TWI332845B - Aqueous sustained-release formulations of proteins - Google Patents

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1332845 A7 B7 五、發明說明（丨） 發明簌圊 本發明係提供一種含羧甲基醚纖維素聚合物之具療 效蛋白質之水溶性持續釋放醫藥調配物，以及其製法。 本發明亦提供使用該醫藥調配物之方法以提供許多新的 5效益’含較大的功效、安全性、患者便利性及患者配合 性。 發明背景 * 由於基因及細胞工程技術新近的進步，已知於活體 10内展現許多醫藥作用之蛋白質能產生大量的醫藥應用 性。蛋白質療法發展之主要限制為製備安定的蛋白質醫 藥調配物。具療效蛋白質通常藉頻繁的注射施藥，因為 活性劑蛋白質通常具短暫的活體内半衰期及可忽略的口 服生物有效性，故對患者造成明顯的身體負擔及相關的 15施藥成本。因此，目前於發展及評估持續釋放調配物方 面，引起了很大的興趣。有效的持續釋放調配物可提供 一種控制活性組份之血液含量的方法，並且亦提供較大 的功效、安全性、患者便利性及患者配合性β 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製 迄今有二個獲致持續釋放的具療效蛋白質之主要機 20制：1)修飾蛋白質以提高蛋白質之半衰期（通常藉降低 清除率）；及2)製備包膠於聚合物微球之持續釋放調配 物。產生持續釋放調配物之優點在於理論上調配物能用 於許多蛋白質療法。 聚合物微球持續釋放調配物之實例揭示於PCT公 25報WO 99/15154 〇^_等人）、美國專利第5 674 534 -3- t托口八故、~~ ----- 1332845 A7 B7 五 、發明說明（2 ) 及5’716,644號（兩者皆屬於Zale_f人）、PCT公報WO 96/40073 (乙等人）及 PCT 公報 WO 00/38651 (Shah. 等人）。 美國專利第5,674,534及5,716,644號及PCT公報 5 W〇 96/40073揭示含有紅血球生成素顆粒（係以鹽安定 化以防止聚集）之聚合物基質。 遺憾•地’大部分蛋白質之不安定性（例如當接觸 熱、有機溶劑等時產生之變性及生物活性損失）已大大 地限制其持續釋放調配物之發展及評估。此外，由於蛋 10白質之生化易變性（大大地影響產生微球所需條件之任 何個別蛋白質之耐受性）之緣故，此等技術未廣泛地如 一般預期地可行。 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 PCT公報WO 00/38651揭示一種於聚合基質中含 有蛋白質之醫藥組合物，其係具熱及pH敏感的凝移化/ 15去凝膠化性質。此等調配物可不接觸熱或有機溶劑地製 得’但其特徵在於使用經改質的水凝膠。使用具熱安定 性的水凝膠遇到不想要的製造困難性，因此目前於商業 上不可行。此等經改質的水凝膠之另一不想要的性質為 其生物可相容性及免疫性相當缺乏。 20 美國專利第4,717,717號（A.L_ Finkenaur)揭示表皮 成長因子之組合物，其係於纖維素聚合物存在下經安定 化’以防止生物活性損失》然而’並未敘述此等調配物 之活髖内持讀釋放性質。 美國專利第5,457,093號（Cini等人）揭示用於眼睛 25及局部應用之含有成長因子的凝膠調配物。然而，並未 -4- 1332845 A7

