TWI444473B

TWI444473B - 微流體懸吊液珠晶片

Info

Publication number: TWI444473B
Application number: TW101135825A
Authority: TW
Inventors: Chia Hsien Hsu; Chih Chen Chen
Original assignee: Nat Health Research Institutes; Nat Univ Tsing Hua
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-07-11
Also published as: WO2013049165A1; TW201329230A; WO2013049165A8; US9034636B2; US20130084634A1

Description

微流體懸吊液珠晶片

本發明係關於一種懸吊液珠平台，特別是指一種3D懸吊液珠裝置以及形成懸吊液珠的方法。

懸吊液珠培養方法(hanging drop culture method)係廣泛地被使用在體外三維(3D)細胞聚集之形成，避免在二維(2D)細胞培養中一般所看到的細胞變形(cellular distortion)。傳統的懸吊液珠技術係包括將細胞培養基(medium)及若干細胞之一液珠(small drop)放置在一塑膠基板上、將基板反轉，以及對其培養所欲的時間長度。然而，懸吊液珠的尺寸係受重力的的限制，也因此沒有麻煩的定期補充則僅能維持有限時間的細胞培養。而修改懸吊液珠方法的方式係包括中空球體、384孔懸吊液珠培養板以及若干微孔結構。在最先的兩個方法中，在懸吊液珠中的內容物並無法輕易地交換。在微井系統中，必須對基板最佳化，以支撐三維(3D)細胞成長與避免細胞附著。

基於上述問題，發明人提出了一種微流體懸吊液珠晶片，以克服現有技術的缺陷。

就某方面而言，本發明係提供一種微流體懸吊液珠(microfluidic hanging drop，μHD)晶片，其係包括：一覆蓋部，具有一長度L1、一寬度W1以及一高度或一厚度T1；一通道形成部，具有一長度L2、一寬度W2以及一高度或一厚度T2，該通道形成部係大致地與該覆蓋部平行，該通道形成部係包括：一第一表面及一第二表面，該第二表面係與該第一表面相對間隔一距離T2；一PDMS片第一端及一PDMS片第二端，係分別位在該通道形成部的兩端，以及該PDMS片第二端係與該PDMS片第一端相對間隔一距離L2；一微流體通道，具有一長度l、一寬度w以及一高度h，該微流體通道係從該第一表面朝向該第二表面形成，並位在該PDMS片第一端與該PDMS片第二端之間，且在該覆蓋端之下，其中，l<L2<L1，w<W2<W1，以及h<T2；以及若干開孔，係位在該第二表面，其中，該等開孔係與該微流體通道連通；其中，該通道形成部係通過該第一表面而在該PDMS片第一端與該PDMS片第二端處與該覆蓋端接觸；一第一後背部及一第二後背部，係均具有大於該通道形成部之該高度T2的一厚度T3，其係鄰近該通道形成部的該PDMS片第一端與該PDMS片第二端，且與該第二表面接觸；以及一輸入口及一輸出口，係鄰近微流體通道的兩端設置，並與該通道連通，該通道係形成在該通道形成部與該等後背部。

就另一方面而言，本發明係提供一種用於形成懸吊液珠之方法，其係包括：(a)提供如上所述之一微流體懸吊液珠(microfluidic hanging drop，μHD)晶片；(b)使一流體經由該輸入口而進入並穿經該微流體通道；以及(c)使懸吊液珠形成在該等開孔，每一流體液珠(fluidic drop)係從一開孔懸吊，該開孔係包含有該流體液珠。該流體可為一細胞培養基。該細胞培養基可包括要研究分析的若干細胞。

在本發明所使用的術語係在其技術領域普遍地具有其本身原本意義，包括在本發明的上下文中以及在說明書上下文中所使用的術語。使用於描述本發明或者是說明書其他地方的某些術語係於下列討論，以提供本發明之描述的額外指導給熟悉本領域的技術人員。為方便起見，某些術語係會被強調，例如使用斜體字及/或引號。此強調的使用並不會影響一術語的範圍及意義；無論其是否有被強調，在相同的上下文中，一術語的範圍及意義是相同的。其係將體會相同的事物係可以多種方式敘述。因此，在文中所討論的任何一個或多個術語係可使用不同語言及同義字，無論是否一術語是詳盡的或是在文中所討論的，是沒有其他涵義可以取代。提供有對於某些術語的同義字。一或多個同義字的列舉並不排除其他同義字的使用。在說明書中任何地方且包括在本文中所討論的術語之舉例的使用，係僅為作例證使用，且並未限制本發明的範圍與意義以及任何例示術語。同樣地，本發明並未限制在本說明書中的不同實施例。

除非不同的定義，在文中所使用的所有技術與科學術語係具有相同意義，係如熟悉本技術領域之人員所理解的。發生衝突時，係將調節包括有定義之本發明實施例。

如下文所使用的「大約」，係意指在所給予之數值或範圍的百分之二十之內，較佳者，其係為百分之十之內，更進一步的話，其係為百分之五以內。係為中所給予的數值是大約值，其意指假若沒辦法確切定義的話，則以「大約」來表示。

如下文所使用，當敘述一個數字或一個範圍時，本技藝所屬領域係傾向於包含一適當、合理的範圍。

對於大約50到大約500微米來說，其係意指在其範圍內的所有整數總數。因此，50、51、52、53...497、498、499以及500微米整數總數係已包括在本發明的實施例中。

