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TWI334355B - Method for preparing an orally administrable formulation for controlled release and orally administrable formulation - Google Patents

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Publication number
TWI334355B
TWI334355B TW092122496A TW92122496A TWI334355B TW I334355 B TWI334355 B TW I334355B TW 092122496 A TW092122496 A TW 092122496A TW 92122496 A TW92122496 A TW 92122496A TW I334355 B TWI334355 B TW I334355B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
patent application
scope
mixture
ethyl cellulose
group
Prior art date
Application number
TW092122496A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200420302A (en
Inventor
Chao Wei Liao
Peggy Lin
Chung Nan Weng
Original Assignee
Animal Technology Inst Taiwan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Animal Technology Inst Taiwan filed Critical Animal Technology Inst Taiwan
Publication of TW200420302A publication Critical patent/TW200420302A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI334355B publication Critical patent/TWI334355B/zh

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Description

1334355 玖、發明說明： 【技術領域】 本發明主要係有關一種製備釋放控制口服製劑之方法。 【先前技術】 用為疫苗之生物製劑（生物組合物），如：微生物、酵素與 蛋白質為用於人類與動物之對熱不安定之醫藥組合物。一 般而言，生物製劑通常採用注射法傳送，以維持良好生物 活性。然而，注射之成本及接受投藥者對注射之抗拒卻限 制了生物製劑之應用性。 為了克服注射投藥法之限制’而發展出口服製劑。然而， 口服生物製劑之有效製劑之製法卻有困難且複雜。例如： 經口投藥之生物製劑需在腸中吸收或以腸部為目標或於腸 中反應。換言之，生物製劑應使用腸溶性材料包埋，供傳 送及控制其於腸中釋放，以避免受到胃中酸破壞。因此， 對熱不安定之生物製劑之包埋通常採用包覆法進行。不論 使用有機溶劑或水性系統進行之包覆法均已常用於製藥系 統中。但由於受到溶劑系統之各種内在與外在因素影響， 如：爆炸危險性與環境污染性，以致亟需尋求水性包覆法 作為替代之途徑《然而，使用水作為溶劑時，需要花費更 多時間或能量進行蒸發。含有生物製劑之口前腸溶性製劑 之傳統製法中，係採用適合腸溶性包衣之材料，如：纖維 素乙酸酯肽酸酯（CAP)、曱基丙烯酸曱酯甲基丙烯酸共聚 物 '羥丙基甲基纖維素肽酸酯（HPMCP)與聚乙酸乙烯酯肽 酸酉曰（PVAP)。此等大分子材料可溶於中性或驗性環境中，
0:V85\e5318.D0C -6 - 1334355 並釋放生物活性成分，但不會在酸性環境中釋放。然而， 包覆過程卻需在高溫下或強烈有機溶劑中進行，生物活性 成分之生物活性在此條件下會急遽下降。此外，包覆法之 成本很高，當使用於動物時尤高。
