)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；胺基酸如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣、及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醣醇或山梨醇；鹽形成對離子(counterion)如鈉；及/或非離子界面活性劑如Tween,Pluronics或聚乙二醇(PEG,polyethylene glycol)。載體分子之明確實例包括但不限於胺基葡聚糖(glycosaminoglycan)(如肝素硫酸鹽)、玻尿酸、角質素硫酸鹽、軟骨素4－硫酸鹽、軟骨素6－硫酸鹽、肝黏醣硫酸鹽(heparan sulfate)及皮膚素硫酸鹽(dermatin sulfate)、基底膜蛋白聚糖(perlecan)及戊聚糖硫酸鹽(pentopolysulfate)。
包含免疫球蛋白之醫藥組合物也可視需要包括醫藥上可接受無毒載體或稀釋劑，其為常用於配製動物或人類用藥之醫藥組合物的媒介。選擇稀釋劑以便不影響組合物之生物活性。實例包括但不限於蒸餾水、生理磷酸緩衝的鹽水、林格氏液(Ringer's solution)、葡萄糖溶液及漢克氏液(Hank's solution)。
藉由溶解、懸浮或乳化於水性或非水性溶劑，如植物或其他類似油、合成脂肪族酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇，可將本發明藥劑配製成為注射用製品。配方也可含有習見添加劑，如溶解劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、安定劑及防腐劑。
也可將免疫球蛋白用於經由吸入或肺傳遞給予之氣霧劑配方中。可將本發明藥劑配製入加壓可接受的推進劑內，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
也可將免疫球蛋白包入由例如凝聚法(coacervation)技術或由界面聚合法製備的微膠囊中(如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊)、於膠體藥物傳遞系統中(如微脂粒、白蛋白微粒、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或於巨乳液中。將此技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences(同前)中。
將用於活體內給藥之免疫球蛋白必需為無菌。在冷凍乾燥及復原前或後藉由通過無菌過濾膜過濾可將此輕易地達成。一般將免疫球蛋白以冷凍乾燥的形式或於溶液中儲存。
一般將有療效的免疫球蛋白組合物放入具有無菌取出口之容器中，例如靜脈內溶液袋或具有由皮下注射針或類似鋒利器具可穿刺的塞子之小瓶。
持久釋放製品之適當實例包括含有蛋白質之固體疏水性聚合物半可滲透的基質，其基質為以成形的物件之形式，如膜或微膠囊。持久釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(hydrogel)(如聚(2－羥乙基－甲基丙烯酸酯)如Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167－277(1981)及Langer,Chem.Tech.12：98－105(1982)所述或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利編號3,773,919)、L－麩胺酸及γ－乙基－L－麩胺酸之共聚物(Sidman等人，Biopolymers 22：547－556,1983)、不可分解的乙烯－醋酸乙烯(Langer等人，同前)、可分解的乳酸－乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTT M (即由乳酸－乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成的可注射微粒)及聚－D－(－)－3－羥丁酸(歐洲專利133,988)。
雖然聚合物如乙烯－醋酸乙烯及乳酸－乙醇酸使能夠釋放分子超過100天，某些水凝膠釋放蛋白質更短的期間。當包入膠囊的抗體保留於體內長時間，其可能因為於37℃暴露至潮濕而變性或聚集，造成生物活性喪失極可能於產生免疫性改變。視牽涉的機制而定可為免疫球蛋白安定性設計合理的策略。例如，若發現聚集機制為經由硫－雙硫互換之分子間S－S鍵結形成，藉由修改巰基(sulfhydryl)基團、自酸性溶液冷凍乾燥、控制水分含量、利用適當添加劑、發展特殊聚合物基質組合物等可達成穩定。
持久釋放的免疫球蛋白組合物也包括微脂粒包住的免疫球蛋白。藉由先前已知的方法製備含有免疫球蛋白的微脂粒。見如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688－92(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030－4(1980)；美國專利編號4,485,045；4,544,545；6,139,869及6,027,726。一般而言，微脂粒為小(約200至約800埃)、單層類型者，其中脂質含量大於約30莫耳%膽固醇；將選擇的比例為最佳免疫球蛋白療法調整。
可將本發明之免疫球蛋白於持久釋放的形式中給予，例如持續性注射、植入製劑或滲透泵，可將其以允許持久釋放活性成份之方式配製。持久釋放配方之植入體為技藝中已知。將植入體用生物可分解的或生物不可分解的聚合物配製為微粒、平板等。例如，乳酸及/或乙醇酸之聚合物形成宿主良好耐受的可侵蝕聚合物。將植入體置於接近蛋白質沉澱處(如伴隨神經退化性疾病形成類澱粉沉積(amyloid deposits)之處)，以便在該處相對於身體其他處局部活性藥劑濃度增加。
此外，診斷及/或治療發炎性腸道疾病之免疫球蛋白可由給予編碼整個或部分抗體(如單鏈Fv)之多核苷酸至個體而提供。將多核苷酸於適當媒介中給予個體以允許免疫球蛋白以治療有效量表現於個體中。
免疫球蛋白之典型每日劑量可為約1微克/公斤至約10毫克/公斤或以上之範圍內，視本文中所提的因素而定。典型而言，醫生將給予免疫球蛋白直到達到理想效果之劑量達到。由習見分析法可輕易地監測此療法的進展。
「穩定的」抗體或抗體片段配方為於其中的蛋白質再儲存時本質上保持其物理安定性及/或化學安定性及/或生物活性。用於測量蛋白質安定性之不同分析技術為技藝中可利用，及回顧於例如Peptide and Protein Drug Delivery,247－301,(Vincent Lee編著，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.l991)及A.Jones,Adv.Drug Delivery Rev.10：29－90(1993)。可將安定性於特定溫度一段特定時期而測量。較佳的是，配方為安定於室溫下(約30℃)或於40℃下至少1個月及/或安定於約2－8℃至少1年或至少約2年。再者，配方較佳於冷凍(至如－70℃)及解凍配方後為安定。
於醫藥配方中，在目測檢查顏色及/或清澈度，或當由UV光散射或由大小排除色層分析法測量，若蛋白質沒有顯現聚集、沉澱及/或變性徵兆，則蛋白質「保持其物理安定性」。
於醫藥配方中，若於特定時間化學安定性為如下定義將蛋白質視為仍保持其生物活性之情況，則蛋白質「保持其化學安定性」。藉由偵測及定量蛋白質之化學改變的形式可評估化學安定性。化學改變可包括大小修改(如修剪)，利用例如大小排除色層分析法、SDS－PAGE及/或基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(MALDI/TOF MS,matrix－assisted laser desorption ionization/time－of－flight mass spectrometry)可將其評估。其他類型化學改變包括電荷改變(如由於去醯胺反應(deamidation)而產生)，其可由離子交換色層分析法評估。
於醫藥配方中，若於特定時間免疫球蛋白的生物活性為醫藥組合物製備之時呈現的生物活性之約10%內(於分析的誤差內)，例如於抗原結合分析法中決定，則免疫球蛋白「保持其生物活性」。
5.7免疫球蛋白組合物之給予途徑 可將於前面討論的醫藥組合物為診斷、預防及/或治療處理發炎性腸道疾病、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變而給予。於治療運用中，可將組合物以有效量給予懷疑或已患有疾病之病患以提供治療。將足以達到此之量定義為治療或醫藥有效劑量。
藉由非經腸胃、局部、靜脈內、口服、或皮下、肌肉內小範圍給予，如藉由煙霧劑或皮膚滲透，可將醫藥組合物給予作為預防及/或治療處理。雖然在口服給予(p.o.)後本發明之蛋白質的物質可能經過腸之過程倖存，藉持續性注射皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)、腹膜內給予；或藉植入製劑為較佳。
可將醫藥組合物以許多單位劑量形式給予，視給予方法而定。例如，適於口服給予之單位劑量形式包括粉末、藥片、藥丸、膠囊及錠劑。
本發明組合物用於治療上述症狀之有效劑量將視許多不同因素而改變，包括給予方式、目標位置、病患的生理狀態及其他給予的藥物。因此，需要將治療劑量定量以最佳化安全性及有效性。可將此等組合物給予至哺乳類作為獸醫用途及以類似於其他治療藥劑之方式(即於生理上可接受的載體中)於人類作為臨床用途。一般而言，給予劑量將為約0.0001至100毫克/公斤之範圍，更通常的是0.01至0.5毫克/公斤宿主體重。
於較佳治療程序中，藉由靜脈內輸注或皮下注射以由1至5毫克抗體/公斤病患體重之劑量給予抗體。在2至8週的期間重複給藥。於此範圍內，較佳的治療程序為以4週間隔重複給予每公斤體重3毫克抗體。
6.0藥物組合 目前使用其他藥物於治療發炎性腸道疾病、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病及不同脊椎關節病變。也考慮使用此等及其他藥物與本文中揭示的化合物及組合物組合。選擇於雞尾酒療法中及/或與本文中揭示的化合物及組合物組合使用的一或多種藥劑將視疾病的處理而定。例如，可將本文中揭示的化合物及組合物與免疫抑制劑一起給予以進一步治療克隆氏症及以抑制症狀。
欲與本文中揭示的化合物及組合物組合使用的藥劑之劑量形式將視個體及利用的藥物組合而改變。
