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TWI460274B - 偵測ＲＯＣＫｓ活化之試劑 - Google Patents

偵測ＲＯＣＫｓ活化之試劑 Download PDF

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TWI460274B
TWI460274B TW101126665A TW101126665A TWI460274B TW I460274 B TWI460274 B TW I460274B TW 101126665 A TW101126665 A TW 101126665A TW 101126665 A TW101126665 A TW 101126665A TW I460274 B TWI460274 B TW I460274B
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rockii
oligopeptide
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Zee Fen Chang
Hsiao Hui Lee
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Univ Nat Yang Ming
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Description

偵測ROCKs活化之試劑
本發明係關於一種偵測試劑組，尤其，本發明係關於一種能偵測ROCKI與ROCKII分別活化情形之試劑組。
Rho相關蛋白激酶(Rho-associated protein kinases,ROCKs)屬於Rho A下游的一個反應分子，屬於絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶家族的一員，此分子參與細胞貼附、細胞移動、細胞收縮力、細胞生長、細胞凋亡、中心體複製、及有絲分裂等細胞活性的調控，而且在許多心血管疾病、癌症、精神疾病的致病性上扮演重要角色。在哺乳類中ROCK有兩種，分為ROCKI及ROCKII，它們有相似的結構，在N端為激酶區域、C端則有一個RhoA結合區域及普列克底物同源(pleckstrin homology,PH)。在細胞內調節ROCK活性的方式包括：(1)藉由RhoA與ROCK的結合；(2)在凋亡細胞中，C端抑制區域的蛋白分解切割作用；(3)藉由細胞內第二個訊息傳遞者的作用(例如花生四烯酸)而使其活化；或(4)與其他蛋白的交互作用，例如Polo-like kinase 1(Plk1)及核仁磷酸蛋白質(nucleophosmin)，以及GTP結合蛋白(Gem、Rad)與ROCK抑制劑(Morgana)的抑制作用。
目前偵測ROCK活化的方法包括：(1)藉由測定ROCK下游受質蛋白分子(例如肌凝蛋白輕鏈(MLC)、肌凝蛋白結合次單元(MBS)、LIM激酶(LIMK)、α-內收蛋白(α-adducin))在處理ROCK抑制劑前後的磷酸化差異(inhibitor-sensitive phosphorylation)，來間接地測定ROCK的活化情形；(2)或者以試管內激酶試驗(in vitro kinase assay)來測定純化後的ROCK蛋白其激酶催化活性。前者的缺點在於這些ROCK下游蛋白並未直接反應ROCKI或ROCKII在細胞及組織內的個別活化情形。後者的缺點則在於需大量樣本以純化出ROCK蛋白，而且在樣本製備過程中與RhoA的結合量更是複雜難解的。因此，現行技術中並無直接且有效的測定ROCKI 或ROCKII個別活化之方法及工具，也就無法進一步判斷個體在是否罹患心血管疾病、癌症或精神疾病等病症時ROCKI及ROCKII活化的情形。
本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。
在哺乳類的ROCKs有兩個，分別為ROCKI與ROCKII，在我們的研究中發現這兩個蛋白質激脢在被活化時有自體磷酸化的情形，為了能找到直接且有效測定ROCKI或ROCKII活化的方法及工具，我們鑑定出它們各別的磷酸化位置，並以實驗證實該位置的磷酸化確實可以代表其活化情形。本發明揭示一組對ROCKI及ROCKII磷酸化具專一性的抗體，可用以評估ROCKI與ROCKII個別的活化程度，該抗體可進一步製備為偵測試劑組，因此，該試劑可應用於檢測生物檢體中ROCKI與ROCKII活性，以供臨床疾病之病理分析與臨床治療用藥之參考；該偵測試劑亦可用於應用於ROCKI與ROCKII活化之相關研究與專一性藥物篩選。