已發現溶散在水溶液中之聚合性乳膠基於其疏水性及乳 膠膜形成性質而可用為包覆材料。由於此等聚合性乳膠可 使溶液中之水於相當低能量下蒸發，因此，可用於在低溫 下包覆生物活性成分（Kulvanich，P.與Leesawat, P.之1996, Release characteristics of the matrices prepared from co-spray dried theophylline and ethylcellulose with/without channeling agents. Proceedings of the International Symposium on Controlled Release of Bioactive materials, 23, 143-144)。均購自美國費城FMC公司之乳膠與乙基纖維素 水性聚合性溶散液（AquacoatTM)用於經共同噴霧乾燥法製 成含生物活性成分之腸溶性製劑（Liao C.W.等人之2001， Release characteristics of microspheres prepared by co-spray drying Actinobacillus pleuropneumoniae antigens and aqueous ethyl-cellulose dispersion, J. Micro encapsulation, Vol. 18, NO. 3,258-297)。 综上所述，發展一種經濟、有效、且可口服之生物活性 成分之製劑是極為迫切的。 【發明内容】 根據本發明，非可預期地發現，已知為包覆材料之乙基 纖維素可用於經共同噴霧乾燥法製成生物活性成分之「腸
0：\85^53I8.D0C 1334355 溶性」包覆材料。本發明提供一種製備生物活性成分之口 服製劑之有效且經濟之方法。 本發明《-目的為提供_種製備口服製劑之方法，該口 服製劑包含-生物活性成分，使之可於中性或驗性環境中 控制釋放，該方法包括下列步驟： ⑷使平均粒徑約微米至約則微米之乙基纖維素粉 末洛散在水性溶散液中，形成—腸溶性包覆材料； ⑻混合生物活性成分與步驟⑷所得之腸溶性包 料’得到一混合物；及 ⑷取步驟⑻所得之混合物進行噴霧乾燥，並於約45t 至’力80 C〈乾燥室中保留約1〇秒至i5秒，得到口服製劑。 本發明之另一目的A接征—, 〇為钕供種依本發明方法製成之口服 製劑。 【實施方式】 本發明之-目的為提供一種製備口服製劑之方法，該口 服製劑包含一生物活性成八，说、 成刀使义可於中性或鹼性環境中 控制釋放，該方法包括下列步驟： ⑷使平均粒徑約0·1微米至約300微米之乙基纖維素粉 末溶散在水性溶散液巾H腸溶性包覆材料； ⑻混合生物活性成分與步驟⑷所得之腸溶性包覆材 料，得到一混合物；.及 (C)取步驟（b)所得之混合物進行噴霧乾燥，並於約饥 至約80 c之乾燥室中保留約J〜 办至15秒’仵到口服製劑。 本文所採用術語「生物活柯士 Λ 成分」係指在人體或動物體
O:\S5\85318.DOC 1334355 内具有生物活性之生物材料或物質。通常，根據本發明之 生物活性成分對pH敏感，且於腸内吸收。生物活性成分可 被吸收至腸内毛細血管中。生物活性成分包括微生物、蛋 白質 '酵素、血清及其混合物，更佳具體實施例中，生物 活性成分為活的微生物。活的微生物亦可經過前處理以 降低其毒性或提高其相容性。微生物可為可提供生物活 性，且可經加熱或使用化學物質（如：曱醛）去除其活性之任 何微生物。本發明一項較佳具體實施例中，微生物係選自 下列各物組成之群中：大腸桿菌（心c/zer/c/n-a CO")、嗜酸乳 «⑽e)、枯草桿菌（5ac///WiSiyW如/&)及其混合物。 本文所採用術語「口服製劑」係指適合口服用之組合物。 本發明一項具體實施例中，口服製劑可用為疫苗或醫藥製 劑或口服用益生菌補充劑《本文所採用術語"疫苗,,係指可 產生抗體之抗原性物質（如：抗原），其可有效保護個體免於 感染。通常，疫苗係用於預防人類與動物之流行病。為了 維持生物活性成分（如：疫苗中之抗原）之生物活性，該生物 活性成分必需包埋在腸溶性包覆材料中，使之通過胃，而 在腸中才釋放。例如：於腸中釋放之抗原性受質會誘發黏 膜（如：派亞氏腺（Peyer's patch))產生免疫球蛋白，提供防 止感染之第一道防線《近年來，許多研究顯示，口服投藥 法為一種可诱發免疫反應之安全、方便且經濟之方式。口 服製劑可添加在飼料中或餵食給動物。這是一種可誘發動 物之免疫反應’以防止感染之最方便方式。 