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TWI338045B - Recombinant attenuated clostridium organisms and vaccine - Google Patents

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TWI338045B
TWI338045B TW096113489A TW96113489A TWI338045B TW I338045 B TWI338045 B TW I338045B TW 096113489 A TW096113489 A TW 096113489A TW 96113489 A TW96113489 A TW 96113489A TW I338045 B TWI338045 B TW I338045B
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clostridium perfringens
toxin
amino acid
animal
organism
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Mark D Cochran
Gary Petersen
Steven V Lair
Richard Synenki
Original Assignee
Schering Plough Ltd
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Description

1338045 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於減毒梭狀芽孢桿菌（c/cmrz•山生物體、 製備及使用該等之方法、及突變蛋白α_毒素和編碼其之核 酸。 【先前技術】 厭氧細菌病原體係農業生產之嚴重的經濟負擔。梭狀芽 孢桿菌家族細菌代表一特殊的負擔，乃因此等細菌可致使 家禽及其他有經濟價值的家畜患嚴重疾病。控制此等生物 體之先前努力依賴於衛生處理及在動物飼料中投與抗生 素。 特定言之’產氣莢膜梭狀芽孢桿菌（"c係 —種發現於土壤'衰變有機物質中之厭氧細菌，且係人類 及動物之腸道菌叢的一部分。將產氣莢膜梭狀芽孢桿菌之 不同菌株標識為生物型A至生物型E，視所產生毒素之光 譜而定[Justin 等人’仏少 4/，6253-6262 (2002). McDonel (1986) PHARMACOLOGY OF BACTERIAL-TOXINS; F Dorner 及 J Drews (編輯）pergamon press，
Oxford]。生物型A菌株作為各類別壞疽及腸道疾病之病原 具有特別重要性。一種由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌引起的特 別嚴重的腸道疾病係壞疽性腸炎（業内亦稱作"壞死性腸 炎"）’ 一種可導致人類及飼養動物二者患壞死病、敗血 症、及溶血病之腸壞疽[參見，Pearson等人，乂 Vet.
Med. /55 ("^):1309-10 (1986); Al-Sheikhy及 Truscott, 119708.doc 1338045 版27⑺:256-63 (1977)]。對於禽類，例如，雞（紅原雞 ㈣心而言，壞疽性腸炎係一個非常嚴重的問 題。A型或C型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌可引起重大的損 失，尤其在肉用仔雞生產中[FWUW⑽，細_ In Diseases of Poultry，第 1〇版第 26ι·264 頁 (1997)]。除與壞死性腸炎暴發相關之損失外，據報導，產 氣莢膜梭狀芽孢桿菌相關性疾病亦會損害畜群之生產能力 [Lovl^Kaldhusdal, A.ian Pathology 30:73-81 (2001)] ^ ,0 上所述，在動物飼料中加入抗菌劑係最常見的控制方法。 Μ ’抗菌劑（例如’抗生素）成本較高且人們對細菌抗性 提高之擔心日盛。 近來，人們已試圖提供可抵抗有害梭狀芽孢桿菌菌種之 疫苗。舉例而言，Lovland等人Ρ_〇/〇灯3仙：83_
V. 92 (2004)]證實候選疫苗係基於產氣英膜梭狀芽抱桿菌八型 及C型類毋素及氫氧化鋁佐劑。據報導，對母雞實施接種 可產生特異性抗體以保護子代免受由產氣莢膜梭狀芽孢桿 菌亞臨床挑戰引起的腸道損傷。自去毒產氣莢膜梭狀穿孢 才干菌毒素製備的基於其他類毒素之疫苗已為人們所知[參 見，例如，美國專利第4,292,3〇7號’該案闡述如下之類毒 素.A型、B型及D型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌、水腫梭菌 (C7· 、及敗毒梭菌（c/ 。 亦建議使用重组類毒素製劑。舉例而言，Titbai丨等人[美 國專利第5,851，827號、第6,403,094號、及第5,817,317號] 報導編碼抗原性產氣莢膜梭狀芽孢桿菌肽之核酸、以及該 119708.doc 等肽自身、及自遠等肽製備之疫苗。例如，闡述了具有天 :、，i產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α毒素之胺基酸殘基26丨至3〇〇， 4缺 >、天然毋素之鞘碟脂水解酶（hydr〇lyZjns)功能域及填 脂酶C的狀。亦報導了此等肽可誘導抵抗該天然毒素之免 疫保護。另外，美國專利第6,61〇,3〇〇號闡述了基於突變蛋 白產氣莢膜梭狀芽孢桿菌β_毒素之抗原性片段的疫苗。 然而，無論類毒素疫苗係源自天然生物體抑或以重組方 式後彳于’製備及向有免疫接種需要之動物投與類毒素蛋白 均被視為沉重的經濟負擔，特殊環境下（例如，治療可能 對整個有機體疫苗之其他組份過敏或敏感的人）除外。而 且，基於蛋白質/類毒素之疫苗通常需要重複加強疫苗以 維持完全效能。 另一建議解決方案係改造可產生代替野生型毒素之突變 蛋白α-毒素的抗原活性病毒。舉例而言，BenneU等人 ;2「以：97_1〇5 (1999)]已闡明表現產氣莢膜 梭狀芽孢桿菌α-毒素之無毒性c功能域的重組牛痘病毒載 體。遺憾的是，儘管在過去2〇年裏建議使用若干重組牛痘 疫苗，但對安全性（活的感染性牛痘病毒會釋放至其中該 感染性牛痘病毒可傳播給彼等對此病毒無抗性之人的環境 中）的擔心仍長期存在。 已知產氣莢臈梭狀芽抱桿菌之α_毒素（尸/c基因）具有若干 生物活性，包括溶血活性、磷脂酶c活 性、輕二醋酶活性、及致死活性。在此項技術 多關於可降低毒性之此。毒素變突的報導。Μ。—等人 119708.doc 1338045 /7rt/eci. /mmwrt. 7194-7196 (2001)]闡述一種可 產生無毒性α-毒素之自然產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株。然 而，修飾此菌株以產生抵抗除毒性野生型產氣莢膜梭狀芽 孢桿菌菌種外之其他變異體的免疫保護將比較困難。
Williamson及 Titball [Fiacc/we 7/(72):1253-1258 (1993)] 證實該毒素自胺基酸殘基247至胺基酸殘基370之單獨區域 足以針對由產氣失膜梭狀牙抱桿函在貫驗上所產生氣性壞 疽來免疫接種小鼠。Alape-Gir0n等人[五j. 267:5 191-5 197 (2000)]已經報導取代 Asp269、Asp336、 Tyr27 5、Tyr3 07、及 Tyr331 可減少 α-毒素毒性。Nagahama 等人[/«/eci. 65:3489-3492 (1997)]報導替換
Asp-5 6、Asp-130、或 Glu-152可減少 α-毒素毒性。Nagahama 等人[·/· 7 77:1 1 79-1 185 (1995)]報導在產氣笑 膜梭狀芽孢桿菌α-毒素中使用中性胺基酸（例如，甘胺酸） 取代68位處之組胺酸可導致該突變蛋白α_毒素之溶血活 性、磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性以及致死活性之完全喪 失。據信’此單一胺基酸變化可滅活該蛋白質之3個鋅結 合功能域中的一個。然後，將藉由取代His68所滅活的鋅 結合功能域表示為Zn2 [Justin等人，扪〇c；2請47:6253-6262 (2002)] 〇 儘管有上述說明’但此項技術中仍需要一種可廣泛地保 濩飼養家畜（包括禽類，例如，雞）免受梭狀芽孢桿菌菌種 (包括產氣莢膜梭狀芽孢桿菌）感染之安全、經濟且有效的 方法。 119708.doc 不應將本文任一參考文獻之引用詮釋為認可此參考文獻 係作為本申請案之，，先前技術"使用。 【發明内容】 為了克服此項技術中上述缺點，本發明提供編碼產氣莢 膜梭狀芽孢桿菌α-毒素之實質無毒性突變蛋白的核酸分 子。在一個這種實施例中，該核酸分子編碼包含減去至少 18個連續胺基酸殘基之SEq id NO: 3胺基酸序列的突變蛋 白（X-毒素’其中該等缺失胺基酸殘基之一係His68。在另一 貫知例中’該核酸分子編碼包含減去至少I 2個連續胺基酸 殘基之SEQ ID NO: 3胺基酸序列的突變蛋白α_毒素，其中 該等缺失胺基酸殘基之一係His68。在又一實施例中，該核 酸分子編碼包含減去至少9個連續胺基酸殘基之SEq ID NO. 3胺基酸序列的突變蛋白’其中該等缺失胺基酸殘基 之一係HisM。在再一實施例中，該核酸分子編碼包含減去 至少6個連續胺基酸殘基之SEQ id NO: 3胺基酸序列的突 變蛋白，其中該等缺失胺基酸殘基之一係HiS68。在又一實 施例中’該核酸分子編碼包含減去至少3個連續胺基酸殘 基之SEQ ID NO: 3胺基酸序列的突變蛋白，其令該等缺失 fe基酸殘基之一係HiS68。 在一個實施例中，本發明之核酸分子編碼其中自SEQ ID NO. 3胺基酸序列缺失不大於48個連續胺基酸殘基之突變 蛋白。在另一實施例中，核酸分子編碼其中自SEq ID no: 3胺基酸序列缺失不大於3 6個連續胺基酸殘基之突變蛋 白。在再一實施例中，核酸分子編碼突其中自Seq id NO: 119708.doc -10- 1338045 3胺基酸序列缺失不大於2 4個連續胺基酸殘基之突變蛋 白。在又一實施例中，本發明之核酸分子編碼突其中自 SEQ ID NO· 3胺基酸序列缺失不大於18個$續胺基酸殘基 之突變蛋白。 在一特定實施例中，本發明提供編碼其中自SEQ m N〇: 4 3胺基酸序列缺失9個連續胺基酸殘基（其中一個係Η、。之 ' 大羞蛋白的核酸分子。在一此類別之特定實施例中’該核
φ 酸分子編碼其中所缺失9個連續胺基酸殘基係介於SEQ ID NO: 3之Tyr62至Trp7〇之間的突變蛋白。在一更具體實施例 中，該核酸分子編碼其中此等缺失9個連續胺基酸殘基係 藉由單一白胺酸殘基替換之突變蛋白。 在另一實施例中’該核酸分子包含SEQ id NO: 2之核苷 酸序列，其中核苷酸268-294缺失。在此類別之特定實施 例中’ SEQ ID NO:2核苷酸序列之核苷酸268-294藉由編碼 單一白胺酸殘基之3個核苷酸替換。 Φ 本發明亦提供產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α_毒素之實質無毒 性突變蛋白。在一個這種實施例中，該突變蛋白α_毒素包 含減去至少18個連續胺基酸殘基之SEQ ID NO: 3胺基酸序 … 列’其中該等缺失胺基酸殘基之一係His68。在另一實施例
,- 中’該突變蛋白包含減去至少12個連續胺基酸殘基之SEQ ID NO: 3胺基酸序列’其中該等缺失胺基酸殘基之一係 His”。在又一實施例中’該突變蛋白包含減去至少9個連 續胺基酸殘基之SEQ ID NO: 3胺基酸序列，其中該等缺失 胺基酸殘基之一係His”。在再一實施例中，該突變蛋白包 119708.doc i 1338045 含減去至少6個連續胺基酸殘基之SEQ ι〇 n〇: 3胺基酸序 列’其中該等缺失胺基酸殘基之—係叫68。在X一實施例 "玄犬文蛋白包含減去至少3個連續胺基酸殘基之 ID NO: 3胺基酸序列，其中該等缺失胺基酸殘基之一係 His68 〇 在一個實施例中，本發明之突變蛋白包含不大於48個自 SEQ ID ΝΟ··3胺基酸序列缺失的連續胺基酸殘基。在另一 實施例中，該突變蛋白包含不大於36個自SEQ ID ]^〇:3胺 基酸序列缺失的連續胺基酸殘基。在再一實施例中，該突 變蛋白包含不大於24個自SEq ID n〇:3胺基酸序列缺失的 連續胺基酸殘基。在又—實施例中，該突變蛋白包含不大 於18個自SEq ID N0:3胺基酸序列缺失的連續胺基酸殘 基。 在一特定實施例中，本發明提供其中9個連續胺基酸殘 基（其中一個係HisM)自SEQ ID NO:3胺基酸序列缺失之實 質無毒性突變蛋白。在此類別之更具體實施例中，所缺失 9個連續胺基酸殘基係介於SEQ ID NO:3之Tyr62至丁 rp7〇之 間。在又一更具體實施例中，此等缺失9個連續胺基酸在 該突變蛋白之胺基酸序列中係藉由單一白胺酸殘基替換。 本發明進一步提供減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體， 減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體具有核酸分子，該核酸 分子編碼整合入其染色體中之產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α—毒 素的實質無毒性突變蛋白。此整合核酸分子較佳定位於與 編碼野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體中野生型α_毒素 H9708.doc 1338045 之核酸分子位置同源的染色體位置。因此，本發明之減毒 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體因缺少功能性野生型户“基 因而可為實質無毒性的。