[go: up one dir, main page]

TWI444189B - 羊毛甾醇－８，２４－二烯－３β，１５α，２１－三醇抑制腫瘤細胞生長之用途 - Google Patents

羊毛甾醇－８，２４－二烯－３β，１５α，２１－三醇抑制腫瘤細胞生長之用途 Download PDF

Info

Publication number
TWI444189B
TWI444189B TW100119159A TW100119159A TWI444189B TW I444189 B TWI444189 B TW I444189B TW 100119159 A TW100119159 A TW 100119159A TW 100119159 A TW100119159 A TW 100119159A TW I444189 B TWI444189 B TW I444189B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
compound
formula
cell
cells
tumor
Prior art date
Application number
TW100119159A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201247207A (en
Inventor
Yu Jen Chen
Cheng Jen Chou
Tun Tschu Chang
Original Assignee
Mackay Memorial Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mackay Memorial Hospital filed Critical Mackay Memorial Hospital
Priority to TW100119159A priority Critical patent/TWI444189B/zh
Priority to US13/483,620 priority patent/US8546366B2/en
Publication of TW201247207A publication Critical patent/TW201247207A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI444189B publication Critical patent/TWI444189B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

羊毛甾醇-8,24-二烯-3β,15α,21-三醇抑制腫瘤細胞生長之用途
本發明係關於一種化合物之用途，特別是關於一種使用該化合物用於製造抑制腫瘤細胞增生之藥物的用途。
牛樟芝(Antrodia cinnamomea )屬於多孔菌科(Polyporaceae )、薄孔菌屬(Antrodia )之台灣本土真菌，又名牛樟菇、樟菇。牛樟芝只生長在高海拔的常綠闊葉大喬木的牛樟樹(Cinnamomum kanehirae)上，且牛樟芝的成分複雜繁多，含有豐富的生理活性物質，如多醣體、三帖類化合物、小分子蛋白質、維生素、微量元素、核酸、類固醇、血壓穩定物質等。在台灣民俗醫學上，牛樟芝為極佳的解毒劑，對食物中毒、農藥中毒，均有良好的解毒作用。
白血病(leukemic)俗稱血癌，是最常見的惡性血液腫瘤，佔小兒癌症發生率之第一位，雖然目前有許多治療進展，但仍具有高復發率無法完全治癒的困難。胰臟癌(pancreatic cancer)主要為胰管上皮細胞的腺癌，由於胰管位於後腹腔，胰臟癌症早期不易確診，且進程快速具高度復發及遠處轉移特性，因其對化學治療和放射治療皆有抗性固故不易消除。胰臟癌、肝癌(hepatoma)及食道癌(esophageal cancer)在成人癌症中整體治療效果目前仍不理想，無法以手術切除者，整體五年存活率低於5%。子宮頸腺癌(cervical adenocarcinoma cancer)屬於子宮頸癌症中較容易復發及轉移者，常對治療有抵抗性。
在細胞毒性劑的癌症治療中，主要的劑量限制為細胞毒性劑對正常的細胞及組織之毒性。對於晚期及末期癌症患者，因其對細胞毒性藥劑的承受度較低，特別要考量藥劑的安全性。故發展抗此些極具破壞性的惡性腫瘤且對正常細胞毒性較小之新穎藥物為目前迫切需要的。
雖然由目前諸多報導可得知牛樟芝萃取物具有藥學治療功效，但究竟萃取物中之何種有效成分可促成牛樟芝達到抑制腫瘤細胞效果，目前則仍處於試驗階段，並少有具體之相關有效成分發表，有待進一步實驗研究來釐清，故若能將牛樟芝萃取物進一步純化分析找出該萃取物中所含真正有效抑癌成分，並將其應用於抑制肝癌、食道癌、子宮頸腺癌、胰臟癌與白血病細胞生長上，對於人類治療上述疾病實將產生莫大的助益。