O:\85\8S3I8.DOC -9- 1334355 口服製劑可為包覆在包衣中之固體或液體核心，其係呈 選自下列各物組成之群中之形式：微膠囊、微粒、微球、 微米t或微小珠、包含微膠囊之膠囊、及包含微膠囊之鍵 劑。 根據本發明’生物活性成分係經包㈣成微膠囊。本發 明士體實施例中’該微膠囊進—步包覆在包衣或容易服用 、單位中通系’製劑之粒子粒徑為約丄至2,刪微米。 本文所採用術扣控制釋放」係指可控制生物活性成分 於特定環境謂放之㈣。較㈣，_生物活性成分於 中性或驗性環境切放；更佳者，係於腸内環境中釋放。 本文所採用術語「腸内捲ρ , 承兄」係和腸腔或生理上等效之環 境0 本文所採用術語「包覆材料」係指供包埋或包覆生物活 性成分之材料。該包覆材料具有形成膜之性質，可包埋或 包覆生物活性成分。根據本發明包覆材料包括水性乙基纖 維素溶散液》乙基纖維素的粒徑越小，越容易於水中形成 落散液。較佳具體實施例中’包覆材料係由平均粒徑〇」 至300微米之乙基纖維素粉末溶散在水溶液中製成。更佳 者’溶散液中乙基纖維素粉末平均粒徑為〇3纟3微米 本發明具體實施例中，乙基纖維素之溶散液黏度範圍為約5 至約心…更佳為約5至约24cps;及最佳為約Η至約 24哪。根據本發明，包覆材料可提供控制生物活性成分於 中性或驗性環境中釋放之效果；更佳為在腸内環境中釋 攻。根據本發明，生物活性成分可混至賦形劑、載劑或辅 〇A85\85J18〇〇c •10- 1334355 劑中。本發明較佳具體實施例中，賦形劑係選自下列各物 組成之群中：奶粉、血清、滑石、及其混合物。現已驚人 地發現，此等較佳賦形劑可提供腸溶性效果。此外，包覆 材料了保遵生物活性成分免於在胃中降解或受損。較佳具 —實施例中，包覆材料進一步包含清潔劑，可使乙基纖維 素溶散形成膜。更佳者，該清潔劑係選自下列各物組成之 群中：錄蟻醇、十二燒基硫_(SDS)及其混合物。本發明 具體實施例中，包覆材料進—步包含腸溶性包覆材料，其 可控制生物活性成分在腸中釋放^較佳者，腸溶性包覆材 料係選自下列各物組成之群中：纖維素乙酸酯肤酸酉旨 (⑽）、甲基丙缔酸甲g旨甲基丙埽酸共聚物、幾丙基甲基纖 維素肽酸酯（HPMCP) '》乙酸乙埽酉旨肽酸酯（PVAP)及其混 合物。根據本發明，可再添加保護劑至製劑中。本發明較 佳具體實施財，保護劑係選自下列各物組成之群中··甘 油、聚乙二醇及其衍生物與其混合物。 根據本發明，步驟（a)提供—種腸溶性包覆材料，其係由 乙基纖維素粉末溶散在水性溶液（如：水）中製成。根據本發 明，包覆材料之製法非常容易在低成本下進行。 本万法之步驟（b)中，生物活性成分與腸溶性包覆材料混 合形成一混合物。生物活性成分可直接混合或根據不同目 的進行前處理m㈣共㈣霧祕以 性成分與包覆材科。本發明具體實施例中，生物活性成分 先製粒形成核心後，才包覆製成大型粒子之製劑。 本方法之步驟（c)中，使步驟⑻所得之混合物於約价至
O:\8S\853I8.00C 1334355 約80°C之乾燥室中進 仃貫霧乾燥约10秒至1 5秒，得到口 服製劑。根據本發明， 此&度不會太高，因此可保持生物 /舌性成分之生物活性。妨诚士 & 很據本發明，乾燥室溫度可隨所使 用之生物活性成分種麵 喊又化。較佳具體實施例中，乾燥室 溫度範圍為約60至約6s〇r , ^ 65 C。本發明具體實施例中，混合物 可經旋轉及在入口埶办友.田ώ 。 …、丄虱》皿度約50°C至約200°C下噴霧乾 燥，以維持乾燥室内，，ra泠 ^ ，風度。由於混合物接觸熱空氣之時間 非吊t HI此製劑中所含水量會吸收潛熱而汽化，混合物 即可在低溫下乾燥。較佳者，混合物於約1G，GG0 rpm至約 40,000 rpm之轉速下旋轉。 纟月方决可視需要再包括步驟⑷，其中在排放收 日中於..，勺15 C至約45。(：之溫度下收集步驟⑷之口服製 劑。 一本發明一項具體實施例中，該方法可於喷霧乾燥器中進 行’其包括⑷加熱空氣用之加熱器；（b)可使混合物霧化形 、ί子之霧化器，（c)使濕的微粒子接觸熱空氣而蒸發微 ，子中水分形成乾粉之乾燥室；⑷供收集粉末之旋風分離 器；及（e)供通風及排氣之風扇。 根據本發明製備之口服製劑之優點為：⑴可抗拒胃液； (2)有能力控制於腸内環境中釋放或延緩釋放；（3)與生物活 性成分及添加物有良好相容性；（句具有安定性；（5)乾燥後 可形成連續膜及膠囊；（6)無毒性且安全；（7)成本低；及（8) 適合製成顆粒及乾燥。此外，根據本發明製劑之生物活性 成分具有良好生物活性。 