描述使用此等調配物於非口服施藥，亦未有任何暗示此 等調配物將具有活體内之持續釋放性質。 因此，尚有提供非口服持續釋放的红血球生成素調 配物之而求，其中該調配物可容易地製得且提昇含於其 5中之活性劑蛋白質之安定性。 發明概述 本發明提供一種製備非口服用之具療效蛋白質水溶 性持續釋放醫藥調配物之方法。本發明亦提供一種通用 10於非口服施藥之具蛋白質的醫藥調配物，該醫藥調配物 包含： a) 醫藥活性量之蛋白質； b) 醫藥上可接受之pH緩衝劑，俾提供pH範圍為約 pH 4.5 至约 pH 9 ; 15 C)滲透壓調節劑（tonicity agent)，係具濃度範圍為約 〇至约125毫莫耳；及 d)羧甲基醚纖維素鈉，係具濃度範圍為總式量之約 0.5%至约 7%， 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製 其中該水溶性調配物之pH為約4.5至約pH 9.0。 20 本發明之較佳調配物提供一種紅血球生成素之醫藥 調配物，其包含： a) 醫藥活性量之紅血球生成素； b) 醫藥上可接受之pH緩衝劑，俾提供pH範圍為約 25 pH 6 至約 pH 9 ; -5- 1332845 A7 B7 五、發明說明（4) c) 滲透壓調節劑’係具濃度範圍為約〇至約200毫 莫耳；及 d) 羧曱基越纖維素鈉（CMC)，係具濃度範圍為總式 量之約0.5%至約7%，該CMC具分子量範圍為約 5 50,000道爾頓至約1，〇〇〇,〇〇〇道爾頓， 其中該調配物之pH為約pH 6.3至約pH 8.3。 本發明亦提供一種製備水溶性持續釋放之紅血球生 成素醫藥調配物之方法，其包含混合CMC聚合物之水 10 溶液與醫藥活性量之EPO »本發明之調配物使用主要 為溶液態（而不是微粒狀態）之CMC聚合物。 本發明亦提供使用此等持續釋放調配物之方法（含 施藥療法）’其中調配物係於廣泛變化之所欲間隔施 藥’包含（但不限於）每二週三次、每週一次 '每二週— 15 次、每三週一次、每月一次、每五週一次、每六週—次 或任何其他時間或可有效用於特殊病患之時間間隔的組 合。 經濟部智慧財產局員Η消费合作社印製 圖式簡單說明 20 圖1 :以平均血漿Epogen Alfa濃度對時間說明持 續釋放調配物CMC-1 ' CMC-2、CMC-3、CMC-4之藥 物動力學性質。 圖2 :以網織紅血球之變化百分率對時間說明持續 釋放調配物CMC-1、CMC-2、CMC-3、CMC-4之藥效 25 學性質。 -6- 1332845 A7 B7 五、發明說明（5) 圖3 :以血紅素量之變化對時間說明持續釋放調配 物 CMC-1 ' CMC-2、CMC-3、CMC-4 之藥效學性質。 圖4 :以紅血球量變化對時間說明持續釋放調配物 CMC-1、CMC-2、CMC-3、CMC-4 之藥效學性質。 5 圖5 :以平均血漿Epogen Alfa濃度對時間說明臨 床批量CMC-EPO之藥物動力學性質。 圖6 :以網織紅血球之變化百分率對時間說明臨床 批量CMC-EPO之藥效學性質。 圖7 :以血紅素量對時間說明臨床批量CMC-EPO 10 之藥效學性質。 圖8 :以紅血球量對時間說明臨床批量CMC-EPO 之藥效學性質。 說明詳述 15 此中使用之”红血球生成素”或’ΈΡΟ”一詞應包含具 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製 重組人類紅血球生成素（rhEPO)之多狀類及蛋白質，以 及紅血球生成素類似物、紅血球生成素類似形式 (isoforms)、紅血球生成素擬態（mimetics)、紅血球生成 素片段、雜化的紅血球生成素蛋白質、融合的蛋白質低 20 聚物及以上之多體（multimer)、以上之同系物、以上之 蛋白質酷化（glycosylation)型態變體、以上之突變蛋白 質（muteins)，不論是否具相同生物活性，且進一步地不 論其合成或製法（包含但不限於重組（當製自cDNA或基 因DNA)、合成、基因轉殖及基因活化法）。紅血球生 25 成素之特例包含愛普丁 -a(Epoetin alfa)(EPREX®、 1332845 A7 B7 五、發明說明（6) ERYPO®、PROCRIT®)、新穎的紅血球生成素刺激蛋白 質（NESPTM ' ARANESPTM、促紅血球生成素 (darbepoetin alfa)，例如揭示於歐洲專利申請案 EP640619之重組人類紅血球生成素（Epoetin)之超蛋白 5 質醣化的類似物）、人類紅血球生成素類似物（例如揭示 於國際專利申請案WO9966054之人類血清白蛋白融合 蛋白質）、揭示於國際專利申請案W09938890之紅血球 生成素突變體、紅血球生成素-ω(可製自揭示於美國專 t 利第5,688,679號之人類紅血球生成素基因的Apa I限 10 制片段）、揭示於國際專利申請案W09911781及歐洲專 利EP1064951之經修飾的蛋白質醣化之人類紅血球生 成素、揭示於WO9805363或美國專利第5,643,575號 之PEG共軛的紅血球生成素類似物。供内生人類紅血 球生成素表現之經修飾的細胞線之特例揭示於國際專利 15 申請案 WO9905268及WO9412650。通常較佳形式之 EP0為純化的重組人類EPO (rhEPO)，其目前係以商標 EPREX® ' ERYPO®、PROCRIT®或 ARANESPTM 調配及 散佈。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 此中使用之”蛋白質”一詞包含肽類、多肽類、共同 20 分子（consensus molecules)、類似物、衍生物或其組 合。”蛋白質”一詞包含具經修飾的胺基酸及醣蛋白之多 肽序列或含有至少一絲胺酸 '滋利胺酸（threonine)或帶 破水化合物部分之阿金胺酸（arginine)側鏈之蛋白質。 亦包含具胺基酸取代作用（對酸度、電荷、疏水溶性、 25 極性、大小或熟習本技藝人士已知的任何其他性質”保 //'"MC、 ^(Y7 1332845 A7 B7 五、發明說明（7 ) 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作枉印製 20 25 守”）之多狀。一般而言，請參照Creighton, Protein<i W.H. Freeman and Company, NY (1984)，第 498 頁。通 常於選擇胺基酸方面可進行改變，只要此一變化維持蛋 白質的總生物活性即可。亦可存在少量胺基終端延長劑 (例如胺基終端的甲硫胺酸或絲胺酸殘基）、少量連結肽 類（至多約二十至二十五個殘基）或促進純化作用之少量 延長劑（例如聚組織胺酸束、抗原決定部位（epitope)或 結合區）。一般而言，請參照Ford等人，Protein 曹 Expression and Purification (199” 2:95-107。多版類或 其類似物亦可含有一或多個胺基酸類似物，例如擬肽類 (peptidomimetics)。熟習本技藝之人士將可容易地使所 需的蛋白質活性劑適應於本發明之組合物。 此中使用之“實驗對象”一詞代表動物，較佳為哺乳 動物，最佳為人類，其係為治療、觀察或試驗的對象。 用於本發明調配物之蛋白質用量將隨著蛋白質之生 物效力以及調配物所需的效力而改變，但每一調配物通 常將含有約1微克/毫升至約2000微克/毫升蛋白質。 特別地’本發明含紅血球生成素之調配物可含有”醫藥 活性量之紅血球生成素，，，通常為約1〇〇〇 IU/毫升至約 180,000 IU/毫升之紅血球生成素，其中ΐ2〇,〇〇〇 ιυ為 約1000微克。可提供散裝藥劑之水溶液（稀釋為本發明 之調配物）紅血球生成素或可提供乾燥藥劑（且使用適量 的水溶性調配物重組）作為紅血球生成素。乾燥藥劑包 含例如凍乾的藥劑或喷霧乾燥的紅血球生成素β於紅血 球生成素以散裝藥劑提供於高效力（大於100000 IU/毫 -9- m. /r*xic\ A 4 4β 4« 入ΟΙΟνΛΐντ 1332845 Α7 Β7 五、發明說明（Ο 升）調配物中時，較佳地，紅血球生成素散裝藥劑係提 供於磷酸鹽緩衝溶液中。此乃由於受到高濃度檸樣酸緩 衝劑（一般用於製備重組人類紅血球生成素）造成患者增 加不適之緣故。使用技藝中熟知的方法（例如透析過濾 5或透析）可達到緩衝劑交換作用，俾提供含有小於1毫 莫耳檸檬酸鹽之ΕΡΟ散劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印鼓 用於本發明醫藥组合物之緩衝劑用量主要取決於所 用的特殊緩衝作用及調配物所需的ρΗβ緩衝，子的濃 度通常在約10 mM至約3〇 mM之範圍内。可維持ρΗ 10範圍為約4至約9之適合的緩衝系統包含（但不限於）檸 檬酸鈉/檸檬酸、醋酸鈉/醋酸、填酸氫二鈉/碟酸二氫鈉 或磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀及技藝中已知之任何其他醫 藥上可接受的pH緩衝劑。使用磷酸氫二鈉及磷酸二氫 鈉之緩衝系統為較佳。可添加pH調整劑（例如但不限 15於氫氣酸、擰檬酸、氫氧化鈉或任何此等物之鹽類，尤 其是檸檬酸鈉）於調配物中，以調整調配物之pH至所 需的調配物PH範圍内。此等調配物之一目標為使患者 不適（與檸檬酸緩衝的調配物之皮下施藥有關）減至最 小。因此，於本發明所有調配物中（於水溶性蛋白質散 2〇劑及調配物緩衝成分中兩者皆同），磷酸鹽緩衝系統為 特佳。 本發明含蛋白質調配物之較佳的pH範圍係介於約 PH 4.5至約pH 9間，較佳為在約pH 6至約pH入5之 範園内。本發明含紅血球生成素調配物之較佳的pH範 25圍係介於約PH6.5至約pH8間，較佳為在 6·9 -10- ^32845 A7 B7 五、發明說明77^ ~ ' — 至約pH 7.4之範圍内。 於本發明調配物中可使用一或多種離子滲透壓調節 劑。離子滲透壓調節劑係為任何可賦予本發明調配物與 人類血液等滲透或接近等滲透之藥劑，並且於水溶液中 5帶有正或負電荷。典型之適合的滲透壓調節劑係為技蔽 中已知’且包含（但不限於）氣化鈉、氣化鉀、硫酸鈉、 硫酸銨、甘胺酸或其他胺基酸。本發明之較佳的滲透壓 調節劑包含但不限於Naa、KC丨及甘胺酸，該藥劑之 使用濃度為在約〇至約17〇毫莫耳之範圍内。於本發明 ίο之調配物中，較佳使用濃度為約75 mM至約1〇〇 之氣化納作為滲透壓調節劑。渗透愿調節劑之類型及其 濃度可能影響調配物之持續釋放性質。在含有超過一種 滲透壓調節劑之調配物中，滲透壓調節劑之總濃度通常 小於200 mM « 15 具分子量為約5〇,〇〇〇至1，〇〇〇,〇〇〇之羧曱基醚纖維 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 素鈉（CMC-CAS #9004-32-4)係以濃度範圍為總式量之 約0.5%至約7%(較佳為約〇 5%至約2%，最佳為約2%) 用於本發明之調配物中。所用之CMC濃度係以本發明 使用的蛋白質特性及用量為基礎而改變。藉比較含 20 CMC調配物與缺少CMC之其他相似調配物之藥物動力 學性質，可測試調配物之持續釋放活性。由於容易製造 且由於容易藉注射施藥之緣故，含〇 5〇/。至約2% CMC 之調配物通常為較佳。一般而言，於調配物中蛋白質 量、調配物中CMC量與調配物之藥物動力學性質間有 25關聯性。含較多蛋白質之調配物需要較高量的CMC， οιντ 1332845 Α7 Β7 五、發明說明（10) 以提供持續釋放性質。蛋白質/CMC含量可以蛋白質 (以毫克計）對°/。〇^(：(每1〇〇毫升之克數）之比例表示。 較佳的EPO調配物含有比例小於或等於660微克 EPO/%CMC。 5 此中使用之“持續釋放，，一詞代表調配物之有利的藥 物動力學性質。可使用技藝中已知或此中描述的方法 (model independent methods)計算藥物動力學參數。例 如（但不限於）藉模式獨立法，使用WinNonlin軟體1.1