為研究出牛樟芝萃取物中所含可抑制腫瘤細胞生長之有效成份，本發明係由牛樟芝萃取物中分離純化出具下列結構式之化合物：
如式(1)結構式之化合物，其化學名為羊毛甾醇-8,24-二烯-3β,15α,21-三醇(Lanosta-8,24-dien-3β,15α,21-triol)，分子式C30 H50 O3 ，分子量458.3756。
本發明中之羊毛甾醇-8,24-二烯-3β,15α,21-三醇係分離純化自牛樟芝子實體之有機溶劑萃取物，有機溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或鹵烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，其中較佳者為乙醇，但並不以此為限，凡是可自牛樟芝萃取出式(1)化合物之有機溶劑皆可應用於此。
本發明式(1)之化合物係藉由誘發人類實體腫瘤，例如肝癌、食道癌、子宮頸腺癌或胰臟癌之腫瘤細胞產生細胞凋亡(apoptosis)，進而抑制其生長；此外，式(1)之化合物對於血液腫瘤，例如人類白血病細胞U937之生長抑制機制，則係經由細胞凋亡以及有絲分裂障礙(mitotic catastrophe)之路徑。
藉由前述化合物，本發明係將其應用於抑制腫瘤細胞生長上，使能進一步用於治療癌症之醫藥組成份中，增益癌症之治療效果。本發明化合物得應用之範圍包括抑制白血病以及肝癌、食道癌、子宮頸腺癌或胰臟癌腫瘤細胞等之生長，使該等腫瘤細胞無法迅速生長，進而抑制腫瘤之增生，延緩腫瘤之惡化，因此，可進一步利用肝癌、食道癌、子宮頸腺癌、胰臟癌或白血病等癌症之治療上。
另一方面，本發明中亦可將式(1)之化合物利用於治療血液腫瘤及實體腫瘤等醫藥組成物之成分中，藉以抑制該等腫瘤細胞的生長。前述醫藥組成物除包括有效劑量之式(1)之化合物外，尚可包括藥學上可接受的載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或澱粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此。本發明醫藥組成物可依一般習知藥學之製備方法生產製造，將有效成分劑量之式(1)之化合物與一種以上之載體相混合，製備出所需之劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其他液體製劑，但未以此為限。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
首先取牛樟芝(Antrodia cinnamomea )子實體利用習知萃取方式，以水或有機溶劑進行萃取，藉以取得牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物。其中，有機溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或鹵烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，但並不以此為限。其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。經萃取過後之牛樟芝有機溶劑粗萃取物，可進一步藉由各種管柱層析加以分離純化，之後再對所得每一純質進行抑癌效果的測試。再針對具抑癌效果之分液藉由各種光譜數據如核磁共振(NMR)、質譜(MS)或紫外線光譜(UV)，比旋光值進行成分結構式分析，最終即發現本發明中如式(1)之化合物，即羊毛甾醇-8,24-二烯-3β,15α,21-三醇(Lanosta-8,24-dien-3β,15α,21-triol)，分子式C30 H50 O3 ，分子量458.3756。式(1)之化合物可選擇性抑制特定種類的腫瘤細胞，但不影響正常單核球(monocyte)。
為證實式(1)之化合物對腫瘤細胞生長之抑制效果，本發明中利用3-(4,5-二甲基-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,MTT)分析法，根據美國國家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，對肝癌、食道癌、子宮頸腺癌、白血病、胰臟癌或卵巢癌等腫瘤細胞進行細胞存活率之測試，並藉由檢測式(1)之化合物處理腫瘤細胞後之形態觀察以及細胞週期分布情形進行進一步了解式(1)之化合物對腫瘤細胞之作用機制。由該些測試，式(1)之化合物顯著抑制人類白血病腫瘤細胞U937、胰臟癌腫瘤細胞BxPc-3、食道癌腫瘤細胞81T、肝癌腫瘤細胞HA22T/VGH以及子宮頸腺癌腫瘤細胞HeLa；然而，卵巢癌腫瘤細胞SKOV-3除外。在這些腫瘤細胞的抑制率在48.5%至99.8%之間。茲對前述實施方式詳盡說明如下：
實施例1 式(1)之化合物之分離
