TWI450963B

TWI450963B - 具高木醣消耗率之分離酵母菌株及使用該菌株製造酒精之方法

Info

Publication number: TWI450963B
Application number: TW101135655A
Authority: TW
Inventors: Yu Chuan Chuang; Shiou Hung Tsai
Original assignee: Far Eastern New Century Corp
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2014-09-01
Also published as: TW201412980A; CN103695329A; CN103695329B

Description

具高木醣消耗率之分離酵母菌株及使用該菌株製造酒精之方法

本發明係關於具有高木糖消耗率之分離酵母菌株及產生乙醇之發酵方法。具體而言，本發明提供具有高木糖消耗率之酵母屬(Saccharomyces )菌株。

過去數十年間對傳統石化燃料(以石油為主之燃料)之大規模消費已付出了很高代價並造成大量污染。而且，人們已認識到世界石油儲量並非無窮無盡，且隨著環境意識逐漸成長，已刺激人們開始研究替代性燃料之可行性，例如纖維乙醇，其可降低CO₂ 產生。

目前用於產生乙醇之方法包括以下操作階段：(a)使適當原材料發酵以獲得發酵產物及(b)蒸餾藉由發酵獲得之產物，藉此產生乙醇。目前主要使用屬於酵母屬(Saccharomyces) 之酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )作為乙醇發酵之種菌。釀酒酵母細胞為圓形到卵形，直徑為5-10微米且可有效利用己糖，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖等。上文所提及之發酵方法包括在含有氮源、碳源及微量元素等之培養基中接種釀酒酵母且在適當條件下進行發酵，且其涉及化學反應：C₆ H₁₂ O₆ → 2 CH₃ CH₂ OH+2 CO₂ 。

可使用各種生質原料進行酒精生產。用於經由發酵製造乙醇之多種多樣之原材料可方便地分類為三種類型之農業原材料：糖、澱粉及木質纖維素材料。儘管生質乙醇可藉由多種不同來源獲得之糖或澱粉發酵來產生，但迄今為止，用於工業規模生產燃料酒精之受質係蔗糖及玉米澱粉。使用糖或澱粉來生產乙醇之技術已發展成熟；然而，該等受質成本高，其可能與食品供應競爭且自該等來源生產乙醇不足以滿足未來對燃料工業之需求。因此，業內對自木質纖維素生產乙醇之興趣逐漸增加。由於木質纖維素可再生，資源豐富，不會與食品供應競爭且可以相對較低之成本獲得，所以木質纖維素係諸如玉米粒等其他乙醇原料之合意替代品。擴大燃料乙醇生產要求使用較低成本之原料。目前，僅木質纖維素原料可自植物生物質獲得足夠數量來代替用於生產乙醇之作物。木質纖維素材料中之主要可發酵糖係葡萄糖及木糖，其分別佔木質纖維素之約40%及25%。