如本文所例示，該減毒產氣莢膜 梭狀芽孢桿菌生物體可為A型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌。 在本發明之一特定實施例中，該減毒產氣莢膜梭狀芽孢 桿菌生物體係產氣莢膜梭狀芽孢桿菌CPERF/ΔαΤο^η 365_ 〇54 (ATCC寄存編號ΡΤΑ7364)。在本發明之另一特定實施 例中，該減毒產氣莢膜梭狀芽抱桿菌生物體係產氣莢膜梭 狀芽孢桿菌CPERFMotToxin 365-053 (ATCC寄存編號 PTA7365)。 可自係哺乳動物或禽類之宿主動物分離藉由本發明方法 減毒之產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體。此等哺乳動物可包 括：牛、羊及豬。適當的禽類之實例包括雞、火雞、 鴨、家鴿、鵝、野鴿、天鵝、山鶉、及松雞。 本發明亦提供疫苗。此等疫苗可包含本發明之減毒產氣 莢膜梭狀芽孢桿菌生物體。本發明之疫苗亦可包含藥理學 上可接受之緩衝劑、賦形劑、及/或佐劑。 另外，本發明提供誘導針對動物中產氣莢膜梭狀芽孢桿 菌之免疫性的方法。一個這種實施例包括對該動物投與免 疫有效劑量之本發明疫苗。本發明之疫苗可藉由許多途押 投與，包括：經口、肌内、靜脈内、皮内、皮下及鼻内, 可將本發明之疫苗施與動物飼料之表面上及/或噴=於該 等動物上以便於經σ投與。本發明進—步提供包含本發= 疫苗之動物飼料。 J19708.doc 13 本發明亦提供另外表現至少一接且m,A f 種基因（編碼非產氣莢膜 夂狀牙孢桿菌多肽）之本發明逋 月減母產風爽膜梭狀芽抱桿菌 生物體。在一個這種實施例一 .., 或夕個非產氣莢膜梭狀 牙抱桿菌多肽係細菌多肽，你 夕A例如，來自大腸桿菌（£ _)、沙門氏菌（Sal_ena)、勞森氏菌〇aws〇nia)、或變 曲捍菌（CampyI〇bacter)等之抗原性蛋白及/或其組合。另一 選擇為，或與之組合，非產氣英膜梭狀芽孢桿菌多肽可為 非細菌多肽。此等非細菌多肽之實例包括哺乳動物或禽類 蛋白質，例如’細胞介素（cyt〇kine)，如雞ILi8;病毒， 如輪狀病毒或冠狀病毒；及寄生蟲，如艾美球蟲屬 (eimena)、等孢子球蟲屬（is〇sp〇ra)、及隱孢子蟲屬 (cryptospori dium) ° 在另一態樣中，本發明提供一種可選擇性地結合至自產 氣莢膜梭狀芽孢桿菌α_毒素之實質無毒性突變蛋白缺失之 抗原決定部位的抗體。此等抗體可區分該實f無毒性突變 蛋白與野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α_毒素。 本發明亦提供包含本發明之抗體的測試套組，其可用於 識別動物個體是否已接種疫苗或者已自然感染產氣莢臈梭 狀芽抱桿菌生物體。 因此，本發明亦提供識別及/或區分已自然感染產氣莢 膜梭狀芽孢桿菌生物體之動物與一接種減毒產氣莢膜梭狀 芽孢才干菌生物體之動物的方法。在一個這種實施例中，节 方法具體包括使來自該動物之流體試樣與抗體接觸，該抗 體可選擇性地結合至發現於野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌 H9708.doc 14 1338045 其自本發明產氣莢膜梭狀芽孢
α-毒素中之抗原決定部位，其自本發明 桿菌α-毒素之實質無毒性突變蛋白缺失 區i彼專已經接種本發明產氣英膜梭狀 抗原。^ !亥抗體與該流體試樣反應日夺，可冑該動物識別為 已經自然感染產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體之個體。 【實施方式】 因此，本發明提供以相對於天然或野生型梭菌屬毒素不 具有可檢測毒性及/或實質低毒性之突變蛋白形式表現— 或多種梭菌屬（C/owWc/M)毒素（例如，α_毒素）之經改造梭 菌屬生物體及培養物β較佳地，本發明之產氣莢膜梭狀芽 孢桿菌突變型生物體可作為活疫苗容易地投與動物。亦提 供本發明之突變蛋白產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α-毒素以及編 碼該等突變蛋白之核酸分子、用於表現α毒素之載體、及 使用該等之方法。 為了清楚地闡述本發明，可界定如下若干術語。疫苗係 一種包含免疫原及其他醫藥上可接受之可選成份（在某些 貫施例中’包括適宜佐劑）的組合物。本文所用術語Μ免疫 原"描述一種在被導入動物中時激發免疫應答之組合物、 物質或載體。出於本發明之目的，本發明涵蓋包含任一能 夠表現本發明突變蛋白α-毒素或將本發明突變蛋白α·毒素 M9708.doc •15- 1338045 導入擬免疫接種動物中之載體的免疫原。載體包括(例如) 在將該載體導入動物中時可表現本發明突變蛋白α_毒素之 本七月產氣莢膜梭狀芽孢桿菌或其他適宜微生物。載黯亦 匕括業内已知核酸分子，例士d，質粒及諸如此類，其在直 接導入動物中時可藉由（例如）進入動物細胞並在動物中表 現大變蛋白α-毒素來表現本發明之突變蛋白α毒素。免疫 原亦可為單獨或作為適宜疫苗組合物之一部分使用的蛋白 質’例如本發明之α_毒素。 除非另有說明，否則本文所用術語"免疫接種，，及,，接種,, 係同義的且可互換使用以描述免疫原至動物之導入從而在 該動物中產生免疫應答◊所產生免疫應答可為治療動物提 供保護免疫性，此可限制或減少經接種動物之臨床病狀， 例如，氣性壞疽及/或死亡率，然後用有毒劑量之產氣莢 膜梭狀芽孢桿菌菌種（對其而言，本發明之疫苗係保護性 的）激發該等經接種動物。 將術語”佐劑"定義為可刺激免疫系統之一或多種物質。 在本文中’佐劑可用於増強對一或多種疫苗抗原/分離物 之免疫應答。可在投與該疫苗之前、同時或之後對靶動物 投與佐劑。本發明之佐劑可自許多來源之任一個獲得，該 等來源包括自然源、重組體來源；及/或以化學方式合成 專。用作佐劑之化學化合物之實例包括但不限於含链化合 物；可代謝及不可代謝之油；嵌段聚合物；ISC〇M(免疫 刺激複合物）；維他命及礦物質（包括但不限於維他命E、 维他命A、碼、及維他命B12) ; Quil A (皂苷）；以不同水 119708.doc -16 - 平與聚稀基聚S旨交聯的基於交聯丙婦酸之聚合物（例如， 丙-2-烯酸聚合物），如以商標CARB〇p〇L⑧出售者；及/或 均句分佈於水中之微米級油滴的乳&，例士”以商標 Emulsigen® 出售者。 時常明確稱作免疫刺激劑之佐劑的其他實例包括 '細菌 及真菌細胞壁組份（例如，脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞 壁醯肽、β-1，3/丨，6-葡聚糖）、源自植物之各種複雜的碳水 化&物（例如，聚糖、醋孟南（acemannan))、源自動物之各 種蛋白質及肽（例如，激素、細胞介素、協同刺激因子）、 及源自病毋及其他來源之核酸（例如，雙鏈rNa、CpG)。 另外，任一數量的各上述物質之組合可提供佐劑效果，因 此’其可形成本發明之佐劑。 本文所用術語"抗體"欲涵蓋多株抗體、單株抗體 '及/或 其片段或重組體衍生物，包括納入抗體可變結構域之經改 造結合蛋白質。 如本文所用，本發明α_毒素蛋白之胺基酸殘基的殘基編 號及位置係基於對產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株13所闡述的 編號系統。產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株13 α_毒素由 GenBank登記編號NC 003366報導，如由SEQ⑴n〇: i所 闡明。該完整的蛋白質之長度係398個胺基酸。藉由下文 所列示大變蛋白載體編碼之α_毒素對應於具有胺基酸殘基 90-98缺失之SEQ ID NO: 1蛋白質。在該蛋白質突變期間 有一 28個胺基酸信號序列裂開。因此，所列示缺失對應於 長度為370個胺基酸之成熟蛋白質的胺基酸殘基62_7〇(seq -Π- 119708.doc 1338045 ID NO: 3)。 編碼本發明α-毒素蛋白之DNA的密碼子編號係基於產氣 莢膜梭狀芽孢桿菌菌株13之户/c基因，如GenBank登記編號 NP 560952中所報導及如SEQ ID N〇: 2所示。α·毒素之編 碼序列在產氣荚膜梭狀芽孢桿菌菌株丨3中為自核苷酸 48590至49786。本文所例示之兩個構建體中之密碼子缺失 對應於NP 560952基因之核苷酸48857至（且包括）48883。此 缺失發現於α-毒素基因内且對應於SEQ ID N〇: 2之編碼序 列中的核苷酸268-294。 此外’為方便說明而使用單數術語，但並不欲受限於 此。因此，舉例而言’所提及包含一種產氣莢膜梭狀芽孢 桿菌細胞之組合物係包括所提及的一或多種此等細胞。亦 應理解，本發明並不限於本文所揭示之特定㈣、過程步 驟、及材料，此等構型、過程步驟、及材料可有些許變 化。亦應理解’本文所用專業術語僅出於闡述特定實施例 之目的而使用且並非欲受限於此，因為本發明之範圍僅受 限於隨附之申請專利範圍及其相等物。 ^在本發明之一個特定態樣中，提供，，實質無毒性"的產氣 莢膜梭狀芽孢桿菌之非逆轉性突變體，即，可表現具有極 小或無毒性之免疫原性α_毒素進而使其適於用作保護性产 苗的生物體。目此’本發明之產氣笑膜梭㈣孢桿菌錢 體相對於野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體具有充分減 ’的毒性’以致在接種此疫苗之動物中可有效激發抗^ 毒素或抗產氣英膜梭狀芽孢桿菌免疫反應的條件下使用 H9708.doc 1338045 時’可容許用作疫苗或抗原。因此，本發明之產氣笑膜梭 狀芽孢桿菌生4勿體相對於野生型產a英膜梭狀芽孢桿菌係 減毒的"。 ” 短語"實質無毒性"亦欲用於具有充分低或無毒性之上述 免疫原性α_毒素突變蛋自，進而亦使其適用於保護性疫 苗。 例如藉由下列業内已知試驗中之一個來量測毒性減 少：於試驗動物組中之溶血活性、磷脂酶c活性、鞘磷脂 酶活性、磷酸二酯酶活性、及一般致死活性。一般而言， 措由此等標準試驗不可檢測殘餘毒性。盡管如此，相對於 何生突變蛋白之野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α•毒素之相 等數里感染性單元的毒性，可證明最小量（例如自約1 〇·4至 、’勺1 〇 )之一或多種此等活性的存在於獸醫環境中係可接受 的。 在一個實施例中，採用產氣莢膜梭狀芽孢桿菌之生物型 Α菌株實踐本發明，其作為各類別壞疽及腸道疾病之病原 具有特別的重要性。特定言之，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌之 α-毒素係缺失-減毒之目標，乃因此毒素之減毒足以致使 產氣关膜梭狀芽孢桿菌相對於野生型菌株係極不具有致死 性。 概δ之’本發明之產氣莢膜梭狀芽孢桿菌基因表現 大身蛋白α~毒素。突變蛋白α-毒素具有一包含Zn2環之Piis 以及側接殘基在内的缺失以大大地降低任一恢復突變至毒 & ^/式的可能性。現在已發現：Zn2環仙殘基（例如，卿 I19708.doc •19- 1338045 ID NO: 3之H】s08)之缺失以及側接Zn2環His殘基之額外殘 基的缺失可提供保留足夠免疫原性的α_毒素以在接種本發 明產氣莢膜梭狀芽孢桿菌之動物中誘導保護免疫性而亦不 可月b經歷恢復突變至編碼野生型α_毒素。可能缺失的額外 殘基相對於Hiw在C-末端方向及/或在Ν_末端方向上缺 失，且在此等方向之任一個上，該等額外殘基之數量可介 於約4個至約60個殘基之間。或者，HiSi48及側接殘基可類 似地缺失。 相對於SEQ ID NO: 3，除包含HisM缺失之外，本發明突 變蛋白（X-毒素之一個實施例亦包含來自Hisw位置之任一側 (在C-末端或N-末端方向上）的至少3〇個胺基酸殘基缺失。 在另一實施例中’相對於SEQ ID NO: 3，除包含His68缺失 之外，本發明突變蛋白α_毒素亦包含來自His”之任一側的 至少20個胺基酸殘基缺失。在又一替代實施例中，相對於 SEQ ID NO: 3 ’除包含HisM缺失之外，本發明突變蛋白α_ 毒素亦包含來自HisM之任一側的至少5個胺基酸殘基缺 失。在再一實施例中，相對於SEQ ID NO:3，本發明之突 變蛋白α-毒素包含自約殘基62至約殘基70之缺失《視情 況’該等缺失胺基酸殘基可藉由一或多個其他殘基（例 如，單一白胺酸殘基）替換。 在又一實施例中，突變蛋白產氣莢膜梭狀芽孢桿菌心毒 素係自產氣莢膜梭狀芽抱桿菌或者自欲用作研究試劑之替 代重組生物體、及/或在診斷測試套組或分析中作為（例如） 抗-α-毒素抗體之扭產生或分離。突變蛋白產氣莢膜梭狀 -20- 119708.doc 日芽抱毒素蛋白之又一用途係在不能夠接受接種本發 明減毒產氣莢獏梭狀芽孢桿菌生物體之動物（例如，人類) 的特殊疫苗中。 ' 另外，本發明提供相對於本發明α_毒素突變蛋白可特異 性地結合至野生型α-毒素的抗體。 在另一實施例中，提供一種以優選方式結合至野生型產 氣莢膜梭狀芽孢桿菌α_毒素蛋白同時對本發明突變蛋白α· 毒素呈現最小結合或不結合（例如，避免結合至具有如上 文所詳述缺失之α·毒素突變蛋白）的抗體《因此，所提供 抗體可用於區分該缺失突變蛋白α_毒素與野生型α毒素， k而亦可用於區分接種本發明疫苗之動物與已感染野生型 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌之動物。產生及篩選此等選擇性抗 體之方法為業内所知。類似地，亦可產生可識別本發明突 變蛋白α-毒素但不識別野生型蛋白質的抗體。本發明之抗 體可為多株抗體、單株抗體或保留選擇性結合性 質之此等抗體的片段或改造片段或衍生物。 已經詳盡地闡述了用於製備及篩選單株抗體之技術[參 見’例如 ’ Stites 等人（編輯 (第 4版），Lange Medical Publications，Los Ahos，California (1988) ’ Harlow及 Lane, j Mcrnwi?/， CSH Press (1988), Goding, Monoclonal Antibodies: Principles (第 2版），Academic Press, New York (1986); 及 Kohler和 Milstein，A^«m56:495-497 (1975)，所有該等 文獻之全文均以引用方式併入本文中]。 119708.doc =如’但不限於此，#由使用經純化野生型產氣英膜梭 =糾菌α-蛋白質（例如，與適宜佐劑之組合）實施接種 士諸如小鼠或雞等適宜動物中產生免疫應答。舉例而 為了免除野生型α蛋白質之毒性，該免疫原可為對應 於缺失殘基之肽，且苦雪 且右而要可精由與適宜佐劑組合或藉由 偶聯至適宜載體蛋白質來增強該肽之免疫原性。與載體蛋 白質之偶聯為業内所知，且可藉由（例如）提供具有終端半 胱胺酸之肽並使用馬來酿亞胺偶聯化學或績基琥拍酸亞胺 基ΜΝ 4來醯亞胺基]環己烷小羧酸醋連接子(來自pi⑽) 將該肽偶聯至鑰孔蟲戚血蘭素（KLH)或牛血清白蛋白（bsa) 來7L成此偶&卜在不需要終端半胱胺酸時亦可採用碳化二 亞胺連接子。 對於單株k體製備而言，可自經免疫接種動物獲得脾淋 巴細胞，自该等淋巴細胞製備雜交瘤，且可獲得一或多種 表現抗-(X蛋白質之潛在的適宜雜交瘤。篩選抵抗突變蛋白 及野生型α-蛋白質之雜交瘤，並識別、選殖及使用表現僅 結合该野生型α-毒素之抗體的雜交瘤以產生僅結合野生型 α蛋白質之單株抗體。視情況，獲得來自識別雜交瘤無性 繁殖系之cDNA，且在其他業内已知表現系統中產生重組 抗體或抗體片段。 如上文所述，一般而言，接種之一個潛在缺點係所得接 種動物在使用所形成抵抗天然菌株之抗體測試感染時可能 產生假％性從而阻礙感染動物之識別。因此，本發明提供 一種用於區分已經感染天然產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體 119708.doc •22· 之動物個體 試套組。 與使用本發明突變蛋白α·毒素接種之動物的測 固故種測試套組包括一定量的對本發明突變蛋“·毒 脚呈^最小結合或不結合之選擇性抗_野生型心毒素抗