I 版（Scientific Consulting, Incorporation, Apex, NC)，可 10計算樂物動力學參數。當評估本發明調配物之持續釋放 性質時’可考慮許多藥物動力學性質。例如（但不限於） 可使用以下PK參數評估，以決定本發明調配物之持續 釋放性質： 15 逢-命清濃度（C^i :係為觀察到的蛋白質最大血清 濃度。由於較緩慢吸收至循環之緣故，持續釋放調 配物可具有較類似的非持續釋放調配物更小的 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 20 it (trnaxl .係為 Cmax 出現之時間。由於 較緩慢擴散至循環之緣故’持續釋玫調配物可具有 較類似的非持績釋放調配物更長的τ 。 半衰期（tui:持續釋放調配物可具有較類似的 25 非持續釋放調配物更長的τι/2。 -12- 1332845 A7 B7 五、發明說明（η) 不欲受限於理論，本案發明人認為此等調配物之 持續釋放性質係經由蛋白質與CMC間之疏水性交互作 用及蛋白質與CMC間之離子交互作用而產生》於所述 5 之PH下，蛋白質及CMC兩者皆帶有負電荷，因此另 外成分（可能是帶電的滲透壓調節劑）形成，，離子架 橋’’（類似生化交互作用中熟知的鹽橋蛋白質、CMC 及/或離子滲透壓調節劑間之交互作用充分地強，俾妨 礙蛋白質自注射區擴散（而未永久地保留於此區域）。熟 10 知本技藝之人士更加明白，本發明調配物大體上可適用 於非口服施藥具療效蛋白質（除紅血球生成素以外），其 包含（但不限於）干擾素、粒細胞粒性群刺激因子、胰島 素、抗體及抗體片段、生長激素、組織胞漿素原活化 劑、白血球介質素及免疫反應用抗原。本發明之調配物 15係利用主要為溶液態而不是微顆粒態之CMC聚合物， 然而’多變化的微顆粒態CMC聚合物與非微顆粒態 CMC聚合物比例可適用於本發明之調配物。 經濟部智慧財產局員工洧費合作社印製 適用於本發明之蛋白質及多肽類包含（但不限於）胰 島素、胃動素、促胃液激素 '激乳素 '促腎上腺皮質激 20素（ACTH)、紅血球生成素、促成長激素（GH)、角質細 胞生長因子（KGF)、幹細胞因子（SCF)、血小板生成 素、護骨素（OPG)及肥胖蛋白質（〇B蛋白質：此蛋白質 於此中亦可稱為纖瘦素（leptin))、粒細胞粒性群刺激因 子（G-CSF)、α干擾素（尤其是a_2b)、p干擾素（尤其是 25 U及卜1|3)、^干擾素、白血球介質素-2、織维組織母細 -13-