對於大約50到大約1000微米來說，其係意指在其範圍內的所有整數總數。因此，50、51、52、53...997、998、999以及1000微米整數總數係已包括在本發明的實施例中。

對於大約1微米到大約2500微米來說，其係意指在其範圍內的所有整數總數。因此，1、2、3、4...2497、2498、2499以及2500微米整數總數係已包括在本發明的實施例中。

一微流體裝置具有至少一維度小於1mm。使用在微流體裝置的一般流體係包括整個血液樣本、體液、微生物的懸浮液(例如細菌、真菌以及病毒)、細胞懸浮液、含蛋白質或抗體溶液以及不同緩衝液。

「微流體懸吊液珠晶片」、「微流體晶片」以及「μHD chip」之詞句係可互換的。

「懸吊(hanging)」係表示向下傾斜、伸出、從主體後延伸(例如從底部及其第二表面後延伸)、凸出、突出。

如下文中所使用的，「液珠(droplet)」係表示一微小的液滴。「液珠(droplet)」及「液滴(drop)」是可互換的。

「輸送一流體」以及「使一流體通過」係可互換的。

「凸出部」係表示凸出或突出某物。

「大致為平坦」係表示具有一表面，此表面係沒有突出物。

下文中的「井(wells)」係與「開孔(openings)」是可互換的。

「覆蓋部」以及「通道覆蓋部」係為可互換的。

靜水壓(Hydrostatic pressure)係表示在一流體中之一給定點施加由重力所形成的一靜力。因為流體的重量係從上到下施力，因此靜水壓的增加係與從表面所測量之深度成正比。

本發明係關於一新穎的微流體懸吊液珠平台，其係能夠控制懸吊液珠形成、細胞載入、交換細胞培養基以及細胞截取，而無須使用移液管的人工。本發明亦係關於一種方法，係用於維持3D細胞培養之懸吊液珠產生。懸吊液珠係經由在一微流體通道之若干開孔自動地浮現，其係提供大量運送進入或運送出懸吊液珠的手段及控制。其係依據本發明之一微流體晶片而證明不同尺寸之一列的懸吊液珠自動形成以及聚苯乙烯小珠及細胞載入到懸吊液珠懸吊液珠。細胞係包括HL-CZ白血病細胞(HL-CZ leukemic Cells)、人類肺癌細胞、老鼠胚胎幹細胞以及老鼠胚胎纖維母細胞，其係可在一微流體懸吊液珠晶片中培養至少七天。

如圖16所示，一微流體懸吊液珠晶片1600係包括：(a)一覆蓋部1610，具有一長度L1、一寬度W1以及一高度或一厚度T1；(b)一通道形成部1612，具有一長度L2、一寬度W2以及一高度或一厚度T2，其係大致地與覆蓋部1610平行，通道形成部1612係包括：(i)一第一表面1614及一第二表面1616，第二表面1616係與第一表面1614相對並間隔一距離T2；(ii)一PDMS片第一端1618及一PDMS片第二端1620，係分別位在通道形成部1612的各端，且PDMS片第一端1620係與PDMS片第二端1618相對並間隔一距離L2；(iii)一微流體通道1622，具有兩端1622a、1622b、一長度l、一寬度w以及一高度h，其係從第一表面1614朝向第二表面1616而形成，並且位在PDMS片第一端1618與PDMS片第二端1620之間，及在覆蓋部1610下面，其中，l<L2<L1，w<W2<W1，以及h<T2；以及 (iv)若干開孔1624，係位在第二表面1616處，其中，開孔1624係與微流體通道1622連通；其中，通道形成部1612係經由第一表面1614而在PDMS第一端1618及PDMS第二端1620與覆蓋部1610接觸；(c)一第一後背部1626及一第二後背部1628，每一後背部係具有大於通道形成部之高度T2的一厚度T3，其係鄰近通道形成部1612之PDMS第一端1618及PDMS第二端1620而設置，並且與其第二表面1616接觸；以及(d)一輸入口1630及一輸出口1632，係分別鄰近微流體通道1622之兩端1622a、1622b設置，並且與通道1622連通，且其係形成在通道形成部1612及後背部1626、1628。

長度L1係定義為通道覆蓋部1610端之間的距離。長度L2係定義為通道形成部1612之PDMS第一端1618與PDMS第二端1620之間的距離。長度l係定義為通道1622之兩端1622a、1622b之間的距離。覆蓋部1610係為透明的或者是大致上是透明的。通道形成部1612係經由第一表面1614而與覆蓋部1610接觸或黏接。開孔1624係可為一列或者是一陣列。分別位在鄰近通道形成部1612之PDMS第一端1618及PDMS第二端1620之第一後背部1626及第二後背部1628，係黏接在通道形成部1612之第二表面 1616上。毛細軟管1634、1636可連接到輸入口1630及輸出口1632。懸吊液珠1638係形成在開孔1624。細胞1640係引入在懸吊液珠1638中。