然而，大多數能進行酒精發酵之酵母(如釀酒酵母)不能使用木糖作為碳源。工業為了能自木質纖維素水解產物生產乙醇，需要具有該等特性之生物體。科學家利用遺傳技術或菌株馴化來改良用於產生乙醇之酵母或細菌之木糖發酵。US 5789210提供能有效使單獨之木糖發酵或同時使木糖與葡萄糖發酵之酵母菌株，其可使用重組DNA及基因選殖技術來產生，且該等技術已用於產生含有選殖木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XD)及木酮糖激酶(XK)基因之重組酵母，該等基因與不受葡萄糖之存在抑制之啟動子融合。US 6582944係關於經木糖還原酶及/或木糖醇脫氫酶基因轉化之新穎重組酵母菌株，其能將木糖還原為木糖醇並因此能在活體內產生木糖醇。Bjorn等人提供酵母菌株TMB 3001，其藉由用木糖還原酶及/或木糖醇脫氫酶基因轉化來解決不能代謝木糖以產生乙醇的問題(Biorn J 、Barbel HH.The non-oxidative pentose phosphate pathway controls the fermentation rate of xylose but not of xylose in TMB 3001,2002,FEMS Yeast Research 2：227-282 )。然而，其仍具有木糖消耗率低(0.13克(g)木糖/克生物質/小時)及乙醇產率低(0.15克產物/克所消耗木糖)等問題。為解決該等問題，Johansson等人另外將轉醛醇酶基因轉化至釀酒酵母中以獲得新菌株TMB 3026，其可將木糖消耗率自0.12提高至0.23。(Biorn J、Barbel HH.The non-oxidative pentose phosphate pathway controls the fermentation rate of xylose but not of xylose in TMB 3001,2002,FEMS Yeast Research 2：227-282 )；然而，仍未滿足對工業生產之要求。Kaisa等人另外產生經轉化酵母TMB 3057，其改良木糖還原酶和/或木糖醇脫氫酶以及缺失之醛糖還原酶基因(GR3)之基因表現，從而提高乙醇產率並降低木糖醇副產物之形成(Kaisa K、Romain F、Barbel HH、Marie GG.High activity of xylose reductase and xylitol dehydrogenase improves xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae,2007,Appl.Microbiol.Biotechnol.73：1039-1046 )。然而，此菌株仍具有木糖消耗率低(0.25克木糖/克生物質/小時)及乙醇產率低(0.27克產物/克所消耗木糖)之問題。此外，Elizebath等人使用基因經修飾之酵母424A(LNH-ST)，其經粗糙鏈孢黴(N.crassa )及近平滑假絲酵母(C. parapsilosis )之木糖還原酶基因以及樹幹畢赤酵母(P.stipitis )之木糖醇脫氫酶基因轉化且具有三個胺基酸之優化密碼子(Eliabeth C、Miroslav S.、Nancy W YH、Nathan SM，Effect of acetic acid and pH on the cofermentation of glucose and xylose to ethanol by a genetically engineered strain of Saccharomyces cerevisiae,2010,FEMS Yeast Res.10：385-393 )。此菌株亦利用GAPDH啟動子來控制TKL 1、TAL 1、RKL 1及RPE 1之磷酸戊糖途徑。然而，其仍具有以下問題：木糖消耗率低(在pH5下0.27克木糖/克生物質/小時)及乙醇產率低(0.785克產物/克所消耗木糖)及對乙酸之耐受性低(在培養基含有1克/升(g/L)乙酸時，木糖消耗率自0.354降低至0.15)。

因此，業內非常需要生物質(例如木糖)至乙醇之轉化率改良之菌株及較高產率產生乙醇之方法。

本發明提供分離酵母菌株，其木糖消耗率高於1.1克木糖/克生物質/小時且包含一或多種得自DSMZ寄存編號25508之釀酒酵母菌株FENC-000(2011年11月8日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920077)之木糖代謝基因。

本發明另外提供產生乙醇之方法，其包含以下步驟：(a)在適宜發酵條件下用本發明之分離酵母菌株使含有木糖或葡萄糖來源之培養基發酵；及(b)自該培養基回收乙醇。

本發明利用選殖及轉化技術以及突變及菌株馴化技術來獲得具有高木糖消耗率及乙醇產率之酵母。用於本發明中之選殖及轉化可將木糖代謝基因轉化至酵母中以解決一些酵母菌株無法利用木糖產生乙醇之問題。用於本發明中之突變及菌株馴化可提高木糖消耗率及乙醇產率以解決消耗率及產率低之問題。藉由組合上文所提及之技術手段，本發明令人意外地獲得具有高木糖消耗率及乙醇產率之突變株。

提供以下術語及方法之解釋以更好地闡述本發明並引導熟習此項技術者實踐本發明。除非上下文明確指示其他含義，否則本文所用「包含」意指「包括」且單數形式「一(a或an)」或「該」包括複數含義。除非上下文明確指示其他含義，否則術語「或」係指所述二選一要素或兩個或更多個要素之組合中之單一要素。

除非另有解釋，否則本文所用所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所瞭解相同之意義。儘管在本發明之實踐或測試中可使用與本文所述方法及材料類似或等效之方法及材料，但下文仍闡述適宜之方法及材料。材料、方法及實例僅具有說明性而不意欲進行限制。根據以下詳細說明及申請專利範圍可瞭解本發明之其他特徵。

本文所用術語「產率」係指相較於起始材料之量，所產生產物的量。

本文所用術語「菌株」係指具有一般特徵之特定物種之微生物。除非指示相反含義，否則術語「菌株」與「細胞」在本文中可互換使用。如熟習此項技術者可瞭解，微生物菌株係由個別酵母細胞組成。另外，個別微生物細胞具有特定特徵，該特徵可將該等細胞鑑別為其特定菌株之成員。