/Γ'ΧΙΟλ A 1332845 A7 B7 五、發明說明（12) 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製 胞成長因子（FGF)、類胰島素促成長激素（IGF)、巨噬細 胞刺激素（M-CSF)、巨噬細胞生長素（GM-CSF)、細胞 群刺激因子（CSF)、腫瘤壞死因子（TNF)、甲狀腺刺激素 (TSH)、黃體激素（LH)、濾泡刺激素（FSH)、人類絨毛 5 膜性腺激素（HCG)、神經滋養成長因子（NGF)、神經滋 養因子3(NT3)、神經滋養因子4(NT4)、腦衍生神經滋 養因子（BDNF)、神經膠質細胞神經滋養因子（GDNF)、 血小板衍生成長因子（PDGF :亦稱為白血球介質素-11)、微血管内皮生長因子（VEGF)、骨骼形態基因蛋白 10 質（BMP)、巨核細胞生長變異因子（MGDF)、因子VII、 因子Vila、因子VIII、因子IX、超氧化物歧化酶 (SOD)、組織胞漿素原活化劑（TPA)、血栓溶解劑、鏈 球菌激酶、血管擴張劑、α-半乳糖苷酶、胰RNA酶' 血小板活化因子乙醯水解酶 '白血球介質素-1接受器 15 拮抗劑（IL-Ira)、REMICADE (英弗利西美（Infliximab): 一種阻礙循環 TNFoc ENBREL(依坦那西普 (etanercept):由人類75千道爾頓（ρ75)腫瘤壞死因子接 受器（TNFR)之胞外配位基結合部分連接至人類IgGl之 Fc部分所組成之二聚融合蛋白質）生物活性之單株抗 20 體）。 可藉由混合調配物試劑於水溶液中，使得成分大 體上均勻地混合以致於沒有局部化的成分，俾製備本發 明之調配物。有利地，於添加蛋白質成分前，可製備及 調整所有調配物成分（除了蛋白質成分以外）至適合蛋白 25 質之條件。另外，蛋白質散劑可經透析過濾為適當的緩 -14- 1332845 A7 B7 五、發明說明（u) 衝系統，較佳為磷酸鹽緩衝劑，並且可將其他藥劑添加 至蛋白質散劑，且可適度地調整散劑蛋白劑濃度至所需 的效力。 本發明含紅血球生成素之調配物以及其他含蛋白 質調配物之較佳調配法通常包含以下步驟： a) 對著10至3 0毫莫耳鱗酸鹽緩衝劑透析過遽重組 人類EPO，俾提供含有小於1 mM檸檬酸之經碟 酸鹽緩衝的EPO散劑； 10 15 b) 混合適量的CMC於經磷酸鹽緩衝的EPO散劑， 俾足以提供最终濃度為約0.5%至約7%CMC ; c) 混合適量的NaCl至經碟酸鹽緩衝的EPO散劑， 俾足以提供最終濃度為約0 mM至約170 mM之 NaCl;及 d) 以水調整EPO散劑，俾足以提供預定的最终調配 物體積及EPO效力。 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製 本發明之調配物係經由非口服施藥（不包括靜脈内 施藥）施藥予需要的實驗對象。特殊的非口服施藥途徑 包含（但不限於）肌肉内、皮下、腹膜内、大腦内、室 20 内、腦室、脊管内、腦池内、椎管内及/或脊髓周圍施 藥途徑（經由顱内或椎管内針投遞）及/或導尿管（具有或 不具泵送裝置可以醫藥活性蛋白質之具療效指徵為 基礎，以選擇施藥途徑》 可經由肌肉内、皮下或腹膜内途徑施予激素、細 25 胞漿、凝集因子及其他生化上具活性的蛋白質，使得蛋 -15- 1332845 A7 B7 五、發明說明（14) 白質系統釋放，其中此等生化上具活性的蛋白質包含胰 島素、胃動素、促胃液激素、激乳素、促腎上腺皮質激 素（ACTH)、紅血球生成素（EPO)、促成長激素（GH)、幹 細胞因子（SCF)、血小板生成素、護骨素（OPG)及肥胖 5 蛋白質（OB蛋白質：此蛋白質於此中亦可稱為纖痩 素）、粒細胞粒性群刺激因子（G-CSF)、α干擾素（尤其是 a-2b)、β干擾素（尤其是β-la及β-lb)、γ干擾素、白血球 介質素-2、類姨島素促成長激素（IGF)、巨嗔細胞刺激 素（M-CSF)、巨噬細胞生長素（GM-CSF)、細胞群刺激 10 因子（CSF)、腫瘤壞死因子（TNF)、曱狀腺刺激素 (TSH)、黃體激素（LH)、濾泡刺激素（FSH)、人類絨毛 膜性腺激素（HCG)、微血管内皮生長因子（VEGF)、巨核 細胞生長變異因子（MGDF)、因子VII、因子Vila、因 子VIII、因子IX、超氧化物歧化酶（SOD)、組織胞漿素 15 原活化劑（TPA) '血栓溶解劑、鏈球菌激酶、血管擴張 劑、α-半乳糖苷酶、胰RNA酶、血小板活化因子乙醒 水解酶、白血球介質素-1接受器拮抗劑（IL-Ira)、 REMICADE 及 ENBREL。 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製 某些成長因子，例如角質細胞生長因子（KGF)、纖 20 維組織母細胞成長因子（FGF)、血小板衍生成長因子 (PDGF:亦已知為白血球介質素-11)可施藥於或接近作 用區，以獲致局部化效益。局部注射本發明之調配物可 產生較高局部面積濃度之活性醫藥藥劑，並且可較局部 施藥含此等蛋白質之凝膠更有效。 25 可藉大腦内、室内、腦室、脊管内、腦池内、椎 -16- 1332845 A7 B7 五、發明說明（15) 管内及/或脊髓周圍施藥途徑（經由顱内或椎管内針投遞） 及/或導尿管（具有或不具泵送裝置）’直接施藥予神經 活性蛋白質，含紅血球生成素（EPO)、神經滋養成長因 子（NGF)、神經滋養因子3(NT3)、神經滋養因子 5 4(NT4)、腦衍生神經滋養因子（BDNF)、神經膠質細胞 神經滋養因子（GDNF)、骨骼形態基因蛋白質（BMp)。 經濟部智慧財產局α工消费合作社印製 當用於EPO施藥時，”具療效，，一詞通常為约i至 10000 I.U·/公斤’較佳為約5〇至2〇〇〇 j u /公斤，更佳 為約50至600 I.U./公斤，最佳為约5〇至3〇〇 j卩/公 10斤體重（尤其是當皮下施予紅血球生成素時）》有利地， 本發明之調配物可以任何頻率或施藥間之時間間隔（未 降低功效）施藥予對治療有反應的實驗對象。在較佳的 施藥療法中’實驗對象係每二週三次'每週一次、每二 週一次、每三週一次、每月—次'每五週一次、每六週 15 一次或更頻繁或較不頻繁的間隔或以任何所需的頻率或 時間間隔施以本發明之持續釋放調配物。紅血球生成素 (EPO)之每日有效劑量較佳為約4〇〇〇至約9〇〇〇 ι.υ.(相 當於每二週約60,0〇〇至約uo’ooo lu.)。更佳地，紅 血球生成素（ΕΡΟ)之每日有效劑量較佳為5715 I.U.(相 20當於每二週約80,0〇〇 ι.υ.)。較佳的施藥療法可以每三 週一次之排程施藥，尤其是對接受癌症治療化學療法之 實驗對象而言，因為許多化學療法係以每三週一次隻排 程施藥。然而，根據本發明調配之具療效蛋白質（例如 ΕΡΟ)的任何排程可容易地與定期訪視治療醫師或與患 25者所需之另一藥劑（例如抗腫瘤劑）之施藥排程協調❶此 -17- ^XTC\ 1332845 A7 B7 五、發明說明（16) 使得EPO療法及化學療法（同時或平行施藥）成為可 能，俾對患者提供經濟且合意的效益。倘若患者（雄性 或雌性）展現血紅素含量為對人類男性而言超過約18克 /dL且對人類女性而言超過約1 6克/dL，則延緩或中斷 5 EPO施藥。 以下實例之目的係為了說明本發明之目的而提供， 然而，本發明不受限於作為例證之實施例。 實例1 10 於免疫受抑制的狗中之EPO持續釋放調配物之評估 本研究係設計以評估不同施藥療法期間於小獵犬中 之CMC-EPO。亦檢視EPO(紅血球生成素）調配物之藥 效學及藥物動力分布曲線。 調配物 EPREX (對照調酉嫩） CMC 1 : 15,000 IU EPO，0.5% CMC，10 mM 磷酸 Na 緩衝 劑，pH 7，15毫克/毫升甘胺酸；總滲透壓=199 毫克 Pro/%CMC=250 CMC 2 ： 15,000 IU EPO，1.0% CMC，10 mM 磷酸 Na 緩衝 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 劑，pH 7，15毫克/毫升甘胺酸；總滲透壓=199 毫克 Pro/%CMOU5 CMC 3 ： 15,000 IU EPO，2.0% CMC，10 mM 磷酸 Na 緩衝 劑，pH 7，15毫克/毫升甘胺酸；總滲透壓=199 毫克 Pro/%CMC=63 CMC 4 ： 15,000 IU EPO，2.0% CMC，10 mM 磷酸 Na 緩衝 劑，pH 7，50毫克/毫升甘露糖醇；總滲透壓滲透壓 調節劑=274 毫克 Pro/%CM063 -18- 1332845 A7 ------_____ B7 五、發明說明（17) 田不用於研究時，使Epo調配物冷;東（~4。〇貯藏 以防止照光。 5 10 15 $究用動物 種名 亞種 性別 來源 施藥年齡： 首次施藥之目標重量 鑑定法： 研究數： 安置 狗 小獵犬 雄性 . Harlan Sprague Dawley, Inc. Indianapolis, Indiana 46299 9至18個月 6至18公斤 動物供應商施加的花紋 21(N = 3隻狗/組） 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 20 25 將狗分組安置於存狗室中，並且使適應劑量施藥首 之控制及取樣。於劑量施藥前進行至少五日隔離。於授 離期結束時，由研究人員確認所有動物之健康情況1 研究7’除非必要（由於健康條件之緣故 狗分組女置。以動物及規範數標記安置室。 援境條件 使動物室維持於出代（相對溼度為削⑽及ι 小時之照光’黑暗週期。每小時至少有十個室之換氣。 -19- 1332845 A7 B7 五、發明說明（18) 食物及水 當研究時，使狗接受 Purina Certified Canine Diet® #5007及任意的水。 5 研究設計（摘錄） 隨機分配小獵犬（N=每組3隻狗，7組）為治療組。 於第-2曰時，以單一口服劑量之環抱靈（cyclosporin， 25毫克/公斤）施藥予狗。之後，使狗接受每曰維持劑量 10 之環孢靈（10毫克/公斤）。所有調配物及賦形劑係經皮 下（sc)施藥。 製備及試驗調配物劑量施藥：（第1日） 於第1日將試驗及對照調配物施藥予狗（所有調配 15 物係以下表所示之體積施藥）。將藥劑向上抽入設有適 當量測針之皮下注射器中。於背頸部施以皮下劑量。於 施藥前夾住施藥區，並且以持久墨水標記。 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製 EPO劑量 (TU/公斤） 調配物 注射量 注射體積 1,500 第1及15日 Eprex 15,000 IU·每 2 週 1毫升/動物 1,500 第1及15日 CMC1 15,000 IU4 2 週 1毫升^動物 1,500 第1及15日 CMC2 15,000IU42 週 1毫升/動物 1,500 CMC3 15,000 IU·# 2 週 1毫升/動物 -20- /n\\c\ αλ ia /〇 in ^ /\ « Λ 五、 (19)