因此，本發明提供一種用於偵測生物樣本中Rho相關蛋白質激酶(ROCKs)包含ROCKI與ROCKII之活化的試劑組，其中包括用以辨識該ROCKI胜肽序列(SEQ ID NO：1)的第1333號位置之絲胺酸之磷酸化的抗體-I、用以辨識ROCKII胜肽序列(SEQ ID NO：2)的第1366號位置之絲胺酸之磷酸化的抗體-II、抗體-I相對應胜肽序列的無磷酸化合成之寡胜肽鏈(寡胜肽-Ia SEQ ID NO：3)和同序列有磷酸化的合成寡胜肽鏈(寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4)、以及抗體-II相對應胜肽序列的無磷酸化合成之寡胜肽鏈(寡胜肽-IIa SEQ ID NO：5)和同序列有磷酸化的合成寡胜肽鏈(寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6)。
根據上述構想，寡胜肽-Ia SEQ ID NO：3為一段包含ROCKI(SEQ ID NO：1)之氨基酸1326至1336的合成寡胜肽，該序列從N 端至C端為RASPRTLSTRS之序列；寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4為寡胜肽-Ia的N端算起第2個絲胺酸(S)被磷酸化的合成寡胜肽，亦即為RASPRTLpSTRS之序列。寡胜肽-IIa SEQ ID NO：5為一段包含ROCKII(SEQ ID NO：2)之氨基酸1356至1368的合成寡胜肽，該序列從N端至C端為DPFARSSPRTSMK之序列；寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6為寡胜肽-IIa的N端算起第3個絲胺酸(S)被磷酸化的合成寡胜肽，亦即為DPFARSSPRTpSMK之序列。
以有寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4當作抗原來生產並純化出磷酸化專一性抗體-I，可用以辨識ROCKI S1333位置的磷酸化，來代表ROCKI的蛋白激脢活性；以有寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6當作抗原來生產並純化出磷酸化專一性抗體-II，可用以辨識ROCKII S1366位置的磷酸化，來代表ROCKII的蛋白激脢活性。利用抗體-I與抗體-II可對生物檢體，進行包括細胞或組織的蛋白質萃出液進行西方墨點分析或是固定後的細胞或組織切片進行免疫染色，同時利用有磷酸化的寡胜肽(寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4與寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6)及無磷酸化的寡胜肽(寡胜肽-Ia SEQ ID NO：4與寡胜肽-IIa SEQ ID NO：6)進行免疫中和反應，來確認所得的訊號確實為ROCKI及ROCKII的磷酸化，進而分析該生物檢體中ROCKI及ROCKII各自的活化情形。以加入有磷酸化的寡胜肽及抗體進行反應當作陰性對照組(negative control)，而在加入無磷酸化的寡胜肽及抗體進行反應時若呈現陽性反應，代表該分子有活化，且訊號強度與其活化程度成正比。若呈現陰性反應或其訊號強度與陰性對照組相同時則代表該分子無活化。
上述生物樣本係來自罹患或疑似罹患疾病的個體，且疾病可為但不限於肝腫瘤、乳癌、白血病、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、心血管疾病及/或神經性疾病，此外該個體係為人或其他哺乳類動物，而該生物樣本係為細胞或組織樣本。
上述試劑包括可辨識ROCKI S1333磷酸化之抗體-I、可辨識ROCKII S1366磷酸化之抗體-II、胺基酸序列自N端至C端包含RASPRTLSTRS之合成寡胜肽-Ia SEQ ID NO：3、胺基酸序列自N端 至C端包含RASPRTLpSTRS之合成寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4、胺基酸序列自N端至C端包含DPFARSSPRTSMK之合成寡胜肽-IIa SEQ ID NO：5、胺基酸序列自N端至C端包含DPFARSSPRTpSMK之合成寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6。試劑中的抗體-I、抗體-II寡胜肽-Ia SEQ ID NO：3、寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4、寡胜肽-IIa SEQ ID NO：5與寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6均具有最低有效劑量，使呈現其作用效果。以西方墨點為例，抗體使用濃度約為0.5-2μg/ml，寡胜肽濃度為0.1-1μg/ml；以組織染色為例，抗體使用濃度約為2-5μg/ml，寡胜肽濃度為0.4-2.5μg/ml。