本文所用術語「母株」係指經受誘變以產生本發明微生物之微生物菌株。因此，片語「母株」之使用並不一定等同於片語「野生型」或提供關於所提及菌株之歷史之資訊。

本文所用術語「突變」係指核酸分子中之插入、缺失或取代。

本文所用術語「誘變」係指藉助其可在生物體之遺傳材料(例如DNA)中產生一個或一個以上突變之方法。使用「隨機」誘變時，無法預測確切突變位點，其出現於微生物染色體中之任何位置。

本文所用片語「誘變循環」一般係指用誘變劑或誘變劑之組合處理細胞，之後培養該等細胞以使存活細胞可繁殖。在多種情形下，將在每一誘變循環後篩選經誘變細胞，以鑑別彼等具有特定特徵之細胞。另外，作為誘變循環之一部分，可在誘變後即刻或在仍暴露於誘變劑中時使經誘變劑處理之細胞暴露於選擇劑或選擇培養基中。

本文所用術語「適宜發酵條件」一般係指可以調節pH、溫度、通氣量等之發酵培養基及條件，較佳地，最適條件使得微生物可產生所需之含碳產物。為確定培養條件是否允許產生產物，可將微生物在接種後培養約24小時至一週，且可獲得並分析樣品。在有細胞生長之樣品或培養基中測試所需產物之存在。

根據上述說明，本發明提供分離酵母菌株，其木糖消耗率高於1.1克木糖/克生物質/小時，且包含一或多種得自DSMZ寄存編號25508 之釀酒酵母菌株FENC-000之木糖代謝基因。在一較佳實施例中，分離酵母菌株係DSMZ寄存編號25508 之釀酒酵母FENC-000之分離菌株。

在一實施例中，本發明酵母菌株展現高木糖消耗率；較佳地高於1.1克木糖/克生物質/小時。更佳地，木糖消耗率高於1.5克木糖/克生物質/小時。

根據本發明，本發明酵母菌株包括(但不限於)酵母屬菌株、克魯維酵母屬(Kluyveromyces )菌株、畢赤酵母屬(Pichia )菌株及假絲酵母屬(Candida)菌株。更佳地，本發明酵母菌株包括(但不限於)釀酒酵母菌株、卡爾斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis )菌株、博伊丁酵母(Saccharomyces bulderi )菌株、巴尼特酵母(Saccharomyces barnetti )菌株、少孢酵母(Saccharomyces exiguus )菌株、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum )菌株、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus )菌株、卡爾斯伯酵母菌株、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis )菌株、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus )菌株、真菌克魯維酵母(Kluyveromyces fungus )菌株、樹幹畢赤酵母(Pichia stipitis )菌株、星形假絲酵母(Candida stellata )菌株及休哈塔假絲酵母(Candida shehatae )菌株。最佳地，本發明提供具有DSMZ寄存編號25508 之釀酒酵母FENC-000之分離菌株。

木糖係可由多種生物體分解代謝或代謝為可用產物之五碳醛糖(戊糖，單糖)。根據本發明，木糖代謝基因包括一或多種選自由以下組成之群之基因：木糖還原酶基因、木糖醇脫氫酶基因、木酮糖激酶基因及木糖異構酶。

根據本發明，本發明酵母菌株係基於遺傳選殖、轉化、誘變、誘變循環及菌株馴化來產生。在一實施例中，本發明酵母菌株係藉由選殖木糖代謝基因及將該等基因轉化至母株中以獲得經轉化菌株來產生。可構築載有抗生素抗性標記基因(例如kan，其編碼卡那黴素(kanomycin)抗性)之質粒並使用其作為載體來將合意木糖代謝基因遞送至染色體中。木糖代謝基因可藉由用適宜限制性酶消化來分離並將其純化，且隨後藉由轉化或電穿孔將其引入宿主細胞中。在本發明一實施例中，釀酒酵母BCRC 22743係用於轉化之宿主。