首先取約1012 g之牛樟芝(Antrodia cinnamomea )子實體，利用習知萃取方式，以蒸餾水於85℃下萃取4次(4×10L)。剩下之子實體殘渣以乙醇加熱迴流(reflux)5次(5×20L)，共約6小時，接著將乙醇萃取物進行蒸發。將濃縮物(354.2 g)懸浮於2L二次水中，並以體積比為1:1之二氯甲烷(dichloromethane)與水劃分之，藉以分為有機成份部份與水溶性成份部份。將蒸乾之該有機成份(311.5g)溶於1.5L之甲醇中並區分為可溶於甲醇部份(296.4克)以及不溶於甲醇部份(15.1g)，可溶於甲醇部份則利用二溶劑系統(正己烷中乙酸乙酯梯度，接者以二氯甲烷中甲醇梯度)作為沖提液，以矽膠管柱分層。於各分部(fraction)收集500mL分液並應用矽膠薄片置進甲苯/乙酸乙酯/乙酸(10:1:0.5)溶媒系統展開的薄層層析法(Thin Layer Chromatography,TLC)分為10個分部(Fr I～X)。分部IV(53.1g)再以甲醇處理，分為可溶於甲醇部分與不溶於甲醇部份，該可溶於甲醇部分(Fr IV-MS,51.6g)利用矽膠液相色譜儀(silica gel MPLC)(己烷中丙酮梯度)層析，分成38個次分部(Fr IV-MS-1~38)。再將Fr IV-MS-26經矽膠液相色譜儀(己烷中丙酮梯度)層析，並經高效液相層析(HPLC，使用20×250mm Cosmosil 5C18 -AR-II管柱、以於水中70~100%甲醇(含0.5%乙酸)之梯度溶劑系統、流速16mL/min、紫外光偵測器設定於210 nm)後，進而獲得式(1)之化合物(12mg)。
式(1)之化合物之化學名為羊毛甾醇-8,24-二烯-3β,15α,21-三醇(Lanosta-8,24-diene-3β,15α,21-triol)，分子式C30 H50 O3 ，分子量458.3756，呈白色粉末狀；溶點為168~170℃；:+41.9°(甲醇，c0.62)；NMR分析值如表一所示：
實施例2： 體外抗白血病腫瘤細胞之活性測試
為進一步測試式(1)之化合物對腫瘤細胞之抑制效果，本實施例將根據美國國家癌症研究所(NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式進行之。取式(1)之化合物，加入含有人類白血病腫瘤細胞U937(monoblastoid leukemic cell line)之培養液中，以進行腫瘤細胞存活率之測試。細胞存活率之測試可採習知之MTT分析法進行分析，而U937為組織淋巴瘤細胞，購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC)，其係屬於人類白血病細胞系的一種，在造血過程中被分級為單核母細胞(monoblasts)。
MTT分析法是一種常見用於分析細胞存活率(percent of viable cells)的分析方法。其中，MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide)為一黃色染劑，它可被活細胞吸收並被粒腺體中的琥珀酸四唑還原酶(succinate tetrazolium reductase)還原成不溶水性且呈藍紫色的formazan，因此藉由formazan形成多寡，即可判斷並計算細胞之存活率。
首先將人類白血病細胞U937置於含有牛血清(fetal calf serum,FCS)之RPMI 1640培養液中培養24小時，並使細胞維持於指數(exponential)生長狀態。將增生後之細胞，使用濃度分別為0(控制組)、1.25、2.5、5、10 μg/ml之式(1)之化合物(實驗組)，於37℃、5% CO2 下培養24-72小時。其後，於避光的環境下於每一孔內加入500 μg/ml的MTT，反應4小時後再於每一孔內加入500 μl isopropanol終止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率。所得結果係以平均值±標準誤差值(SEM)表示之，並藉由t檢定(t -test)統計程式比對各實驗結果間差異，其中p 值小於0.05代表具有統計上之顯著差異。
結果於試驗第一天，藉由濃度為1.25、2.5、5、10 μg/ml之式(1)之化合物的作用，其可有效抑制人類白血病腫瘤細胞U937之生長，且生長抑制率會隨式(1)之化合物濃度增加而提升，至試驗第三天，各濃度式(1)之化合物對人類白血病腫瘤細胞U937之生長抑制率皆超過60%，且濃度為5與10 μg/ml之式(1)之化合物之生長抑制率可達約95%以上，最高可達99.8%，IC50 約為2 μg/ml。因此可證實牛樟芝萃取物中之式(1)之化合物確實能夠利用於白血病腫瘤細胞生長之抑制，且其抑制作用係遵循劑量依賴性原則(dose-dependent manner)與時間依存性原則(time-dependent manner)。