本發明另提出一種用分別以辨識ROCKI及ROCKII之抗體，ROCKI由一胜肽-I序列(SEQ ID NO：1)編碼，其中抗體-I能辨識胜肽-I序列的第1333號位置之絲胺酸之磷酸化；ROCKII由一胜肽-II序列(SEQ ID NO：2)編碼，其中抗體-II能辨識胜肽-II序列的第1366號位置之絲胺酸之磷酸化。
根據上述構想，該抗體包括二個抗原結合區，每一個抗原結合區由輕鏈變異區及重鏈變異區組成，抗體-I結合區能辨識ROCKI序列的第1333號位置之絲胺酸之磷酸化；抗體-II結合區能辨識ROCKII序列的第1366號位置之絲胺酸之磷酸化。
本發明另提出一種偵測生物樣本中ROCKI與ROCKII活化之方法，ROCKI為具有Ser1333之胜肽-I序列(SEQ ID NO：1)，ROCKII為具有Ser1366之胜肽-II序列(SEQ ID NO：2)，該方法包括：(1)提供抗體-I及寡胜肽-Ia SEQ ID NO：3，其中抗體-I能辨識ROCKI Ser1333磷酸化，且寡胜肽-Ia SEQ ID NO：3編碼N端至C端為RASPRTLSTRS之序列；混合抗體-I與寡胜肽-Ia SEQ ID NO：3成為第一混合物；以及將第一混合物加入生物樣本，若產生陽性訊號，表示生物樣本中的ROCKI被活化，且其訊號強度可代表ROCKI之蛋白激脢活性大小；但若產生陰性訊號，則表示生物樣本中的ROCKI未被活化。(2)提供抗體-II及寡胜肽-IIa SEQ ID NO：5，其中抗體-II能辨識ROCKII Ser1366磷酸化，且寡胜肽-IIa SEQ ID NO：5編碼N端至C端為DPFARSSPRTSMK之序列；混合抗體-II 與寡胜肽-IIa SEQ ID NO：5成為第二混合物；以及將第二混合物加入生物樣本，若產生陽性訊號，表示生物樣本中的ROCKII被活化，且其訊號強度可代表ROCKII之蛋白激脢活性大小；但若產生陰性訊號，則表示生物樣本中的ROCKII未被活化。
其中該方法(1)還包括：(3)提供寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4，寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4編碼N端至C端為RASPRTLpSTRS之序列；抗體-I與寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4成為第三混合物；將第三混合物加入生物樣本。由於寡胜肽-Ib序列SEQ ID NO：4的N端起算第2個絲胺酸有被磷酸化，因此會與抗體結合，進而中和抗體，使抗體-I無法辨認生物樣本中被活化的ROCK I，並使結果判斷為陰性訊號。其中該方法(2)還包括(4)提供寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6，寡胜肽-IIb編碼SEQ ID NO：6 N端至C端為DPFARSSPRTpSMK之序列；抗體-II與寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6成為第四混合物；將第四混合物加入生物樣本。由於寡胜肽-IIb序列SEQ ID NO：6的N端起算第3個絲胺酸有被磷酸化，因此會與抗體結合，進而中和抗體，使抗體-II無法辨認生物樣本中被活化的ROCKII，並使結果判斷為陰性訊號。而(3)與(4)之結果則作為本偵測方法的陰性對照組(negative control)。
本發明另提出一種偵測ROCKI與ROCKII酵素活性之方法，ROCKI為具有Ser1333之胜肽-I序列(SEQ ID NO：1)，ROCKII為具有Ser1366之胜肽-II序列(SEQ ID NO：2)，可測定藥物分別對ROCKI與ROCKII蛋白酵素活性的抑制能力，用於篩選ROCKI與ROCKII專一性抑制劑藥物。
本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該些實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。熟習本技藝之人士仍可依據既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該 等實施例皆當屬於本發明之範圍。
實驗方法：
利用QuikChange®定點突變套組(Stratagene)將特定的突變分別導入野生型pEF-myc-ROCKII或pCMV2-flag-ROCKI質體，而形成不同的基因構築物。