為了形成懸吊液珠，首先係將一流體傳送進入通道，並填滿通道的空間(即第一層)，之後填滿開孔(即第二層)。當第二層未被填滿時，由於光的折射/偏向(refraction/deflection)，使得開孔顯得更暗。當第二層填滿流體時，暗的陰影即消失。在所有開孔填滿流體之後，流體進一步流經通道，其係造成懸吊液珠的形成。當一懸吊液珠的表面張力已克服流體壓力時，懸吊液珠脹破(burst)，由於脹破液珠之流體的損失而造成其他液珠體積變小。一脹破懸吊液珠意指一液珠懸掛在開孔並朝通道形成部的第二表面延伸。一脹破液珠(或懸吊液珠)具有比其懸掛之開孔大的直徑。

在某方面而言，本發明係關於一種微流體懸吊液珠晶片，係包括：(a)一覆蓋部，具有一長度L1、一寬度W1以及一高度或一厚度T1；(b)一通道形成部，具有一長度L2、一寬度W2以及一高度或一厚度T2，其係大致地與覆蓋部平行，通道形成部包括：(i)一第一表面及一第二表面，第二表面與第一表面1614相對並間隔一距離T2； (ii)一PDMS第一端及一PDMS第二端，係分別位在通道形成部的各端，且PDMS第二端與PDMS第一端相對並間隔一距離L2；(iii)一微流體通道，具有一長度l、一寬度w以及一高度h，其係從第一表面朝向第二表面而形成，並且位在PDMS片第一端與PDMS片第二端之間，及在覆蓋部下面，其中，l<L2<L1，w<W2<W1，以及h<T2；以及(iv)若干開孔，係位在第二表面處，其中，開孔係與微流體通道連通；其中，通道形成部係經由第一表面而在PDMS片第一端及PDMS片第二端與覆蓋部接觸；(c)一第一後背部及一第二後背部，每一後背部具有大於通道形成部之高度T2的一厚度T3，其係鄰近通道形成部之PDMS片第一端及PDMS片第二端而設置，並且與其第二表面接觸；以及(d)一輸入口及一輸出口，係分別鄰近微流體通道之兩端設置，並且與通道連通，且其係形成在通道形成部及後背部。

在本發明的一實施例中，通道形成部的第二表面係大致為平坦的及/或其上並沒有凸出部分。前述的微流體懸吊液珠晶片可包括一個以上的微流體通道。通道可以或可無須在其底部具有相同尺寸的開孔。開孔係連接到一通道且在開孔及與其連接的通道之間沒有一障壁(barrier)存在。開孔對氣體而言是開放的，且從晶片底部是可進入的，亦即，從通道形成部之第二表面進入。微流體懸吊液珠晶片可包括開孔的陣列。

在本發明的一實施例中，前述的微流體懸吊液珠晶片可包括多數個通道，而每一通道與排成一列的開孔連通。

在本發明的另一實施例中，每一開孔具有一直徑，其範圍係從1微米到2500微米。

在本發明之另一實施例中，開孔的直徑範圍係從50微米到1毫米(mm)。

在本發明之另一實施例中，覆蓋部並不適於從通道形成部可移除。

前述的微流體懸吊液珠晶片可更進一步包括一細胞培養基(cell culture medium)，其係位在微流體通道與開孔內，其中，在開孔內之細胞培養基係形成懸吊液珠。懸吊液珠可包含細胞。微流體懸吊液珠晶片可更進一步包括與輸入口連通之一流體傳送裝置以及與輸出口連通之一流體吸取裝置。

在本發明之另一實施例中，通道形成部包括一材料，其係選自下列群組：聚二甲基矽氧烷(polydimethyl-siloxane，PDMS)、聚乙烯(Polyethylene，PE)、聚碳酸脂樹脂(Polycarbonate，PC)、聚苯乙烯(Polystyrene，PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate，PMMA)、環烯烴共聚物(Cyclic Olefin Copolymer，COC)、矽(silicon)、玻璃(glass)以及熱塑性材料(thermoplastics materials)。在本發明之另一實施例中，在通道形成部之第一表面的PDMS片第一端與PDMS片第二端係黏接到覆蓋部。

再者，在本發明之另一實施例中，微流體懸吊液珠晶片係置放在一容器中。此容器可包括一液體儲水槽，可更進一步包括一外部輸入口以及一外部輸出口，外部輸入口係與微流體懸吊液珠晶片的輸入口連通，外部輸出口與微流體懸吊液珠晶片的輸出口連通。容器的外部輸入口可與一流體傳送裝置連通，且外部輸出口可與一流體吸取裝置連通。

在某方面而言，本發明係關於一種用於形成懸吊液珠之方法，其包括：(a)提供如上所述之一微流體懸吊液珠晶片；(b)使一流體經由該輸入口而進入並穿經該微流體通道；以及(c)使懸吊液珠形成在該等開孔，每一流體液珠係從一開孔懸吊，該開孔包含有該流體液珠。該流體可為一細胞培養基，而該細胞培養基可包括要研究分析的若干細胞。前述的方法可更進一步包括允許一額外流體從輸出口出去。

前述之方法可更進一步包括將晶片放置在一容器中，此容器包括一支架(holder)，以適於容置此晶片。

在本發明的一實施例中，流體包括懸浮的細胞且懸吊液珠包括細胞。

在本發明的另一實施例中，每一懸吊液珠係具有一高度H，其係不大於包含懸吊液珠之開孔的直徑，且懸吊液珠的高度H可由流體的不同靜水壓所控制，而靜水壓取決於連接到輸入口之瓶子中液面與微流體懸吊液珠晶片液面之間的高度差異(△h係如圖7所示)。壓力係使用方程式P=pgh計算，其中，P為壓力(N/m² )，p為液體密度(kg/m³ )，g為重力加速度(998kg/m³ )，以及h為高度差(△h係如圖7所示)。