6玄測武套組亦可台括；？ I；i杳Κ I I括足乂貫施至少一個診斷試驗之其 他適宜試劑。在另一實施例中， \ 、 J中使用可易於檢測之標誌部 /刀（例如，任—業内已知的酵素標誌，如過氧化物酶；螢 光標記物’如螢光素；珠體，包括磁性小珠；及諸如此類) 對該抗體實施標記（tagged或labeled) m，該套也可 進·;括選擇性地結合至選擇性抗野生型α·毒素抗體 的標記抗體。免疫分析法為此項技術所熟知，纟包括三明 治型免疫分析法、競爭性免疫分析法、酶聯免疫吸附分析 (ELISA)、放射免疫分析（RIA)及其他。 本發明亦提供用於識別及區分感染自然（即，野生型）產 氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體之動物與使用包含本發明減毒 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體之疫苗接種的動物的方法， 其按照（例如）下列步驟實施： (a)使來自該動物之流體試樣與自上述選擇性抗-野生型 α-毒素抗體接觸’該選擇性抗_野生型α_毒素抗體對本發明 突變蛋白α·毒素呈現最小結合或不結合；及 (b)測定該抗體是否與該流體試樣反應； 其中當該抗體與該流體試樣反應時，該動物被識別為已 經感染天然產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體之動物。 製備減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株 119708.doc •23- 1338045 可按照下列實施將野生型產翁苯 … 1產轧夾膜梭狀芽孢桿菌分離物 轉化成適於作為疫苗投與之減毒式香#— 士 , ， 成毋或貫質無毒性菌株的方 法。可使用僅編碼α·毒素突變蛋白之其阳# u 文尤日之基因替換位於細菌染 色體上之α-毒素（p/c)基因，從一 仗4產乳失膑梭狀芽孢桿 菌生物體不能夠產生野生型毒辛 韋不概&之，產生疫苗生 物體之方法包括但不限於下列當 仏r幻㊉用步驟’不必按順序出 現0
⑴識別欲藉由接種加以保護之動物類別及所獲得的一或多 種用於筛選目的之臨床分離物。對於α•毒素…此步驟 通常為可選步驟，；3因來自一動物物種之分離物更不可能 為其他動物物種提供保護^ ⑺藉由（例如）PCR或其他業内已知核酸擴增技術使用適宜 側接引物以擴增來自產氣莢膜梭狀芽孢桿菌分離物之― 基因並使用適宜引物實施擴增以產生期望缺失突變。或 者，可探測適當文庫。
(J)形成包含缺失—基因之自殺載體’其中產氣莢膜梭狀 牙孢桿菌複製源已經移除’及/或可在產氣莢獏梭狀芽孢 桿菌中複製之複製源、完全不存纟；且在任—情況下，包含 毗鄰突變一基因之適宜可選標钱、，例如，抗生素標誌。 隨後^藉由（例如）電穿孔或其他業内已知方法將此載體插 入產氣炎膜梭狀芽抱桿菌生物體中。 ⑷選擇其中已經將突變蛋白一基因成功地整合入細菌染 色體中之產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體。此可藉由於可選 試劑（例如’ #應於可選標諸之抗生素）存在下培養步驟（3) H9708.doc •24· 1338045 之產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體來實施。舉例而言，可在 抗生素選擇下生長之唯一產氣英膜梭狀芽孢桿菌生物體可 為彼等已藉由同源重組將自殺载體及其抗生素抗性基因直 接整合入細菌染色體争者。因此，此等生長蓋氣英膜梭狀 牙抱桿g生物體可具有兩似鄰一基因，—個係野生型 而另一個可能具有缺失突變。 (5)選擇已經受另-重組事件之產氣英膜梭狀芽抱桿菌生物 體，該重組事件可移除該等可選標認（例如，抗生素標該） 以及野生型;^基因。此可藉由於不存在可選試劑(例如， 抗生素）時培養⑷之生物冑並在血禮脂上選擇非溶血性純 系來實施。 由於藉由同源重組完成突變蛋白核酸之插入，因此編碼 «亥犬變蛋白α-毒素之核酸分子係在與編碼野生型心毒素之 核酸分子之定位同源的染色體位置納入，該野生型&毒素 係存於未減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌中。 更具體而言，可自患病動物或其他來源獲得產氣莢膜梭 狀芽孢扣菌之野外分離物。開始，將自相關野外分離物獲 得的基因組DNA插入適宜雙重微生物往復載體（例如，具 有可選標記（如，抗生素標記）之往復質粒）中以評定其可轉 化性。概言之，適宜往復載體可包含1個、2個、3個或更 多個下列特徵：選殖位點、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌複製 源 '大腸桿菌複製源、及抗生素抗性基因及/或可選標 。己。適用於此目的或容易地適應於此目的之業内已知載體 包括（例如）R〇berts等人所述重組往復質粒pHR1〇6 尸〆 119708.doc -25- 1338045 A/z>co6i〇/ 54: 268-270 (1988)] : Bannam等人所述pJlR 750 及 pJIR 751 質粒[P/aimW 2P..233-235 (1 993)]; Matsushita等人之無啟動子pPSV啟動子選擇載體[1994, 3^ 3 17-319]; Lyras等所述往復質粒pJIRi456及 pJIR1457[1988, 3P, 160-164];及Kim等人所述 pAK201往復載體[1989，却/>/ β??νζ>ί)« 55, 360_ 3 65]，該等文獻之内容全部以引用方式併入本文中。產氣 莢膜梭狀芽孢桿菌複製源之移除可將往復載體轉變成自殺 載體。 舉例而言，一種往復質粒係pJIR418，由Sloan等人在 1 992,尸27, 2〇7·219闡述，該文獻以引用方式併入本 文中。 產生2104轉化體/微克質粒DNA且對抗生素標誌（例如， 氣黴素或紅黴素）敏感之分離物係缺失之潛在候選者。來 自候選菌株之基因組DNA隨後用作候選菌株之p/c 毒素） 基因及側接序列之長程PCR的模板。舉例而言，如下文所 列示，使用產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株13染色體以識別用 於擴增編碼該α-毒素之基因的引物。隨後使用此等引物以 自另一菌株選殖α-毒素基因，該另一菌株係CP6家禽分離 物。 在對PCR產物實施亞選殖後，對α-毒素基因及側接區實 施測序並繪製限制性内切酶譜。藉助側接限制酶切位點合 成新穎寡核苷酸引物並將兩次不同的擴増之產物選殖至適 宜自殺質粒（已經移除產氣莢膜梭狀芽孢桿菌複製源），例 119708.doc •26· 1338045 如，下文所列示質粒U92_23 i中以 疫苗菌株。 I、有該缺失之期望 藉由任一業内已知標準方 w ^ ώ 皁方法將所提供對分離物具有特里 ^ # 應動物的產氣英膜梭狀芽孢桿菌菌株 "電穿孔儿成。當將該自殺載體插 產氣夹膜梭狀穿抱摇窗< χ目士 （具有產氣莢膜梭狀芽孢桿菌 妓I源）中時，該自殺載體 在細胞f中複製，且除 =㈣整合入細菌染色體中，否則不可存活。成功的 ;心可於抗生素(對應於剛剛導入的抗生素標記基因） 存在下生長之最佳生物體。 二管在下文所列示載體中採用氣黴素及/或紅黴素標 D,:可知用任—業内已知可選標諸基因。 此等重組體事件係自野生型W基因與缺失…基因質粒 T之同源性形成。將所得重組細菌稱為整合體。該整合 ^ S有在p/c基因基因座受到整合之導入同源性載體的拷 、因此所付'整合體包括W基因之兩個拷貝：初始正 市的拷貝及導入缺失版本。所導入抗生素抗性基因係定位 」P 土因之兩個拷貞之$。在〆c基因之兩個拷貝之間可 月匕發生極少的随地逢^ 亀重、.且事件。此重組事件可能產生兩種結 果中的一種+ 在故兩種情形中，均已經移除介入兩個尸/c 基因（包括k性基因）拷貝之間的DNA。在第一種結果中， 复/正吊的或野生型基因進而回收不具有抗生素標 达之初始母體菌株。在第二種結果中，野生型一基因經 缺失拷貝替拖， 、產生不具有抗生素標該之期望α-毒素缺失 119708.doc •27- 1338045 體構建體》 自培養基移除抗生素可使彼等已經受重組之細菌存活並 複製。隨後，#由於不存在表現野生型α-毒素之產氣莢膜 梭狀芽孢桿菌通常所呈現溶血現象時血瓊脂上之生長狀況 來識別缺失重組純系。
概言之，可產生減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌疫苗並可自 其分離有用的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌野生型菌株的動物包 括任一對其而言產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染係一問題之動 物。相關脊椎動物包括禽類、哺乳動物及魚，且具體而言 係具有經濟及/或農業重要性之動物。下文所列舉動物係 彼等預期可受益於產氣莢膜梭狀芽孢桿菌疫苗及/或自其 :乂 v寻有用的產軋莢膜梭狀芽抱桿菌野生型分離物者。儘 * e b的If形時*係任一此疫苗包含最初自擬接受接種之 動物種屬或物種分離的組份，但此並非必需條件。 等動物之非限制性列表包括彼等禽類、牛、羊等家族 1 U %物（例如’可實施水產養殖及/或自野外捕獲並 备诗〇月j於4納槽中保持存活一段時間者）。此等包括 、例士鳟魚或鮭魚、及其他出於經濟效益而養殖或捕 獲之物種。非恭H去 貪椎動物水生動物包括龍蝦、螃蟹、軟體動 物類，例如鉍奋 . ^ ”、、 早…、、給、牡螺、muscles、扇貝、及 諸如此類。廊理4 心解.禽類可包括（例如）雞、火雞、鵝、鴨 等。應理解：生j 可匕括（例如）畜牛、肉牛、小菜牛等。應 理解：羊可包括(例如)展羊等。 ϊ 19708.doc -28- 1338045 出於本發明之目的，應理解：術語"魚”可包括但不限於 魚之TWeos"分組，即，硬骨魚類。TWeoi/z·分組包括链目 (Sa/wowz/brwe·? order)(其包括娃科家族）及驢 形目（Perci/orme·? order)(其包括刺臀魚科（Ce/ii/^rc/njae)家 族）。
潛在魚受試者之實例包括娃科家族、黯科（SerrawWae) 家族、鯛科而e)家族、慈鯛科（C/c/2/z·心e)家族、刺臀 魚科家族、三線石鐘（three-Line Grunt)(三 線雞魚irz7z’《eaiw/w))、及藍眼豹（Blue-Eyed Plecostomus)(昆琶（P/ec〇5iomw5· ·5·ρρ))。 鮭科家族 分類群名稱 常用名 鯡形白鮭 湖泊白娃 (Coregonus clupeaformis) 霍氏白鞋/|咖） 霍氏白链(Bloater) H〇nc〇Fhyitchus keta) 狗娃(Chum salmon) 駝背大麻哈魚 粉色娃魚 {Oncorhynchus gorbuscha) 銀大麻哈魚 銀魚圭(Coho Salmon) {Oncorhynchus kisutch) (銀色經魚(Silver Salmon)) 孟蘇大麻哈魚 櫻娃(孟蘇链魚(masou salmon)) {Oncorhynchus masou) 納爾卡大麻哈魚 撒克愛鞋(Sockeye Salmon) {Oncorhynchus nerka) 大鱗大哈魚 切奴克鞋魚(chinook Salmon) {Oncorhynchus tshawytscha) 真柱白ά 圓白娃(round whitefish) (Prosopium cylindraceum) 克拉見大麻哈魚 切喉鱒 {Oncorhynchus clarki) 麥奇釣吻缚 彩虹鱒 {Oncorhynchus my kiss) -29-
H9708.doc 1338045 大西洋,1 圭(Sar/mo itf/fl/*) 褐鱒 褐鳟~X紅點鱗（S· fontinalis) 北極紅點臨(Salvelimis alpinus) 強壯紅點鮭 (Salvelinus confluentus) 溪红點給(Sa〖ve 丨inus fontinatis) 白斑紅點条圭 (Salvelinus leucomaenis) 點能[Salvelinus malma) 湖參工點陡(Salvelinus namaycush) 造条、{Thymallus thymallus) 大西洋鮭魚 褐色鳟魚 雜種虎鱒(Tiger hybrid-trout) 北極嘉魚(Arctic charr) 公牛鱒 溪流鱒 曰本嘉魚(白斑嘉魚） 花美紅點斑I圭(Dolly varden) (宮部紅點經(Miyabe charr)) 湖泊鱒魚 河鱒 鮪科家族之某些成員