之後，用誘變劑使經轉化菌株突變。本發明並不限於展現高木糖消耗率及乙醇產率之細胞。換言之，本發明包括特徵為在培養生長指定時間段後能高速消耗木糖之細胞。在具體實施例中，本發明菌株係藉由以下方式來產生：使染色體上含有相關木糖代謝基因之酵母細胞在非天然啟動子控制下經受1個、2個、3個、4個、5個或更多個誘變後篩選之循環，以鑑別顯示高木糖消耗率之細胞。

業內已知眾多進行誘變之方法且其可用於產生本發明細菌菌株。一般而言，該等方法涉及使用化學試劑或輻射來誘導突變。用於誘變程序中之化學化合物類別之實例包括(但不限於)甲磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N-亞硝基脲N-亞硝基-N,N-二乙胺(NDEA)及N-乙基-N'-硝基-N-亞硝基胍(ENNG)、羥胺、亞硫酸氫鹽及硝基呋喃(例如7-甲氧基-2-硝基萘并[2,1-p]呋喃)，業內已知其可誘導核酸分子突變。熟習此項技術者可瞭解如何調節誘變劑之濃度及/或特定條件以達成合意突變率。

在細胞經過誘變後，可對其進行篩選以確定其是否具有如本發明所述之特定特徵。該特徵之實例包括高木糖消耗率及乙醇產率。本發明菌株可藉由使用多個誘變及篩選之循環來產生。在每次誘變處理後，可針對提高之木糖消耗率篩選經誘變細胞。

根據上述說明，本發明提供產生乙醇之方法，其包含以下步驟：(a)在適宜發酵條件下用本發明之分離酵母菌株使含有木糖或葡萄糖來源之培養基發酵；及(b)自該培養基回收乙醇。

根據本發明，使用本發明之分離酵母菌株來使包含木糖或葡萄糖來源之碳源發酵。木糖或葡萄糖來源可為木糖或葡萄糖本身或可為包含木糖或葡萄糖單元之任何碳水化合物寡聚物或聚合物，例如木質纖維素、木聚糖、纖維素、澱粉及諸如此類。對於自該等碳水化合物釋放木糖或葡萄糖單元，可將適當碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、澱粉酶及諸如此類)添加至發酵培養基中，或可藉由經轉化宿主細胞來產生該等酶。在後一情形下，經轉化宿主細胞可經遺傳改造以產生並分泌該等碳水化合物酶。在一較佳方法中，經轉化宿主細胞使木糖及葡萄糖二者發酵。除了作為碳源之木糖(及葡萄糖)來源外，發酵培養基可另外包含經轉化宿主細胞生長所需之適當成份；例如業內非常熟悉用於諸如酵母等微生物生長之發酵培養基之組合物。

發酵方法係用於產生諸如以下等發酵產物之方法：乙醇、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙烯酸、檸檬酸、3-羥基-丙酸、胺基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、β-內醯胺抗生素(例如青黴素G(Penicillin G)或青黴素V及其發酵衍生物)及頭孢菌素。發酵方法可為好氧或厭氧發酵方法。厭氧發酵方法在本文中定義為不存在氧之情況下運行或實質上不耗氧(例如小於5 mmol/L/h)之發酵方法，且其中有機分子用作電子供體及電子受體二者。於不存在氧之情況下，無法藉由氧化磷酸化來氧化在糖酵解及生物質形成中產生之NADH。為解決此問題，許多微生物使用丙酮酸鹽或其衍生物中之一種作為電子及氫受體，由此使NAD+再生。因此，在較佳厭氧發酵方法中，使用丙酮酸鹽作為電子(及氫受體)且將其還原為諸如以下等發酵產物：乙醇、乳酸、1,3-丙二醇、乙烯、乙酸或琥珀酸。

發酵方法較佳地在最適於轉化宿主細胞生長之溫度下進行。因此，對於大多數酵母，在低於38℃之溫度下實施發酵方法。對於酵母或絲狀真菌宿主細胞，較佳地在低於37、36、35、34、33、32、31、30、29或28℃之溫度下，且在高於20、21、22、23、24或25℃之溫度下實施發酵方法。