7.0長期給藥劑量流程 本發明之長期治療流程以保持充分受體飽和之量提供α4 整合素藥劑(如小分子或免疫球蛋白)以抑制需要此的病患中之病理性發炎。本發明之方法需要每兩週或每月至每兩個月給予一次，其中重複給藥於至少6個月期間施行，更佳的是於一年或更長。本發明方法包含於人類病患中得到及維持包含α4 整合素之二聚體(如VLA－4)受體飽和量於約65%至100%之範圍內，更佳的是於75%至100%之間，及再更佳的是於80－100%之間。將此等受體飽和量長期維持於此等量(如於大約6個月期間)以允許持續抑制病理性發炎。
於明確實施例中，治療藥劑為抗體，較佳的是人化或人類抗體，及給藥以每月為基礎。可監測受體飽和量以決定給藥療法的功效，及測量生理標記物以確認給藥療法的成功。作為確認，可監測抗體之血清濃度以確認抗體之清除及以決定半生期對治療功效之可能影響。
於另一個明確實施例中，治療藥劑為小分子化合物，及給藥以每月為基礎。可監測飽和量以決定給藥療法的功效，及測量生理標記物以確認給藥療法的成功。
對於用本發明藥劑之治療，劑量範圍為約0.0001至100毫克/公斤，更通常的為0.01至5毫克/公斤宿主體重。例如，劑量可為1毫克/公斤體重或10毫克/公斤體重。劑量及頻率視藥劑於病患中的半生期而定。給藥之劑量及頻率將視處理為預防或治療而定。對於免疫球蛋白給予，各給藥注射一般為2.0至8.0毫克/公斤劑量之間。對於化合物給予，各給藥注射一般為1.0至50.0毫克/公斤劑量之間。根據本文中提供的教導，藉由自病患得到體液樣品可監測有效劑量。為此，一般將血清或腦脊髓液樣品取出及利用技藝中已熟知的方法決定整合素受體飽和度。理想上，在起初給藥前取出樣品；在各治療之前及/或之後取出及測量隨後的樣品。
作為由重複個別給藥組成的長期給藥之另一種選擇，可將用以治療發炎性腸道疾病、氣喘、多發性硬化症(MS,multiple sclerosis)、風濕性關節炎(RA,rheumatoid arthritis)、植體抗宿主疾病(GVHD,graft versus host disease)、宿主抗植體疾病、及不同脊椎關節病變之藥劑以持久釋放的配方給予，其限制條件為給藥使得受體飽和量維持足以抑制發炎。例如，可使用控制釋放系統來長期給予本發明範圍內之藥劑。適當控制釋放藥劑形式之討論可見於Lesczek Krowczynski,EXTENDED－RELEASE DOSAGE FORMS,1987(CRC Press,Inc.)。
不同的控制釋放技術涵蓋非常廣泛藥物劑量形式之系列。控制釋放技術包括(但不限於)物理系統及化學系統。物理系統包括(但不限於)具有速率控制膜的儲液囊系統，如微膠囊、巨膠囊及膜系統；無速率控制膜的儲液囊系統，如中空纖維、超微孔纖維素三醋酸酯及多孔聚合物質及泡沫；單石(monolithic)系統，包括物理上溶解於無孔、聚合、或彈性體基質(如不可侵蝕的、可侵蝕的、環境藥劑進入及可分解的)之彼等系統，及物理上分散於無孔、聚合、或彈性體基質(如不可侵蝕的、可侵蝕的、環境藥劑進入及可分解的)之材料；層狀的結構，包括化學上類似或不類似外面控制層之儲液囊層；及其他物理方法，如滲透泵或吸附於離子交換樹脂上。
化學系統包括(但不限於)聚合物基質之侵蝕(如異種或同種侵蝕)，或聚合物基質之生物侵蝕(如同種或異種)。控制釋放之系統類型之其他討論可見於Agis F.Kydonieus,CONTROLLED RELEASE TECHNOLOGIES：METHODS,THEORY AND APPLICATIONS,1980(CRC Press,Inc.)。
可使用本發明的方法來治療罹患關於或起因自病理性發炎的疾病之病患或預防地治療特定疾病高風險的病患。預防與治療處理所需的給藥流程可改變，及將需要為特定用途及治療的疾病而設計。
於一些方法中，將二或多個藥劑(如具有不同結合專一性之單株抗體、一種單株抗體及如本文中揭示的化合物)同時給予，於此情況中，給予的各藥劑之劑量於指示的範圍內。組合療法也可發生於將藥劑以理想時間間隔之給予期間連續地給予病患。間隔也可為不規則，如由測量受體飽和量或由遵循疾病過程之其他指標所指示。
熟悉本技藝者將輕易知道劑量可隨特定藥劑之功能、症狀之嚴重性及患者對副作用的敏感性而改變。一些特定藥劑比其他的更有功效。對於特定藥劑之較佳劑量由熟悉本技藝者藉許多方式可輕易地決定。較佳的方式為測量特定藥劑之生理效力。
於預防應用中，長期將醫藥組合物以足以消除或降低危險或延緩疾病開始之量給予易患或有危險患有特定疾病之病患。將此量定義為預防有效劑量。在具有減輕的多發性硬化症之病患中，藉NMR成像或於一些情況中藉由病患觀察到的病症發生前徵兆可評估風險。
用於治療上述疾病之本發明組合物之有效劑量流程將視許多不同因素而改變，包括給予方式、目標位置、病患的生理狀態及其他給予的藥物。因此，需要滴定治療劑量以最佳化安全性及功效。一般而言，給藥流程之各給予將為約0.0001至約100毫克/公斤之範圍，通常約0.01至約50，及更通常為約0.1至約30毫克/公斤宿主體重。
8.0測試試劑 可將試劑於試管內及活體內測試。存在許多試管內模型以測試是否試劑結合至α4 次單元，如技藝中已知。利用試驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE,experimental autoimmune encephalomyelitis))之動物模型可進行測試藥劑於活體內是否具有活性於診斷及/或治療發炎性腸道疾病以及其他發炎症狀。EAE為一種中樞神經系統之發炎症狀，與多發性硬化症類似(Paterson於TEXTBOOK OF IMMUNOPATHOLOGY,Miescher及Mueller－Eberhard編著179－213頁，Grune及Stratton,N.Y.1976)。
利用例如說明於Stamper及Woodruff,J.Exp.Med.144：828－833(1976)中所述之試管內結合試驗可測試EAE腦切片支持白血球附著之能力。可檢查對抗白血球黏著受體之試劑於試管內切片試驗中之抑制活性。U937細胞(一種人類單核細胞株)之附著幾乎完全受抗人類VLA－4整合素抗體阻礙。相較於抗其他黏著分子之抗體，此抗體產生顯著較大阻礙效果。
意外地，選擇性抑制α4 整合素之纖維結合蛋白結合活性之抗體(P4G9及HP1/7)增加U937附著至EAE血管。此等結果顯示α4 整合素之纖維結合蛋白結合活性於試管內不直接涉及U937黏著至EAE血管。已知利用上述α4 β1 試劑之試管內結果，藉由測量延遲癱瘓開始或降低癱瘓嚴重性，也可將此等抗體對EAE發展之作用於活體內測試。
對於診斷及/或治療發炎性腸道疾病有效的其他試劑可由利用黏著試驗確認。例如利用HP2/1或N－[N－(3－吡啶磺醯基)－L－3,3－二甲基－4－硫脯醯胺]－O－[1－甲基哌嗪－4－基羰基]－L－酪胺酸異丙基酯作為控制組，可篩選其他抗體或試劑抑制淋巴細胞結合至α4 β1 整合素已知配體之能力。可確認數種其他試劑藉由對準VLA－4白血球細胞表面受體之α4 次單元而抑制黏著。
有用於本發明方法及組合物中的單株抗體包括例如美國專利編號6,033,665中說明的HP2/1、TY21.6、TY21.12及L25，將其全文為所有目的以參考資料併於本文中。此等抗體與VLA－4之α鏈反應及阻擋結合至VCAM－1、纖維結合蛋白及發炎的腦內皮細胞，但不影響β1 整合素家族其他成員之活性。
也可使用其他選擇性反應對抗VLA－4/VCAM－1目標之試劑。此試劑進一步不會影響間質交互作用(由β1 整合素之所有成員媒介)也不會影響正常腸免疫性(由α4 β7 媒介)。此及其他此類試劑之製造係於本技藝之技術範圍內。
用以決定是否藥劑展現α4 β1 及/或α4 β7 活性之試驗對熟悉本技藝者為已知。
例如，於試驗中，可將化合物結合至固體載體及將α4 β7 整合素樣品加至其中。藉由習見方法如利用三明治ELISA試驗可決定樣品中α4 β1 或α4 β7 整合素之量。此外，本發明之某些化合物於活體內抑制由α4 β1 或α4 β7 整合素媒介之白血球黏著至黏膜器官之內皮細胞及上皮細胞，及因而可用於治療由α4 β1 或α4 β7 整合素媒介之疾病。
可將上面確認的化合物之生物活性於許多系統中試驗。例如，可將化合物固定於固體表面上及可測量表現α4 β1 或α4 β7 整合素之細胞黏著。利用此形式，可篩選大量化合物。適於此試驗的細胞包括已知表現α4 β1 或α4 β7 整合素之任何白血球如記憶T細胞及嗜酸性白血球。也可使用許多白血球細胞株，實例包括細胞株RPMI－8866。
也可測試化合物競爭性抑制α4 β1 或α4 β7 整合素及MAdCAM－1之間，或α4 β1 或α4 β7 整合素及已知結合α4 β1 或α4 β7 整合素之標記化合物如本發明化合物或對α4 β7 整合素之抗體之間結合的能力。於此等試驗中，可將MAdCAM－1固定於固體表面上。也可將MAdCAM－1表現為具有Ig尾巴(如IgG Fc)的重組融合蛋白質，以便可將對α4 β7 整合素之結合於免疫分析中偵測。或者，可使用MAdCAM－1表現細胞，如活化的內皮細胞或MAdCAM－1轉染的纖維母細胞(fibroblast)。
α4 β7 及α4 β1 兩者皆可媒介對VCAM－1及對纖維結合蛋白之黏著。對於測量阻擋對VCAM－1及對纖維結合蛋白黏著之能力的試驗，說明於世界專利申請公告編號WO US98/15324中之試驗為特別較佳。將此申請案全文以參考資料併於本文中。
許多試驗形式利用標記的試驗成份。標記系統可為許多形式。根據記憶中已熟知的方法可將標記直接或間接結合至試驗的理想成份。可使用廣泛不同的標記。藉由數種方法其中任一種可將成份標記。最常見的偵測方法為利用具有3 H、1 2 5 I、3 5 S、1 4 C、或3 2 P標記的化合物等之放射自顯影術(autoradiography)。非放射線標記包括結合至標記的抗體之配體、螢光物質、化學冷光劑、可作為對標記的配體之專一的結合配對成員的酵素及抗體。標記之選擇視所需的敏感度、與化合物結合之簡易、穩定度需求及可獲得的儀器而定。
用以證明治療發炎反應功效之適當活體內模型包括小鼠、大鼠、天竺鼠或靈長類中之試驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE,experimental autoimmune encephalomyelitis)，以及其他α4 整合素相關之發炎模型。