分類群名稱_常用名 喪锻绮{Centropristis ocyurus) 堤海驢 費成親綠(Centropristis philadelphicus)岩海繞 條故锻黯(Centropristis striata) 黑海驢 侏沙綠(Dijyiectrum bivi加Umt) 矮小沙河驢 矣集/& ^iPiplectrum formosum') 沙河驢 金象石斑条、[Epinephelus flavolimbatus)令'造臭藏 黑、象石 M HEpirtephelus morio) 紅鼻總 橫帶黯〇Se "ranws ;?/2〇e0e) 發光賴 璧:綠(Serranus fortiigarum) 垄驢 鯛科家族之某些成員 分類群名稱_常用名 南方丰蜗(Archosargusprobatocephalus)丰蛾 菱羊蜗(/^chosargus fhomboidalis) 羊頭產鯛(CfliflWiMSpemifl) 菱禮兔牙網(Lagodon rhomboides) 真彌(Pagrus Major) 耳銅(Spams aurata) 門齒蜗(Stenotomus chrysops) 海鯛 羊鯛真網(Sheepshead porgy) 菱體兔齒鯛(Pinfish) 紅海鯛 烏頰魚海鯛 變色窄牙鯛(Scup) 119708.doc -30 1338045 慈鯛科家族之某些成員 分類群名稱_ 寬體寶麗網(Aequidens latifrons) 白各師王(Cichlasoma nigrofasciatum) Crenichichla sp. 大神仙魚(Pterophyllum scalare) 莫桑比克羅非魚(Tilapia mossambica) 吳郭魚(Oreochromis spp) 奥利亞羅非魚(Sarotherodon aurea)
刺臀魚科家族之某些成員 分類群名稱 岩故繞(Ambloplites rupestris) 九陽繞(Centrarchus macropterus) 黑斑小日驢 小日驢o/ie/erto/cee) 橫帶小曰鱸(£7<m0wa z⑽扣《w)
常用名_ 起突額麗魚(Blue acara) 剛果慈鯛(Congo cichlid) 梭型鯛(Pike cichlid) 天使魚 莫桑比克口育魚類 (Mozambique mouth breeder) 羅非魚(Tilapia) 金色羅非魚(Golden Tilapia) 常用名 岩驢 曰鱸(Flier) 埃弗格來兹小太陽魚 (Everglades pigmy sunfish) 奥克小太陽魚（Okefenokee pigmy sunfish) 帶狀小太陽魚 藍點太陽魚 藍點九刺日藏{Enneacanthus gloriosus) 暗色九刺曰驢帶狀太陽魚 紅胸太陽魚α«/7Ϊ«5) Β-九陽魚(Lepomis cyanenus) 藍太陽魚X駝背太陽魚 既贺九陽务、(Lepomis gibbosus) 九揚务、(Lepomis gulosus) 检:點太暢务、(Lepomis humilis) 藍^思太陽良(Lepomis macrochims) 長耳太陽务、(Lepomis megahtis) 紅眼黑驢(Af/cw/;如c⑽似泛） 4、口黑繞(Micropterus dolontieui) 紅腹太陽魚 藍綠鱗總太陽魚(Green sunfish) 藍綠鱗鳃太陽魚X瓜仁太陽魚 瓜仁太陽魚(Pumpkinseed) 貪食太陽魚(Warmouth) 撥點太陽魚(Orange-spotted sunfish) 藍總魚 長耳太陽魚(Longear sunfish) 淺派驢(Shoal bass) 小嘴鱸 斑點黑罐{Micropterus punctulatus)斑點，鱸 大 口黑竣(Micropierus salmoides) 大嘴鱗 119708.doc 31 1338045 白刺蓋太陽魚办脚xis amw/ans>刺蓋太陽魚(White cmppie) 黑刺蓋太陽魚 ^ ； (Pomoxis nigromaculatus) 暗刺盍太 iW 魚(Black crappie) 在另一實施例中，動物係伴侣動物或人。出於本發明之 目的，應理解：術語"伴侣動物"包括所有動物一馬（馬 科）、貓（貓科）、狗（犬科）、及齧齒類動物（包括小鼠、大 鼠、豚鼠、兔種）、及禽類（例如，家鴿、鸚鵡）、及諸如此 '· 類。 • 接受此接種之烏類可與商業性家禽業或非商業性家禽業 相關。此等包括（例如）鴨科y⑽,例如天鵝鵝、及 鴨；鴿科，例如野鴿及家鴿（如，馴養家 鴿）；雉科·心e)，例如山鶉、松雞及火雞； ，例如家雞；鸚鵡科（ρί⑴，例如長尾鸚 鵡、金剛鸚鵡（macaws)、及普通鸚鵡（例如，作為寵物飼 養或用於收集銷售者）。雞列示於下文中。 野生型分離物之來源 齡般而5，可使用最初自任—如上文所述相關感染動物 及/或自環境分離之野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌開始製 備本發明之減毒產氣莢膜梭狀芽抱桿菌生物體。該環境包 括任一合有可存活產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體及/或可 存活產（笑膜梭狀芽孢桿菌孢子之材步斗，包括（例如）受污 染食物、土壌、水、動物塾料、糞便、及諸如此類。
Justin 等人[价", 6253 6262 (2〇〇2)]對來自在 序^生物化學性質方面幾乎—致之不同產氣笑膜梭狀芽 抱桿&菌株的α_毒素實施了特徵分析。然而’ JUstin等人 U9708.doc -32- 1338045 亦Μ述自禽類來源（天鶴）分離之菌株，該菌株與其他菌株 相比具有呈現大程度的序列變異及變化底物特異性之“主 素。出於此原』’吾人認為最佳分離物可為在轉化：:: 形式時可產生抵抗產氣莢膜梭狀芽孢桿菌之許多其他天然 菌株之cx•毒素的保護免疫性者。·然而，^分離物間之二 毒素可能發生變異，則較佳情形經常為對來自需要抗-產 氣英膜梭狀芽孢桿菌疫苗之動物物種的產氣笑膜梭狀芽抱
桿菌生物體實施分離及減毒。下文所列示分離物係自雞分 離得並在此物種中測試。 疫苗
^發明之減毒產氣英膜梭狀芽抱桿g生物體通常調配成 醫樂上可接受之疫苗組合物。該等疫苗組合物係依照投藥 途徑調配且可與活性抗原劑相容。該活性抗原劑為例如本 發明之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型生物體的一或多種 菌株。視情況，該疫苗組合物亦可包含一或多種無毒性α_ 蛋白質與該等減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌Α型生物體組 合0 舉例而言’該疫苗組合物中所含之減毒產氣莢膜梭狀芽 孢桿菌A型生物體實質上均為活的且可存活的，雖然對於 某些特定情況，例如為使某些人或免疫缺陷（immune_ C〇mpromised)動物免疫，該疫苗只含殺死之減毒產氣莢膜 梭狀芽孢桿菌A型生物體。 邊疫苗組合物包含生理學上可相容之緩衝劑及/或鹽， 視凊况合併佐劑及/或免疫增強劑或刺激劑（共同投與或者 119708.doc -33- 1338045 連續投與，例如在接種疫苗之前或之後）。 適合之免疫刺激劑包括，但不限於，細胞介素、生長因 子、趨化因子（chemokines)、來自淋巴細胞、單核細胞、 淋巴器官細胞之細胞培養物的上清液、細胞製劑或細胞提 取物（例如金黃色葡萄球菌（5>邮;aWreMiS)或脂多 糖製劑）、促細胞分裂劑（mitogens)、或佐劑（包括小分子量 某物）免疫刺激劑可在培育期間任何時刻印内投與。在
特定態樣中，該免疫刺激劑可以含有減毒產氣莢膜梭狀芽 孢桿菌A型生物體之培養基投與。 上述本發明疫苗係藉由例如下列途經之—種或組合注射 或接種而投與：經口、鼻内、非經勝、皮下、劃破、及/ 或肌内，以業内已知之任何適合調配物，例如相容之緩衝 劑及/或生理學上可接受之鹽水，視情況合併佐劑及/或免
疫增強劑或刺激劑投與(共同投與或者連續投盘，例如在 接種疫苗之前或之後)。對於經口服用疫苗/接種疫苗方 法，可輕易地採用此項技術中已知之任何生理學上適宜的 懸浮劑。另外’可將該組合物納入(例如混合入) :=或喷塗至食物顆粒上、撒施於或噴塗於玉米或其 他穀物上、及諸如此類。 胃腸道係產氣莢膜梭狀芽孢桿 Λρ 〇 ng ^ ^ ^ ^ 4木之常見位點，且因 此口服亦屬於一種接種方法 毒產裔茁报祕也· - ^ 月腸道中本發明活減 層產生局部保護免疫反應且亦可在胃腸道之黏膜 競♦方式用於防止野生 H9708.doc .34· 1338045 型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌之後續定居。 對於禽類（例如家禽，包括雞、鴨、鵝等）而言，口服方 法或卵内注射係特別有用的接種途徑。卵内途徑列示於下 文中且自激發孵化雞來產生自動免疫及保護。 藉由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌表現之外源基因 藉助上述貫例中所發展技術，將任一非天然基因（即， 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌之外源基因）視情況插入產氣莢臈 梭狀芽孢桿菌之染色體DNA中。對於異種蛋白表現而言， 可實施保護側接α-毒素基因之序列、α_毒素啟動子及其信 號序列的基SUi合。在—個實施例中，可使用外源基因替 換大部分尸k基因編碼序列。插入基因下游之,/(：基因之其 餘核苷酸係在框架外，且因此不產生功能性α_毒素。或 者，可將外源基因於框架内插入至編碼α_毒素突變蛋白之 核苷酸序列，形成α-毒素_異種蛋白融合蛋白。 可藉助（例如）Ν-末端FLAG標記序列及適當的限制酶切 位點合成外源基因之募核苷酸引物。可將該pCR產物選殖 至自殺載體中；將FLAG標記及外源基因插入具有α_毒素 仏號序列之框架内。該異種蛋白係在α_毒素啟動子控制下 表現且由尸/c信號序列靶定進行分泌。可藉由西方點潰分 析使用抗-FLAG抗體監測上清液培養基中所分泌異種蛋 白。 可將任一適宜外源基因以此方式插入產氣莢膜梭狀芽孢 桿菌基因組中。此等包括（例如）來自胃腸道病原體之dna 編碼抗原’包括（例如）諸如大腸桿菌、沙門氏菌屬、彎曲 H9708.doc -35- 1338045 才干菌屬、勞森氏菌屬 '及諸如此類細崮之抗原性蛋白；諸 如X美球蟲屬、等孢子球蟲屬、隱孢子蟲屬及諸如此類寄 生蟲之抗原性蛋白；及諸如輪狀病毒、冠狀病毒及諸如此 類病毒之抗原性蛋白，以免疫接種經此重組產氣莢膜梭狀 牙孢桿菌治療之動物。可藉由此重組產氣莢膜梭狀芽孢桿 菌表現之其他蛋白包括治療性蛋白質或肽。視情況，此等 包括胃腸道之内源性肽，包括三葉因子或任一類別之業内 已知細胞介素’例如，雞IL-1 8、及諸如此類。 一種此產氣莢膜梭狀芽孢桿菌構建體表現雞IL_丨8蛋白 質。含有基因融合之活細菌的投與可遞送治療劑量之化_ 18至腸且因不產生心毒素而對宿主動物相對無害。亦可使 用此糸統表現其他治療劑。 本文引用了許多參考文獻，各文獻之全部内容以引用方 式併入本文中。出於說明目的，本發明包括下列具體實例 且除非另有說明’否則該等實例並非欲限制本發明之範 圍。 實例1 產氣炎膜梭狀芽抱桿菌α-毒素缺失趙同源載艘 製造用於構建產氣莢膜梭狀芽孢桿菌心毒素缺失體之同 源質粒載體1 1 62-55-20。將該質粒納入若干重要的成份； 大腸桿菌質粒PUC18之複製區；產氣莢膜梭狀芽孢桿諸氣 黴素（〇如户）及紅黴素抗性基因（二者亦在大腸桿菌 中表現）；及藉由特定9個胺基酸缺失滅活之產氣笑膜梭狀 芽孢桿菌α-毒素基因。按照下列以若干步驟製造質粒 119708.doc • 36- 1162-55-20 。 首先’自產氣莢膜梭狀芽孢桿菌（菌株CP6)之近期禽類 分離物選殖基因。使用產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株i 3 之序列（Genbank NC 003366; SEQ ID NO: 2)設計擬用於選 殖p/c基因之募核苷酸引物。自Sigma Genosys，Woodlands， TX購得此等及所有後續引物。定位於少p/c基因（CPE0035) 内 之上游 引 物 ， 即 5, AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC 3’（SEQ ID NO: 14) 對應於菌株13之核苷酸47675-47700(SEQ ID NO·· 2)。定位 於coi妒基因（CPE0037)内之下游引物，即5, GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC 3' (SEQ ID NO: 15)係與菌株13之核苷酸50597-50629互補。在長裎 聚合酶鏈反應（PCR)中一起使用此等引物及來自產氣莢膜 梭狀芽孢桿菌菌株CP6之基因組DNA。可自菌株13之已知 序列（如圖1中所示）預知自上游又p/c基因至下游co6阶基因 之2955個驗基對的產物。a-毒素啟動子、信號序列及p/c基 因（CPE003 6)編碼序列包含於此片段中，即，介於上游 基因與下游妒基因之間。隨後將PCR 2955個鹼基對片 段選殖至產生質粒1 162-52.1之選殖用載體pCR-Blunt (Invitrogen公司，Carlsbad, CA)中。自此片段（SEQ ID NO: 22 ;且對應多肽係SEQ ID NO: 23)測定菌株CP 6之295 5個 鹼基對片段之編碼區的核苷酸序列且證實該核苷酸序 列與產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株13之p/c基因的核苷酸序 列（SEQ ID NO: 2)實質同源。. 119708.doc -37- A接下來，自往復質粒pJIR418選殖大腸桿菌複製區及產 軋莢膜梭狀芽孢桿菌抗性基因（Sloan等人，1992,尸/α⑽w ,2〇7·219; Genebank Μ77169)。