再者，本發明之另一實施例中，使一流體經由該輸入口進入並穿過該微流體通道之步驟係在一水壓下或透過一幫浦(pump)來實現。

然而，在本發明的另一實施例中，懸吊液珠並未延伸到開孔後面或者是並未延伸到通道形成部之第二表面。

實例

雖然本發明使用了幾個較佳實施例進行解釋，但是下列圖式及具體實施方式僅僅是本發明的較佳實施例；應說明的是，下面所揭示的具體實施方式僅僅是本發明的例子，並不表示本發明限於下列圖式及具體實施方式。

方法及材料

裝置包括在其底部具有開孔的一微流體通道，且係使用軟微影技術(soft lithographic)及聚二甲基矽氧烷(PDMS，polydimethyl-siloxane)薄膜轉換技術而將PDMS製造在玻璃基板上。簡單地說，具有兩層特徵之主晶片係使用具有負光阻(SU-8，Microchem Inc.Newton,MA)之傳統黃光微影技術(photolithography)。此主晶片係使用成鑄模(molds)，其上塗佈有PDMS聚合物。提供有塗佈在聚乙烯(polyethylene，PE)片(Scotchpark^TM 1022 Release Liner，3M^TM ，St.Paul，MN)的一含氟聚合物及厚玻璃(厚度為1cm)，並壓向主晶片以擠出過量的PDMS。PDMS係允許在兩小時65℃時在一傳統烤箱中進行固化(cure)。一旦完成固化，與黏接的PE片之PDMS特性係從主晶片移除。在以氧氣電漿(oxygen plasma)處理之後，PDMS層係黏接到一玻璃基板，並使PE片剝離。

當藉由使用靜水壓或一針筒幫浦(syringe pump)在一控制流量下將溶液引入到微通道時，懸吊液珠係產生在PDMS微通道之底部的開孔中。最小壓力(係懸吊液珠開始形成時之壓力)及最大壓力係已被評估。當液珠脹破，至少一液珠延伸到第二表面且在另一液珠的流體係流到脹破的液珠，因此，其係顯現出平坦化。因此，當所提供的壓力增加直到懸吊液珠平坦化時，開孔直徑及脹破壓力之間的關係已被評估。

圖3-5係表示本發明之微流體懸吊液珠晶片的製造流程。黃光微影技術(Photolithography)

以下列示用於將一光罩上的圖案印刷在一晶圓之黃光微影技術的步驟。

步驟1：將SU-850光阻塗佈在晶圓上：塗抹轉速500rpm、5秒，之後轉速1250rpm、30秒。

步驟2：軟烤(soft bake)：65℃、10分鐘，之後95℃、20分鐘。

步驟3：曝光2.5秒。

步驟4：曝後烤(post-bake)：65℃、10分鐘，之後95℃、10分鐘。

步驟5：清洗對準點(aligner key)(左右對稱，兩組)。

步驟6：將SU-8 50塗佈在晶圓上：塗佈轉速500rpm、5秒，之後1800rpm、30秒。

步驟7：軟烤：65℃、20分鐘，之後95℃、10分鐘。

步驟8：校準對準點(光罩及晶圓)。

步驟9：曝光2.5秒。

步驟10：曝後烤：65℃、8分鐘，之後95℃、10分鐘。

步驟11：清洗晶圓。

步驟1~4係為第一層結構。步驟6~9係為第二層結構。

清潔液體為醋酸丙二醇甲醚酯(Propylene glycol monomethyl ether acetate，PMA或PGMEA)。其參數為如繪示的所有實數。

一PDMS裝置的準備

圖4A表示在軟微影技術製造後具有凸出特徵(SU8結構)的一晶圓，其中，第一層特徵具有100±1μm之一厚度，第二層特徵具有130±2μm之一厚度。圖4B係表示7片主晶圓。每一主晶圓使用一光阻(mold)，其係以矽烷(silane)塗佈(表面處理，其係協助之後其上的PDMS從光阻剝離。主晶圓之後係放置在氧氣電漿中2分鐘，並將其與兩滴三氯矽烷(Trichlorosilane)(在秤量皿中)一起放置在乾燥器(desiccator)中30分鐘。在塗佈之後，每一主晶圓係具有一矽烷塗佈的一單一層。

圖5表示製造一PDMS裝置500之一夾鉗翻模製程。

A)將一已固化(固體)的PDMS薄片516置放在一厚玻璃(高度=1cm)518上。將一晶圓510(具有SU-8光阻通道512以及開孔圓柱514結構)置放在PDMS薄片516上。