〇：\85^53I8.D〇c -12· 1334355 下列實例僅供說明用’並無意限制本發明範圍。 實例1 以乙基纖維素粉末溶散液包埋之口服用大腸桿菌疫苗 疙含乙猶灌#之这##存：取乙基纖維素粉末（15%至 90%)溶散於添加〇.5g至2g十二烷基硫酸鈉（SDS)之水中， 形成;谷散液。於激烈攪拌下’添加〇. 5 g至3 g融化之錄蠘 醇至溶散液中，形成包含乙基纖維素之包覆材料。 扁活'/i之刼磨·潜姜勒：無活性之細菌培養物之製法為使 用甲越培養大腸桿菌1 8-vtst)，並去除 /舌性。選出大起桿囷F18-VTST之單一菌落，於37°C及振 屢下’接種至50mL含l〇ppm至lOOppm鏈菌素、康黴素、 胺卞青黴素或四環黴素或0.2%至2%山梨糖醇之lb營養 液中。取20 mL培養物加至400 mL相同培養基中，在未振 盪下培養2天。添加甲醛（0.5%至3%)，於37〇c下振堡後， 置於4°C至10°C下1天。 為周梦#者廣法：混合l〇Q/c至82%去活性之大腸桿菌培 養物、0%至52%水、1%至5%豬血清與1%至2%甘油，添 加16%至88%包含乙基纖維素之包覆材料。混合物均勾 後，添加0.1%至2%滑石，混合。混合物移至噴霧乾燥器 中，其條件為：乾燥室溫度為45°C至80t，熱空氣溫度12〇 。(：至 20(TC ’ 槽溫 60°C 至 65°C，及入 口溫度 4〇。(：至 5(rc , 於10,000 rpm至40,000 rpm下旋轉乾燥1〇秒至ι5秒。經 微粒化及蒸發後’得到微膠囊，採用旋風分離機收集。口 服用疫苗保存在4。(3下。 O:\85\8S3t8.DOC -13- 1334355 要試驗之製劑示於表1，其中"HPMCP"代表羥丙基甲基 纖維素肽酸醋；ECN7-A為講自 Hercules Incorporated Aqualon Division公司之乙基纖維素，黏度為5.6至8cps; ECN7為已研磨至平均粒子大小為5微米至10微米之 ECN7-A ; ECN22-A 為購自 Hercules Incorporated Aqualon Division之乙基纖維素，黏度為18至24cps; ECN22為已研 磨至平均粒子大小為5微米至10微米之ECN22-A;及 AquacoatTM代表購自FMC公司之乙基纖維素水性聚合性溶 散液。 表1 : 配方 包覆材料 細菌培養物 HPMCP 滑石 豬血清 K 乙基纖維素-ECN7-A:30g ddH20: 100g SDS: 1.5g 鯨蠟醇：1.5g 500 mL 5g 2.5g l〇g L 乙基纖維素-ECN7:30g ddH20: lOOg SDS: 1.5g 鯨蠟醇：1.5g 500mL 5g 2.5g log Μ 乙基纖維素-ECN22-A: 30g ddH20: lOOg SDS: 1.5g 鯨蠟醇：1.5g 500mL 5g 2.5g lOg Ν 乙基纖維素-ECN22:30g dd H20: lOOg SDS: 1.5g 鯨蠟醇：1.5g 500mL 5g 2.5g log 0 Aquacoat1M: lOOg 500mL 2.5g log Ρ — 500mL 35g 2.5g lOg 疫苗保存在4°C下。於一週後進行效率分析與蛋白質釋 放分析，觀察其形態與粒子大小，追蹤其安定性。再分別 於1、2、3、6與12個月後進行效率分析與蛋白質釋放分 O:\8SV85318.DOC -14· 1334355 析。 政举分夯：採用總蛋白質重2.5g之細菌依上述成正比方 法包覆’進行分析。由於細菌中之抗原量低，並與總蛋白 负成正比’因此採用總蛋白質量作為分析法之指標。取 lOOmg疫苗粉末置入1〇 π^容器中，添加^ % ， 並振風1小時。然後添加1 mL三氯曱烷與丙酮，置於通風 櫥中夜。乾燥後，添加l〇mL· PBS，混合。然後取出丨.5 mL 樣本，於12,5〇〇rpm下離心10分鐘。採用Bi〇 RadTM蛋白 質刀析試劑，定量各樣本中上澄液之蛋白質量。分析法所 估算 < 蛋白質量數值除以2.5g總蛋白質，即可評估包覆效 率，其結果示於表2中。由表2數據可見，其效率極高， 約 94 - 96。/0。 樣本 No. 1 ---- ^ L 做琛樣本中蛋白質分析量 (g) 自25g初蛋白質之回收率 _ (%) 2 3 23.5 + 0.6 " Ο /1 Λ 4. Λ /1 95.2 94.0 蛋冷身摩成分考此分析法說明於Liao等人之文獻（2〇〇 〇 中，於37。(：與l〇〇rpm下進行。取2〇〇mg疫苗（蛋白質總重 15!^)先於50〇11^〇.〇1?^1^1中反應2小時（1^2)，然後 添加0.2M三鹼價磷酸鈉至pH值為68為止，供進一步反 應。分析期間，每0.5小時或每i小時取出i 5机樣本，