實施例3： 體外抗胰臟癌腫瘤細胞之活性測試
本測試亦係根據細胞存活分析法(即前述MTT分析法)，將分離純化之式(1)之化合物，加入含有人類胰臟癌腫瘤細胞BxPc-3之培養液中，並採前述MTT分析法進行分析，藉以測試胰臟癌腫瘤細胞存活率，其中，BxPc-3屬於胰臟癌腫瘤細胞系，購自美國菌種保存中心(ATCC)，其係為源自於人類胰腺癌之貼附型上皮細胞株。
首先將人類胰臟癌腫瘤細胞BxPc-3培養於DMEM培養液中，此培養液尚包含：100 IU/ml盤尼希林(penicillin；Invitrogen,Carlsbad,CA)、100 μg/ml鏈黴素(Streptomycin；Invitrogen,Carlsbad,CA)、2 mM麩醯胺酸(glutamine；Invitrogen,Carlsbad,CA)以及10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS；Atlanta Biologicals,Norcross,GA)。將增生後之細胞，使用濃度分別為0(控制組)、5、10 μg/ml之式(1)之化合物(實驗組)，於37℃、5% CO2 下培養24-72小時。其後，於避光的環境下於每一孔內加入500 μg/ml的MTT，反應4小時後再於每一孔內加入500 μl isopropanol終止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率。所得結果係以平均值±標準誤差值(SEM)表示之，並藉由t檢定(t -test)統計程式比對各實驗結果間差異，其中p 值小於0.05代表具有統計上之顯著差異。
結果顯示，式(1)之化合物係可顯著抑制人類胰臟癌腫瘤細胞BxPc-3之生長，且生長抑制率會隨式(1)之化合物濃度增加而提升，同時亦會隨作用時間增長而增進生長抑制率，至試驗第三天，濃度為5與10 μg/ml之式(1)之化合物之生長抑制率最高可達48.5%。因此可證實牛樟芝萃取物中之式(1)之化合物確實能夠利用於人類胰臟癌腫瘤細胞生長之抑制，且其抑制作用係遵循劑量依存性原則與時間依存性原則。
實施例4： 體外抗食道癌腫瘤細胞之活性測試
本測試亦係根據細胞存活分析法，將分離純化之式(1)之化合物，加入含有人類食道癌腫瘤細胞81T之培養液中，並採前述MTT分析法進行分析，藉以測試食道癌腫瘤細胞存活率，其中，81T屬於食道癌腫瘤細胞系，來自台北榮民總醫院菌種保存中心，其係為源自於人類食道癌之鱗狀上皮細胞株。
首先將人類食道癌腫瘤細胞81T培養於DMEM培養液中，此培養液尚包含：100 IU/ml盤尼希林(penicillin；Invitrogen,Carlsbad,CA)、100 μg/ml鏈黴素(Streptomycin；Invitrogen,Carlsbad,CA)、2 mM麩醯胺酸(glutamine；Invitrogen,Carlsbad,CA)以及10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS；Atlanta Biologicals,Norcross,GA)。將增生後之細胞，使用濃度分別為0(控制組)、5μg/ml之式(1)之化合物(實驗組)，於37℃、5% CO2 下培養24-72小時。其後，於避光的環境下於每一孔內加入500 μg/ml的MTT，反應4小時後再於每一孔內加入500 μl isopropanol終止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率。
式(1)之化合物在低濃度5μg/ml下處理人類食道癌腫瘤細胞81T，72小時後之生長抑制率為61.4%。
實施例5： 體外抗肝癌腫瘤細胞之活性測試
本測試亦係根據細胞存活分析法，將分離純化之式(1)之化合物，加入含有人類肝癌腫瘤HA22T-VGH細胞之培養液中，並採前述MTT分析法進行分析，藉以測試肝癌腫瘤細胞存活率，其中，HA22T-VGH屬於肝癌腫瘤細胞系，來自台北榮民總醫院菌種保存中心，其係為源自於人類肝癌腫瘤之細胞株。
首先將人類肝癌腫瘤細胞HA22T-VGH培養於DMEM培養液中，此培養液尚包含：100 IU/ml盤尼希林(penicillin；Invitrogen,Carlsbad,CA)、100 μg/ml鏈黴素(Streptomycin；Invitrogen,Carlsbad,CA)、2 mM麩醯胺酸(glutamine；Invitrogen,Carlsbad,CA)以及10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS；Atlanta Biologicals,Norcross,GA)。將增生後之細胞，使用濃度分別為0(控制組)、5μg/ml之式(1)之化合物(實驗組)，於37℃、5% CO2 下培養24-72小時。其後，於避光的環境下於每一孔內加入500 μg/ml的 MTT，反應4小時後再於每一孔內加入500 μl isopropanol終止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率。