B)將未固化的液態PDMS膠520塗佈在晶圓510上，並保證晶圓510的表面塗佈有液體的PDMS膠520。

C)提供一片PE片524在未固化的液態PDMS膠520及晶圓510上。

D)將另一厚玻璃526(1cm)置放在PE片524頂部上，並將其置放在65℃之一烤箱中2小時。

E)在液態PDMS膠520已固化之後，將PE片524撕離黏貼在其上的PDMS膠520。具有SU-8光阻通道512及開孔圓柱514結構之區域為中空，且沒有那些結構的區域為已固化(固體)的PDMS膠520(其係當作是一通道行程部1612)。將在其上黏貼有PE片524之已固化PDMS膠520以及新的一片載玻片1610(1”×3”，高度=1cm)置放在一氧氣電漿機器中，使PDMS膠520(或通道形成部1612)正面朝上以進行兩分鐘處理以及對PE片524正面朝下進行以進行一有效的處理。

F)在氧氣電將處理之後，藉由將PDMS膠520(或通道形成步1612)置放在載玻片1610(其係當作是一通道覆蓋部)上，以將PDMS膠520(或通道形成部1612)結合在新的載玻片1610(在氧化電將處理期間向上的一側)上。將結合的PDMS載玻片置放到一加熱板(65℃-75℃)上20分鐘，以加強結合。

G)從PDMS膠520(或通道形成部1612)將PE片524剝離，完成製造出具有覆蓋部1610及通道形成部1612的一PDMS裝置。

H)夾鉗翻模設定的截面視圖：在頂部上之一厚玻璃(1cm)526，之後為PE片524、PDMS膠(具有通道及開孔)520、SU-8光阻通道512以及開孔514結構、矽晶圓510、PDMS薄片516以及在底部的一厚玻璃518。

輸入口及輸出口的形成

製造輸入口及輸出口之前的準備： 在15cm器皿中的PDMS預聚合物溶液大約35g係放置在一65℃烤箱中6小時，以固化PDMS。已固化(固體)的PDMS係切割成正方形方塊(1×1cm，高度0.3cm)。PDMS方塊係當作是第一後背部1626及第二後背部1628。

圖17A-17B表示形成輸入口1630的製程。使用一打孔器(一削尖的鈍針)對一筆直的通道(一輸入口通道)進行打孔，其係當作是一輸入口，從側邊(如圖17A所示)而經過一片PDMS方塊1626(1×1cm，高度0.3cm)。筆直通道1630係用於管狀插入。其係具有兩端以插入兩個分別的毛細軟管。一毛細軟管係用於傳送一細胞懸浮液，而另一毛細軟管係用於連接到包含一新鮮細胞培養基(如圖6B所示)的一瓶子。然後，從PDMS方塊1626的頂部打一個孔1630b，孔1630b與輸入口通道1630連通並垂直。輸入口PDMS方塊1626係當作是一第一後背部1626。毛細軟管可經由在輸入口通道1630兩端之孔1630a連接到輸入口通道(或輸入口)1630，以傳送細胞及/或新鮮細胞培養基。圖17B係表示垂直於及與輸入口通道6130連通之孔1630b的側視示意圖。

圖17C-17D表示形成輸出口1632的製程。從側邊(如圖17C所示)經由(並非全部經過)一片PDMS方塊1628以對一筆直通道1632(一輸出口通道)進行打孔至一半。之後，從PDMS方塊1628 的頂部打一個孔1632b，孔1632b與輸出口通道1632垂直並其封閉端連通。圖17D係表示與輸出口通道1632之封閉孔連通並垂直之孔1632b的一側視示意圖。

在製造完成輸入口及輸出口方塊(其係第一後背部1626及第二後背部1628)之後，將其(具有向上的孔1630b、1632b)及之前製造好之貼合在載玻片(其係為覆蓋部1610)上之PDMS片(PDMS片向上)置放入一氧氣電漿機器以進行2分鐘處理。之前製造好之PDMS片1612與微流體通道1622連通。對輸出口方塊1628進行重複製程，其係使在PDMS片1612的另一端具有孔1632b以搭配其孔1632b。在輸入口方塊1626與通道形成部1622上的孔1632b，以及在輸入口方塊1626上之輸入口通道1630的兩開放端1630a係一同形成晶片1600的輸入口1630。在輸出口方塊1628與通道形成部1622上之孔，以及在輸出口方塊1628上之輸出口通道1632的開放端1632a係一同形成晶片1600的輸出口。將晶片置放在65℃之加熱板上至少2小時。其係完成一微流體懸吊液珠晶片1600。

之前已完成之PDMS片之二孔1630b、1632b(分別當作為輸入口及輸出口)係在夾鉗翻轉製程期間製造。如圖3B所示，通道的每一端處，兩個圓圈係橋接通道。外圓圈與通道共有一相同高度，且內圓圈係當成是凸極(protruding poles)，其係與第二層(例如開孔)具有相同高度。因此，在每一通道的端部具有二開孔。

微流體懸吊液珠晶片係置放在用於細胞培養的一封閉環境。封閉環境，本例中為一10cm的器皿，係在其底部填滿液體，因此使空氣變得潮濕。如下所列的尺寸僅用於繪示目的。其他適於形成微流體懸吊液珠晶片的尺寸及懸吊液珠的形成係可被使用。

PDMS的尺寸：PDMS係為12.7×19.4mm² 。PDMS片的結構厚度為230μm(第一層厚度加第二層厚度=100+130=230)。

通道的尺寸： 具有500μm之開孔的通道：長度=13.5mm；寬度=1mm(1000μm)；厚度=100μm。具有200μm之開孔的通道：2.2.1長度=11.4mm；寬度=0.6mm(600μm)；厚度=100μm。具有100μm之開孔的通道：2.3.1長度=11.4mm；寬度=0.2mm(200μm)；厚度=100μm。具有50μm之開孔的通道：2.4.1長度=11.4mm；寬度=0.1mm(100μm)；厚度=100μm。