\ 15,000 g下離心，上澄液保存在_2〇<>c下。上澄液再經pBS 緩衝液稀釋，以Bi0 Radw蛋白質分析試劑定量。亦使用 BS Α標準溶液估算蛋白質量。
OAES\853l8.DOC •15- 1334355 分析結果示於圖1。不含乙基纖維素之配方p即使在 HPMCP义協助下’仍無法在腸中（pH 6 8)具有良好之控制 釋放性質。由購自FMC公司之AquacoatTM.製備之配方〇 之結果顯示，AquacoatTN1可用於製備良好之口服用疫苗。 此外，EC-N7(配方κ與L)與EC-N 22 (配方Μ與N)之乙基 纖維素亦在腸中，對控制細菌釋放具有良好效果。此外， 使用包含配方Ν之包覆材料製成之製劑未出現沉澱現象。 配方Ν於ΡΗ 6.8下之第一個半小時内之釋放速率快，配方 Ν於腸中具有控制釋放之效果。然而，配方L於ρΗ 6 8之 釋放速率太快，可能造成膜崩裂。 實例2 使用乙基纖維素粉末溶散液包埋之口服用大腸桿菌抗原 疫苗 包含乙基纖維素之包覆材料及本文中採用之共同噴霧乾 燥法說明於實例1中β 乂##苈犮# :本實例採用大腸桿菌F 18-VTST。細菌 母液保存在-7CTC下，含50%甘油之LB培養基中。經福馬 林殺死之細菌抗原之製法中，取1 ml菌種接種至37°C之 10 mL LB中一夜，然後移至含2〇〇 mL lb之500 mL亨頓 (Hinton)燒瓶中，於37°C下培養15小時。培養物使用均質 器稍加均質化後（polytron pt.-300，KinematicaAG)，添加 0.5 %福馬林至培養液中，於37。(：下混合1小時，然後於4°C 下培養15小時。為了確保營養液中沒有活的細菌，吸出5ml 去活性之營養液加至含200 mL LB之500 mL亨頓燒瓶 O:\85V853I8.DOC -16- 1334355 中，於37°C下培養，直到培養1週後仍沒有細菌生長為止。 然後使用經福馬林去活性之營養液作為疫苗製劑中之抗 原。 該製劑示於表3中，其中"HPMCP”指羥丙基曱基纖維素 肽酸酉旨；N7、14、22、55 與 100 為購自 Hercules Incorporated Aqualon Division之乙基纖維素粉末，其黏度分別為7、1 4、 22、55與100 cps;AquacoatTM指購自FMC公司之乙基纖 維素水性聚合性溶散液。 表3 配方 包覆材料 抗原 HPMCP 滑石 緒血清 1 乙基纖維素-N7: 5g ddH20: 100mL SDS: 0.5g 鯨蠟醇:0.5g lOOmL lg 〇.5g 〇.5g 2 乙基纖維素-N7: lOg dd H20： 200mL SDS: lg 鯨蠟醇：lg lOOmL lg 〇.5g 〇.5g 3 乙基纖維素-N7: 15g dd H2O： 200mL SDS: lg 鯨蠟醇：lg lOOmL lg 0.5g 〇.5g 4 乙基纖維素-N14: lOg ddH2〇： l〇〇mL SDS: 1.5g 鯨蠟醇：1.5g lOOmL lg 0.5g 〇_5g 5 乙基纖維素-N22: lOg dd H2〇： lOOmL SDS: 1.5g 鯨蠟醇：1.5g lOOmL lg 〇.5g 〇.5g 6 乙基纖維素-N55: lOg ddH20: lOOmL SDS: 1.5g 鯨蠟醇：1.5g lOOmL lg 0.5g 2g O:\85\85318.DOC •17· 1334355 7 乙基纖維素-N100: 10g dd H2O： 100mL SDS: 1.5g 鯨蠟醇：1.5g lOOmL lg 〇.5g 2g 8 ddH20： lOOmL SDS: 1.5g 鯨蠟醇：1.5g 100mL Hg 0.5g 2g 9 Aquacoat1M: 30mL lOOmL ig 〇.5g 2g 蛋冷：r舉犮分#:該分析法說明於實例1。分析結果示 於圖2。除了配方8以外之各配方均於腸（pH 7)中具有良好 之控制釋放效果。不含乙基纖維素之配方8中，即使添加 11 g HPMCP，仍沒有腸溶性特性。 實例3 製備原生性補充劑之活細菌微膠囊 乳酸細菌（LAB)，尤指乳酸桿菌與雙歧桿 菌類屬常存在於胃腸道中，可有效抑制病 原性細菌、抗腫瘤與抗血膽固醇活性，改善消化性及刺激 免疫系統。