發明說明 、取檨及虚ΐΦ 於指定的初時間點（參見如下）’經由頸靜脈收集約 2毫升血液於料化之Vacuuiners⑧中。於㈣脈無法 取血之情形中，則經由頭靜脈收集並且註明。於環孢靈 施藥前得到之初血液收集係用以獲得血漿。將血液置於 冰上，離心（1500 x g，於約下，1〇分鐘），·以及收 集血漿。將血漿冷凍於_2(rc直到分析時為止。 於第二次血液收集時，於早上得到约2毫升使用含 10 EDTA之Vacutainers®收集之血液，並且置於冰上。於 約4°C下貯存第二次收集物為全血，並且用於網織紅丘 球、血紅素及總紅血球測量。 初次血液收集時間點： 15 第1日（先劑量、3、6、12及16小時）、第2日（24 及36小時）、第3日、第5日、第7日、第1()日第 15曰（先劑量）、第16日及第28曰。 第二次血液收集時間點： 於第 1 ' 3、7、10、14、17、21、24 及 28 日之先 20 劑量。 數壚分析 使用 Excel (Microsoft®，97_SR_2 版）進行數據分 1332845 A7 B7 五、發明說明（2〇) 析。使用 WinNonlin (Scientific Consulting®，2.1 版）處 理血漿數據，並且計算以下藥物動力學參數：' Tmax、末端Tl/2及C1/F(註：無法估計經吸收的劑量比 例，因此本模式之清除率真正地為清除率/F，其中F為 5 經吸收的劑量比例）。亦使用 WinNonlin計算網織紅血 球、血紅素及總紅血球數據之AUC(0_最後 >(與基線之差 異）。進行可行的統計分析（即ANOVA、t-檢定）。‘ 結果 10 如圖1所示，相較於EPREX，所有含CMC之調配 物具有較優的藥物動力學性質。明顯地，Cmax較 EPREX為低，且Tl/2較EPREX為長。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 如圖2、3及4所示，除了含50毫克/毫升甘露糖 醇之調配物外，所有CMC調配物之藥效學性質優於 15 EPREX。含50毫克/毫升甘露糖醇之調配物類似於 EPREX。圖2顯示於CMC調配物施藥後之較高百分比 的網織紅血球變化。亦如圖2所示，就EPREX而言， 於施藥後急遽增加且接著降低。於所有CMC調配物中 之降低緩和係證實系統EPO量自此等調配物之注射區 20 釋放出來。圖3及4顯示血紅素及總紅血球（RBC)對時 間之變化。除了含50毫克/毫升甘露糖醇及1%CMC之 調配物外，所有其他CMC調配物提供刺激狗中造寫作 用之較優的藥效學效果。 25 實例2 -22- 1332845 A7 B7 五、發明說明（21 ) 於皮下施藥後一個月之免疫受抑制 1利的狗中EP〇調配物 之評估 研究設計（招i鏟） 5 本研究類似於實例1中所述者，但如此中所述般地 修飾。隨機分配小撒犬（N=3隻狗/組，5组）為治療組。 於第-2日時’以單一口服劑量之環孢靈(25 $克/公斤) 施藥予狗。之後，使狗接受每日維持劑量之環抱靈〇〇 毫克/公斤）。於免疫受抑制的狗進行二次劑量療法。調 1〇配物及賦形劑兩者係以單一皮下（sc)劑量施藥。於超過 四週期間之指定時間收集血液樣品。每日監測注射區， 並且每週測得體重。 調配物 15 EPREX : 40,000 劑量 CMCzl: 40,000 IU EPO，7% CMC，20 mM 碟酸