PDMS片的厚度可不同。在SU-8黃光微影製程期間改變第一層厚度(即微通道的厚度)及第二層厚度(即開孔的厚度)是可實行的。

用於輸入口及輸出口方塊之較厚PDMS的尺寸： 長度=1cm；寬度=1cm；厚度=3mm。

微流體懸吊液珠平台的組裝

一10cm培養皿蓋係鑿孔以產生三個孔，其中，兩個孔係相互穿過，而第三個孔係垂直於其他兩個孔的中點。一10cm培養皿係填滿7ml的內儲水槽。培養皿更包括二外支架，以適用於支撐輸入口及輸出口流體儲水槽。培養皿更包括一晶片支架(例如4mm厚PDMS方塊數片以支撐一微流體懸吊液珠晶片)，其係允許所形成之液珠鄰近內儲水槽。PDMS方塊(或晶片支架)高度係低於10cm培養皿的高度。將微流體懸吊液珠晶片置放在晶片支架(4mm厚度的PDMS)上，並以已鑿孔的板子封閉培養皿。使在懸浮液中包括細胞之一流體前進入置放在晶片支架上的晶片，以形成載有細胞之懸吊液珠。在細胞載入到懸吊液珠之後，輸入口與包括一新鮮細胞培養基之一外部輸入口儲水槽連通。通道的輸出口係與一外部輸出口儲水槽連通。壓力係容許連續且平穩的提供新鮮細胞培養雞給通道以及包括有細胞的懸吊液珠。連接到外部輸入口儲水槽及通道形成部之輸入口的毛細軟管，係正確地置放到在10cm培養皿蓋上之孔內。

為了播種細胞或細胞珠，細胞或細胞珠懸浮液係流經通道，且此流動係停止5分鐘以允許細胞或細胞珠沉澱在微懸吊液珠中。藉由再開始流動以移除過剩的細胞。

結果

對於自動化時代而言，發展一微流體裝置以達成一簡易的流體輸入。懸吊液珠或液滴係形成在微通道底部的開孔處。開孔的直徑可在1到2500μm範圍之間。

開孔直徑及脹破壓力之間的關是可以估計的。脹破壓力係定義為懸吊液珠變平坦化處的壓力。當僅考慮對流運輸的一定性評估時，開孔的直徑除以在微通道中之平均速度，係可計算將在懸吊液珠中溶液裝滿的最大比率。在開孔的溶液可在每秒超過50次被裝滿，甚至是直徑大於500μm的開孔，其係滿足一典型的細胞培養。直徑為10μm的聚苯乙烯小珠(Polystyrene beads)以及包括人類肺癌細胞、老鼠胚胎幹細胞與老鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblast)的細胞，係成功地載入到懸吊液珠中。

圖1A-1D係表示操作中一微流體懸吊液珠晶片的一剖視示意圖。圖1A：一細胞培養基進入並填滿微通道。圖1B：當微通道填滿細胞培養基時，懸吊液珠係形成並懸吊在開孔的底部。細胞係載入到微通道並停泊在懸吊液珠中。圖1C：未受限細胞可被沖洗掉。圖1D：不同細胞外的溶液在精確的問度與空間控制下，可經由微通道而被引入到懸吊液珠。培養在懸吊液珠中的細胞可使用一微量吸管(micropipette)直接從懸吊液珠收取，抑或是藉由提供吸力到微通道以在輸出口進行收集。

為了轉移細胞，藉由同時抬起輸入口及輸出口瓶子可增加提供壓力。當壓力增加時，微懸吊液珠在PDMS片(即通道形成部1612的第二表面1616)的外表面脹破，且細胞可藉由從空氣液滴介面(air-droplet interface)(即從PDMS片的外表面，或從通道形成部1612的第二表面1616)使用一微量吸管以吸力收取或是沖洗掉。

圖2A表示一微流體懸吊液珠晶片的倒視圖，其從底部到頂部不同直徑之通道及井(或開孔)分別為500μm、200μm、100μm以及50μm。圖2B為一微流體懸吊液珠晶片的倒視圖，微流體懸吊液珠晶片具有9個通道，每一通道連通位在通道形成部底部之26個開孔，每一開孔的直徑為100μm(1mm)。

圖3A係表示在一4”矽晶圓(外圓圈)上之7個主晶圓的光罩設計。每一晶圓可當作是用以製造一微流體懸吊液珠晶片的一光阻。圖3B為一主晶圓的放大圖，係表示縱向(longitudinal)凸出特徵，其係形成通道(指定為第一層特徵，具有高度Y1)，以及從縱向特徵凸伸的小圓特徵(small round features)(指定為第二層特徵，具有高度Y2，Y2>Y1)，其係形成開孔。從底部到頂部的小圓特徵係形成具有50、100、200以及500μm之直徑。支撐特徵(supporting features)係位在縱向凸出特徵之間，且具有與第二層特徵相同的高度Y2。圖3並未依比例繪示。