視需要可將具有理想生物活性之化合物改質以提供理想性質如改良的藥理學性質(如活體內安定性、生物可利用性)，或能夠於診斷應用中被偵測到。例如，於本發明的磺醯胺中包含一或多個D－胺基酸通常增加活體內安定性。可將安定性以許多方式試驗如藉由測量蛋白質於與胜肽酶或人類血漿或血清培養期間的半生期。已說明許多如此之蛋白質安定性試驗(見如Verhoef等人，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.,1990,15(2)：83－93)。
實例
提出下列實例以便提供普通熟悉本技藝者完整揭示及說明如何製造及使用本發明，及並非用來限制發明人視為其發明之範圍，也非用來代表以下實驗為所有或唯一進行的實驗。關於使用的數字(如量、溫度等)已努力確保正確性，但應有一些實驗誤差及偏差。
實例1
可溶MadCAM－1 FACS分析 此分析測量重組可溶MadCAM－1與懸浮的RPMI－8866細胞之交互作用。將重組可溶MadCAM－1(ArsMadCAM－1")表現為具有人類IgG Fc尾巴的融合蛋白質(Tidswell等人，J.Immunol.(1997)159(3)：1497－1505)。在小分子抑制劑的存在或不存在下將可溶MadCAM－1與RPMI－8866細胞混合。將1 mM MnCl2 包含於分析緩衝液中以增加α4 β7 整合素之活性及促進其與MadCAM－1構體之交互作用。於室溫30分鐘後，將細胞用含1 mM MnCl2 的緩衝液清洗及在4℃及1 mM MnCl2 存在中暴露至抗MadCAM－1融合蛋白質Fc尾巴的螢光標記抗體30分鐘。將細胞清洗，重新懸浮於含MnCl2 緩衝液及由FACS分析檢查。可進行相同的分析以測量重組可溶VCAM－1與表現α4 β1 之細胞如T淋巴癌細胞(Jurkat)T細胞株之交互作用。
實例2
無細胞ELISA分析 此分析測量溶解的α4 β7 整合素與固定於塑膠上的MadCAM－1之交互作用。將RPMI－8866細胞用清潔劑分解以溶解α4 β7 整合素。將抗β7 整合素之抗體2G3(Tidswell等人，J.Immunol.(1997)159(3)：1497－1505)加至分解液。此抗體擔任兩個目的，第一個，其為一個標籤，藉此可將α4 β7 整合素於此分析中偵測，及第二個，2G3為一種抗體，其穩定β7 整合素之配體佔據的結構及促進β7 整合素相關的交互作用。將細胞分解液、2G3及測試藥劑加至已用MadCAM－1塗佈的微量滴定盤。使混合物於室溫培養30分鐘。將盤清洗，用1% BSA填塞，及暴露至HRP連結的羊－抗小鼠Ig，及辨識與已結合分析孔上MadCAM－1的α4 β7 整合素相連的2G3。於室溫30分鐘後，將孔清洗及暴露至HRP受質已定量已結合MadCAM－1的α4 β7 整合素之量。
實例3
FACS分析受體佔據 此分析測量抗體2G3與RPMI－8866細胞或與淋巴細胞之交互作用。抗體辨識大鼠或人類β7 整合素之配體佔據的抗原決定位。增加小分子配體濃度引發2G3抗原決定位於β7 整合素上及將允許更高量抗體結合至細胞表面。受體佔據所需的配體濃度直接關係於配體對α4 β7 整合素之親和力。曾說明類似的分析法以檢視配體與α4 β1 整合素之交互作用，其利用對抗β1 整合素之配體佔據的抗原決定位之抗體(抗體15/7；Yednock等人(1995)J.Biol.Chem.270：28740－50)。β1 整合素分析依靠表現α4 β1 整合素而非α4 β7 整合素之細胞(如T淋巴癌細胞)。於兩個分析中，在小分子配體存在中，將適當的細胞與2G3或15/7混合。將細胞於室溫培養30分鐘及清洗以去除為結合的抗體。將細胞暴露至抗小鼠IgG之螢光標記的抗體，其偵測細胞結合的2G3或15/7及將細胞由FACS分析檢視。
實例4
活體外細胞黏著分析 可使用此分析測量於培氏斑(Peyer's patch)(與腸連結的淋巴組織)之組織切片中淋巴細胞或RPMI－8866細胞黏著至露出的高度特化內層小靜脈(high endothelial venules)。此等血管表現高量MadCAM－1。此分析係說明於Yednock等人JBC(1987)104：725－731中。
實例5
活體內遷移分析 1 1 1 In－標記或螢光標記的淋巴細胞於活體內遷移至培氏斑。於此分析中，將淋巴細胞自一群動物分離及用放射性或螢光追蹤劑標記。將細胞靜脈內注射入第二群動物。1至24小時後，藉由決定伽瑪計數器(gamma counter)中伴隨不同組織的放射線數量，或藉由自組織分離淋巴細胞及決定攜帶螢光標籤的細胞數量(由FACS分析決定)可監測標記的細胞局部化至不同組織。此類分析係說明於Rosen等人，1989 J.Immunol.142：1895－1902中。
實例6
試管內分析決定候選試劑對VLA－4之結合 使用試管內分析來評估候選試劑對α4 β1 整合素的結合。可使用於此分析中結合的試劑藉習見方法(如競爭結合分析)來評估生物樣品中VCAM－1量。此分析對IC5 0 值小至約1 nM為敏感。
藉由可溶VCAM－1與T淋巴癌細胞(如美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)編號TIB 152、TIB 153及CRL 8163)(一種人類T細胞株，其表現高量α4 β1 整合素)之交互作用測量α4 β1 整合素之活性。VCAM－1與細胞表面以α4 β1 整合素相關的方式交互作用(Yednock等人，J.Bio.Chem.,1995,270：28740)。
將重組可溶VCAM－1表現為含有VCAM－1七個細胞外區塊於N端上及人類IgG1 重鏈固定區域於C端上之嵌合融合蛋白質。藉由Yednock同前所述之方式製造及純化VCAM－1融合蛋白質。
如由Yednock同前所述將T淋巴癌細胞生長於補充10%胎牛血清、盤尼西林、鏈黴素及麩醯胺酸的RPMI 1640中。
將T淋巴癌細胞用1.5 mM MnCl2 及5微克/毫升15/7抗體於冰上培養30分鐘。Mn＋ 2 活化受體以增加配體結合，及15/7為一種單株抗體，其辨認活化的/配體佔據的α4 β1 整合素構造及將分子鎖成此構造，因而穩定VCAM－1/α4 β1 整合素交互作用。Yednock等人，同前。由其他研究者曾製備類似於15/7抗體之抗體(Luque等人，1996,J.Bio.Chem,271：11067)及可用於此分析中。
而後將細胞於室溫與由66微克/毫升至0.01微克/毫升之不同濃度候選試劑(利用標準5點連續稀釋)培養30分鐘。而後將15微升可溶重組VCAM－1融合蛋白質加至T淋巴癌細胞及於冰上培養30分鐘(Yednock等人，同前)。
而後將細胞清洗兩次及重新懸浮於以1：200之PE－連結的羊F(ab')2 抗小鼠IgG Fc(Immunotech,Westbrook,ME)中及於冰上黑暗中培養30分鐘。將細胞清洗兩次及用標準螢光活化的細胞篩選儀(FACS,fluorescence activated cell sorter)分析法分析，如說明於Yednock等人，同前。
具有IC5 0 小於約15μM之試劑對α4 β1 具有結合親和力。
實例7
試管內飽和分析決定候選試劑對α4β1之結合 下列說明一種試管內分析來決定於試驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE,Experimental Autoimmune Encephalomyelitis)模型中(說明於下個實例中)，或於其他活體內模型中，一試劑為有效所需的血漿濃度。
將對數生長的T淋巴癌細胞清洗及重新懸浮於含20微克/毫升15/7抗體(說明於前面實例中)之正常動物血漿中。
將T淋巴癌細胞稀釋兩倍於含由66微克/毫升至0.01微克/毫升之不同濃度已知候選試劑量之正常血漿樣品中(利用標準12點連續稀釋做標準曲線)，或於由候選試劑處理的動物之周圍血液得到的血漿樣品中。
而後將細胞於室溫培養30分鐘，用含2%胎牛血清及各1 mM之氯化鈣及氯化鎂之磷酸緩衝鹽水(PBS,phosphate－buffered saline)(分析液)清洗兩次以去除未結合的15/7抗體。
而後將細胞暴露至1：200之藻紅素(phycoerythrin)連結的羊F(ab')2 抗－小鼠IgG Fc(Immunotech,Westbrook,ME)(其已用5%來自被研究的動物之血清共同培養而吸附任何非專一交叉反應性)及於4℃黑暗中培養30分鐘。
將細胞用分析液清洗兩次並於其中重新懸浮。而後用標準螢光活化的細胞篩選儀分析法分析，如說明於Yednock等人，1995,J.Bio.Chem.,270：28740。
而後將數據作圖為螢光對劑量，如於正常劑量－反應方式。造成曲線的上高原的劑量代表於活體內模型中得到功效所需之量。
也可使用此分析來決定飽和其他整合素結合位置所需的血漿量，如α9 β1 整合素，其為最接近α4 β1 之整合素(Palmer等人，1993,J.Cell Bio.,123：1289)。
於是，可將上述分析用轉染編碼α9 整合素cDNA之人類結腸癌細胞株SW 480(ATTC #CCL228)代替T淋巴癌細胞進行(Yokosaki等人，1994,J.Bio.Chem.,269：26691)，以測量α9 β1 整合素之結合。作為控制組，可使用表現其他α及β1 次單元之SW 480細胞。
利用此分析，已為於本分析中測試的試劑建立於活體內模型中對α4 β1 及α9 β1 得到功效所需之血漿量。
實例8
人化21.6抗體之建立 藉由連結PCR選殖的小鼠21.6 VL 及VH 區域之cDNA至人類固定區域建立嵌合輕及重鏈。利用特別設計的PCR引子改良小鼠cDNA序列之5'－及3'－端。設計5'－端PCR引子(表1)(其雜交至編碼引導序列開頭之DNA序列)以產生有效轉譯必需之DNA序列(Kozak,1987,Mol.Biol.196：947－950)，及以產生選殖入表現載體之HindIII限制位置。設計3'－端PCR引子(其雜交至編碼J區域端之DNA序列)以產生剪接至固定區域必需之DNA序列，及以產生選殖入表現載體之BamHI位置。將PCR放大產物用HindIII及BamHI消化，選殖入pUC19載體，及定序以確認於PCR放大期間沒有發生錯誤。而後將採用的小鼠21.6可變區域次選殖入含有人類κ或γ－1固定區域之哺乳類細胞表現載體內。