例如：補充LAB可為仔豬提供促進體重增加、 提高飼料轉化率、加強有益菌聚集及減少腸内有害細菌之 效果。 細菌菌種··取今唆乳择菌（Lactobacilhis acidophi丨us)與成 糖乳桿菌（Ζ. 於MRS營養液（Difco)中，於37°C與 5% C〇2下培養3天，而枯草桿菌則於LB 營養液（Lennox，Difco)中，於37°C下培養3天。此包含嗜 酸乳桿菌、戊糖乳桿菌與枯草桿菌之SCP混合物中各細菌 數終濃度使用玉米作為稀釋劑調整至109CFU/g。 •兹合勿：取107至101G CFU/mL(80至90%)之嗜酸乳桿 0Λ8 S\85m.DOC -18- 1334355 菌、戊糖乳桿菌與枯草桿菌之新鮮培養物與奶粉（2至10%) 混合後，添加約10至20%乙基纖維素，混合。混合後，再 添加0.1至2%滑石，混合。混合物移至噴霧乾燥器中，其 條件為：熱空氣溫度120°C至200 °C，槽溫60°C至65°C， 入 口溫度 40°C 至 50°C，於 1〇,〇〇〇 rpm 至 40,000 rpm 下旋 轉。經微粒化及蒸發水後，得到含108至1011 CFU/g細菌 之微膠囊，採用旋風分離機收集。組合物保存在4°C下。 疫苗之製劑示於表4中，其中”細菌"為嗜酸乳桿菌、戊 糖乳桿菌與枯草桿菌之混合物。"HPMCP"代表羥丙基甲基 纖維素肽酸酯；與ECN22為已研磨至平均粒子大小為5微 米至10微米之ECN22-A。 表4 配方 細菌 奶粉 HPMCP 滑石 乙基纖維素-ECN22-A: 30g ddH20: 100g SDS: 1.5g 鯨蠟醇：1.5g lOOmL 50g lOg 5g 穿袭法：乾燥前，於MRS洋菜盤上計算乳桿菌數，於 LB洋菜盤上計算枯草桿菌數。每O.lg喷霧乾燥之細菌於 9.9mL 最大回收稀釋劑（maximum recovery diluent (Oxoid)) 中再水合。使細胞再水合2小時後，再加稀釋劑稀釋，取 合適稀釋液依上述方法塗覆。細菌存活百分比計算方式如 下： 存活％ = (N/No) X 1 00，其中No為乾燥前每克乾物之細 菌數，N為粉末中每克乾物之細菌數。 其結果示於表5 : 〇Λ85\853 丨 8.DOC -19· 表5 細菌 培養物重 (kg) 細菌數 微膠囊重（g) 細菌數/微 膠囊重（g) 包覆前與包 覆後之變化 嗜酸乳桿菌 4 3.0χ108 595 2.0xl0y 0.99 枯草桿菌 4 5.2xl〇/ 577 3.7x10s 1.02 腐病及廣之立泠鈐：由大腸桿菌〇157:H7與鼠傷寒 1334355 沙門氏菌（S. i_y/?/z/mwr/wm)分別與乳桿菌菌種培養，分析有 害細菌對乳桿菌生長之影響。每次實驗之試管中包含5 ml MRS-LB (Luria-Bertani營養液）營養液（1:1)，依乳桿菌與腸 病原菌1 : 1之比例接種細胞數（約5 X 105 CFU/ml)。 乳桿菌對抗大腸桿菌或鼠傷寒沙門氏菌之拮抗活性示於 表6，此證明活細菌微膠囊可抑制腸内有害細菌。 表6 時間 乳桿菌 (log CFU/ml) 大腸桿菌 E.coli0157:H7 (log CFU/ml) 沙門氏菌 (log CFU/ml) 24小時 10 4.2 5.1 48小時 7.8 <2 <2 實例4 以乙基纖維素粉末溶散液包埋之口服用大腸样菌疫苗之 效果 V、冷處之名虔#禮禮式：取6週齡雌性Balb/c小白鼠， 實驗前先檢疫一週，然後於實驗期間可自由攝食及飲水。 動物隨機分成每組6隻，接受經口或皮下投藥之組合處理。 為小白鼠接種之抗原係依據表7製備。 O:\85\853I8.DOC • 20· 表7 組別 高劑量 低劑量 配方N 39.5mg/0.5mL細菌培養液 12 mg/0.15mL細菌培養液 配方0 40.5mg/0.5mL細菌培養液 13.5mg/0.15mL細菌培養液 注射劑 正常劑量(CUmL細菌培養液） — 空白組 0.1 Ml —般生理食鹽水 — 1334355