一、免疫沈澱法及試管內激酶反應：
在免疫沈澱緩衝液(1% Nonidet P40,5%甘油，50mM Tris/HCl,pH 7.4,150mM NaCl,1mM PMSF及蛋白酶雞尾酒抑制劑)中收集表現myc-ROCKII的細胞。在預先澄清之後，於4℃將細胞萃出液與抗myc抗體或混合60分鐘，並以蛋白質A-瓊脂糖珠(Protein A-agarose beads)沈澱30分鐘。將免疫沈澱物與有或無100μM Y27632(ROCK抑制劑)預先反應，接著在30℃與含有5μCi[γ-32P]ATP的激酶緩衝液(50mM Tris/HCl,pH 7.4,10mM MgCl2,1mM EGTA,0.5mM DTT,5mM NaF,0.1mM Na3VO4及20μM ATP)反應20分鐘。由非轉染細胞的免疫沈澱物(對照組)作為背景值。 以本領域技術人員所熟知西方點漬法及抗myc抗體來偵測myc-ROCKII的蛋白表現量。Flag-ROCKI則以相同方式，以抗flag抗體進行免疫沈澱及西方點漬法。
二、膠體內蛋白水解作用及液相層析-蛋白質譜(LC-MS/MS)鑑定磷酸化位置
根據Tsay et al.,Anal.Biochem.2000.287：55-64所揭示的內容，從膠體上切下對應於myc-ROCKII的蛋白條帶，以供蛋白酶消化作用之用。簡言之，以Lys-C、Arg-C及Asp-N(用於增加序列涵蓋範圍的多重酵素)消化蛋白質，再以0.1%甲酸萃取胜肽。使用安裝有安捷倫1100D HPLC系統的Thermo Finnigan LTQ Orbitrap串聯質譜儀進行電噴灑離子化-離子捕捉-串聯質譜分析。以Tsay et al.,Anal.Biochem.2000.287：55-64所揭示的內容，獲得到沖提物的光譜，以作為掃瞄模式的連續集合，包括：(1)基於沖提條件，在所選擇的離子追蹤上確定磷酸胜肽，(2)藉由撞擊引發誘導作用(CID)實驗以在序列中繪製出磷酸化胺基酸的位置，以及(3)使用所選擇 的離子追蹤法來定量地測定myc-ROCKII蛋白質的磷酸化狀態。
三、製備磷酸根專一性抗體
將含有ROCKI之pSer1333的磷酸寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4與鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)耦合成為抗原，並且將該抗原免疫兔子，收集抗血清，並依序以磷酸胜肽耦合之管柱進行親和性純化，並以非磷酸寡胜肽-Ia SEQ ID NO：3耦合之管柱來去除非抗磷酸化抗體，經過去鹽與濃縮，得到抗專一性pSer1366 ROCKII之多株抗體(抗體-I)。將含有ROCKII之pSer1366的磷酸寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6與鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)耦合成為抗原，並且將該抗原免疫兔子，收集抗血清，並依序以磷酸胜肽耦合之管柱進行親和性純化，並以非磷酸寡胜肽-IIa SEQ ID NO：5耦合之管柱來去除非抗磷酸化抗體，經過去鹽與濃縮，得到抗專一性pSer1366 ROCKII之多株抗體(抗體-II)。
四、免疫組織化學染色：
將乳房組織的腫瘤部分及非腫瘤部分包埋於Tissue-Tek OCTTM化合物中、急速冷凍並且切片為5μm厚的冷凍切片。以4%(w/v)三聚甲醛固定所述切片15分鐘，且置於煮沸的檸檬酸緩衝液中10分鐘。以3%過氧化氫淬熄內生性過氧化酶活性10分鐘，再以TBST緩衝液中的5.5%(v/v)正常山羊血清進行阻斷。之後在有或無磷酸寡胜肽或非磷酸寡胜肽(0.5μg/ml)的情況下，將切片與抗pSer1366 ROCKII之初級抗體(1：200倍稀釋；5μg/ml)混合培養。在廣泛的清洗後，將切片與耦合辣根過氧化氫酶(HRP)之抗兔子抗體混合培養，之後以二氨基聯苯胺(DAB)呈色3分鐘。以蘇木精來逆染色切片，之後脫水並加以封片。
實驗結果：
在HEK-293T細胞過度表現的myc-ROCKII蛋白質經免疫沈澱法以及在有或無ROCK抑制劑Y27632存在下，接受含有[γ-32P]ATP的試管內激酶反應。放射性標定的ROCKII被偵測出來，且ROCK抑制劑Y27632會阻斷ROCKII磷酸化訊號，表示本發明的ROCK蛋白質發生自體磷酸化。為了確定磷酸化位置，經免疫 沈澱之ROCKII與非放射性的ATP進行激酶反應，接著以SDS/PAGE將蛋白質分離後，將對應於myc-ROCKII之蛋白條帶以Lys-C、Arg-C或Asp-N進行膠內蛋白水解脢消化反應，以增加用於LC-MS/MS分析的全部序列的涵蓋範圍(78.3%)。發現到三個對Y27632敏感的磷酸胜肽。由質譜上發現碎裂的胜肽練質量數增加的79.96Da，由分子量判斷出有三個可能位置，分別是：Thr1365/Ser1366、Ser1374或Ser1379發生單磷酸化(結果未顯示)。