小鼠可變區域結構之模擬。建立小鼠21.6抗體VL 及VH 區域之分子模型。將模型建立於在UNIX操作系統下運作的視算科技(Silicon Graphics)IRIS 4D工作站及利用分子模擬套裝軟體QUANTA(Polygen Corp.,USA)。小鼠21.6 VL 區域之FRs結構係基於人類本周氏(Bence－Jones)免疫球蛋白RE1之已解出的結構(Epp等人，1975 Biochemistry 14：4943－4952)。小鼠21.6 VH 區域之FRs結構係基於小鼠抗體Gloop2之已解出的結構。保留FRs中相同的基團；利用QUANTA內的工具取代不相同的基團。確認小鼠21.6 VL 區域之CDR1及CDR2分別屬於標準結構群2及1(Chothia等人，1987,J.Mol.Biol.196：901－917)。因為RE1的CDR1及CDR2屬於相同標準群，將小鼠21.6 VL 區域之CDR1及CDR2於RE1的CDR1及CDR2的結構上模擬。小鼠21.6 VL 區域之CDR3不呈現相當於任何VL 區域之CDR3標準結構群。然而，資料庫搜尋顯示於小鼠21.6 VL 區域中之CDR3類似於小鼠HyHEL－5 VL 區域中之CDR3(Sheriff等人，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：8075－8079)。因此，將小鼠21.6 VL 區域之CDR3於小鼠HyHEL－5 VL 區域中之CDR3的結構上模擬。確認小鼠21.6VH 區域之CDR1及CDR2分別屬於標準結構群1及2。將小鼠21.6 VH 區域之CDR1於Gloop2 VH 區域之CDR1上模擬，其接近地類似VH 區域之CDR1的標準群1成員。將小鼠21.6 VH 區域之CDR2於小鼠HyHEL－5之CDR2上模擬(Sheriff等人，同前)，其也為VH 區域之CDR2的標準群2成員。對於VH 區域之CDR3，沒有標準結構。然而，於小鼠21.6 VH 區域中之CDR3類似於小鼠R19.9 VH 區域中之CDR3(Lascombe等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：607－611)及藉由去除存在於小鼠R19.9 VH 區域CDR3環頂端之額外的絲胺酸基團及煉合及修飾空缺而於此CDR3上模擬。最後利用CHARMM位能將模型經過最陡的下降及共軛梯度能量最小化(Brooks等人，1983,J.Comp.Chem.4：187－217)，如於QUANTA中執行以便減少不良的原子接觸及以最佳化凡德瓦爾(van der Waals)及靜電交互作用。
改造人類21.6可變區域之設計－骨架序列之同源人類抗體的選擇。藉由比較胺基酸序列確認其FRs與小鼠21.6之FRs顯示高一致性百分比之人類可變區域。表3及4比較小鼠21.6可變區域與所有已知小鼠可變區域及而後與所有已知人類可變區域。確認小鼠21.6 VL 區域屬於小鼠κVL 區域子群5，如由卡巴定義。將個別小鼠κVL 區域確認具有高達93.4%一致性於小鼠21.6κVL 區域(38C13V'CL及PC613'CL)。小鼠21.6 VL 區域幾乎類似於人類κVL 區域子群1，如由卡巴定義。將個別人類κVL 區域確認具有高達72.4%一致性於小鼠21.6κVL 區域。使用來自一個最類似人類可變區域之骨架區域(FRs,framework regions)RE1於改造人類21.6 VL 區域之設計中。將小鼠21.6 VH 區域確認為屬於小鼠VH 區域子群2c，如由卡巴定義。將個別小鼠重鏈可變區域確認具有高達93.3%一致性於小鼠21.6 VH 區域(17.2.25'CL及87.92.6'CL)。小鼠21.6 VH 區域幾乎類似於人類VH 區域子群1，如由卡巴等人同前定義。將個別人類VH 區域確認具有高達64.7%一致性於小鼠21.6 VH 區域。使用來自一個最類似人類可變區域之FRs(21/28'CL)於改造人類21.6 VH 區域之設計中。
取代於骨架區域中的胺基酸(A)輕鏈。在改造人類21.6 VL 區域之設計中的下一步為連接來自小鼠21.6 VL區域之CDR至來自人類RE1的FRs(Palm等人，1975,Physiol.Chem.356：167－191)。於改造的人類21.6 VL 區域之第一個形式(La)中，於人類FRs中做七個改變。於FR4中的位置104、105及107處，將來自RE1的胺基酸用來自另一個人類κ輕鏈之更典型人類J區域胺基酸取代(Riechmann等人，1988,Nature 332：323－327)。
於FR2中的位置45處，將通常存在於RE1的離胺酸改變成精胺酸，如見於小鼠21.6 VL 區域中之此位置。吾人認為於此位置的胺基酸基團於支持小鼠21.6 VL 區域之CDR2環為重要。
於FR2中的位置49處，將通常存在於RE1的酪胺酸改變成組胺酸，如見於小鼠21.6 VL 區域中之此位置。於模型中觀察到於小鼠21.6 VL 區域中在此位置的組胺酸位於結合位置的中間及可能於抗體－抗原結合期間與抗原直接接觸。
於FR3中的位置58處，將通常存在於RE1的纈胺酸改變成異白胺酸，如見於小鼠21.6 VL 區域中之此位置。吾人認為於此位置的胺基酸基團於支持小鼠21.6 VL 區域之CDR2環為重要。
於FR3中的位置69處，將通常存在於RE1的羥丁胺酸(threonine)改變成精胺酸，如見於小鼠21.6 VL 區域中之此位置。於模型中觀察到於小鼠21.6 VL 區域中在此位置的精胺酸位於相鄰小鼠21.6 VL 區域的CDR1環及可能於抗體－抗原結合期間與抗原直接接觸。
設計改造的人類21.6 VL 區域之第二個形式(稱為Lb)含有如上述相同的取代除了沒有改變RE1的FR2中之位置49處。
(B)重鏈。在改造人類21.6 VH 區域之設計過程的下一步為連接來自小鼠21.6 VH 區域之CDR至來自21/28'CL的FRs(Dersimonian等人，1987,J.Immunol.139：2496－2501)。於改造的人類21.6 VH 區域之第一個形式(Ha)中，於人類骨架區中做五個改變。於人類FRs中五個改變為於位置27、28、29、30及71處。
於FR1中的位置27、28、29及30處，將存在於人類21/28'CL的胺基酸改變成見於小鼠21.6 VH 區域中彼等位置之胺基酸。雖然將此等位置記為於FR1內(Kabat等人，同前)，位置26至30為形成VH 區域之CDR1環的結構環部份。所以，於此等位置的胺基酸可能直接涉及抗原結合。確實，位置27至30為VH 區域CDR1之標準結構的部份，如由Chothia等人，同前定義。
於FR3中的位置71處，將存在於人類21/28'CL的精胺酸改變成丙胺酸，如見於小鼠21.6 VH 區域中之此位置。位置71為VH 區域CDR2之標準結構的部份，如由Chothia等人，同前定義。由小鼠21.6可變區域之模型，顯示於位置71處的丙胺酸於支持VH 區域之CDR2環為重要。於此位置用精胺酸取代丙胺酸非常可能破壞CDR2環之安置。
改造的人類21.6 VH 區域之第二個形式(Hb)含有形式Ha之五個上述改變加上於FR2中一個另外的改變。
於FR2中的位置44處，將存在於人類21/28'CL的精胺酸改變成甘胺酸，如見於小鼠21.6 VH 區域中之此位置。基於VL －VH 區域堆疊之出版的資訊及小鼠21.6可變區域的模型，吾人認為於位置44的胺基酸基團可能對於於VL －VH 區域堆疊為重要。
設計改造的人類21.6 V區域形式Hc以使CDR3環看起來更像人類VCAM－1。小鼠21.6抗體及人類VCAM－1兩者皆結合至α4 β1 整合素。抗體VH 區域之CDR3環為六個CDR環最多變化者及一般為抗體－抗原交互作用中抗體最重要的單一成份(Chothia等人，同前；Hoogenboom & Winter,1992,J.Mol.Biol.227：381－388；Barbas等人，1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4457－4461)。於小鼠21.6 VH 區域之CDR3及人類VCAM－1的胺基酸86－94之間確認某序列類似性，特別是於CDR3環中YGN(酪胺酸－甘胺酸－天門冬醯胺)序列及於VCAM－1中FGN(即苯丙胺酸－甘胺酸－天門冬醯胺)之間。吾人認為此等序列有關於在許多細胞黏著事件中重要的RGD(即精胺酸－甘胺酸－天門冬胺酸)序列(Main等人，1992,Cell 71：671－678)。所以，於CDR3中的位置98處，將存在於小鼠21.6 VH 區域的酪胺酸改變成苯丙胺酸，如見於人類VCAM－1序列中。
也考慮於FR2中位置36處之可能取代。小鼠21.6 VH 鏈含有特殊的半胱胺酸(cysteine)基團於FR2中位置36處。於FR2中的此位置於相關小鼠及人類序列中通常為色胺酸。雖然半胱胺酸基團常對抗體的構造為重要，小鼠21.6可變區域之模型未顯示此半胱胺酸基團直接或間接涉及抗原結合，所以在所有三種人化21.6抗體之形式皆保持存在於人類21/28'CL VH 區域的FR2中之色胺酸未經取代。
改造的人類21.6抗體之建立。本質上如由Daugherty等人，1991,Nucleic Acids Res.19：2471－2476所述由重疊PCR片段建立改造的人類21.6 VL 區域之第一個形式(resh21.6VLa)。使用小鼠21.6 VL 區域(如前所述改造及插入pUC19)作為模板。合成四對引子：APCR1－vla1、vla2－vla3、vla4－vla5及vla6－vla7。相鄰對重疊至少21個鹼基。APCR1引子互補於pUC19載體。將適當的引子對(0.2微莫耳)與10ng模板DNA、及1單位AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)於含有10 mM Tris－HCl(pH 8.3)、50 mM KCl、200μM dNTPs、及1.5 mM MgCl2 之50微升PCR緩衝液合併。將各反應進行25個循環。在起初融解於94℃ 5分鐘後，將反應循環於94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，及72℃ 2分鐘，及最後於72℃再培養10分鐘。引子煉合及伸展步驟之間的恆溫時間(ramp time)為2.5分鐘。將來自第一回合PCR反應之四個反應(A、B、C及D)產物酚萃取及乙醇沉澱。
將PCR產物A及B、C及D於第二回合PCR反應中連結。將PCR產物A及B、及C及D(各50 ng)加至50微升PCR反應(如前所述)及除了將煉合溫度升到60℃外，如上述經過20個循環放大。將此等反應之產物稱為E及F。使用的PCR引子對分別為APCR1－vla3及vla4－vla7。將PCR產物E及F酚萃取及乙醇沉澱及而後利用APCR1及vla7作為末端引子類似於上述於兩步PCR反應中由其本身互補性組合於第三回合PCR反應中。將代表整個改造的人類21.6 VL 區域包括領導序列之完全組合的片段用HindIII及BamHI消化及選殖入pUC19做定序。將具有正確序列之複製體記為resh21.6VLa。