圖6A表示一反微流體懸吊液珠晶片的全視圖。在圖6B的一放大圖係表示通道及具有500μm直徑之開孔，連接二毛細軟管(以上箭頭與下箭頭表示)之輸入口，其中一毛細軟管用於傳送所欲研究之細胞，另一毛細軟管用於傳送一新鮮細胞培養基，以及連接到一輸出毛細軟管(以右箭頭表示)的輸出口。

圖7係表示在懸吊液珠高度(不同直徑之開孔)與靜水壓之間關係之觀察裝置的排列。一微流體懸吊液珠晶片1600係置放在鄰近物鏡(objective lens)之立體顯微鏡(stereomicroscope)710的平台上，且一鏡子712係置放在微流體懸吊液珠晶片1600之前與物鏡之下。此排列允許立體顯微鏡從側邊截取影像。在具有直徑500μm開孔之一微流體懸吊液珠晶片中懸吊液珠的高度為86.58781μm(如圖8A所示)、134.4584μm(如圖8B所示)、191.8916μm(如圖8C所示)以及脹破懸吊液珠(如圖8D所示)，在壓力分別為205.8 N/m² 、279.3 N/m² 、352.8 N/m² 以及401.8 N/m² 。在具有直徑200μm開孔之一微流體懸吊液珠晶片中懸吊液珠的高度為33.58103μm(如圖9A所示)、44.80326μm(如圖9B所示)、83.16841μm(如圖9C所示)以及脹破懸吊液珠(如圖9D所示)，在壓力分別為343 N/m² 、416.5 N/m² 、539 N/m² 以及563.5 N/m² 。

圖10A-10C係表示懸吊液珠高度相對靜水壓的關係圖。懸吊液珠高度係定義為在圖8-9(在懸吊液珠中的垂直柱)中凸出懸吊液珠之長度。一懸吊液珠高度係從PDMS片(即通道形成部的第二表面)的邊緣測量到懸吊液珠之外曲率的底點(bottom point)。矢狀面懸吊液珠(sagittal-plane-droplets)的擷取影像係由QCapture軟體所分析及測量，其係控制連接到立體顯微鏡的相機。立體顯微鏡與裝置的設置如圖7所示。靜水壓係取決於接到輸入口之瓶子中液面與微流體懸吊液珠晶片液面之間的高度差異(△h係如圖7所示)。壓力係使用方程式P=pgh計算，其中，P為壓力(N/m² )，p為液體密度(kg/m³ )，g為重力加速度(998kg/m³ )，以及h為高度差(△h係如圖7所示)。

圖11表示在為流體懸吊液珠晶片中在500μm直徑之井(成一列的開孔)中的細胞培養及細胞聚集形成。左圖係繪示一微流體懸吊液珠晶片之剖視示意圖，右圖為一上到下所視的顯微照片。細胞為老鼠胚胎幹細胞。圖11A：將細胞載入到微流體懸吊液珠晶片的通道中；圖11B：停止流動讓細胞下降；圖11C：再開始流動將過量的細胞清洗掉；圖11D：充滿細胞培養基下之微流體懸吊液珠晶片中使細胞成長。圖12係表示在不同時間點之老鼠胚胎纖維母細胞聚集形成：0小時、18小時以及25小時(分別為圖12A-12C)，其係使用一微流體懸吊液珠晶片。

圖13A-13B係分別表示使用傳統懸吊液珠方法於1小時細胞培養以及使用一微流體懸吊液珠晶片方法於0小時細胞培養之人類肺癌細胞聚集形成。用傳統懸吊液珠方法培養之細胞係分佈在時間點0的懸吊液珠中，且花費時間(約1小時)集中在懸吊液珠中。培養在微流體懸吊液珠晶片中的細胞係快速地集中在懸吊液珠中。因此，用傳統懸吊液珠方法培養1小時的細胞係可與用微流體懸吊液珠晶片培養0小時之細胞相比。

圖14及圖5係表示人類肺癌細胞聚集形成，其中使用傳統懸吊液珠方法(圖14A及圖15A)與微流體懸吊液珠晶片方法(圖14B及圖15B)在24小時(圖14A-14B)及在48小時(圖15A-15B)之細胞培養。

綜上所述，本發明係揭示一簡易的微流體懸吊液珠細胞培養平台。將微流體通道整合到懸吊液珠係允許自動化、高通量及長期的3D細胞培養，其係期待有益於學習研究，例如幹細胞分化(stem cell differentiation)、再生醫學(regenerative medicine)、組織工程(tissue engineering)、藥物篩選(drug screening)以及發育生物學(developmental biology)。

雖然本發明以相關的較佳實施例進行解釋，但是這並不構成對本發明的限制。應說明的是，本領域的技術人員根據本發明的思想能夠構造出很多其他類似實施例，這些均在本發明的保護範圍之中。

1600‧‧‧微流體懸吊液珠晶片

1610‧‧‧覆蓋部

1612‧‧‧通道形成部

1614‧‧‧第一表面

1616‧‧‧第二表面

1618‧‧‧PDMS片第一端

1620‧‧‧PDMS片第二端

1622‧‧‧微流體通道

1622a、1622b‧‧‧兩端

1624‧‧‧開孔

1626‧‧‧第一後背部

1628‧‧‧第二後背部

1630‧‧‧輸入口

1630a‧‧‧孔(開放端)