式(1)之化合物在低濃度5μg/ml下處理人類肝癌腫瘤細胞HA22T-VGH，72小時後之生長抑制率為90.3%。
實施例6： 體外抗子宮頸腺癌腫瘤細胞之活性測試
本測試亦係根據細胞存活分析法，將分離純化之式(1)之化合物，加入含有人類子宮頸腺癌腫瘤HeLa細胞之培養液中，並採前述MTT分析法進行分析，藉以測試子宮頸腺癌腫瘤細胞存活率，其中，HeLa屬於子宮頸腺癌腫瘤細胞系，購自美國菌種保存中心(ATCC)，其係為源自於人類子宮頸腺癌之貼附型上皮細胞株。
首先將人類子宮頸腺癌腫瘤細胞HeLa培養於DMEM培養液中，此培養液尚包含：100 IU/ml盤尼希林(penicillin；Invitrogen,Carlsbad,CA)、100 μg/ml鏈黴素(Streptomycin；Invitrogen,Carlsbad,CA)、2 mM麩醯胺酸(glutamine；Invitrogen,Carlsbad,CA)以及10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS；Atlanta Biologicals,Norcross,GA)。將增生後之細胞，使用濃度分別為0(控制組)、5μg/ml之式(1)之化合物(實驗組)，於37℃、5% CO2 下培養24-72小時。其後，於避光的環境下於每一孔內加入500 μg/ml的MTT，反應4小時後再於每一孔內加入500 μl isopropanol終止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率。
式(1)之化合物在低濃度5μg/ml下處理人類子宮頸腺癌腫瘤細胞HeLa，72小時後之生長抑制率為56.8%。
實施例7： 體外抗卵巢癌腫瘤細胞之活性測試
本測試亦係根據細胞存活分析法，將分離純化之式(1)之化合物，加入含有人類卵巢癌腫瘤SKOV-3細胞之培養液中，並採前述MTT分析法進行分析，藉以測試卵巢癌腫瘤細胞存活率，其中，SKOV-3屬於卵巢癌腫瘤細胞系，購自美國菌種保存中心(ATCC)，其係為源自於人類卵巢癌之貼附型上皮細胞株。
首先將人類卵巢癌腫瘤細胞SKOV-3培養於DMEM培養液中，此培養液尚包含：100 IU/ml盤尼希林(penicillin；Invitrogen,Carlsbad,CA)、100 μg/ml鏈黴素(Streptomycin；Invitrogen,Carlsbad,CA)、2 mM麩醯胺酸(glutamine；Invitrogen,Carlsbad,CA)以及10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS；Atlanta Biologicals,Norcross,GA)。將增生後之細胞，使用濃度分別為0(控制組)、5μg/ml之式(1)之化合物(實驗組)，於37℃、5% CO2 下培養24-72小時。其後，於避光的環境下於每一孔內加入500 μg/ml的MTT，反應4小時後再於每一孔內加入500 μl isopropanol終止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率。
式(1)之化合物在低濃度5μg/ml下處理人類卵巢癌腫瘤細胞SKOV-3，72小時後之生長抑制率為無。
實施例8： 癌症腫瘤細胞經式(1)之化合物處理後之細胞週期分析
本試驗係利用流式細胞儀分析式(1)之化合物對人類白血病腫瘤細胞週期之影響。
取濃度為2.5 ug/ml之式(1)之化合物處理人類白血病腫瘤細胞U937，並分別以未經處理之U937作為控制組。取上述處理48小時後之細胞，於4℃下以70%乙醇固定1小時，接著利用CycleTESTPLUS DNA套組(Becton Dickinson,Lincoln Park,NJ)中提供之含有0.5 mg/ml碘化丙錠(propidium iodide)與0.1 mg/ml RNAse之碘化丙錠溶液染色30分鐘，再以流式細胞儀(Flow cytometry,FACScalibur；Becton Dickionson)檢測該些細胞中的DNA含量，收集來自104 細胞之資料並以ModFit(Becton Dickinson)軟體分析細胞週期之變化，其結.果如第一圖。
經式(1)之化合物作用之白血病腫瘤細胞U937呈現特殊的細胞週期分佈，包括低倍體(hypoploidy)、G2/M細胞週期停滯以及多倍體(polyploidy)，參考第一圖。推測U937細胞死亡模式包括凋亡(apoptosis)以及有絲分裂障礙(mitotic catastrophe)。