藉由Kamman等人，1989,Nucl.Acids Res.17：5404之方法利用PCR引子於改造的人類21.6 VL 區域之第一個形式中做較小的修改，建立改造的人類21.6 VL 區域之第二個形式(Lb)。合成兩組引子。本質上將各PCR反應於如上述相同條件下進行。於第一個PCR反應中，使用突變的引子21.6VLb2來破壞StyI位置(Thr－ACC－97至Thr－ACA－97)。而後，於第二個PCR反應中，使用突變的引子21.6VLb1(His－49至Tyr－49)與pUC－resh21.6VLa2作為模板DNA。將PCR產物用StyI及BamHI切割及次選殖入pUC－resh21.6VLa2(用相同限制酵素切斷)。將具有正確序列之複製體記為pUC－resh21.6VLb。
利用如建立改造的人類21.6 VL 區域之形式「a」所述之相同PCR方法建立改造的人類21.6 VH 區域之形式「a」。將編碼改造的人類425 VH 區域(Kettleborough等人，同前)之形式「g」及改造的人類AUK12－20 VH 區域之形式「b」的HindIII－BamHI DNA片段次選殖入pUC19載體分別產生pUC－resh425g及pUC－reShAUK12－20b。AUK12－20之形式「b」係由Kettleborough等人，同前所述片段VH a425之PCR突變衍生，及編碼胺基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT SYYIH WVRQAPGQGLEWVG YIDPFNGGTSYNQKFKG KVTMTVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGN－RFAY WGQGTLVTVSS(間隔分開FR及CDR區域)。
使用質體pUC－resh425g及pUC－reshAUK12－20b，以及含有用於建立嵌合21.6重鏈而改質之小鼠21.6 VH 區域之pUC載體(pUC－chim21.6VH )作為隨後PCR反應中的模板DNA。為建立改造的人類21.6 VH 區域之形式「a」設計及合成PCR引子。利用pUC－reshAUK12－20b作為DNA模板及APCR1－vhal作為PCR引子對得到PCR產物A。利用pUC－chim21.6 VH 作為DNA模板及vha2－vha3及vha6－APCR4分別作為PCR引子對得到PCR產物B及D。最後，利用pUC－resh425g作為DNA模板及vla4－vla5作為PCR引子對得到PCR產物C。將最後PCR產物次選殖入pUC19作為DNA定序用之HindIII－BamHI片段。將具有正確DNA序列之複製體記為pUC－resh21.6VHa。
本質上如上述建立改造的人類21.6 VL 區域之形式「b」建立改造的人類21.6 VH 區域之剩餘形式。合成兩組引子。為了第二個(Hb)及第三個(Hc)形式，分別使用突變引子21.6VHb(Arg－44至Gly－44)及21.6VHc(Try－98至Phe－98)於PCR反應中並以pUC－resh21.6VHa作為模板DNA。用限制酵素將PCR產物VHb及VHc切割及次選殖入pUC載體pUC－resh21.6VHa分別成為MscI－BamHI及PstI－BamHI片段，以產生pUC－resh21.6VHb及pUC－resh21.6VHc。
以類似於用於建立改造的人類21.6 VL 區域第一個形式(La)之方式建立改造的人類21.6 VH 區域之第一個形式(Ha)。然而，於此例中，使用PCR引子與三個不同模板DNA：如已改造表現嵌合21.6重鏈之小鼠21.6 VH 區域，人化425 VH 區域形式"g"(Kettleborough等人，同前)，及人化AUK－12－20形式"b"VH 區域。利用PCR引子於人化21.6 VH 區域之第一個形式(Ha)中做較小的修改，建立人化21.6 VH 區域之第二個及第三個形式(Hb及Hc)。
說明：(卡巴)編號根據Kabat等人，同前；(#)連續編號如分子模擬中使用；(小鼠21.6)來自小鼠21.6抗體VL 區域之胺基酸序列；(小鼠κ5)來自子集5之小鼠κVL 區域之共通序列(Kabat等人，同前)；(人類κ1)來自子集1之人類VL 區域之共通序列(Kabat等人，同前)；(人類RE1)人類VL 區域之胺基酸序列(Palm等人，Physiol.Chem.356：167－191(1975))；(RH VL 21.6)改造的人類21.6 VL 區域之L1形式之胺基酸序列；(＊ )為CDR環標準結構之部份的基團(Chothia等人，同前)；(劃底線)於人類FRs中的基團，其中胺基酸基團被改變。
說明：(卡巴)編號根據Kabat等人，同前；(#)連續編號如分子模擬中使用；(小鼠21.6)來自小鼠21.6抗體VH 區域之胺基酸序列；(小鼠2c)來自子集2c之小鼠VH 區域之共通序列(Kabat等人，同前)；(人類1)來自子集1之人類VH 區域之共通序列(Kabat等人，同前)；(人類21/28'CL)人類VH 區域之胺基酸序列(Dersimonian等人，J.Immunol.,139：2496－2501(1987))；(RH VH 21.6)改造的人類21.6 VH 區域之H1形式之胺基酸序列；(＊ )為CD環標準結構之部份的基團(Chothia等人，同前)；(劃底線)於人類FRs中的基團，其中胺基酸基團被改變。
實例9
那他珠單抗 那他珠單抗為針對α4 整合素分子之重組人化抗體(rhAb)及抑制由α4 β1 (VLA－4)及α4 β7 整合素媒介的細胞結合。那他珠單抗結合至α4 次成份，其係表現於白血球(主要為淋巴細胞)上。鼠科單株抗體結合至α4 整合素阻止於此等白血球上的α4 β1 與其於內皮細胞上相對的受體VCAM－1交互作用。吾人相信此等細胞黏著分子交互作用之阻擋避免此等白血球通過血管內皮及隨後進入實質組織。
α4 整合素結合組織中的其他配體，包括造骨蛋白(osteopontin)及纖維結合蛋白的抗原決定位。那他珠單抗的其他機制包括藉由用此等配體抑制α4 －陽性白血球而壓抑於疾病的組織中進行的發炎反應。因此，那他珠單抗作用為壓抑出現於疾病位置處存在的發炎活性，與經由與VCAM－1及MadCAM－1交互作用抑制進一步補充免疫細胞進入發炎組織。
於發炎性腸道疾病(IBD,inflammatory bowel diseases)中的工作已證實於IBD個體之發炎及未發炎的腸道兩者中，血管細胞黏著分子(VCAM－1,vascular cell adhesion molecule－1)及黏膜附素細胞黏著分子(MAdCAM－1,mucosal addressin cell adhesion molecule)的表現於發炎的活躍位置，其建議白血球之補充至黏膜促成IBD之發炎反應特徵。所以，破壞VCAM－1/α4 β1 及MAdCAM－1/α4 β7 交互作用之藥劑可造成降低淋巴細胞遷移及減少細胞激素及其他引起組織傷害的物質之釋放。於棉冠狨猴(CTT,cotton－top tamarin)(一種靈長類物種，其經歷一種慢性IBD於發炎的腸道組織中具有關鍵黏著分子之類似表現模式)中抗α4 整合素抗體之研究相較於安慰劑已顯示高度顯著改善急性結腸炎。
已於小鼠、天竺鼠、及猴子中進行單一及多重劑量毒性研究。利用那他珠單抗進行所有毒性研究及包括於天竺鼠中的急性研究、小鼠及狒狒(cynomolgus monkeys)中之亞急性研究、及誘變性及組織交叉反應性研究。此等研究不顯示顯著毒性之臨床或驗屍證據。
於小鼠中，有證據α4 整合素及VCAM－1在胎盤及心臟發育中扮演角色，及其也可能在胎兒發育中扮演更廣的角色。所以，若以那他珠單抗阻擋α4 整合素有導致墮胎的作用或畸形的危險。初步的生殖毒性研究暴露五隻懷孕的狒狒群至0.06、0.3、或30毫克/公斤那他珠單抗之反覆靜脈內給藥。五隻懷孕的雌性其中一隻於30毫克/公斤群中在接受到五次給予那他珠單抗之後，在懷孕第31天流產。因為流產的整體比例落於此物種之自然流產比例內，吾人不相信此事件與那他珠單抗相關。一個進行的後續生殖毒性研究已暴露10至15隻懷孕的狒狒群至3、10、或30毫克/公斤之反覆靜脈內給藥。胚胎死亡已以類似比例發生於所有處理的群：分別為控制組兩隻，3毫克/公斤中一隻，10毫克/公斤中兩隻及30毫克/公斤群中兩隻。作為預防措施，在研究期間全程及在研究藥物最後灌注後至少3個月，有分娩可能之婦女必需利用有效的避孕法，及在每次那他珠單抗給藥之時必需有陰性懷孕測試。
於靈長類的六個月多劑量毒性研究中，在所有給藥族群中約有一半那他珠單抗處理的動物發現有盲腸、結腸、及/或直腸黏膜之極微至輕微淋巴質漿細胞(lymphoplasmacytic)發炎及未發現於媒介族群中。發炎的特徵為在固有層(lamina propia)內增量的淋巴細胞及漿細胞伴隨偶爾隱窩膿瘍(crypt abscesses)。由那他珠單抗30.0及60.0毫克/公斤/週群動物之結腸及直腸中有輕微增加的發病率及改變大小，代表劑量反應的關係。然而，雖然可能有劑量反應關係，發炎的發病率無關於那他珠單抗血清濃度。雖然此等改變可能反映受影響動物腸道之某些潛在的影響，兩個最高那他珠單抗劑量族群動物中輕微增加發炎之發病率及大小，與在控制組族群中無此現象總結，指出那他珠單抗可能於此過程中扮演角色。
將在克隆氏症及潰瘍性結腸炎早期研究摘要於下。一個研究為於診斷具有慢性活動的克隆氏症之男性及女性個體中單一靜脈內灌注3毫克/公斤那他珠單抗之隨機、雙盲、安慰劑控制組、安全性、耐受性及療效研究。徵召30個個體；18個用那他珠單抗(3毫克/公斤)治療及12個用安慰劑。治療後2週，7個那他珠單抗治療的個體(39%)及1個安慰劑治療的個體(8%)為臨床緩解(克隆氏症活性指數(CDAI,Crohn's disease Activity Index)<150)(p＝0.1)。此外，在治療後第2週時，相較於安慰劑治療的個體(33%)更少那他珠單抗治療的個體(11%)需要救援治療。相較於平均基線CDAI分數，僅那他珠單抗族群於治療後2及4週時平均CDAI分數顯著降低。此等作用在超過治療後4週並未持續及與在第4週時間點觀察到的低那他珠單抗血清濃度相關聯。
用單一、靜脈內劑量3毫克/公斤之那他珠單抗治療為安全及被具有CD之個體良好耐受。無個體因為發生有害狀況而退出研究。六個個體報告一個嚴重有害狀況；所有個體於那他珠單抗治療的族群。此等狀況無一為致命。六個狀況中的五個為承認復發或惡化個體的克隆氏症，另一個嚴重有害狀況為承認貧血。於那他珠單抗及安慰劑族群之間無顯著差異於最常報告的有害狀況(頭痛、克隆氏症及腹部疼痛)之發生。