1630b‧‧‧孔

1632‧‧‧輸出口

1632a‧‧‧開放端

1632b‧‧‧孔

1634‧‧‧毛細軟管

1636‧‧‧毛細軟管

1638‧‧‧懸吊液珠

1640‧‧‧細胞

500‧‧‧PDMS裝置

510‧‧‧晶圓

512‧‧‧光阻通道

514‧‧‧開孔圓柱

516‧‧‧PDMS薄片

518‧‧‧厚玻璃

520‧‧‧PDMS膠

524‧‧‧PE片

526‧‧‧厚玻璃

710‧‧‧立體顯微鏡

712‧‧‧鏡子

h‧‧‧高度

H‧‧‧高度

L1‧‧‧長度

l‧‧‧長度

L2‧‧‧長度

T1‧‧‧高度/厚度

T2‧‧‧高度/厚度

T3‧‧‧厚度

w‧‧‧寬度

W1‧‧‧寬度

W2‧‧‧寬度

Y1‧‧‧高度

Y2‧‧‧高度

圖1係表示本發明微流體懸吊液珠晶片的剖視示意圖及其操作原理。

圖2A-2B係表示本發明流體懸吊液珠晶片的倒視圖照片，其中，圖2A為流體懸吊液珠晶片，係具有若干通道及不同直徑之若干開孔，圖2B為矩陣式的微流體懸吊液珠晶片，其係具有9個通道，每個通道有26個開孔，每一開孔具有1mm(1000μm)的直徑(9×26個井之陣列)。

圖3係表示本發明一主晶圓(master wafer)的設計，其中，圖3A為一光罩設計，具有7小片晶圓(即光阻)，圖3B為圖3A之一主晶圓的放大圖，其係顯示從下到上之開孔的直徑依序為50、100、200以及500μm，而圖3並未按比例繪製。

圖4A-4B係表示具有7個較小晶圓片之一大晶圓，其包含軟性微影技術製造之後的SU8(負光阻)結構，且此7個較小晶圓片用於夾鉗翻模製程(clamp-molding process)。

圖5係表示製造一微流體懸吊液珠晶片之一夾鉗翻模製程。

圖6A-6B係表示本發明一微流體懸吊液珠晶片之倒視圖及一放大圖之顯微照片，比例尺為1000μm。

圖7係表示裝置之排列的照片，此裝置係用於不同壓力下在晶片之開孔處懸吊液珠形成之觀察。

圖8A-8D係表示本發明在一微流體懸吊液珠晶片在不同壓力下之液珠形成的側視圖，此微流體懸吊液珠晶片具有直徑為500μm之一開孔，其垂直長柱條係表示懸吊液珠高度，其中，圖8A中壓力為205.8 N/m² ，液珠高度為86.58781μm，圖8B中壓力為279.3 N/m² ，液珠高度為134.4584μm，圖8C中壓力為352.8 N/m² ，液珠高度為191.8916μm，圖8D中脹破液珠(箭頭處)壓力為205.8 N/m² ，橫柱比例尺為500μm。

圖9A-9D係表示本發明在一微流體懸吊液珠晶片在不同壓力下之液珠形成的側視圖，此微流體懸吊液珠晶片具有直徑為200μm之一開孔，其在液珠內之垂直黑色長柱係表示懸吊液珠尺寸/高度，其中，圖8A中壓力為343 N/m² ，液珠高度為33.58103μm，圖8B中壓力為416.5N/m² ，液珠高度為44.80326μm，圖8C中壓力為539 N/m² ，液珠高度為83.16841μm，圖8D中脹破液珠(箭頭處)壓力為563.5 N/m² ，其橫柱比例尺為200μm。

圖10A-10C係表示懸吊液珠高度對壓力的相互關係圖。

圖11A-11D係表示本發明一微流體懸吊液珠晶片(左圖)從其下面(右圖)所視的剖視示意圖以及懸吊液珠的顯微照片，其係使用一微流體懸吊液珠晶片方法所顯示之老鼠胚胎幹細胞培養，橫比例尺為500μm。

圖12A-12D係表示從下面所視之懸吊液珠的顯微照片，其係顯示使用一微流體懸吊液珠晶片方法在不同時間點時，老鼠胚胎纖維母細胞聚集之形成，其中，圖12A為0小時，圖12B為18小時，以及圖12C為25小時。

圖13A-13B係表示從下面所視之懸吊液珠的顯微照片，其係顯示人類肺癌細胞聚集之形成，其中，圖12A係將一傳統懸吊液珠方法使用在1小時的細胞培養，圖12B係將一微流體懸吊液珠晶片方法使用在0小時的細胞培養，橫柱比例尺為200μm。

圖14A-14B係表示從下面所視之懸吊液珠的顯微照片，其係顯示在一24小時之細胞培養後之人類肺癌細胞聚集之形成，其中，圖14A為傳統懸吊液珠方法，圖14B為微流體懸吊液珠晶片方法，橫柱比例尺為200μm。

圖15A-15B係表示從下面所視之懸吊液珠的顯微照片，其係顯示在一48小時之細胞培養後之人類肺癌細胞聚集之形成，其中，圖15A為傳統懸吊液珠方法，圖15B為微流體懸吊液珠晶片方法，橫柱比例尺為200μm。

圖16係表示本發明一微流體懸吊液珠晶片之側視示意圖。

圖17A-17D係表示輸入口與輸出口之形成的製程示意圖。