Na緩衝劑’ pH 7’ 5毫克/毫升甘胺酸 (0.5%)，75 mM NaC卜 0.3% Tween 80。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 總滲透壓=142mM 微克Pro/%CMC=47 20 蓋座及試驗調配物劑量施藥：（第1日） 所有調配物係以下表所示之體積施藥。將藥劑向上 抽入設有適當量測針之皮下注射器中。於背頸部施以皮 下劑量。於施藥前夾住施藥區，並且以持久墨水標記。 -23- 1332845 A7 B7 五、發明說明（22) 治療 EPO劑綱 劑量體積(毫升） 施藥途徑 EPREX 30,000 0.75 皮下 CMC-5 30,000 0.75 皮下 初次血液收集時間點： 所有組··先劑量、6、12及16小時（第1曰）、2 4 及 36 小時（第 2 曰）；及第 3、5、7、13、17、21、24 5 及28日之先劑量。 第二次血液收集時間點： . 於第 1、3、7、10、14、17、21、24 及 28 日之先 劑量。 10 結果 CMC-5調配物顯示具有較EPREX優越的藥物動力 學性質，其特徵在於較低的〇^^及較長的T1/2。此調配 物亦展現具有較EPREX稍佳的藥效學性質。 15 實例3 於每三週皮下施藥後之非免疫受抑制的雄性小獵犬中之 經濟部智慧財產局員工消t合作社印製 CMC-EPO調配物評估 調配物

20 CMC-6 : 80,000 IU/毫升 ΕΡΟ，1% CMC，20 mM 填酸 Na，pH 7·2，100 mM NaCl ; 總滲透壓 =100 mM 微克

Pro/%CMC=660 -24- 1332845 A7 B7 五、發明說明（23) EPREX : 80K 8〇,〇〇〇ιυ/毫升劑量 g究概述 试驗及對照物件係藉多重皮下注射，施藥於小撒 5 欠，每三週期間一次注射。 組 i ¥*J量 治療 ΕΡΟ嫩 ，公斤） 斤） m αυ/耕） 總數 施藥 曰 雜士日 mm 品曰 1 CMC6 1200 0015 80000 3 1、22 1、2、3、35、 1、3、7、10、 4、45、5、7、 14 Ί7 '21 ' 1〇、15、22、 Ά '28 '31 ' 23'28'36 5 35、38 及42 42 2 1200 0015 40)300 3 1、22 1 -2'3 '35 * 1、3,7、10、 4、45、5、7、 14 Ί7 '21 ' 10'15 '22 ' 7A '28 '31 ' 23'28'36^ 35'38 及42 42 *練ίϋ力學抵雜顧示曰收集。於第1曰舰集先劑量，接著於第6、12、24小時 (第2日)及36小献制趟量》撕肴其^日，係於細大约相同時間收集侧樣品。 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製

ο IX

5 1M 藥物動力學 測定ΕΡΟ之最大平均血漿濃度（Cmax)及其出現時間 (Tmax)° 藉線性梯形規則（根據 Baiier，乂 忍iop/mr/w.，（1988) 16:303-309)，估計自時間零至第 22 曰於平均血漿濃度-時間曲線下之面積（AUC〇 T)及其變 異。藉著使AUC〇_T除劑量（12〇〇 iuy公斤）可估計表觀清 除率（CL/F)。必要時，藉著使對數平均濃度對時間之線 -25-

1332845 A7 B7 五、發明說明（24) 性迴歸（使用隨機分布於單一直線附近之數據點）以估計 终端速率常數（k)。以Ln2/k計算末端半衰期。 藥效學 5 收集供血液學研究之血液（約0.5毫升）於如前述表 中所述之含有EDTA抗凝血劑的試管中。 測定以下血液學性質以評估CMC-6及對照調配物 之藥效學性質： ， •紅血球數 10 •血紅素 •白血球數（總數） •網織紅血球數（絕對量及百分率） •網織紅血球血紅素 15 使用第1曰之數值作為基線值，計算藥效學參數 (%網織紅血球、血紅素及總紅血球）與基線之變化。使 用線性梯形規則，計算與基線之藥效學數值變化之 AUC。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 20 結果 CMC-6之藥物動力學顯示具有較EPREX對照組為 低之及較低的T1/2 = CMC-6之藥效學顯示於第6 曰產生較優的網織紅血球變化，但於所有其他測量中， 具有與EPREX類似的藥效學性質。 1332845 A7 B7 五、發明說明（25) 實例4 於非免疫受抑制的雄性小獵犬皮下施藥Ep〇調配物後 之43日藥物動力學/藥效學評估 5 本研究係設計以評估經由皮下注射法，於雄性小獵 犬中之試驗物件的藥物動力學及藥效學。 試驗系統 種名/品種：小撒犬 10 供應商：Marshall Farms, 5800 Lake Bluff Road North