口服疫苗係懸浮於0.2%乙酸中，每間隔10天經鈍端之 餵食管投藥至小白鼠之胃中。接種2次後經過2週，自眼 眶後血管叢抽血。陽性對照組每間隔10天，經皮下注射接 種含0 · 2 5 mL經福馬林去活性之營養液之0 · 5 mL疫苗，共 接種3次。亦於接種2次後經過2週，自眼眶後血管叢抽 血。於4°C下凝血12小時後離心得到血清。滴注lml洗滌 緩衝液（含100 // g/ml大豆胰蛋白酶抑制劑、50 mM EDTA、ImM PMSF、0.5%明膠與 0,05 % NaN3 之 PBS)至腸 内，收集腸内群落樣本。所收集之群落樣本保存在-20°C下。 採用酵素連結免疫吸收性分析法測定抗體活性：以 ELISA法檢測抗體《取新鮮培養之細菌（0D 600=1.8)經 0.1% triton-X 100處理，估算總蛋白質量。取100# g蛋白 質經PBS稀釋後，作為抗原。在96-孔板中各孔中塗覆100 ML抗原作為第一道塗層。取已於PBS中稀釋之血樣加至 孔中，於37°C下反應1小時。然後添加與HRP(辣根過氧 化酶）共價鍵結之山羊抗小白鼠IgG或IgA，添加TMB/E 染色。於620 nm下測定吸光度。各ELISA板上亦使用抗 小白鼠IgG或IgA之稀釋製作標準曲線。然後測定樣本中 抗體濃度。 ELISA之結果示於圖FIG.3。當注射抗原後，IgG之分泌 O:\B9A5i\S.DOC -21 - 1334355 量大幅提高，經口投與疫苗之結果類似。其結果顯示IgA 受到本發明口服疫苗之刺激而分泌’尤其指配方N與〇。 亦即根據本發明疫苗可刺激小白鼠之免疫力。 V、冷薦複4·之攻# :取4·5週齡雌性Balb/c小白鼠於有 空調之環境中飼養，並於分析期間供應飼料（實驗室飼料 (laboratory rodent dietTM) #5001)及淨水。根據表 7 製備配 方N與〇之疫苗、注射疫苗及空白處理組，為小白鼠接種。 於接種後第14天進行攻毒試驗。於1週後估算小白鼠死亡 率及進行組織病理分析。結果示於表8。 表8 组別 細菌稀釋液 0 培養液O.lmL 1 Τ〇¥##Ζ 3 Ίοο倍稀釋液 4 釋液 —5 10,000倍稀 釋液 小白鼠數 5 5 5 5 5 --------- 死亡數 0 0 〇 配方N-H 0 0 0 0 配方N-L 3 3 2 Γ ·*- 一 0 配方0-H 2 2 0 0~~~~ 配方0-L 4 4 1 0 〇 注射劑 4 4 0 0 〇 空白處理組 5 5 4 1 0 配方N之口服疫苗於高劑量下可有效保護小白鼠免於細 菌感染，沒有小白鼠死亡。由配方N及配方〇之高劑量處 理組與對照組比較，疫苗具有顯著保護效力。此分^法中 其他組中小白鼠死亡數隨細菌濃度增加而變化。如上述， 配方N纟口服疫苗於高劑量下可保護小白鼠免於細^感 染，且可抑制腸内有害微生物生長。本發明製劑提供安全、 方便且經濟之疫苗。
O:\85\85318.DOC -22· 1334355 實例5 以乙基纖維素粉末溶散液包埋之大腸样菌抗原口服疫苗 之效果 小白鼠模式之免疫接種法及採用根據實例2之乙基纖維 素包埋之口服大腸桿菌抗原疫苗之抗體反應測定法已說明 於實例4中。
配方4至6之ELISA結果示於圖4。注射抗原後，使Ig〇 分泌量大幅提高，口服疫苗之效果類似。其結果顯示，IgA 受到本發明口服疫苗之刺激而分泌。亦即根據本發明疫苗 可刺激小白鼠之免疫力。 雖然本發明具體實施例已例證及說明，但習此相關技藝 之人士仍可進行各種不同修改與改良。本發明不受限於其 中所說之特定形式，且所有未偏離本發明精神與範圍之修 改仍在附錄之申請專利範圍所界走之範圍内。 【圖式簡單說明】 圖1說明根據本發明實例i之配方κ至p之口服疫苗中 蛋白質釋放分析法之結果。 圖2說明根據本發明實例2之配方J至9之口服疫苗中 蛋白質釋放分析法之結果。 圖3說明接觉根據本發明實例丨之配方l n與〇之口 服用疫苗刺激之小白鼠與注射抗原a:lgG;b:IgA之小白鼠 體内抗體含量結果。其數值以6隻小白鼠每次取樣時之效 價平均值±標準偏差表示。若看不出標準偏差時，表示該標 準偏差符號太小’無法辨識β
O:\85\85318.DOC -23- !334355 圖4說明接受根據本發明實例2之配方4至6《口服用 疫苗刺激且注射抗原a· lgG; b: IgA之小白鼠體内抗體含量 結果。其數值以6隻小白鼠每次取樣時之效價平均值±標準 ·~γ~ 0 多— *、右看不出標準偏差時’表示該標準偏差符號太 小，無法辨識β
O:\85\85318.DOC •24-

Claims (1)