使用限制酵素Bam 出及 SPe I消化質粒pJIR418並用Kien〇w聚合酶填充末端。大片 段之連接反應產生質粒1162_451並恢復Bam _制酶切 位點。此質粒保留大腸桿菌複製@ ’但不同於pJI議， 其不含有產氣莢膜梭狀芽孢桿菌複製源。因此，該質粒能 夠在大腸桿菌中但不可在產氣莢膜梭狀芽孢桿菌中自主複 製。 在下一步驟中’將〆c基因之匕末端部分亞選殖至中間 體質粒1 162-45.1。使用Bam出及豇。幻消化質粒1162_ 52_1釋放一 1742個鹼基對片段，其含有（^•毒素基因之c末 端部分，自定位於p/c基因下游之唯一 Bam HI位點經由⑶办 妒基因至定位於母體質粒多選殖位點之Ec〇 RI位點内的。 在定位於質粒1162_45_1多選殖位點内之Bam HI位點與Eco Ri位點之間選殖該1742個鹼基對片段。在所得質粒1162_ 53.7中’ p/c基因之c—末端部分與親本質粒之及 基因係在相同轉錄取向上。 在最後一步中’將該户丨c基因之N•末端部分選殖至質粒 1 1 62-53.7之唯一 Bam HI位點。此可藉由製造源自在質粒 1 162-52.1中亞選殖的α•毒素基因之pCR片段來完成。上游 引物’即 5' ggatccAGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC 3’（SEQ ID N0: 16)與先前所述_yp/c 引物（SEQ ID NO: 4)係 一致的，只是包含側接Bam HI位點（小寫字母）。定位於α_ 119708.doc -38- 1338045 毒素基因 内之下游引物，即 5, ggatccaATGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3, (SEQ ID NO: 17)與菌株13之核苷酸48824-48857互補且包 含側接Bam HI限制酶切位點及間隔子核苷酸以保持閱讀框 架（小寫字母）。將自PCR與此等引物及質粒1 162-52-1模板 DNA形成之Bam HI片段選殖至質粒1162-53.7之唯一 Bam HI位點。分離在相同轉錄取向上含有兩個基因區之質 粒。此質粒1 162-55.20含有具有期望9個胺基醆缺失並在野 生型5素之ala 61與asp 71之間添加有一 ieu殘基的基因 (參見圖2)。該質粒之DNA測序確認該閱讀框架及24個密 碼子（編碼8個胺基酸殘基）淨缺失。 實例2 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌重組體CPERF001之構建 使用下列策略將在實例1中所構建户心基因之缺失型式導 入產氣莢膜梭狀芽孢桿菌。該同源載體1162_55 2〇被稱為 產氣莢臈梭狀芽孢桿菌"自殺質粒"，乃因其產氣莢膜梭狀 芽抱桿菌複製源已經移除。 當將此質粒轉化成產氣莢膜梭狀芽孢桿菌時，其不能夠 複製且不可存活。然而，倘若將該經轉化細菌置於氯黴素 及/或紅黴素選擇下，則質粒DNA可能因與户/c基因之同源 f生而被追重組至細菌基因組中。所得重組細菌被稱為整合 體。该整合體含有在户基因基因座受到整合之導入同源 載體的拷貝。因此’所得整合體含有兩個p/c基因拷貝： 初始正常拷貝及導入缺失型式。所導入抗性基因定位於兩 H9708.doc -39- 4 p/c基因拷貝之間。冑自該整合體去除抗生素選擇時， 個p/c基因拷貝之間發生重組。此重組事件可能產生 兩種結果Φ 4 ,D 9 —種。在這兩種情形中，均已經移除介入兩 户基因（包括抗性基因）拷貝間之DNA。在第一種結果 火復"玄正*的p/c基因從而可回收初始母體菌株。在 第二播聋士里 士 ' ° 中’正常的p/c基因經缺失拷貝替換’產生期 望甘素缺失體構建體。由於缺失體菌株之^毒素經滅 活，所以此菌株係非溶血性的。因此，可藉由在血竣脂平 板上繂選非溶血性純系來識別期望缺失體整合體。 由於期望形成所需整合體之重組事件以低頻率發生，因 此關鍵疋使用具有高轉化效率之母體產氣英膜梭狀芽抱桿 菌菌株。因此，分析產氣莢膜梭狀芽孢桿菌之若干近期禽 類分離物的轉化效率。使用經輕微修飾（闡述於下文中）之 llen^Blaschek {Applied and Environmental Microbiology 54:2322 (1988))所述往復質粒pJIR418轉化該等分離物。菌 株1240呈現最同轉化效率（參見表〇，9,個轉化體繼 克PJIR418質粒DNA。選擇此g株作為構建缺失體 CPERF001之親本菌株。選擇菌株29作為cpERF〇〇2之親本 菌株。 119708.doc -40· 1338045 表1
23 1220 1240 CP-2 1230 5227 5230 5.6xl〇2 4.〇xl 0( 9.2x1 〇6 Μ. …、 7.1xl〇3
益 # k*V 上文所列舉野生型菌株之來源係Dr. J. Glenn Songei·，
Dept, of Veterinary Sciences and Microbiology, University of Arizona, Tucson, Arizona 85721 以1:25稀釋來自TSYC培養基（3〇克/公升胰酶大豆肉湯，
5克/公升酵母菌提取物’ 0.5克/公升半胱胺酸）之過夜厭氧 培養物的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株124〇個細胞並使之生 長至A_ = 〇.5436。在將100毫升細胞以ΐ8,000χ克離心1〇分 鐘後’藉由將細胞重新懸浮於等體積之預還原蔗糖磷酸鎂
("SMP” ’ 以 270 mM蔗糖，1 mM MgCl2，7 mM NaP〇4，pH 7·3製備）緩衝液中兩次繼而形成具有〇·5毫升smP之最終再 懸浮液來製備電穿孔勝任細胞。此形成約2.0毫升最終體 積0 在〇_2公分吸收池中使用4微克質粒1 162-55.20對若干等 份（1〇〇微升）細胞實施電穿孔。在1.37千伏、1〇〇歐姆電阻 及50微法拉電容下使用Bio-Rad Gene Pulser II。在電穿孔 後’立刻使用2·0毫升預還原胰酶大豆酵母菌半胱胺酸培 H9708.doc -41 - 1338045 養基rrsw㈣騰酶大i肉湯'5克酵母菌提取物、 〇·5克半胱胺酸、950毫升水製備）稀釋細胞並在抓下將立 在厭氣瓿中培養3個小時。在 U收期後，將細胞稀釋物置 於TSYC + 25微克/毫升氣衡音伞,
傲素千板上。將此等平板在37°C 下’於厭氣瓶中培育過夜。 隹迴仪生长 一，v L·^ I Ή Γ\ ^ 5〇個氣黴素抗性菌落。使7個拖宁从敕人λ 仗/個推疋的整合體之各菌落在非
選擇性TSYC培養基中；ψ具* 生長至出現4個連續出芽並將其置於 非選擇性血璦脂平板上。該等非選擇性原液之—即⑽_ 3"呈現若干非溶血性菌落。將川固此等非溶血性菌落補 綴於非選擇性主平板並將複製物置於TSYc+氣黴素平板 上。21個菌落中有2個對氣黴素敏感。
规剛到母微克1162-5 5.20 DNA平均 使1個氣黴素敏感性推定缺失體，即1192_32.14與124〇野 生型及整合體U92-3"一起生長並置於血凌脂平板上。 1240野生型菌株顯示清晰的p溶血區而1192_32」4缺失體係 非洛血丨生菌落之純淨培養物並將其重命名為CpERF〇〇 ^。 其他血液平板用作主平板並將複製物置於非選擇性及選 擇性培養基上。；1240野生型及CPERF〇〇1均對氯黴素及紅 黴素敏感。正如吾人所預期，整合體1192_31·7對氣黴素及 紅黴素二者均具有抗性。 為了排除抗生素抗性基因存在但不在cpERF〇〇l中表現 之可能性，合成用於pcR反應之對氣黴素及紅黴素基因具 有特異！·生之PCR引物。自野生型菌株、整合體菌株及 CPERFG(H菌株製傷基因組DNA並將其用作抗生素基因引 U9708.doc •42- 1338045 物之PCR反應的;^板。PCR分析之結果顯示正響應僅來自 自救質粒及整合體而非母體124〇或缺失體cpERF〇〇l。此 確認抗性基因序列之預期損失。 為了確素基因内之缺失，藉由pcR使用適當的& 毋素特異性引物擴增圍繞該缺失之1 〇86 區。對經擴增 片段實施選殖並測序。測序結果確認自a•毒素基因之听 62至trp 70有9個胺基酸缺失及單—丨⑶插入（參見圖 2C)。 分析CPERF001之滅活⑽員毒素蛋白表現。在無氧生長6 個小時以後’收集若干等份（1毫升）細胞並離心之。藉由聚 丙烯醯胺凝膠電泳》析15微升未㈣縮上清液培養基並使 用針對重組"·毒素蛋白之兔子多株抗體對其實施西方點潰 分析 1 1(12): 1253·1258 (1993))。結果顯示：對於 a類毒素蛋白而言，特異性抗體可與期望大小之蛋白質反 應。 CPERFGG1係產氣英膜梭狀芽孢桿菌A型菌株之經基因改 造缺失體。此菌株分泌產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a毒素之 滅活類毒素形式。由於此菌株不再表現活性a_毒素但保留 大部分毒素抗原性，因此其可用作疫苗以防止由產氣莢膜 梭狀芽抱桿菌引起的疾病。 實例3 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌重組體CPErf〇〇2之構建 為了補償產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株29之較低轉化效率 (參見上表1),構建新穎同源載體。將該新穎載體納入直接 J19708.doc -43 - 1338045 自菌株29基因組選殖之產氣莢膜梭狀芽孢桿菌序列中。預 計，此可產生更有效的重組步驟。該新穎載體係按照下列 製造之 1 192-38.3。 在第一步驟中，自往復質粒PJIR418選殖大腸桿菌複製 區及產氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗性基因（Sloan等人， 27, 207 (1992); Genebank M77169)。使用限制酵素Ndel消 化質粒PJIR418。大片段之連接反應產生質粒1 192-23.1。 此質粒缺少產氣莢膜梭狀芽孢桿菌複製源，但不同於實例 1中所構建質粒1 162-45.1，其保留pJIR418之完整的多選殖 位點。 在下一步驟中，將；?/c基因之C-末端部分亞選殖至中間 體質粒1192-23.1中。來自菌株29之基因組DNA用作長程 PCR之模板。擴增自Bam HI位點至CPE0038基因之一部分 的〆c基因（α-毒素）區域。上游尸/c引物，即5· CTGGGATCCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGAT 3' (SEQ ID NO: 18)對應於菌株13之核苷酸48880-48916 (Genbank NC 003366) » CPE0038基因内之下游引物，即 5· actctgcagTTGTCATATCAATTAAATTAACTATAATCCC 3' (SEQ ID NO: 19)與菌株13之核苷酸51244-5 1275互禎且含 有包含Pst I限制酶切位點在内的側接核苷酸（小寫字母）》 獲得2402個鹼基對之產物並用限制酵素Bam HI及Pst I消化 之。使用經Bam HI及Pst I消化之1 192-23.1的大片段連接此 片段以產生質粒1 192-36.10。 在最後一步驟中，藉由PCR選殖p/c基因之N-末端部分。 • 44· 119708.doc 1338045 上 游 引 物 ， 即 5' actgagctcCTAGACACTTTGCTTCAATATTTGGGAA 3' (SEQ ID NO: 20)對應於菌株13之核苷酸46513-46540且包含側接 核苷酸及Sac I位點（小寫字母）。下游引物，即5’ actggatccGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3, (SEQ ID NO·· 21)與菌株13之核苷酸48824-48855互補且包 括側接核苷酸及Bam HI位點。產生2363個鹼基對產物並使 用Sac I及Bam HI限制酵素消化此產物。將經消化片段與 經Sac I及Bam HI消化之1 192-3 6.10的大片段連接以產生質 粒1 1 9 2 - 3 8 · 3。側接1 1 9 2 - 3 8.3中尸/ c B a m ΗI位點之區的後續 測序確認了自tyr 62至trp 70之9個胺基酸缺失。 使用質粒1 1 92-38.3對產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株29細胞 實施電穿孔。上文顯示菌株29係以3.6x1 04個轉化體/微克 PJIR418質粒DNA之效率轉化。使菌株29細胞生長並按照 實例2中對其實施電穿孔’只是在3小時回收期後使用液體 選擇技術。不是平板接種而是以12毫升TSYC+25微克/毫 升氯黴素稀釋若干等份（0.67毫升）細胞並使其在37〇c下於 厭氣瓶中生長過夜。使用此修飾，乃因菌株29相對於丨24〇 具有較低轉化及平板接種效率之故。在過夜生長之後，再 次在選擇培養基中稀釋細胞。隨後使來自二次出芽之細胞 在無選擇時傳代5次’然後將其平板接種於血瓊脂平板 上來自血瓊脂平板之菌落均為溶血性的。隨後將2個血 液平板一式兩份平板接種至TSYC、TSYC+25微克/毫升氣 黴素及TSYC + 5G微克紅黴素平板。所有菌落均對紅徵素敏 H9708.doc •45· 感但130個菌落中僅有1個對氯黴素敏感。將此菌落n92_ 45.4B重命名為CPERF002。使用α-毒素特異性引物對來自 CPERF002之基因組DNA實施PCR分析，顯示α-毒素陽性 帶。此帶較來自野生型菌株29 DNA之對應帶更小。對氣 黴素及紅黴素抗性基因具有特異性之引物不能夠擴增 CPERF002 DNA但自質粒1 192-38.3顯示強陽性帶。