根據本發明，在該方法中，乙醇容積生產率較佳地為至少0.6克乙醇/升/小時；較佳地至少0.7克乙醇/升/小時、0.8克乙醇/升/小時、0.9克乙醇/升/小時、1.0克乙醇/升/小時、1.1克乙醇/升/小時、1.5克乙醇/升/小時、2.0克乙醇/升/小時、2.5克乙醇/升/小時、3.0克乙醇/升/小時、3.5克乙醇/升/小時、4.0克乙醇/升/小時、4.5克乙醇/升/小時或5.0克乙醇/升/小時；更佳地約0.6克乙醇/升/小時至約2.5克乙醇/升/小時，或約1.0克乙醇/升/小時至約3.0克乙醇/升/小時。在方法中基於木糖及/或葡萄糖之乙醇產率較佳地為至少50%、60%、70%、80%、90%、95或98%。

分離酵母菌株具有意外之木糖消耗率及高乙醇產率，因此該酵母菌株有利於藉由發酵方法產生乙醇。

實例 實例1 木糖代謝基因之選殖及重組質粒之構築

培養30個得自食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)之野生型釀酒酵母菌株並使用含有10%乙醇之SX培養基進行選擇，且選擇一個對高含量乙醇具有高耐受性之菌株，即釀酒酵母BCRC 22743。在以下條件下使用聚合酶鏈式反應(PCR)來選殖以下基因：

1. pGK啟動子

長度：643 bp

類型：DNA

原始菌株：釀酒酵母

基因注釋：pGK啟動子

正向引子：GACTACGCATGCGGCGCGAATCCTTTATTTTGGCTTC(SEQ ID NO：1)

反向引子：TGAATTACTGAACACAACATTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG(SEQ ID NO：2)

2.木糖還原酶

長度：957 bp

類型：DNA

原始菌株：樹幹畢赤酵母

基因注釋：木糖還原酶

正向引子：AAAACAATGCCTTCTATTAAGTTGAACTCT(SEQ ID NO：3)

反向引子：CAATTCAATTCAATTTAGACGAAGATAGGAATCTTGTC(SEQ ID NO：4)

3.木糖醇脫氫酶

長度：1,092 bp

類型：DNA

原始菌株：樹幹畢赤酵母

基因注釋：木糖醇脫氫酶

正向引子：GACTACGCGGCCGCGGCGCGAATCCTTTATTTTGGCTTC(SEQ ID NO：5)

反向引子：AAGGAAGGGTTAGCAGTCATTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAG(SEQ ID NO：6)

4.木酮糖激酶

長度：1,803 bp

類型：DNA

原始菌株：釀酒酵母

基因注釋：木酮糖激酶

正向引子：AAAACAATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAG(SEQ ID NO：7)

反向引子：CAATTCAATTCAATTTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTCG(SEQ ID NO：8)

5. pGK終止子

長度：433 bp

類型：DNA

原始菌株：釀酒酵母

基因注釋：pGK終止子

正向引子：GACTCTCATCTAAATTGAATTGAATTGAAATCGATAG(SEQ ID NO：9)

反向引子：TAGAGTCCCGGGAGTCTGCTCGAGGAGATGCGGCCGCGACTTTTTTTGTTGCAAGTGGGAT(SEQ ID NO：10)

使用業內已知之遺傳改造技術將經選殖基因引入pAUR101質粒中以構築重組載體(Li L、Shuqiu C、Anja J VB、Eric BK.Rad51p and Rad54p,but not Rap52p,elevate gene repair in Saccharomyces cerevisiae directed by modified single-stranded oligonucleotide vectors,2002,Nucleic Acids Research 30：2742-2750 )。處理釀酒酵母BCRC 22743以形成勝任細胞且用重組載體轉化，從而使得可將木糖還原酶、木糖醇脫氫酶及木酮糖激酶基因引入釀酒酵母BCRC 22743之基因組DNA中。選擇所得轉化株以獲得能使用木糖並產生乙醇之經轉化菌株。

實例2 所選轉化株之木糖代謝及乙醇產生

根據實例1中所述之程序，自超過1,000個釀酒酵母轉化株中選擇5個能使用木糖並產生乙醇之經轉化菌株，並將其命名為釀酒酵母RG 352、釀酒酵母RG 758、釀酒酵母RG 316、釀酒酵母RG 527及釀酒酵母RG 589。在所選菌株中，釀酒酵母RG 589能在5% SX培養基中產生最高乙醇濃度(16 g/L)且達成0.21 g木糖/g生物質/小時之木糖消耗率。然而，上文所提及之結果優於菌株TMB 3001，但與菌株TMB 3026、TMB 3057及424A(LNH-ST)無顯著差異。木糖消耗率之比較示於圖1中。