接著，測定myc-ROCKII的Thr1365、Ser1366、Ser1374及Ser1379磷酸化突變為丙胺酸的情形。請參閱第1圖，第1A圖為野生型(wild-type,WT)及突變株(T1365A、S1366A、S1374A、S1379A、四個位置均突變的4A)之myc-ROCKII磷酸化32p標示之自動放射顯影及myc-ROCKII西方點漬(Western blot,WB)表現示意圖。以及flag-ROCKI野生型(wild-type,WT)及突變株(S1333A)之磷酸化32p標示之自動放射顯影及西方點漬表現示意圖。第1B圖為myc-ROCKII野生型(wild-type,WT)及突變株之相對磷酸化比較柱狀圖。S1366A的突變株(即胜肽第1366號之絲胺酸突變為丙胺酸)顯著地降低[γ-32P]ATP標定的強度，但在T1365A突變株沒有影響。而在Ser1374或Ser1379的突變(分別為S1374A及S1379A)皆降低了放射性標定強度，但降低程度並不如S1366A突變株。這四個胺基酸位置均突變為丙胺酸的突變株(4A)幾乎完全終止了myc-ROCKII上的放射性標定訊號。因此，ROCKII在Ser1366、Ser1374及Ser1379發生自動磷酸化，而最強的磷酸化發生在Ser1366。
為了測定ROCKII S1366的磷酸化是否為生物材料中活化的ROCKII的標記，我們製備出可抗pSer1366 ROCKII(anti-pSer1366 ROCKII)的抗體-II，其中，抗體-II可利用西方點漬法來偵測經免疫沈澱之野生型myc-ROCKII試管內(in vitro)的自體磷酸化，而不會偵測到S1366A myc-ROCKII，而且前述自體磷酸化的訊號會被磷酸寡胜肽-IIb中和掉，但不會被非磷酸寡胜肽-IIa SEQ ID NO：5中和(第2A圖)。同時我們也製備出可抗pSer1333 ROCKI(anti-pSer1333 ROCKI)的抗體-I，其可利用西方點漬法來偵測經免 疫沈澱之野生型flag-ROCKI試管內(in vitro)的自體磷酸化，而不會偵測到S1333A flag-ROCKI，而且前述自體磷酸化的訊號會被磷酸寡胜肽-Ib中和掉，但不會被非磷酸寡胜肽-Ia SEQ ID NO：3中和(第2B圖)。
將myc-ROCKII免疫沈澱處理λ蛋白去磷酸酶(λPPase)進行去磷酸反應後，可以阻斷抗體-II偵測的訊號(第3圖)，表示其對於偵測的ROCKII具有磷酸化的專一性。再者，細胞經Y27632(ROCK抑制劑)處理後，pSer1366 myc-ROCKII的訊號強度顯著降低(第4圖)。因此，ROCKII Ser1366的磷酸化在活化的ROCKII具有指標性。
接著，響應於細胞中的RhoA的活化可導致ROCKs的活化，我們測試內生性ROCKII上的Ser1366磷酸化以及ROCKI上的Ser1333磷酸化是否被偵測出來。請參閱第5圖，我們將綠螢光蛋白標示的RhoA：持續活化態的GFP-RhoAV14、持續活化但與ROCKs交互作用有缺陷的GFP-RhoAV14E40L(Sahai et al.,EMBO J.1998,17：1350-1361.)、顯性無效形式的GFP-RhoAN19、以及綠螢光蛋白當作對照組轉染使表現於HEK-293T細胞，將細胞蛋白萃出液晶電泳後進行西方點漬分析，以抗體-II偵測的結果顯示表現GFP-RhoAV14的細胞中其ROCKII的Ser1366磷酸化程度增高，而轉染GFP-RhoAV14E40L及GFP-RhoAN19則無ROCKII的Ser1366磷酸化增強的情形(第5A圖)。以抗體-I偵測的結果顯示ROCKI的Ser1333磷酸化程度改變也確實受到RhoA活化而增強(第5B圖)。從這些結果顯示，內生性ROCKI與ROCKII在細胞內活化的情形確實可以分別以抗體-I與抗體-II偵測。
除了以上的人類細胞實驗，本發明還在動物細胞研究ROCKII的Ser1366磷酸化表現量。將小鼠胚胎纖維母細胞培養於無血清之培養基24小時，再於有或無Y27632(10μM)條件下，以有絲分裂抑制劑nocodazole(10μM)處理(nocodazole會造成Rho A活化)，發現在無Y27632(10μM)處理的條件下，ROCKII Ser1366磷酸化的訊號會增強，以及ROCKII調控之下游蛋白肌凝蛋白輕鏈的磷酸化訊號亦有明顯增強(第6A圖)，而前述磷酸化訊號增強的現 象，則在給予ROCK抑制劑Y27632(10μM)後消失。同樣地，ROCKI的活化情形也可以被偵測到(第6B圖)。由此可見，細胞中ROCK II Ser1366磷酸化的程度可以反映RhoA調控的ROCK II活化情形，而ROCK I Ser1333磷酸化的程度可以反映RhoA調控的ROCK I活化情形。