對 CPERF002 α-毒素實施測序，確認9個胺基酸缺失（參見圖 3)。 分析CPERF002之滅活α類毒素蛋白表現。在無氧生長6 個小時以後’收集若干等份（1毫升）的細胞並離心之。.藉 由聚丙烯醯胺凝膠電泳分析1 5微升未經濃縮上清液培養基 並使用針對重組α-毒素蛋白之兔子多株抗體對其實施西方 點潰分析（Faccke 11(12)·· 1253-1258 (1993))。結果顯示： 對於α類毒素蛋白而言，特異性抗體可與期望大小之蛋白 質反應。 CPERF002係產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α型菌株之經基因改 造缺失體。此菌株分泌產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α _毒素之 滅活類毒素形式。由於此菌株不再表現活性α_毒素但保留 大部分毒素抗原性’因此其可用作疫苗以防止由產氣莢膜 梭狀芽孢桿菌引起的疾病。 實例4 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌缺失體疫苗 評定實例2及實例3中所述CPERF001及CPERF002缺失體 疫苗菌株提供針對野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌挑戰之保 II9708.doc •46· 1338045 護的能力。將該研究之第一部分設計為測定所投與活疫苗 菌株對孵化蛋之孵化率是否具有任何不利影響。實驗群組 之分配及安全性結果闡述於表2中。 表2 群組* 1 安全性結果 疫苗(劑量)** CPERF001 (0.8x102)x 孵化蛋之數量（％) 18 (90%) 2 CPERF001 (0.8x100 17(85%) 3 CPERF001 (O.SxlO4) 11 (55%) 4 CPERF001 (0.8x105) 16(80%) 5 CPERF002 (1.9xl02) 16 (80%) 6 CPERF002 (1.9χ103) 17 (85%) 7 CPERF002(1.9xl04) 14 (70%) 8 CPERF002 (1.9x 105) 12 (60%) 9 菌株 1240(1.5χ103) 16 (80%) 10 菌株29 (3.7x103) 13 (65%) 11 培養基對照 19 (95%) 12 未接種對照 18 (90%) * 20個蛋每群組 **在孵化18天時以卵内方式投與100微升劑量（IM) x以菌落形成單位（"c fu ”）量測每個劑量之效價。 在投與1 〇3或更少劑量（群組1、2、5及6)時，此等群組並 非較僅接種培養基之群組（群組11)或未經接種之群組（群組 1 2)具有明顯更低的孵化率。在最低劑量時，CPERF00 1顯 示與培養基對照相同且較未經接種對照群組更佳的孵化 率。 由於較高劑量之缺失體可對蛋孵化率具有不利影響，因 此該研究之有效部分僅包含每一缺失體之2個最低劑量的 群組。使用（野生型）產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株激發此等 119708.doc -47- 1338045 群組以及培養基對照鳥類（群組11)，該菌株CP6係在烏有 20、21及22天大時以約〗〇8 cfu/毫升/只鳥經口投與。在25 天大時對所有鳥貫施屍體檢剖並使有下文所概述壞死性腸 炎評定量表對小腸内損傷實施打分。
_〇記分__ "^小腸上無NE 肉眼可見損 傷；腸具有正 常的彈性(在打 開後自動卷 回）。 壞死性腸炎1 + i壁薄且軟垂 (在打開時腸保 持平坦且不會 卷回至正常位 置）.有過量或 黏稠黏液覆蓋 於黏膜上或者 病灶或多病灶 使黏膜中度變 紅或漿膜管充 ifry 〇 壞死性腸炎2+ 單一或少數多 病灶區使腸璧 變紅並腫脹； 單一或少數多 病灶區使腸黏 膜出現潰瘍或 壞死。 壞死性腸炎3+ 大量多病灶區 使腸黏膜出現 壞死及潰瘍土黏 膜表面上大量 出血或出現血 纖蛋白層或壞 死碎屑（土耳其 浴巾外觀）。 壞死性腸炎4+ 具有NE肉眼可 見損傷記分2+ 或以上之死亡 動物。 可依照 Charles Hofacre，D.V.M·，M.A.M.，Ph.D.，University of Georgia, Poultry Diagnostic and Research Center, 953
College Station Road，Athens，GA 30602對記分實施較小改 動0
在研究結束時對來自未經接種對照群組（未受激發）之五 (5)只鳥實施屍體檢剖以確認在研究過程中未暴露於產氣莢 膜梭狀芽孢桿菌。結果示於表3中。 表3 群組 * 疫笛 卵内疫苗 劑量(cfu) 使用產氣莢膜梭狀芽孢 桿菌激發時之大小(天） 數量 平均值 1 CPERF001 lxio2 20、21 及22 9 0.67 2 CPERF001 lxio3 20、21 及22 13 0.46 5 CPERF002 lxio2 20、21 及22 12 1.33 6 CPERF002 lxio3 20、21 及22 12 1.08 擬保護之治療群組* 結果 119708.doc -48- 1338045 11 培養基對照 無 20、21 及22 15 1 80 12 #»*> 無 未受激發 5 0.00 *在25天大時實施屍體檢剖 與群組11相比’群組1及群組2各自之記分在統計學上明 顯更低（Wilcoxon Exact Rank Sum Test ρ$〇.〇250)。群組5 及群組ό之平均記分較群組11更低但在統計學上無不同 (Wilcoxon Exact Rank Sum Test ptO.2177)。依照 David
Siev 所遂轾序[Journal 〇f Modern AppUed StatisUcal 第4卷，No. 2，500-508 (2005)]對疫苗效率實施 評定。當與群組11對比時’將疫苗在降低疾病嚴重性方面 之效率評定為54%(群組1)、65%(群組2)、20%(群組5)及 27°/。(群組 6)。 實例5 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌豬缺失體之構建 使用上文實例1及實例2中所用策略來自產氣莢膜梭狀芽 孢桿菌豬菌株構建α-毒素缺失突變體。開始，使用質粒 PJIR418對來自患病豬之野外分離物實施電穿孔以評定其 可轉化性。產生^104個轉化體每微克質粒DNA並對氯黴素 或紅黴素敏感之分離物係缺失之候選者。 來自候選菌株之基因組1)1^八用作〆c (α_毒素）基因及側 接序列之長程PCR的模板。在亞選殖pCR產物之後對α_ •^素基因及、側接區實施測序並繪製限制性内切酶譜。藉 助側接限制酶切位點合成新穎寡核苷酸引物並將2次獨立 擴增之產物選殖至自殺質粒1192_23」以製造如實例1中所 119708.doc -49- 1338045 述27個鹼基對缺失。 將該豬自殺載體電穿孔至對應產氣笑膜梭狀芽孢桿菌之 豬菌株並使用上文實例2中所述方法分離缺失突變體。藉 由血瓊脂平板上不存在β溶血作用及藉由對α毒素基因實 施DN Α測序來確認缺失突變體e 此構建體係產氣莢膜梭狀芽孢桿菌A型菌株之經基因改 造缺失體。此菌株分泌產氣莢膜梭狀芽孢桿菌^ _毒素之 滅活類毒素形式。由於此菌株不再表現活性α_毒素但保留 大部分毒素’抗原性，因此其可用作疫苗以防止豬患由產氣 莢膜梭狀芽孢桿菌引起的疾病。 生物寄存 下列生物材料之培養物已經由下列國際寄存機構寄存： 美國典型培養物保藏中心（ATCC) 1〇8〇1 university
Boulevard, Manassas，Va. 201 10-2209, U.S.A. ’ 在滿足國際 認可用於專利程序目的之布達佩斯微生物寄存條約 (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)要求的條件下寄存。 生物體 登記編號 寄存日期 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌 PTA7364 2006年2月7日 CPERF/ΔαΤοχΐη 365-054 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌 PTA7365 2006年2月7曰 CPERF/ΔαΤοχΐη 365-053 【圖式簡單說明】 ]I9708.doc <Λ 圖1閣月產氣英膜梭狀芽孢桿菌α_毒素編碼區之基因組 圖圖中展示用於構建CPERF001之兩個大片段（Η 82驗基 對及1746鹼基對）各自之定位。圖中亦指出所形成的27鹼 基對缺失之定位。”如，表示外卜基因（CPE〇〇35) ; "ye"表 示編碼α-毒素（磷脂酶C)之基因且"CobW"表示下游基因。 圖2A闡明產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株CP6之pic基因之一 部分的序列[SEQ ID NO: 4 ;此係CP6之p/c基因片段之SEQ ID NO: 22的一部分（即，核苷酸262_3〇〇)]及對應肽序列 (SEQ ID NO: 5) ’其中下劃線表示用於形成該缺失之 BamH 1内切核酸酶限制酶切位點。 圖2B闡明用於在母體產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株124〇中 形成缺失之引物的序列（SEQ ID NO: 6)，此形成缺失體 CPERF001。下劃線表示該引物中所含BamH1限制酶切位 點以便於構建該缺失。圖中亦闡明對應肽（SEQ ID NO:7)。 圖2匸闡明匚？五1^001(3£(5 1〇_:8;核苷酸103-117)中 及對應肽（SEQ ID NO: 9)中所形成缺失之序列。下劃線表 示復原BamHl内切核酸酶限制酶切位點。 圖3 A再次闡明產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株cp6之pic基因 之一部分的序列[SEQ ID NO: 4，核苷酸262-300]及對應肽 序列（SEQ ID NO: 5)，其中下劃線表示用於形成該缺失之 BamH 1内切核酸酶限制酶切位點。 圖3B闡明用於在母體產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株29中形 成缺失之引物的序列（SEQ ID NO: 10)，此形成缺失體 119708.doc 51 1338045 CPERF002。圖中亦闡明對應肽（SEQ ID NO: 11)。 圖3C闡明CPERF002中所形成缺失之序列（SEQ ID NO: 12)及對應肽（SEQ ID NO: 13)。
119708.doc -52- 1338045 序列表 <110> 瑞士商先靈薇雅有限公司 <120> 重組之減毒梭狀芽孢桿菌生物體及疫苗 <130〉 AH06175 <140〉 096113489 <141> 2007-04-17 <150> 60/792,553 <151> 2006-4-1*7 <160> 23 <170> Patentln version 3.3
<210> 1 <211> 398
<212> PRT 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株13 <400> 1
Met Lys Arg Lys lie Cys Lys Ala Leu lie Cys Ala Thr Leu Ala Thr 15 10 15
Ser Leu Trp Ala Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala Trp Asp Gly Lys 20 25 30 lie Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met lie Val Thr Gin Gly Val Ser 35 40 45
He Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu Ser Val Arg Lys 50 55 60
Asn Leu Glu lie Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu Gin Leu Gly Ser 65 70 75 80
Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu Tyr Gin Asp His 85 90 95
Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys Asp Asn Ser Trp 100 105 110
Tyr Leu Ala Tyr Ser lie Pro Asp Thr Gly Glu Ser Gin lie Arg Lys 115 120 125
Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gin Arg Gly Asn Tyr Lys Gin 130 135 140
Il9708.doc 1338045
Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe Gly Asp lie Asp 145 150 155 160
Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp Ser Ala Gly His 165 170 175
Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu Gin Tyr Lys lie 180 185 190
Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr Ala Asp lie Leu 195 200 205
Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr Ala Arg Gly Phe 210 215 220
Ala Lys Thr Gly Lys Ser He Tyr Tyr Ser His Ala Ser Met Ser His 225 230 235 240
Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn Ser 245 250 255
Gin Lys Gly Thr Ala Gly Tyr lie Tyr Arg Phe Leu His Asp Val Ser 260 265 270
Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala 275 280 285
Tyr lie Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met 290 295 300
Tyr Phe Gly lie Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gin Glu Trp Glu Met 305 310 315 320
Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr 325 330 335
Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys lie Asp Asp lie Gin Asn Met 340 345 350
Trp lie Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro 355 360 365
Glu Asn lie Lys lie lie Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp 370 375 380 119708.doc 1338045
lie Asn Glu Trp lie Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn lie Lys 385 390 395 <210> 2 <211> 1197
<212> DNA <213>產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株13 <400> 2 atgaaaagaa agatttgtaa ggcgcttatt tgtgctacgc tagcaactag cctatgggct 60 ggggcatcaa ctaaagtcta cgcttgggat ggaaagattg atggaacagg aactcatgct 120 atgattgtaa ctcaaggggt ttcaatctta gaaaatgatc tgtccaaaaa tgaaccagaa 180 agtgtaagaa aaaacttaga gattttaaaa gagaacatgc atgagcttca attaggttct 240 acttatccag attatgataa gaatgcatat gatctatatc aagatcattt ctgggatcct 300 gatacagata ataatttctc aaaggataat agttggtatt tagcttattc tatacctgac 3 60 acaggggaat cacaaataag aaaattttca gcattagcta gatatgaatg gcaaagagga 420 aactataaac aagctacatt ctatcttgga gaggctatgc actattttgg agatatagat 480 actccatatc atcctgctaa tgttactgcc gttgatagcg caggacatgt taagtttgaa 540 acttttgcag aggaaagaaa agaacagtat aaaataaaca cagcaggttg caaaactaat 600 gaggattttt atgctgatat cttaaaaaac aaggatttta atgcatggtc aaaagaatat 660 gcaagaggtt ttgctaaaac aggaaaatca atatactata gtcatgctag catgagtcat 720 agttgggatg attgggatta tgcagcaaag gtaactttag ctaactctca aaaaggaaca 780 gcaggatata tttatagatt cttacacgat gtatcagagg gtaatgatcc atcagttgga 840 aagaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtgaaaaaga tgctggaaca 900 gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg 960 gacaacccag gaaatgattt tatgactgga agtaaagaca cttatacttt caaattaaaa 1020 gatgaaaatc taaaaattga tgatatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca 1080 gcattcccag atgcttataa gccagaaaac ataaagataa tagcaaatgg aaaagttgta 1140 gtagacaaag atataaatga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaataa 1197 <210> 3 <211> 370
<212> PRT <213>產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株13 <400> 3
Trp Asp Gly Lys lie Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met lie Val Thr 119708.doc 1338045
Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu lie Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu 35 40 45
Gin Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu 50 55 60
Tyr Gin Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys 65 70 75 80
Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser lie Pro Asp Thr Gly Glu Ser 85 90 95
Gin lie Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gin Arg Gly 100 105 110
Asn Tyr Lys Gin Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe 115 120 125
Gly Asp lie Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp 130 135 140
Ser Ala Gly His Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu 145 150 255 160
1 5 10 15 Gin Gly Val Ser lie Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu 20 25 30
Gin Tyr Lys lie Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr 165 170 175
Ala Asp lie Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr 180 185 190
Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser lie Tyr Tyr Ser His Ala 195 200 205
Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr 210 215 220
Leu Ala Asn Ser Gin Lys Gly Thr Ala Gly Tyr lie Tyr Arg Phe Leu 225 230 235 240
His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys -4· I19708.doc 1338045 245 250 255
Glu Leu Val Ala Tyr lie Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr 260 265 270
Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly lie Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gin 275 280 285
Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys 290 295 300
Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys lie Asp Asp 305 310 315 320
lie Gin Asn Met Trp lie Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp 325 330 335
Ala Tyr Lys Pro Glu Asn lie Lys lie lie Ala Asn Gly Lys Val Val 340 345 350
Val Asp Lys Asp lie Asn Glu Trp lie Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn 355 360 365 lie Lys 370 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213>寡核苷酸
<400> 4 aacgcctatg atctatatca agatcatttc tgggatcct <210> 5 <211> 13
<212> PRT <213>寡肽 <400> 5
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<212> DNA <213>寡核苷酸 119708.doc 1338045 <400> 6 aatgcattgg atcc <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213>寡肽 <400> 7
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<212> DNA <213>寡核苷酸
<400> 8 aatgcattgg atcct <21〇> 9 <211> 5 <212> PRT <213> 寡肽 <400> 9
Asn Ala Leu Asp Pro 1 5 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> 寡核苷酸 <400> 10 aatgcggatc cagt <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> <400> 11 Asn Ala Asp Pro 1 <210> 12 <211> 12 <212> DNA <213> 寡核苷酸
119708.doc 1338045 '參· <400> 12 aatgcggatc ct 12 <210> 13 <211> 4
<212> PRT <213>寡肽 <400> 13
Asn Ala Asp Pro 1 <210> 14
<211> 26 <212> DNA <213>寡核苷酸 <400> 14 26 33 agctgcataa gcaaaagttc caactc <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213>寡核苷酸 <400> 15 gcagaaactc ttcttagacc tattctttta ggc <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> 寡核苷酸 <400> 16 ggatccagct gcataagcaa aagttccaac tc 32 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> 寡核苷酸 <400> 17 ggatccaatg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 41 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> 寡核苷酸 <400> 18