1334355 [ 傅厌 4 f ' . · · . -r^· 第092122496號專利申請案 申請專利範圍替換本(99年9月） 拾,、申請專利範圍： 1 一種製備口服製劑之方半，兮π η„ Α 方法忒口服製劑包含一生物活 性成分，使之可於中性式終 次驗)1 % i兄中控制釋放，該方 法包括下列步驟： ⑷使平均粒徑約（M微米至約3⑽微米之乙基纖維素粉 末及血清或奶粉溶散在水性溶散液中及添加清潔 劑至水性乙基纖維素溶散液中，形成一腸溶性包覆 材料，、中m /絜劑係選自由：&I# 酸鈉（SDS)與其混合物組成之群中； (b)混合生物活性成分盘步 又刀/、y驟（a)所得之腸溶性包覆材 料’得到一混合物；及 ⑷取步驟（b)所得之混合物進行噴霧乾燥，並於約饥 至約80C之乾燥室中保留約10秒至15秒，得到口服 製劑。 2 ·根據申請專利範圍第1珀 因弟1項之方法，其中乙基纖維素粉末 於浴散液中之黏度範圍為約5至約i〇5cps。 3. 根據巾請專職圍第丨項之方法，其中乙基纖維素粉末 於溶散液中之黏度範圍為約5至約24Cps。 4. 根據中請專利範圍第旧之方法，其中乙基纖維素粉末 於溶散液中之黏度範圍為約18至約24cpS。 5. 根據中請專利範圍第丨項之方法，其中乙基纖維素粉末 於溶散液中之平均粒徑為0.3至3微米。 6·根據申請專利範圍第！項之方法，其中另外添加腸溶性 包覆材料至水性乙基纖維素溶散液中。 85318.doc 係Ξ1:專:範圍第6項之方法，其中腸溶性包覆材料 st ψ ^ 素乙酸酯肽酸醋（CAP)、甲基丙烯酸曱 0曰T基丙烯醆妓 ，_ (HPMCP)盘聚乙二、授丙土甲基纖維素肽酸S旨 组成之群/中乙馱乙烯酯肽酸酯（PVAP)，與其混合物 其中添加生物活性成 其中再添加保護劑至 8. 根據申請專利範圍第丨項之方法 分至載劑、輔劑或賦形劑中。 9. 根據申請專利範圍第】項之方法 口服製劑中。 10.根據申請專利範 石 ° 圍第8項之方法 其中賦形劑係為滑
11·根據中請專利範圍第9項之方法其中保護劑係選自 由 ·甘油、耳X 7 、乙二醇與其衍生物’及其混合物組成之 群中。 據申-月專利I已圍第i項之方法，其中生物活性成分係 ^自由·微生物、蛋白質、酵素、血清，與其混合物 組成之群中。 13. 根據中請專利範圍第12項之方法其中微生物係選自 由 ' JL gn . 腸桿菌（五a/zer/c/na coz·/)、嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acid〇philus)、戍糖乳桿菌⑼^川似 PeW/〇5e)、枯草桿菌（方mW/b)，與其混合物組 成之群中。 14. 根據申睛專利範圍第12項之方法其中微生物為活的 或去活性之微生物。 853l8.doc .15.根據申請專利範圍第丨項之方法，其 16. 根據申請專利範圍第〗項之方法其中水：:1為疫苗。 17. 根據中請專利範圍第】項之方法其中 2為水。 活性成分係製成顆粒。 之生物 18. 根據申請專利範圍第1項之方 室溫度為約6〇t至約65t：。 之乾知 19. 根據申請專利範圍第丨項之方法，1 1Μ00卿至約4G，_rpm之 ;I物再於約 燥。 料下㈣’進行喷霧乾 20.根據申請專利範圍第1項之方法， 六/ 其甲此合物係於入口 …二氧溫度約5CTC至約20(rc下噴霧乾燥。 2 1.根據申請專利範圍第丨項之 * 其再包括步驟（d)，1 I在排放收集槽中，於約说至約价之溫度下收华 步驟（c)之口服製劑。 、 種服衣d ’其包含根據申請專利範圍第m項中 任一項之方法製備之生物活性成分。 23.根據申請專利範圍篦？ SI弟22項之製劑’其中控制生物活性 成分於腸内環境中釋放。 24·=據申請專利範圍第22項之製劑，其係呈選自下列各 組成之群中之形式：微膠囊、微粒、微球、微米粒 或微小珠、包含微膠囊之膠囊、及包含微膠囊之錠劑。 853 丨 8.doc 1334355 年W月〇曰修(更)正本 第092122496號專利申請案 中文圖式替換$95年12月） 拾壹、圖式： pH 2 pH 6.8 Tm/§Tl鉍茹咖
-2 2 Ο 1 釋放時間（小時） 響 85318-951208.doc i Α36791 85318 005860135-2 1334355 60%^6φ 咖 pH 2 pH 6.8 ◄1^ 00 40 20
-2- 1334355
ο 2 4 ο 接種疫苗後週數 B 3a 1334355
射 L Ν ο注 l-A—t 接種疫苗後週數 圖3b 1334355 osao
Ο 2 4 接種疫苗後週數 + 4Ν-14 -Cl· 5 N-22 6 Ν-55 土注射 圖4a 1334355 6 4 Αα Λα osao
12 3 4 接種疫苗後週數 圖4b + 4N-14 -Π-5Ν-22 + 6N-55 +注射
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