Rose, New York 14516 研究之動物數：18隻雄性動物 治療初期之年齡（大約）： 5至7個月 治療初期之體重範圍（大約）：8至11公斤 15 經濟部智慧財產局員Η消费合作社印製 本研究係對狗進行，以評估經設計以維持與治療有 關的紅血球生成作用之不同EPO調配物（Ep〇etin alfa) ’其係為人體中具療效的調整作用之潛在指示。就 每一經檢視的調配物而言，所用的狗數為提供科學上正 20確結果所必須的最小數目。於活體内模式不可接受者是 可行的。慣常地使用為了繁殖目的之小獵犬，以進行符 合調整需求之藥物動力、藥效學及毒物學研究。 動物韵基 25 ϋ:於經空氣調節的建築物中之一供研究的居 -27- ^>η·7 1332845 A7 B7 五 、發明說明（26) 室 溫度：19至25°C(目標範圍）， 相對溼度：>40%， 換氣：每小時最少10次換氣量， 照光週期：12小時照光（人工）/12小時,1 里使動物個別地安置於圍攔（1.44平方公尺） 中 10 15 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製 20 ±_物.:顆粒狀之完全商業膳食（Diet 125C1，UAR) 中；經分析不含化學及生物污染物。 數量分配:300克/動物，曰（於治療曰施藥後 及於其他研究日之每日大致相同時間提供食 物）。 述主要是飲用水（隨意地），每年至少一次分析化 學污染物，且每年至少二次分析細菌污染物 (Laboratoire Sante Evironnement Hygiene de Lyon)。 度染物_ :沒有已知的污染物以可妨礙獲致本研究 目的之含量存在於膳食或水中。膳食及水的 分析證明書將保留於試驗場所之檔案庫中。 25 預治痊鋥庠 -28- 10 經濟部智慧財產局具工消費合作社印製 1332845 A7 B7 五、發明說明（27 動物健康程序: 標準犬類接種及抗寄生蟲治療（由供應商進行） 臨床檢查新來者之不健康情形； 於適應環境期間進行完整臨床檢查。 適應環境期間· 於動物到達與治療開始間至少二週。 動物鑑定: 使用耳廓上的花紋及微晶片植入物：Electronic Laboratory Animal Monitoring System, ELAMS (Bio Medic Data Systems) o 如扁號 顏色碼 動物數 1 白 271 至 272 2 綠 274 至 276 3 藍 277 至 279 4 红 280 至 282 5 黃 283 至 285 6 淺橙 286 至 288 15 試驗設計 分配治療組··於適應環境期間進行：以體重級別為 基準，進行隨機分配程序。 使動物分派為以下組： 20 -29-

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84 2 J J 5 ο II* 經濟部智慧財產局負工消费合作社印髮 5 ti A7 ---------21 發明說明（28) ^----f 組 ------- -— Epoetin alfii 劑量 _(TU/公斤/施藥） 雄_物數 第1曰 第15曰 第29曰 1 1500 1500 1500 3 2 "Π 1500 1500 1500 3 3 1500 1500 3 4 1500 Ί 1500 • 3 5 1500 1500 • 3 6 1500 1500 - 3 試驗物件A施藥t ' 途徑:皮下 方法: 於以乙基醇水溶液局部消毒後，使用無菌注 射器及注射針（皮下引入）進行大丸劑注射。 使用於背頸/肩胛間區域中之一注射區。 施藥體積·· 根據最近記錄的體重，計算治療日之個別劑 量（至小數點以下第二位）。於施藥前後秤量 含有劑量溶液之注射器重，俾計算真正的個 別投遞劑量。 頻率:於治療曰（第1曰）一次。 觀察 •30- 1332845 A7 B7 五 、發明說明（29 ) 發病率/死亡率： 每曰至少觀察動物二次。任何經判斷為垂死 條件之動物將經抽血以供血液學、臨床化學 及藥物動力學測定’並且接著使之安樂死。 10 臨床症候: 每曰觀察動物。於治療期間，於施藥前或之 後至少一次檢視動物，以偵測任何臨床症候 或對治療的反應。每日觀察注射區。於治療 開始前，進行完整臨床檢查。 :於治療初期前二週開始，每週坪個別 重量 15 經濟邹智慧財產局貝工消費合作钍印焚 20 25 jfa·液收隹: 自未麻醉的人工制約動物之頸靜脈抽企 遂收隼： 血液參數：EDTA。 臨床化學參數：無抗凝血劑。 血液龙； 所有動物：於施藥前（第·7曰及第丨曰施藥前）及第 3'5、7'9、11、13、15、18、21、 24、27、30日進行二次。來自第1及2組之 -31- taut i > « ^>0-7 1332845 A7 B7 五、發明說明（30 ) 動物將額外地於第33、36、39及43日抽 血° 於每一時間點，自每一隻狗取出約2毫升之 全血。 5 •血紅素 •紅J&L球數 •平均血球體積 •網織紅血球數（絕對量及百分率） •總白血球數 10 •網織紅血球血紅素（絕對量及百分率） •網織紅血球次族群（Η-、M-及L-網織紅血 球） 臨床化學 15 所有動物：於施藥前（第1曰）及研究末期（第30 曰：第3至6組；第43曰：第1及2組）。 於每一時間點，自每一隻狗取出約2毫升之 全it。 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製 •納 20 •鉀 •氣 • !弓 •無機碌 •葡萄糖 25 •尿素 -32- 1332845 A7 B7 五、發明說明（31) 10 15 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製 20 •總膽固醇 •三酸甘油酯 •總膽紅素 •總蛋白質 •白蛋白 •總球蛋白（計算值） •白蛋白/球蛋白比例 •肌酸 •鹼性磷酸酶 •天門冬酸胺基轉移酶 •丙胺酸胺基轉移酶 •γ-麩氨醯轉移轉移酶 藥物動力學 檢視的動物:所有動物。 自未麻醉的人工制約動物之頭靜脈抽血。於 每一時間點，自每一隻狗取出约2毫升之全 血至具有肝素抗凝血劑之容器（置於冰浴上） 中。藉著以約3000 irpm(每分鐘轉數）離心1〇 分鐘且移至聚丙烯管’可得到血漿樣品。將 血漿樣品貯存於深度冷凍中（約·2〇<^ )，直到 送至附屬Testing Faci丨ity 1為止。 訂 25 於以下時間點取樣： -33

1332845 A7 B7 五、發明說明（32) 第1及2組 第1曰 先劑量，施藥後6及24小時 第2曰 於第1日施藥後24及36小時 第3、4、5、6、7及8 日 每日一次 第15日(先劑量） 第二劑 第16曰 每曰一次 第29日(先劑® 第三劑 第30及43日 每日一次 第3至6組 第1曰 先劑量，施藥後6及24小時 第2曰 於第1曰施藥後24及36小時 第3、4、5、6、7及8 日 每日一次 第15曰(先劑量） 第二劑 第16及30日 每日一次 5 藥物動力學數據評估 繪製所有藥效學（血液學）參數之組平均值圖（圖5 至8)。 實例5 10 藉皮下施藥於非免疫受抑制的雄性小獵犬之藥物動力學 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 /藥效學交叉G-CSF調配物研究 試驗系統 種名/品種：小獵犬 15 供應商：HaΓlanFrance，Z·I·duMalcourlet，R.N·9，B·P· 98, 03800 GANNAT，法國 -34- A7 B7 五、發明說明（33) ' — 研究之動物數：6隻雄性動物 治療初期之年齡（大約）：5至7個月 治療初期之體重範圍（大約）：9至u公斤 5 本研究係對狗進行，以評估具GCSF(粒細胞粒性 群刺激因子）之不同的調配物。就每一經檢視的調配物 而言，所用的狗數為提供科學上正確結果所必須的最小 數目。於活體内模式不可接受者是可行的。慣常地使用 為了繁殖目的之小獵犬，以進行符合調整需求之藥物動 10力、藥效學及毒物學研究》 動物韵卷 安置-••於經空氣調節的建築物中之一供研究的居 室： 15 溫度：19至25°C(目標範圍）， 相對溼度：>40%， 換氣：每小時最少10次換氣量， 照光週期：12小時照光（人工）/12小時黑暗。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 20 旦!_·‘使動物個別地安置於圍攔（1.44平方公尺） 中。 盒物―··顆粒狀之完全商業膳食（Diet 125C1，UAR) 中；經分析不含化學及生物污染物。 25 數量分配：300克/動物，曰（於治療曰施藥後及 -35- ^32845 A7 B7 五、發明說明（34) 於其他研究日之每日大致相同時間提供食 物）。 於取樣進行臨床實驗測定前及屍體檢驗前，使 動物禁食整夜。由於取樣排程之特性，並非全 5 部藥物動力學樣品皆在禁食條件下取樣》 兔.主要是飲用水（隨意地），每年至少一次分析化 學污染物，且每年至少二次分析細菌污染 物。 10 污染物~ :沒有污染物已知以可妨礙獲致本研究目 的之含量存在於膳食或水中。膳食及水的分 析證明書係保留於試驗場所之擋案庫中。 15 通治瘓鋥庠 動物健康鋥序： 標準犬類接種及抗寄生蟲治療（由供應商進行）； 臨床檢查新來者之不徤康情形； 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 於適應環境期間進行完整臨床檢查。 20 適應環境期間： 於動物到達與治療開始間至少二週。 動物鑑定: 25 使用耳廓上的花紋及微晶片植入物：Electronic 1332845 A7 B7 五、發明說明（35)