第二個早期研究為於具有活性潰瘍性結腸炎之男性及女性個體中單一灌注3毫克/公斤靜脈內那他珠單抗之開放式安全性、耐受性及療效研究。徵募10個個體及用那他珠單抗(3毫克/公斤)治療。治療後2及4週時，5個個體(50%)具有良好臨床反應，定義為鮑威爾－泰克活性指數(PTAI,Powell－Tuck Activity Index)分數≦5及平均PTAI分數由第0週的9.7分別降低至治療後第1、2、及4週的6.9、5.7及4.9。平均PTAI分數保持抑制於12週研究期間。於第0及4週期間70%個體不接受救援藥物。
於此研究中最常報告的有害狀況為潰瘍性結腸炎惡化、頭痛、嘔吐、昏睡及喉嚨痛。於此研究中報告的30個有害狀況，僅3個被視為與研究藥物有關。此等為一次發生各頭痛、潰瘍性結腸炎惡化及昏睡。有兩個狀況為嚴重；兩者皆為惡化的潰瘍性結腸炎之報告，不被視為與治療有關。三個個體報告嚴重的有害狀況。此等狀況無一為致命。此等狀況為弧形菌腸炎(Campylobacter enteritis)之發生；潰瘍性結腸炎之復發，其造成個體退出研究，及強直、發燒、頭痛及嘔吐之事件。
另一個早期研究為在具有中度至嚴重活性克隆氏症之個體中一或兩次靜脈內灌注安慰劑、3或6毫克/公斤那他珠單抗之雙盲、安慰劑控制組、平行族群、多中心、療效、安全性及耐受性研究。將總共248個個體其中244個接受至少一劑量研究藥物。隨機68個用3毫克/公斤單一灌注，66個於4週間隔用兩次灌注3毫克/公斤，51個於4週間隔用兩次灌注6毫克/公斤及63個接受安慰劑。在第4、6、8及12週，三個活性治療族群之至少一個中那他珠單抗於引發緩解(CDAI<150)上優於安慰劑。在接受兩次灌注3毫克/公斤族群中於第6週觀察到最高緩解率46%，於此及接受兩次灌注6毫克/公斤族群中於第8及12週觀察到緩解率41－43%。在第2、4、6、8及12週，三個活性治療族群之至少一個中那他珠單抗於引發反應(於CDAI中≧70點或≧100點下降)上優於安慰劑。在接受兩次灌注3毫克/公斤族群中於第6週觀察到最高反應率73%(≧70點下降)及56%(≧100點下降)。經由發炎性腸道疾病問卷評估，也達到生活品質統計學上顯著改善及降低C－反應性蛋白質。
用那他珠單抗治療似乎為安全及被具有活性CD之個體良好耐受。各治療族群由於有害狀況退出之個體有類似數字：於安慰劑、單一3.0毫克/公斤、兩次3毫克/公斤及兩次6毫克/公斤灌注劑量族群中分別為2、1、2及3個個體。總計32個個體報告於研究的主要階段期間有嚴重有害狀況(於安慰劑、單一3.0毫克/公斤、兩次3毫克/公斤及兩次6毫克/公斤灌注劑量族群中分別為9、8、8及7個個體)。此等狀況無一為致命及無一被評估為與研究藥物有關。此等狀況的大部份為治療CD併發症或症狀許可。於至少兩個那他珠單抗治療族群中以較大頻率報告的非疾病相關狀況包括胸痛、發燒、感冒症狀、頭昏及結膜炎。
那他珠單抗於治療克隆氏症之用途大多數具有CD之個體將一開始對包括5－ASA配方(柳酸磺胺鈚啶、美沙拉嗪、奧沙拉嗪(olsalazine))、口服類固醇(如培尼皮質醇、甲基培尼皮質醇、布地縮松)之市售藥物有反應。更近來，已發展針對腫瘤壞死因子的藥劑(抗腫瘤壞死因子α抗體、英利昔單抗)用於治療嚴重難治CD及難治瘺管疾病。然而，一些病患持續具有令人虛弱的疾病及需要改善治療以目前療法無法良好控制疾病之個體。
有證據在具有IBD的個體中MadCAM－1及VCAM－1為向上調控，與MadCAM－1/α4 β7 交互作用調節淋巴細胞歸巢至腸。於IBD中抗－α4整合素抗體之可能角色一開始由於棉冠狨猴中的研究發現及更近來由那他珠單抗於臨床試驗中的結果支持。
計劃兩個另外的研究(於下詳細說明)以確認早期結果及設計來引發反應及/或緩解中度至嚴重活性CD個體族群(CDAI≧220,≦450)。徵召來自第一個研究之個體，其為有反應及而後有輕微活性疾病(CDAI分數<220及≧70下降)於隨後的研究中，設計其來決定重複給予那他珠單抗是否可維持反應及/或緩解。已知CD之慢性本質，明顯重要的是評估新藥劑在較長時間時期間降低或消除疾病活性的能力。此外，維持一旦達到的改善之方法也反映目前臨床實踐的目標。
評估療效之主要工具為克隆氏症活性指數(CDAI,Crohn's disease Activity Index)。CDAI係由美國國家克隆氏症研究協會(NCCDS,US National Co－operative Crohn's Study)於1979年發展及為CD臨床分數之最為人知者。其廣泛應用於新療法之臨床試驗中及已得到一般接受為臨床活動的終點。一般接受CDAI分數<150為緩解，分數≧150至<220被視為輕微活性疾病而分數≧220至<450被視為中度至嚴重活性疾病。
於是，將失去反應定義為CDAI分數≧220及失去緩解為CDAI分數≧150。使用此等定義與救援介入之使用合併於此研究中之維持反應及緩解分析。
此研究之其他終點包括經由發炎性腸道疾病問卷評估，一種已為IBD族群發展的生活品質工具，及SF－3612，其提供生活品質之更一般的評估及其被一些管理當局贊同。也評估發炎標記物如C－反應性蛋白質之變化，以及於接受之的次個體族群中取消隨附的口服類固醇之能力。
選擇作為臨床評估之那他珠單抗起始劑量係基於在天竺鼠試驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE,Experimental Allergic Encephalitis)模型中非臨床研究。此等研究證實那他珠單抗3毫克/公斤劑量產生EAE徵象極至症狀顯著延遲開始及逆轉兩者；較低劑量那他珠單抗為不有效。單一劑量3毫克/公斤似乎提供那他珠單抗之血清濃度伴隨α4整合素受體阻塞高達大約3週，及6毫克/公斤約6週。
藉由給予對體重調整的劑量已評估那他珠單抗於所有迄今之臨床試驗。由完成的臨床試驗於健康自願者及於具有MS及IBD的個體中單一劑量藥物動力學數據顯示3毫克/公斤灌注那他珠單抗可維持那他珠單抗血清濃度為2.5－3.0微克/毫升，此量與充分受體飽和程度及抑制細胞黏著3－4週有關。單一較高劑量6毫克/公斤那他珠單抗灌注產生α4整合素飽和量，其為稍高及更延長(大約6週)。
發現於此等第II階段研究中觀察到的藥物動力學作用及治療反應係關於那他珠單抗劑量及血清那他珠單抗濃度。基於此等發現，伴隨那他珠單抗清除與體重大部份無關之知識，研究由固定劑量300毫克產生的暴露範圍以決定是否固定劑量給予可取代由體重調整劑量。
經由藥物動力學模擬及假設AUC正比於總劑量，證實300毫克固定劑量將產生那他珠單抗暴露，其重疊於第II階段試驗中使用的3毫克/公斤及6毫克/公斤劑量觀察到的暴露。因此，因為於CD及MS兩種適應症中3毫克/公斤劑量為有效的，6毫克/公斤劑量造成未顯現劑量限制的毒性及對6毫克/公斤劑量無增加的益處超過3毫克/公斤劑量，300毫克固定劑量為第III階段研究之適當選擇。
進行於具有克隆氏症(CD,Crohn's Disease)病患中靜脈內Tysabri(那他珠單抗，每月300毫克)於維持臨床反應及緩解之療效、安全性及耐受性之雙盲、安慰劑控制組研究。
目的為比較那他珠單抗與安慰劑於具有CD的個體中維持臨床反應之能力，比較那他珠單抗與安慰劑於具有CD的個體中維持臨床緩解之能力，比較那他珠單抗與安慰劑對於生活品質之作用(由發炎性腸道疾病問卷(IBDQ,Inflammatory Bowel Disease Questionnaire)測量)，及比較那他珠單抗與安慰劑允許個體達到取消口服類固醇之能力。
研究設計進行具有先前活性克隆氏症(CD,Crohn's disease)(定義為中度至嚴重活性，CDAI≧220，<450)，其於第一個研究中對在第10週的治療有反應及維持反應至第12週(定義為≧70點降低於基線CDAI)及其疾病為輕微活性(定義為CDAI分數<220)之個體之第III階段、國際、多中心、隨機、雙盲、安慰劑控制組，平行族群研究。
於此族群中，有一個次族群，其於第一個研究的第10週時已達到緩解(定義為CDAI分數<150)。自第10週至第12週無法保持反應之個體不適合於第二個研究及繼續於第一個研究的安全性後續階段。允許包含接受隨附的CD藥物之個體，其限制條件為在第一個研究中其參與全程劑量維持穩定。所有CD的隨附藥物保持穩定於12個月治療階段(最高至15個月)期間，除了口服類固醇，其根據固定的規則系統降低。在本申請案申請之時，僅得到9個月的數據。
將那他珠單抗每月給予300毫克12次灌注。將安慰劑每月給予12次灌注。根據其疾病狀態(緩解與無緩解，即CDAI<150或≧150)、隨附使用口服類固醇及隨附使用免疫抑制劑，將個體分類。
一旦隨機選取，個體接受其第一次灌注。之後，其以每月為基本(於此將1個月定義為4週期間)回到診所做評估及灌注。除非為了救援介入之目的視為必需，允許任何新CD藥物的導入或對現存隨附CD藥物之劑量改變(除了根據固定的規則系統減少口服類固醇)。一旦救援，將此個體視為治療失敗。
個體於此研究中將接受高達12次灌注及於最後一次灌注後1個月(即在第15個月時)回診做最後治療階段評估。
樣本大小於第一個研究中預期大約380個個體對治療有反應及於第10週時有輕微活性疾病(定義為≧70點降低於CDAI分數及CDAI分數<220及未使用救援介入)，維持至第12週/第3個月。假設於兩個研究間25%不適合個體淘汰率，預期徵召285人於第二個研究中。其中，預期200個個體已達到緩解(定義為CDAI分數<150)。
將隨機給藥的285個個體(每個治療族群142個人，比例1：1)之樣本大小以5%顯著性給予90%功效偵測到那他珠單抗治療族群及安慰劑族群之間維持反應率(定義為CDAI分數<220及未使用救援介入)差異，假設那他珠單抗為65%反應率及安慰劑為44%反應率及允許10%淘汰率。
於是，將隨機給藥的200個緩解個體之次族群以5%顯著性給予90%功效偵測到那他珠單抗治療族群及安慰劑族群之間維持緩解(定義為CDAI分數<150及未使用救援介入)差異，假設那他珠單抗為55%反應率及安慰劑為30%反應率及允許10%淘汰率。
使於第一個研究中第10週合適的個體答應及徵召入第二個研究中，以便允許服用隨附口服類固醇的個體開始類固醇減少。在第12週/第3個月時(即在下一個每月的灌注之時)繼續符合合格標準的個體將重新隨機選取及進入治療階段，其將持續12個月長(即高達第15個月)。個體為男性或女性，十八歲或以上。
藥物劑量及配方將靜脈內那他珠單抗以300毫克劑量給予。將那他珠單抗以20毫克/毫升濃度提供於5毫升小瓶中。將所有灌注組成於0.9%鹽水之100毫升袋中。那他珠單抗小瓶中含有20毫克/毫升那他珠單抗於10 mM磷酸緩衝液，140 mM NaCl及0.02%聚山梨醇酯(polysorbate 80)，用磷酸調整至pH 6.0。