實施例9： 式(1)之化合物對腫瘤細胞核內DNA之影響
除前述型態外觀上的變化外，細胞凋亡發生時細胞亦會產生一些生化特性上的改變，包括細胞核染色質的濃集(chromatin condensation)、細胞皺縮裂解形成凋亡小體(apoptotic body)以及凋亡後期之DNA斷裂(internucleosomal cleavage of DNA)而在DNA電泳時形成DNA梯度(DNA ladder)等。因此為進一步確認式(1)之化合物抑制人類白血病腫瘤細胞U937係與細胞凋亡之何階段有關，本試驗利用DNA電泳檢測是否有細胞凋亡後期，細胞核內DNA裂解成梯度片段的產生。
式(1)之化合物誘導之細胞死亡經由DNA電泳證實式(1)之化合物會引發染色體DNA(genomic DNA)碎裂成寡核酸片段(oligonucleosomal fragmentation)，即為凋亡之特徵，將該DNA以1.5%電泳膠置於含1 μM EDTA之5 mM TBE電泳緩衝液(pH 8.0)中進行電泳分析，接著將膠片以溴化醯液(Ethidium Bromide)染色，再於紫外光下觀察，其結果如第二圖所示。
實施例10： 式(1)之化合物對癌症腫瘤細胞粒線體膜電位及蛋白酶caspase之影響
將人類白血病腫瘤細胞U937以濃度為5 μg/ml之式(1)之化合物處理16小時，並以經4μM抗腫瘤物質喜樹鹼(Camptothecin)處理16小時之U937作為陽性對照組，未經處理之細胞為控制組。將上述細胞以PBS清洗後，加入40 nM 3,3'-dihexyloxacarbocyanine(DiOC6(3)；Molecular Probes,Eugene,OR)於37℃下避光培養15分鐘，立刻以流式細胞儀分析之，並分別以波長為488 nm之激發光(excitation)與波長為530 nm之發射光(emission)偵測綠螢光密度，以此代表粒線體膜電位的變化。
細胞凋亡過程中若受粒線體途徑影響，則粒線體的膜電位會下降。經式(1)之化合物處理之人類白血病細胞U937並未呈現顯著下降趨勢，此表示式(1)之化合物所誘導腫瘤細胞走向凋亡的路徑，可能與粒線體途徑無關係。
因此，式(1)之化合物並沒有改變粒線體膜電位(mitochondrial transmembrane potential)，故為粒線體-獨立(mitochondria-independent)路徑。蛋白酶3(caspase 3)和泛蛋白酶(pan-caspase)抑制劑可阻斷喜樹鹼(camptothecin)誘導之生長抑制劑，但不阻斷式(1)之化合物誘導之生長抑制劑。此外，蛋白酶3和蛋白酶8的表現不隨式(1)之化合物改變。因此，式(1)之化合物可能藉由蛋白酶-獨立路徑誘導凋亡。
實施例11： 式(1)之化合物對人類正常單核白血球之影響
式(1)之化合物對骨髓白血病細胞的正常對應周邊血液單核細胞(mononuclear cells)分離出來的人類正常單核白血球只有些微抑制(低於10%)。
由上述實施例可知，式(1)之化合物對人類白血病U937細胞具有高達99.8%之生長抑制作用；式(1)之化合物在低濃度5μg/ml下處理人類肝癌腫瘤細胞HA22T-VGH、胰臟癌腫瘤細胞BxPc-3、食道癌腫瘤細胞81T及子宮頸腺癌腫瘤細胞HeLa，72小時後之生長抑制率分別為90.3%、49.1%、61.4%及56.8%。
根據上述實施例可知，式(1)之化合物擁有優異的抗人類白血病腫瘤細胞、胰臟腫瘤細胞、食道腫瘤細胞、肝腫瘤細胞以及子宮頸腺腫瘤細胞之細胞毒性，而對正常單核白血球不具明顯毒性。
另一方面，本發明亦可將式(1)之化合物利用於治療白血病、胰臟癌、肝癌、食道癌與子宮頸腺癌等醫藥組成物之成分中，藉以抑制該等腫瘤細胞的生長，並助益於上述腫瘤之治療。前述醫藥組成物除包括有效劑量之式(1)之化合物外，尚可包括藥學上可接受的載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或澱粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此。本發明醫藥組成物可依一般習知藥學之製備方法生產製造，將式(1)之化合物有效成分劑量與一種以上之載體相混合，製備出所需之劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其他液體製劑，但未以此為限。
第一圖係為人類白血病腫瘤細胞U937經式(1)之化合物處理之細胞週期分析。以DNA直方圖表示。A.控制組；B.由2.5μg/ml之式(1)之化合物處理兩天後。
第二圖係為DNA膠體電泳圖。泳道1為分子定量標記；泳道2為控制組；泳道3為由5μg/ml之式(1)之化合物處理24小時後之結果。