接著，以抗pSer1366 ROCKII抗體-II來測定是否能偵測到ROCK II Ser1366磷酸化。請參閱第7圖的免疫組織化學染色圖譜，在人類乳房病患腫瘤組織檢體中，以抗pSer1366 ROCKII抗體-II偵測到ROCKII Ser1366磷酸化訊號(棕色)。而磷酸化訊號可藉由與磷酸化寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6(在Ser1366處磷酸化，DPFARSSPRTpSMK)的競爭而阻斷，表示抗pSer1366 ROCKII抗體與ROCK II Ser1366磷酸化之間的專一性。因此，抗pSer1366 ROCKII抗體可作為評估檢體的ROCKII活化的工具。
本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。
所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。
第1圖為myc-ROCKII的野生型跟突變株以及flag-ROCKI的野生型跟突變株在HEK-293T細胞表現後進行試管內(in vitro)蛋白質激脢反應，以放射線標定之自動放射顯影示意圖。
第2圖(A)為抗pSer1366 ROCKII抗體-II辨識磷酸化ROCKII蛋白能力示意圖。野生型或S1366A突變型myc-ROCKII表現構築載體轉染HEK-293T細胞後抽取得到myc-ROCKII蛋白，以抗myc抗體對myc-ROCKII蛋白進行免疫沈澱，於添加無磷酸化寡胜肽-IIa SEQ ID NO：5與磷酸化寡胜肽-IIb SEQ ID NO：6(0.2μg/ml)作 為競爭的情況下，以抗體-II(1μg/ml)探測myc-ROCKII蛋白SI366磷酸化的情形。(B)為抗pSer1333 ROCKI抗體-I辨識磷酸化ROCKI蛋白能力示意圖。野生型或S1366A突變型flag-ROCKI表現構築載體轉染HEK-293T細胞後抽取得到flag-ROCKI蛋白，以抗flag抗體對flag-ROCKI蛋白進行免疫沈澱，於添加無磷酸化寡胜肽-Ia SEQ ID NO：3與磷酸化寡胜肽-Ib SEQ ID NO：4(0.2μg/ml)作為競爭的情況下，以抗體-I(1μg/ml)探測myc-ROCKII蛋白S1366磷酸化的情形。
第3圖為野生型myc-ROCKII免疫沈澱物在有或無λPPase情形下於30℃作用20分鐘後，再進行SDS-PAGE及西方點漬法的蛋白表現示意圖。
第4圖為經myc-ROCKII表現構築載體轉染之HEK-293T細胞以有或無ROCK抑制劑Y27632(20μM)處理2小時進行免疫成澱之西方點漬法的蛋白表現示意圖。
第5圖為GFP、GFP-RhoAV14、GFP-RhoAV14E40L或GFP-RhoAN19表現構築載體轉染HEK-293T細胞之蛋白萃出物以(A)抗體-II及(B)抗體-I進行西方點漬法表現示意圖。
第6圖為正常MEF在無血清培養基中培養24小時後，再於有或無Y27632(10μM)條件下以有絲分裂抑制劑nocodazole(10μM)刺激細胞之蛋白萃出物以(A)抗體-II及(B)抗體-I西方點漬法表現示意圖。
第7圖為在人類乳房腫瘤中之ROCKII Ser1366磷酸化示意圖。來自兩個乳癌病患的腫瘤部分及非腫瘤部分組織進行切片，並在磷酸化寡胜肽-IIb SEQ ID NO：5或無磷酸化寡胜肽-IIa SEQ ID NO：6存在下，以抗pSer1366 ROCKII抗體辨識。正常兔子IgG為陰性反應控制組。#1為淋巴結陰性，#2為淋巴結陽性。
<110> 國立陽明大學
<120> 偵測ROCKII活化之試劑
<130> 2012RDPA004
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1354
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Rho-associated protein kinase 1(ROCKI)
<210> 2
<211> 1388
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<223> Rho-associated protein kinase 2(ROCKII)
<400> 2
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> oligopeptide-Ia
<400> 3