對於控制組，將安慰劑提供於相同的5毫升小瓶中及包含10 mM磷酸緩衝液，140 mM NaCl及0.02%聚山梨醇酯，用磷酸調整至pH 6.0。
給予途徑藉由靜脈內灌注經大約60分鐘以流速2毫升/分鐘給予那他珠單抗或安慰劑。在各灌注開始後觀察所有個體2小時。
程序
程序包括身體檢查、生命表徵、體重、CDAI、IBDQ、SF－36、個體整體評估、血液學、生化、C－反應性蛋白質(CRP,C－reactive protein)、抗核抗體(ANA,anti－nuclear antibodies)、血清那他珠單抗量、抗－那他珠單抗抗體及懷孕測試評估之血液樣本、驗尿及懷孕測試用的尿液樣本、有害狀況、隨附的藥物及救援介入之評估。
第一期、第二期及第三期終點第一期終點： 主要終點為對於個體於第12週時的反應失去反應(定義為CDAI分數220或使用救援介入)之時。
第二期終點： 1.或有第一期終點：對於在第12週時緩解的個體(定義為CDAI分數<150)失去緩解(定義為CDAI分數150或使用救援介入)之時。
2.對於在第12週時緩解的個體(定義為CDAI分數<150)之比例(%)在12個月後(即於第15個月)保持緩解(定義為CDAI分數<150且未使用救援介入)。
3.於第9個月時，於IBDQ中自CD301中的基線之平均變化。
4.在第9個月時，數目(%)不服用口服類固醇。在第9個月時，個體之數目(%)於緩解(定義為CDAI分數<150且未使用救援介入)及不服用口服類固醇。
第三期終點： 1.在第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及15個月時，個體之數目(%)具有輕微活性疾病(定義為CDAI分數<220且未使用救援介入)。
2.在第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及15個月時，個體之數目(%)於緩解(定義為CDAI分數<150且未使用救援介入)。
3.在第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及15個月時，個體之數目(%)具有CDAI分數<200且未使用救援介入。
4.在第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及15個月時，平均CDAI分數。
5.於第3、6、12及15個月時，於IBDQ中自CD301中的基線之平均變化。
6.於第3、6、9、12及15個月時，於SF36中自CD301中的基線之平均變化。
7.於第3、6、9、12及15個月時，於個體整體評估中自CD301中的基線之平均變化。
8.在第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及15個月時，數目(%)不服用口服類固醇。
9.在第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及15個月時，個體之數目(%)於緩解(定義為CDAI分數<150且未使用救援介入)及不服用口服類固醇。
10.第一次使用救援介入之時(包括手術介入)。
11.在第3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及15個月時，個體之數目(%)需要救援介入(包括手術介入)。
12.於第3、6、9、12及15個月時，C－反應性蛋白質自CD301中的基線之平均變化(於具有升高的CRP於CD301中基線的個體中)。
13.於第3、6、9、12及15個月時，血清白蛋白自CD301中篩選之平均變化。
統計學考量療效分析係基於有意治療的族群。將第一期終點之分析對符合方案(per protocol)族群重複。將類別資料呈現為數量及百分比。將連續數字呈現為摘要統計。所有實施的比較為以5%顯著程度之雙尾。
主要分析調整用於分類以及地理位置及其他預先指定的協變數之因子。若第一期療效終點為以5%程度統計學上顯著，才分析或有第一期終點，失去緩解之時。
當400個病患由第一個及第二個研究合併得到數年數據及當每個個體將具有最少3個月數據(即最少已完成第一個研究至第12週或於第二個研究中已完成第12週/第3個月)時，進行管理分析。
研究藥物提供研究藥物(那他珠單抗或安慰劑)20毫克/毫升那他珠單抗或安慰劑於乾淨、有蓋、各別的5毫升小瓶中。將小瓶包裝入3瓶之盒中以保護免於光線。將各盒用獨特6碼盒數字標記及含有一次灌注足量研究藥物。
那他珠單抗小瓶含有20毫克/毫升那他珠單抗於10 mM磷酸緩衝液，140 mM NaCl及0.02%聚山梨醇酯，用磷酸調整至pH 6.0。將安慰劑提供於相同的5毫升小瓶中及包含10 mM磷酸緩衝液，140 mM NaCl及0.02%聚山梨醇酯，用磷酸調整至pH 6.0。
研究藥物劑量隨機使個體接受那他珠單抗每月(即每4週)300毫克經由靜脈內灌注高達12次灌注。
研究藥物製備將15毫升鹽水(相當於欲加入的研究藥物之體積)自0.9%鹽水之100毫升袋中取出及丟棄。而後將15毫升研究藥物自三小瓶中取出經由18或19號針頭抽入50毫升針筒，及經由20－23號針頭通過藥物孔隔膜加入鹽水袋中。利用無菌技術進行稀釋。
研究藥物給予研究藥物之給予藉靜脈內灌注每4週進行一次。各灌注費時大約60分鐘。利用流速大約2毫升/分鐘進行灌注。一旦100毫升研究藥物袋空了，將其用50毫升鹽水袋取代，以便以相同速率沖洗灌注管線。
口服類固醇減少在進入第二個研究時立即要求所有接受口服類固醇的個體以下列規則系統進行減量。於劑量相當於>10毫克培尼皮質醇之個體將以每7天5毫克之速率開始減少直到其達到10毫克之劑量。於劑量相當於10毫克培尼皮質醇之個體以每7天2.5毫克之速率減少直到其完全取消。將服用布地縮松的個體以每3週3毫克之速率減少。
身體檢查在第6個月、第9個月、第12個月及第15個月將進行完整的身體檢查及作為在第15個月前退出的病患之早期中斷就診的部份。每次就診記錄體重作為評估CDAI分數之部份。每次就診記錄生命表徵。在當給予灌注的就診時，記錄灌注前一刻(0分鐘)及終了時的生命表徵。
生活品質評估生活品質評估由個體整體評估、發炎性腸道疾病問卷(IBDQ,Inflammatory Bowel Disease Questionnaire)及健康檢查組成，於第3個月、第6個月、第9個月、第12個月及第15個月就診期間由個體完成及為早期中斷就診的部份。個體必需在就診之初(即在任何評估或灌注之前)完成評估，首先完成個體整體評估。個體整體評估為視覺類比量表(visual analog scale)，個體評估相較於接受其第一次給予研究藥物前一刻的感覺其感覺的整體印象。
那他珠單抗濃度於第3個月、第6個月、第9個月、第12個月及第15個月期間收集血液樣本做那他珠單抗濃度量測。在當給予灌注的就診時，將樣本於灌注前一刻(0分鐘)採集。此外，僅在第6個月及第12個月，於灌注結束後至少1小時收集第二個樣本。
統計方法評估那他珠單抗於具有CD的個體中維持輕微活性疾病(定義為CDAI分數<220及未使用救援介入)及緩解(定義為CDAI分數<150及未使用救援介入)之能力。主要研究的比較為在治療族群之間失去反應的時間(其中將失去反應定義為CDAI分數220或使用救援介入)。完成或有相繼分析於在第12週時緩解的個體(CDAI<150)之次族群中治療對於治療族群之間失去緩解(定義為CDAI分數150或使用救援介入)的時間之作用。
於第一個研究中預期大約380個個體對治療有反應及於第10週時有輕微活性疾病(定義為≧70點降低於CDAI分數及CDAI分數<220及未使用救援介入)，維持至第12週/第3個月。其中，假設於兩個研究間適合個體之25%淘汰率，預期徵召285人於第二個研究中。其中，預期200個個體已達到緩解(定義為CDAI分數<150)。
將隨機給藥的285個個體(每個治療族群142個人，比例1：1)之樣本大小以5%顯著性給予90%功效偵測到那他珠單抗治療族群及安慰劑族群之間維持反應率(定義為CDAI分數<220及未使用救援介入)差異，假設那他珠單抗為65%反應率及安慰劑為44%反應率及允許10%淘汰率。
於是，將隨機給藥的200個緩解個體之次族群以5%顯著性給予90%功效偵測到那他珠單抗治療族群及安慰劑族群之間維持緩解(定義為CDAI分數<150及未使用救援介入)差異，假設那他珠單抗為55%反應率及安慰劑為30%反應率及允許10%淘汰率。
療效分析所有療效分析及摘要係基於有意治療的族群。利用符合方案族群進行主要療效參數之確認分析。利用有意治療的族群之子集，包含於第一個研究中隨機接受那他珠單抗有反應者對第一期及第二期終點進行敏感度分析。
結果於第二個研究中，未服用類固醇的病患於第9個月(相較於在第一個研究基線服用類固醇者)顯示下列結果：
於兩個族群中最常見的副作用為頭痛、噁心及腹部疼痛。嚴重不良反應(SAE,serious adverse event)中，8%對7%安慰劑對那他珠單抗。
圖1顯示當給予於克隆氏症試驗的病患那他珠單抗之反應曲線圖。在進入試驗三個月時那他珠單抗有反應的族群中，61.3%病患於9個月後維持反應，而僅28.8%安慰劑族群維持反應。
圖2顯示當給予於克隆氏症試驗的病患那他珠單抗反應之減輕程度曲線圖。在在進入試驗三個月時那他珠單抗緩解的族群中，43.8%病患於9個月後維持反應，而僅25.8%安慰劑族群維持反應。
圖3顯示於不同族群中：有意治療的族群(ITT)、升高的C－反應性蛋白質族群(CRP)、無反應性或不耐免疫抑制的族群(immuno UI)、及對類固醇無反應性、不耐、或有依賴性之族群(類固醇UID)，當給予於克隆氏症試驗的病患那他珠單抗反應之減輕程度曲線圖。此等分類法係基於病患先前使用此等藥物之病歷。
療效摘要於研究的族群中，於第一個研究中相較於安慰劑，觀察到用那他珠單抗有臨床上有意義的差異於緩解及反應率。第二個研究(於第一個研究中有反應者之雙盲取消研究)確認於第一個研究中見到的引發作用。於第二個研究中6個月後觀察到鼓勵的維持數據。於第二個研究中，那他珠單抗使得個體得以成功地逐漸減少類固醇。
所有其他指數將由醫師在門診病人就診時評估如下：
實例10
此實驗為在克隆氏症中那他珠單抗維持臨床反應及緩解之療效、安全性、及耐受性之雙盲、安慰劑控制組研究。
那他珠單抗為對α4整合素之人化單株IgG4抗體，將其於隨機控制的研究中評估以決定六個月療程維持於第III階段引發反應/緩解研究中那他珠單抗治療的個體所達到的臨床反應/緩解之能力。