Claims (8)

  1. 一種具下列結構式之化合物以製備抑制腫瘤細胞增生之藥物的用途， 其中該腫瘤細胞為食道癌(esophageal cancer)、子宮頸腺癌(cervical adenocarcinoma cancer)或胰臟癌(pancreatic cancer)之腫瘤細胞或白血病腫瘤細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物係藉由使食道癌腫瘤細胞之G0/G1細胞週期呈現停滯，並使sub-G1細胞核族群比例增加，誘發細胞凋亡。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該食道癌腫瘤細胞係81T細胞株。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物係藉由使子宮頸腺癌腫瘤細胞之G0/G1細胞週期呈現停滯，並使sub-G1細胞核族群比例增加，誘發細胞凋亡。
  5. 如申請專利範圍第1項或第4項所述之用途，其中該子宮頸腺癌腫瘤細胞係HeLa細胞株。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物係藉由使胰臟癌腫瘤細胞之G0/G1細胞週期呈現停滯，並使sub-G1細胞核族群比例增加，誘發細胞凋亡。
  7. 如申請專利範圍第1項或第6項所述之用途，其中該胰臟癌腫瘤細胞 係BxPc-3細胞株。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物係由牛樟芝萃取物所分離製得。
TW100119159A 2011-05-31 2011-05-31 羊毛甾醇－８，２４－二烯－３β，１５α，２１－三醇抑制腫瘤細胞生長之用途 TWI444189B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW100119159A TWI444189B (zh) 2011-05-31 2011-05-31 羊毛甾醇－８，２４－二烯－３β，１５α，２１－三醇抑制腫瘤細胞生長之用途
US13/483,620 US8546366B2 (en) 2011-05-31 2012-05-30 Method for inhibition of tumor cell growth using (22R)-5α-lanosta-8,24-dien-3β,15α,21-triol