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> oligopeptide-Ib
<400> 4
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> oligopeptide-IIa
<400> 5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> oligopeptide-IIb
<400> 6

Claims (12)

  1. 一種用於偵測一生物樣本中一Rho相關蛋白質激酶II(ROCKII)之活化之試劑，該ROCKII係包括SEQID NO：2，其中該試劑包括一抗體-II，該抗體-II係與SEQID NO：2的第1366號位置之磷酸化絲胺酸產生專一性鍵結並且不與SEQID NO：2的第1366號位置之未磷酸化絲胺酸產生專一性鍵結，進一步地該抗體-II之抗原為SEQID NO：6。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的試劑，其中該胜肽-II序列具有SEQID NO：5序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的試劑，其中SEQID NO：6為SEQID NO：5序列的該N端起算第3個絲胺酸(S)被磷酸化。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的試劑，其中該生物樣本係來自一個體，該個體罹患或疑似罹患一疾病，且該疾病係選自由肝腫瘤、乳癌、白血病、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、心血管疾病、神經性疾病及其組合所組成的群組其中之一。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的試劑，其中該個體係為人或人以外之其他哺乳類動物。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的試劑，其中該試劑還包括：一寡胜肽-IIa為SEQID NO：5，具有N端至C端為DPFARSSPRTSMK之序列；以及一寡胜肽-IIb為SEQID NO：6，具有N端至C端為DPFARSSPRTpSMK之序列。
  7. 一種用以辨識一Rho相關蛋白質激酶II(ROCKII)之抗體-II，該ROCKII係包括SEQ ID NO：2，其中該抗體-II與SEQID NO：2的第1366號位置之磷酸化絲胺酸產生專一性鍵結並且不與SEQID NO：2的第1366號位置之未磷酸化絲胺酸產生專一性鍵結，進一步地該抗體-II之抗原為SEQ ID NO：6。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之抗體-II，其中該抗體-II包括一抗原結 合區，該抗原結合區可辨識SEQID NO：6。
  9. 一種偵測一生物樣本中Rho相關蛋白質激酶II(ROCKII)之活化之方法，該ROCKII具有第1366號位置為絲胺酸之一胜肽-II序列，該方法包括：(a)提供一抗體-II及一寡胜肽-IIa SEQID NO：5，其中該抗體與SEQID NO：2的第1366號位置的磷酸化絲胺酸產生專一性鍵結並且不與SEQID NO：2的第1366號位置之未磷酸化絲胺酸產生專一性鍵結，進一步地該抗體-II之抗原為SEQ ID NO：6，且該寡胜肽-IIa SEQID NO：5的N端至C端為DPFARSSPRTSMK之序列；(b)混合該抗體-II與該寡胜肽-IIa SEQID NO：5成為一第二混合物；以及(c)將該第二混合物加入該生物樣本，若產生陽性訊號，表示該生物樣本中該ROCKII被活化，且若產生陰性訊號，表示該生物樣本中該ROCKII未被活化。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該步驟(a)還包括：(a1)提供一寡胜肽-IIb SEQID NO：6，該寡胜肽-IIb SEQID NO：6 N端至C端為DPFARSSPRTpSMK之序列；(a2)混合該抗體-II與該寡胜肽-IIb SEQID NO：6成為一第四混合物；以及(a3)將該第四混合物加入該生物樣本，並判斷為陰性訊號，作為該方法之陰性對照組(negative control)。
  11. 如申請專利範圍第1項、第9項所述之試劑或方法，可應用於評估該ROCKII之酵素活性，或ROCKII專一性抑制劑之藥物篩選。
  12. 如申請專利範圍第1項、第7項或第9項所述的試劑、抗體或方法，其中該胜肽-II序列為SEQ ID NO：2。
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