方法將具有克隆氏症(CD,Crohn's disease)的339個成人個體，其在第一個研究中接受三次那他珠單抗灌注後達到反應(≧70－點降低基線克隆氏症活性指數(CDAI,Crohn's Disease Activity Index))及/或緩解(CDAI<150)及具有CDAI分數<220，以1：1之比例隨機用那他珠單抗(300毫克)(n＝168)或安慰劑(n＝171)做高達12次額外的每月灌注。第一期終點為在第二個研究中另外連續6個月在每個時間點不失去由第一個研究的反應之個體比例。將失去反應定義為CDAI≧220及≧70－點增加第二個研究中的基線CDAI或使用救援介入。也評估緩解的維持。
結果在6個月時，61%(103/168)用那他珠單抗處理的個體(ITT族群)持續符合臨床反應標準相對於29%(49/170)隨機選取接受安慰劑個體(p<0.001)。44%(57/130)於用那他珠單抗處理的族群維持臨床緩解，相較於26%(31/120)於安慰劑族群(p＝0.003)。此外，55%(37/67)於第一個研究中服用類固醇之用那他珠單抗處理的個體於第二個研究中重新隨機給予那他珠單抗取消類固醇，相較於25%(19/76)重新隨機給予安慰劑(p<0.001)。未觀察到治療族群之間嚴重及不嚴重不良反應比例中明顯差異。
於第二個研究中，那他珠單抗顯現超過安慰劑顯著優越性於第一個研究中那他珠單抗有反應者於6個月時期間所有連續時間點維持反應及緩解之能力。每月給予那他珠單抗6個月為良好耐受及能夠使個體成功地取消類固醇。
將所有上述文獻、專利及專利申請案全文以參考資料併於本文中猶如將各獨立文獻、專利及專利申請案全文明確及獨立地指示為為所有目的以參考資料併入之相同程度。本申請案主張2004年4月1日申請之美國臨時專利申請案第60/558,120號之權利，該案之全文為所有目的以引用的方式併入本文中。
圖1顯示當給予於克隆氏症試驗的病患那他珠單抗之反應曲線圖(見實例2)。
圖2顯示當給予於克隆氏症試驗的病患那他珠單抗反應之減輕程度曲線圖(見實例2)。
圖3顯示於不同族群中：有意治療的族群(ITT)、升高的C－反應性蛋白質族群(CRP)、無反應性或不耐免疫抑制的族群(immuno UI)、及對類固醇無反應性、不耐或有依賴性之族群，當給予於克隆氏症試驗的病患那他珠單抗反應之減輕程度曲線圖(見實例2)。此等分類法係基於病患先前使用此等藥物之病歷。

Claims (58)

  1. 一種那他珠單抗之用途，其係用於製備降低及/或消除患有選自發炎性腸道疾病、氣喘、多發性硬化症、風濕性關節炎、植體抗宿主疾病、宿主抗植體疾病、脊椎關節病變、及其組合組成的族群的疾病之個體對類固醇治療的需要之藥物，其中該個體對用類固醇治療無反應、不耐或依賴。
  2. 如請求項1之用途，其中該個體為人類。
  3. 如請求項1之用途，其中該藥物係以非經腸胃給予至需要其的個體。
  4. 如請求項3之用途，其中該非經腸胃給予造成於該個體中至少約1ng/mL那他珠單抗之有效血液濃度。
  5. 如請求項4之用途，其中該那他珠單抗之有效血液濃度於該個體中為約1ng/mL。
  6. 如請求項1之用途，其中該藥物係長期給予個體。
  7. 如請求項6之用途，其中該長期給予藥物為至少一年期間每週或每月給予。
  8. 如請求項1之用途，其中該疾病為發炎性腸道疾病，及其中該藥物係以有效量給予，以使個體逐漸減少類固醇療法。
  9. 如請求項8之用途，其中該發炎性腸道疾病為克隆氏症或潰瘍性結腸炎。
  10. 如請求項8之用途，其中該藥物係以約2毫克/公斤至約8毫克/公斤之量給予至該個體。
  11. 如請求項8之用途，其中該個體需要類固醇的治療有效量少於在無給予藥物時所需者。
  12. 如請求項8之用途，其中該個體係為對用免疫抑制劑治療無反應或不耐之病患。
  13. 一種組合之用途，其係用於製備治療發炎性腸道疾病之藥物，其中該組合包含類固醇節約有效量之那他珠單抗，及選自下列組成之族群的第二種藥劑：(i)一種免疫抑制劑，其中該免疫抑制劑不是類固醇；(ii)一種抗-TNF組合物；(iii)一種5-ASA組合物；及(iv)其組合。
  14. 如請求項13之用途，其中該組合另外包含治療有效量之類固醇節約劑，其係選自由抗-α4 整合素藥劑及抗-VCAM-1藥劑所組成之群。
  15. 如請求項13之用途，其中該免疫抑制劑係選自硫唑嘌呤、6-巰嘌呤、甲氨蝶呤及山喜多組成的族群。
  16. 如請求項13之用途，其中該抗-TNF組合物為英利昔單抗。
  17. 如請求項13之用途，其中該5-ASA藥劑係選自柳酸磺胺鈚啶、美沙拉嗪及奧沙拉嗪組成的族群。
  18. 如請求項1之用途，其中該疾病為多發性硬化症，及其中該藥物係以有效量給予，以使個體逐漸減少類固醇療法。
  19. 如請求項18之用途，其中該個體需要類固醇的治療有效量少於在無給予藥物時所需者。
  20. 如請求項18項之用途，其中該個體係為對用免疫抑制劑 治療無反應或不耐之病患。
  21. 一種組合之用途，其係用於製備治療多發性硬化症之藥物，其中該組合包含類固醇節約有效量之那他珠單抗，及選自下列組成之族群的第二種藥劑：(i)一種免疫抑制劑，其中該免疫抑制劑不是類固醇；(ii)一種抗-TNF組合物；(iii)一種5-ASA組合物；及(iv)其組合。
  22. 如請求項21之用途，其中該組合另外包含治療有效量之類固醇節約劑，其係選自由抗-α4 整合素藥劑及抗-VCAM-1藥劑所組成之群。
  23. 如請求項21之用途，其中該免疫抑制劑係選自硫唑96嘌呤、6-巰嘌呤、甲氨蝶呤及山喜多組成的族群。
  24. 如請求項21之用途，其中該抗-TNF組合物為英利昔單抗。
  25. 如請求項21之用途，其中該5-ASA藥劑係選自柳酸磺胺鈚啶、美沙拉嗪及奧沙拉嗪組成的族群。
  26. 如請求項1之用途，其中該疾病為風濕性關節炎，及其中該藥物以足以使個體逐漸減少類固醇療法之量給予。
  27. 如請求項26之用途，其中該個體需要類固醇的治療有效量少於在無給予藥物時所需者。
  28. 如請求項26之用途，其中該個體為對用免疫抑制劑治療無反應或不耐之病患。
  29. 一種組合之用途，其係用於製備治療風濕性關節炎之藥物，其中該組合包含類固醇節約有效量之那他珠單抗， 及選自下列組成之族群的第二種藥劑：(i)一種免疫抑制劑，其中該免疫抑制劑不是類固醇；(ii)一種抗-TNF組合物；(iii)一種5-ASA組合物；及(iv)其組合。
  30. 如請求項29之用途，其中該組合另外包含治療有效量之類固醇節約劑，其係選自由抗-α4 整合素藥劑及抗-VCAM-1藥劑所組成之群。
  31. 如請求項29之用途，其中該免疫抑制劑係選自硫唑嘌呤、6-巰嘌呤、甲氨蝶呤及山喜多組成的族群。
  32. 如請求項29之用途，其中該抗-TNF組合物為英利昔單抗。
  33. 如請求項29之用途，其中該5-ASA藥劑係選自柳酸磺胺鈚啶、美沙拉嗪及奧沙拉嗪組成的族群。
  34. 如請求項1之用途，其中該疾病為植體抗宿主疾病或宿主抗植體疾病，及其中該藥物以足以使個體逐漸減少類固醇療法之量給予。
  35. 如請求項34之用途，其中該個體需要類固醇的治療有效量少於在無給予藥物時所需者。
  36. 如請求項34之用途，其中該個體為對用免疫抑制劑治療無反應或不耐之病患。
  37. 一種組合之用途，其係用於製備治療植體抗宿主疾病或宿主抗植體疾病之藥物，其中該組合包含類固醇節約有效量之那他珠單抗，及選自下列組成之族群的第二種藥劑： (i)一種免疫抑制劑，其中該免疫抑制劑不是類固醇；(ii)一種抗-TNF組合物；(iii)一種5-ASA組合物；及(iv)其組合。
  38. 如請求項37之用途，其中該組合另外包含治療有效量之類固醇節約劑，其係選自由抗-α4 整合素藥劑及抗-VCAM-1藥劑所組成之群。
  39. 如請求項37之用途，其中該免疫抑制劑係選自硫唑嘌呤、6-巰嘌呤、甲氨蝶呤及山喜多組成的族群。
  40. 如請求項37之用途，其中該抗-TNF組合物為英利昔單抗。
  41. 如請求項37之用途，其中該5-ASA藥劑係選自柳酸磺胺鈚啶、美沙拉嗪及奧沙拉嗪組成的族群。
  42. 如請求項1之用途，其中該疾病為氣喘，及其中該藥物以足以使個體逐漸減少類固醇療法之量給予。
  43. 如請求項42之用途，其中該個體需要類固醇的治療有效量少於在無給予藥物時所需者。
  44. 如請求項42之用途，其中該個體為對用免疫抑制劑治療無反應或不耐之病患。
  45. 一種組合之用途，其係用於製備治療氣喘之藥物，其中該組合包含類固醇節約有效量之那他珠單抗，及選自下列組成之族群的第二種藥劑：(i)一種免疫抑制劑，其中該免疫抑制劑不是類固醇；(ii)一種抗-TNF組合物；(iii)一種5-ASA組合物；及 (iv)其組合。
  46. 如請求項45之用途，其中該組合另外包含治療有效量之類固醇節約劑，其係選自由抗-α4 整合素藥劑及抗-VCAM-1藥劑所組成之群。
  47. 如請求項45之用途，其中該免疫抑制劑係選自硫唑嘌呤、6-巰嘌呤、甲氨蝶呤及山喜多組成的族群。
  48. 如請求項45之用途，其中該抗-TNF組合物為英利昔單抗。
  49. 如請求項45之用途，其中該5-ASA藥劑係選自柳酸磺胺鈚啶、美沙拉嗪及奧沙拉嗪組成的族群。
  50. 如請求項1之用途，其中該疾病為脊椎關節病變，及其中該藥物以足以使個體逐漸減少類固醇療法之量給予。
  51. 如請求項50之用途，其中該脊椎關節病變係選自僵直性脊椎炎、乾癬性關節炎、來特氏症候群、發炎性腸道疾病之關節炎、未分化脊椎關節炎及幼年脊椎關節炎組成的族群。
  52. 如請求項51之用途，其中該個體需要類固醇的治療有效量少於在無給予藥物時所需者。
  53. 如請求項51之用途，其中該個體為對用免疫抑制劑治療無反應或不耐之病患。
  54. 一種組合之用途，其係用於製備治療脊椎關節病變之藥物，其中該組合包含類固醇節約有效量之那他珠單抗，及選自下列組成之族群的第二種藥劑：(i)一種免疫抑制劑，其中該免疫抑制劑不是類固醇；(ii)一種抗-TNF組合物； (iii)一種5-ASA組合物；及(iv)其組合。
  55. 如請求項54之用途，其中該組合另外包含治療有效量之類固醇節約劑，其係選自由抗-α4 整合素藥劑及抗-VCAM-1藥劑所組成之群。
  56. 如請求項54之用途，其中該免疫抑制劑係選自硫唑嘌呤、6-巰嘌呤、甲氨蝶呤及山喜多組成的族群。
  57. 如請求項54之用途，其中該抗-TNF組合物為英利昔單抗。
  58. 如請求項54之用途，其中該5-ASA藥劑係選自柳酸磺胺鈚啶、美沙拉嗪及奧沙拉嗪組成的族群。
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