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW100119159A TWI444189B (zh) 2011-05-31 2011-05-31 羊毛甾醇－８，２４－二烯－３β，１５α，２１－三醇抑制腫瘤細胞生長之用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201247207A TW201247207A (en) 2012-12-01
TWI444189B true TWI444189B (zh) 2014-07-11

Family

ID=47262144

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW100119159A TWI444189B (zh) 2011-05-31 2011-05-31 羊毛甾醇－８，２４－二烯－３β，１５α，２１－三醇抑制腫瘤細胞生長之用途

Country Status (2)

Country Link
US (1) US8546366B2 (zh)
TW (1) TWI444189B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI612026B (zh) * 2013-02-20 2018-01-21 國鼎生物科技股份有限公司 環己烯酮組成物及其製造方法
TWI597061B (zh) * 2013-02-20 2017-09-01 國鼎生物科技股份有限公司 治療白血病之方法及組成物
TW202202158A (zh) * 2020-06-30 2022-01-16 台灣利得生物科技股份有限公司 牛樟芝組合物於免疫調節的用途

Also Published As

Publication number Publication date
US20120309732A1 (en) 2012-12-06
US8546366B2 (en) 2013-10-01
TW201247207A (en) 2012-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zakaria et al. Eurycomanone induce apoptosis in HepG2 cells via up-regulation of p53
Adil et al. Sodium arsenite-induced myocardial bruise in rats: Ameliorative effect of naringin via TGF-β/Smad and Nrf/HO pathways
Esmaeili et al. Inactivation of PI3K/Akt pathway and upregulation of PTEN gene are involved in daucosterol, isolated from Salvia sahendica, induced apoptosis in human breast adenocarcinoma cells
Lin et al. Isoorientin from Gypsophila elegans induces apoptosis in liver cancer cells via mitochondrial-mediated pathway
Wang et al. Protective effects of Punica granatum (pomegranate) peel extract on concanavalin A-induced autoimmune hepatitis in mice
Hao et al. Acetylshikonin induces apoptosis of human leukemia cell line K562 by inducing S phase cell cycle arrest, modulating ROS accumulation, depleting Bcr-Abl and blocking NF-κB signaling
Liu et al. Tetrahydrocurcumin is more effective than curcumin in inducing the apoptosis of H22 cells via regulation of a mitochondrial apoptosis pathway in ascites tumor-bearing mice
Mathema et al. Growth inhibitory effect of β‐eudesmol on cholangiocarcinoma cells and its potential suppressive effect on heme oxygenase‐1 production, STAT 1/3 activation, and NF‐κB downregulation
Yu et al. 2-methoxyjuglone induces apoptosis in HepG2 human hepatocellular carcinoma cells and exhibits in vivo antitumor activity in a H22 mouse hepatocellular carcinoma model
Lee et al. Anticancer effects on human pancreatic cancer cells of triterpenoids, polysaccharides and 1, 3-β-D-glucan derived from the fruiting body of Antrodia camphorata
Li et al. Croton tiglium extract induces apoptosis via Bax/Bcl-2 pathways in human lung cancer A549 cells
US7994158B2 (en) Method for inhibiting tumor growth with dehydrosulphurenic acid extracted from Antrodia cinnamomea
Okpako et al. Antiproliferative activity of ethyl acetate fraction of Euphorbia ingens against prostate cancer cell line: an in silico and in vitro analysis
Baohong et al. Latex derived from Ficus carica L. inhibited the growth of NSCLC by regulating the caspase/gasdermin/AKT signaling pathway
TWI444189B (zh) 羊毛甾醇－８，２４－二烯－３β，１５α，２１－三醇抑制腫瘤細胞生長之用途
Ezzat et al. Anti-carcinogenic effects and mechanisms of actions of Citrus limon fruit peel hydroethanolic extract and limonene in diethylnitrosmine/2-acetylaminofluorene-induced hepatocellular carcinoma in Wistar rats
Einafshar et al. Pro-apoptotic effect of chloroform fraction of Moraea sisyrinchium bulb against glioblastoma cells
Nandi et al. Anti‐cancer effect of astrakurkurol from a folklore tribal mushroom on human hepatocellular carcinoma cells via mediating cell cycle inhibition, apoptosis, and migration
Zhang et al. Compositions and anti-tumor activity of Pyropolyporus fomentarius petroleum ether fraction in vitro and in vivo
Sangpairoj et al. Extract of the sea cucumber, Holothuria scabra, induces apoptosis in human glioblastoma cell lines
Zou et al. A polysaccharide from Andrographis paniculata induces mitochondrial-mediated apoptosis in human hepatoma cell line (HepG2)
Huang et al. A composition of bractatin and neobractatin from the fruits of Garcinia bracteata induces apoptosis in throat cancer through the endoplasmic reticulum stress, mitochondrial apoptotic and Akt pathways
Sharma et al. In vitro and in vivo evaluation of antitumor activity of methanolic extract of Argyreia nervosa leaves on Ehrlich ascites carcinoma
Hashemi et al. Salvurmin A and Salvurmin B, Two Ursane Triterpenoids of Salvia urmiensis Induce Apoptosis and Cell Cycle Arrest in Human Lung Carcinoma Cells
Yew et al. Tannic acid-rich porcupine bezoars induce apoptosis and cell cycle arrest in human colon cancer cells