實例3 釀酒酵母RG 589突變株之製備

用甲磺酸乙酯(EMS)溶液將釀酒酵母RG 589細胞處理20分鐘以獲得突變株。將所得溶液離心並移除上清液。將殘留細胞沈澱塊用0.1 M磷酸鹽緩衝液(pH 6)洗滌兩次。經過適當稀釋後，將細胞接種於5% SX培養基(4.7 g/L酵母氮源基礎及50 g/L木糖)中並在30℃及200 rpm振盪下培養。若在50 g/L木糖濃度下培養之突變株可利用木糖來維持、生長、代謝並產生乙醇，則其使用木糖之能力更佳。在50 g/L木糖濃度下將突變株培養三天後，取出突變株且隨後依上文所提及之突變及培養方法進行二十次。將所得突變株平鋪於SX培養基板上以供突變株選擇。在兩天後，選擇快速生長之突變株並命名為釀酒酵母FENC-000，其寄存在德國微生物菌種寄存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)，寄存編號為25508 。在將所選突變株用SX 5%培養基在30℃及200 rpm振盪下培養24小時後，木糖消耗率達至1.54 g木糖/g生物質/小時，其為RG 589及424A(LNH-ST)之5倍至7.14倍。結果展示於圖2中。

實例4 使用釀酒酵母FENC-000之乙醇產生及比較產率

在30℃及200 rpm振盪下用與一種或兩種碳源混合之SX培養基培養實例3中提及之釀酒酵母FENC-000(即DSMZ 25508)及實例2中提及之釀酒酵母RG 589。乙醇產率展示於下表中。

釀酒酵母FENC-000在使用50 g/L木糖時，其乙醇產率為釀酒酵母RG 589的1.3倍。對於使用兩種糖作為碳源，釀酒酵母FENC-000的乙醇產率分別為RG 589及TMB 3001的約1.394倍及2倍。

圖1顯示實例2中所提及不同菌株之木糖消耗率。

圖2顯示實例3中所提及釀酒酵母突變株之木糖消耗率。

<110> 遠東新世紀股份有限公司

<120> 具有高木糖消耗率之分離酵母菌株及使用該菌株產生乙醇之方法

<130> F00734/US2207

<140> 101135655

<141> 2012/09/27

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物

<400> 4

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

<210> 6

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<212> DNA

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<220>

<223> 引物

<400> 6

<210> 7

<211> 29

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<223> 引物

<400> 7

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<220>

<223> 引物

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<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

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Claims

一種具有DSMZ寄存編號25508 之釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )FENC-000之分離菌株(2011年11月8日寄存於食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920077)。
如請求項1之分離菌株，其具有選自由以下組成之群之木糖代謝基因：木糖還原酶基因、木糖醇脫氫酶基因及木酮糖激酶基因。
如請求項1之分離菌株，其係藉由以下方式獲得：選殖一或多種木糖代謝基因，將該基因轉化至宿主酵母菌株中，用誘變劑使所得菌株突變且選擇木糖消耗率高於1.1克木糖/克生物質/小時之酵母菌株。
如請求項1之分離菌株，其可產生乙醇。
一種產生乙醇之方法，其包含以下步驟：(a)在適宜發酵條件下，使用如請求項1之分離菌株使含有木糖或葡萄糖來源之培養基發酵；及(b)自該培養基回收該乙醇。
如請求項5之方法，其中該來源係包含木糖或葡萄糖單元之碳水化合物寡聚物或聚合物。
如請求項5之方法，其中該碳水化合物寡聚物或聚合物係木質纖維素、木聚糖、纖維素或澱粉。
如請求項5之方法，其中該乙醇之生產率為至少1.0克乙醇/升/小時。
如請求項5之方法，其中該乙醇之生產率為至少1.5克乙醇/升/小時。
如請求項5之方法，其中該乙醇之生產率在約0.6克乙醇 /升/小時至約2.5克乙醇/升/小時範圍內。
如請求項5之方法，其中該乙醇產率為至少70%。