ctgggatcct gatacagata ataatttctc aaaggat 37 H9708.doc 401338045 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213>寡核苷酸 <400> 19 actctgcagt tgtcatatca attaaattaa ctataatccc > > > > 0 12 3 X 1 1 1 2 2 2 2 20 37
DNA 寡核苷酸 <400> 20 37 41 actgagctcc tagacacttt gcttcaatat ttgggaa <210> 21 <211> 41 <212> DNA <213> 寡核苷酸 <400> 21 actggatccg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c <210> 22 <211> 1197
<212> DNA <213>產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株CP6 <400> 22 atgaaaagaa agatttgtaa ggcgcttatt tgtgctgcgc tagcaactag cctatgggct 60 ggggcatcaa ctaaagtcta cgcttgggat ggaaaaattg atggaacagg aactcatgct 120 atgattgtaa ctcaaggggt ttcaatctta gaaaatgatc tgtctaaaaa tgaaccagaa 180 agtgtaagaa aaaacttaga gattttaaaa gagaacatgc atgagcttca attaggttct 240 acttatccag attatgataa gaacgcctat gatctatatc aagatcattt ctgggatcct 300 gatacagata ataatttctc aaaggataat agttggtatt tagcttattc tatacctgac 360 acaggggaat cacaaataag aaaattttca gcattagcta gatatgaatg gcaaagagga 420 aactataaac aagctacatt ctatcttgga gaggctatgc actattttgg agatatagat 480 actccatatc atcctgctaa tgttactgcc gttgatagcg caggacatgt taagtttgag 540 acttttgcag aggaaagaaa agaacagtat aaaataaaca cagcaggttg caaaactaat 600 gaggattttt atgctgatat cttaaaaaac aaagatttta atgcatggtc aaaagaatat 660 gcaagaggtt ttgctaaaac aggaaaatca atatactata gtcatgctag catgagtcat 720 agttgggatg attgggatta tgcagcaaag gtaactttag ctaactctca aaaaggaaca 7δ0 gcaggatata tttatagatt cttacacgat gtatcagagg gtaatgatcc atcagttgga 840 119708.doc 9001338045 aagaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtgaaaaaga tgctggaaca gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg gacaacccag gaaatgattt tatgactgga agtaaagaca cttatacttt caaattaaaa gatgaaaatc taaaaattga tgatatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca gcattcccag atgcttataa gccagaaaac ataaagataa tagcaaatgg aaaagttgta gtagacaaag atataaatga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaataa <210> 23 <211〉 398
<212> PRT 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌株CP6 <400> 23
Met Lys Arg Lys lie Cys Lys Ala Leu lie Cys Ala Ala Leu Ala Thr 1 5 10 15
Ser Leu Trp Ala Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala Trp Asp Gly Lys 20 25 30 lie Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met lie Val Thr Gin Gly Val Ser 35 40 45 工le Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu Ser Val Arg Lys 50 55 60
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Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn Ser 245 250 255
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Claims (1)

1^3^045 (〇只y a诗、€)王
. 第096113489號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(99年1〇月） • 十、申請專利範圍： 1· 一種編碼產氣英膜梭狀芽孢桿菌 ge«s)a-毒素之實質無毒性突變蛋白的核酸分子，其中該 突變蛋白a-毒素包含減去至少9個但不大於48個連續胺基 酸殘基之SEQ ID NO: 3的胺基酸序列；且其中該等缺失 胺基酸殘基之一係His68。 2·如請求項1之核酸分子’其中該突變蛋白a_毒素包含減去 至少12個連續胺基酸殘基之SEQ id NO: 3的胺基酸序 列；且其中該等缺失胺基酸殘基之一係His68。 3.如請求項2之核酸分子，其中該突變蛋白a_毒素包含減去 至少1 8個連續胺基酸殘基之SEq id NO: 3的胺基酸序 列；且其中該等缺失胺基酸殘基之一係HiS68。 4·如請求項丨之核酸分子，其中該突變蛋白&毒素包含減去 Tyre2至Trp1 2 3〇範圍之9個連續胺基酸殘基的SEq m N〇: 119708-991005.doc 1 ·如吻求項1之核酸分子’其包含SEQ ID NO: 2之核酸序 列，其中該核酸分子之核苷酸268_294缺失。 2 6.如请求項5之核酸分子，其中該等缺失核苷酸係由一個 編碼單一 Leu殘基之核苷酸序列替代。 3 · 種產氣莢膜梭狀芽孢桿菌a-毒素之實質無毒性突變蛋 白其中该突變蛋白a-毒素包含減去至少9個但不大於48 個連、$胺基酸殘基之SEq ID N〇: 3的胺基酸序列；且其 中該等缺失胺基酸殘基之—係、。 8·如„月求項7之產氣芙膜梭狀芽抱桿菌…毒素之實質無毒性 1338045 突變蛋白’其中該突變蛋白α_毒素包含減去至少12個連 續胺基酸殘基之SEQ ID NO: 3的胺基酸序列；且其中該 等缺失胺基酸殘基之一係His68。 9. 如請求項8之產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α_毒素之實質無毒性 突變蛋白，其中該突變蛋白包含減去至少18個連續胺基 酸殘基之SEQ ID NO: 3的胺基酸序列；且其中該等缺失 胺基酸殘基之一係His68。 10. 如請求項7之產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α•毒素之實質無毒性 突變蛋白，其十Tyi*62至Trp70範圍之9個連續胺基酸殘基 φ 缺失且由單一Leu殘基替代。 11. 一種減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其係藉由將如 請求項1之核酸分子整合入未減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿 菌生物體之染色體中所構建，藉此將野生型心毒素基因 》 以如請求項1之核酸分子取代。 12. 如請求項11之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其係 實質無毒的。 1 3.如請求項11之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中· 該核酸分子位於染色體上之位置與編碼未減毒產氣莢膜 梭狀芽孢桿菌中存在之野生型α-毒素之核酸分子之位置 同源。 14.如β青求項i〖之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體’其係 A型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌。 1 5 ·如叫求項i丨之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體’其中 用於構建之未減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌可自哺乳動物 119708-991005.doc 或禽類之宿主動物分離。 如％求項1 5之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中 甫乳動物係選自牛 '羊、及猪組成之群。 "月求項1 5之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體其中 4禽類係雞 '火雞 '鶴、鴨、天鶴、野鸿㈣）、家锋 (Pigeon)、松雞、或山鶉（partridge)。 1 8.如5月求項11之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其包 3至J —個編碼非產氣莢膜梭狀芽孢桿菌多肽之基因。 19.如吻求項18之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中 °玄非產氧莢膜梭狀芽孢桿菌多肽係非細菌多肽。 2〇·如請求項19之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體其中 該非細菌多肽係禽類或哺乳動物多肽。 2 1.如請求項20之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中 該非細菌多肽係禽類多肽。 22. 如請求項20之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中 έ玄非細函多狀係細胞介素（Cyt〇kine)。 23. 如請求項22之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其中 該細胞介素係雞IL-1 8。 24· —種疫苗，其包含如請求項丨丨之減毒產氣莢膜梭狀芽炮 桿菌生物體。 25.如請求項24之疫苗，其進一步包括一或多種下列物質： 藥理學上可接受之緩衝劑' 賦形劑、或佐劑。 26_ —種免疫有效劑量之如請求項24之疫苗的用途，其係用 於製造一種用於誘發動物對於產氣莢膜梭狀芽孢桿菌免 M9708-991005.doc 1338045 疫性的藥物。 27’如哨求項26之用途，其中藉由下列途徑之一或多種投與 泫疫田.心口、肌内、靜脈内、皮内、皮下、或鼻内。 28. 士叫求項26之用途，其中該疫苗施於動物飼料之表面 上0 29·如吻求項26之用途，其中該疫苗喷灑於動物以便於經口 投藥。 30. —種動物飼料，其包含如請求項以之疫苗。 31. —種抗體，其可選擇性地結合於一個存在於產氣莢膜梭 狀芽孢桿菌-毒素中，但不存在於如請求項7之產氣笑 膜梭狀芽孢桿菌α-毒素之實質無毒性突變蛋白中之抗原 決定部位（epit〇pe) ’其中該抗體可區分該實質無毒性突 變蛋白與野生型產氣莢膜梭狀芽孢桿菌α _毒素。 32. —種測試套組，其用於識別動物個體是否已自然感染產 氣笑膜梭狀芽孢桿菌生物體，其包含如請求項3丨之抗 體。 3 3. —種識別已自然感染產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體之動 物與用如請求項11之減毒產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體 接種之動物的方法，該方法包括： (a) 使違動物之流體試樣與如請求項3 1之抗體接觸， (b) 測定該抗體是否與該流體試樣反應； 其中當該抗體與該流體試樣反應時，該動物識別為已 自然感染產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體之動物。 34. —種產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其係具有aTcc寄 119708-991005.doc 133^045 存編號 PTA7364之 CPERF/ΔαΤοχίη 365-054(BCRC寄存編 號 BCRC 910359)。 3 5. —種產氣莢膜梭狀芽孢桿菌生物體，其係具有ATCC寄 存編號 PTA7365之 CPERFMaToxin 365-053(BCRC寄存編 號 BCRC 910358)。
119708-991005.doc
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