Laboratory Animal Monitoring System, ELAMS (Bio Medic Data Systems)。 _號 顏色碼 動物數 1 綠 391 至 393 2 藍 394 至 3% 5 試驗設計 分配治療組：於適應環境期間進行：以體重級別為 基準，進行隨機分配程序。 使動物分派為以下組： 10 組 治療 GCSF劑量 (跡公斤/施藥*) 雄㈣物 數 第1曰 第15曰 1 繼物件A 70 3 2 件B 70 3 *於分析第一週藥物動力學樣品後’確認第二^施藥(第15日)ί吏用之劑量水平：藉由規 範修正以定義劑量水平〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15 物件A : GCSF，批號14901-185，濃度：1.164毫克/毫 升如此中所述之調配物。 物件 B : CMC-GCSF，批號 15849-136-1 * 濃度：0.60 毫克/毫升如此中所述之調配物。 20 進行以上治療法所需的劑量體積如下： -37- Μ 丄川845 A7 B7 五、發明說明（3〇 組 GCSF劑量 ~^ (微克^公斤/施藥 5¾物數 第1曰 1 1 0.60 藉規範修正而定ί 2 0.117 藉贿修正而〜 j 3 复之-原理:劑量係以現存的數據(得自先前 研究中評估之調配物）為基礎而選擇。 試驗物#之祐.竿法 5 友:於以乙基醇水溶液局部消毒後，使用無菌 注射器及注射針（皮下引入）進行大丸劑注 射。使用於背頸/肩胛間區域中之二注射區。 疾藥胃積:取決於施藥治療法。根據最近記錄的 10 體重’計算第1及15曰之個別劑量體積（至 小數點以下第二位）；此等體積係記錄於研究 數據中。於施藥前後秤量含有劑量溶液之注 射器重’俾計算真正的個別投遞劑量。 15 施藥途鹆之選擇原理:選擇皮下途徑，因為此係 經濟部智慧財產局員工消t合作社印製 為人類之施樂途捏 途徑:皮下 择率：於第1及15日一次。 -38- E/T'XICX > f ^1A ^ ^c\n Α7

接續期間••於研究期 間二次施藥（第i及1 5曰） 發病率/开.亡f 每曰至 動物脾r /觀察動物二次。任何經判斷為垂死條件之 — '、液千 '臨床化學及藥物動力學測 々，並且接著使之安樂死。 藓床症候 1〇 _ a每曰觀察動物。於治療期間’於施藥前或之後至少 _人檢視動物’以偵測任何臨床症候或對治療的反應。 日觀察注射區。於治療開始前，進行完整臨床檢查。 15 於治療初期前二週開始’每週秤個別重量 —血液: 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 25 自未麻醉的人工制約動物之頸靜脈抽血 IL#收集: 血液參數：EDTA » 臨床化學參數：無抗凝血劑。 .於施藥前（第-7日及第1曰施藥前），及 -39- 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製 1332845 A7 B7 五、發明說明（38) 以下時間點： 第1曰 於第1次治療後6、12及16小時 第2曰 於第1次治療後24及36小時 第3曰 於第1次治療後48小時 第4曰 於第1次治療後72小時 第5曰 於第1次治療後％及108小時 第15曰 於第2*次治療後6、12及16小時 第16曰 於第2*次治療後24及36小時 第17曰 於第2*次治療後48小時 第18曰 於第2*次治療後72小時 ’ 第19曰 於第2*次治療後96及108小時 *於分析第一週藥效學數據後，確認第二欠施藥(第15日)ί吏用之取樣排程；藉由規範修 如定義時間點。 於每一時間點，自每一隻狗取出約0.5毫升之全 血0 •總白血球數 •獨特的白血球數（嗜中性白血球、淋巴球、單核 10 白血球、嗜伊紅血球及嗜鹼細胞）。 血液學數據之品質控制 血液學數據之品質控制如下： 於血液樣品（未包含重複分析）之每一初操作前後， 15 操作對照組。就每一對照批量而言，於每一時間點（就 研究期間每一給定的批量之整個内在壽命時距而言）計 算平均值及標準差。亦記錄批數。以CBC/DIFF模式操 作ADVIA(用以進行血液學測定），俾收集獨特白血球 -40-

1332845 A7 B7 五、發明說明（39 數據 10 15 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 20 臨床化學 於第1曰及末期（第19曰）施藥前對所有動物進行 之。於每一時間點，自每一隻狗取出約2毫升之全血。 •鈉 •鉀 •氣 •妈 •無機填 •葡萄糖 •尿素 •總膽固醇 •三酸甘油酯 •總膽紅素 •總蛋白質 •白蛋白 •總球蛋白（計算值） •白蛋白/球蛋白比例 •肌酸 •驗性鱗酸酶 •天門冬酸胺基轉移酶 •丙胺酸胺基轉移酶 •γ-麩氨醢轉移轉移酶 25 -41 1332845 A7 B7 五、發明說明（4〇) 藥物動力學 檢視的動物:所有動物。 血液:自未麻醉的人工制約動物之頸靜脈抽血。 於每一時間點，自每一隻狗取出約2毫升之 5 全血至具有肝素抗凝血劑之容器（置於冰浴上） 中。藉著以約3000 rpm(每分鐘轉數）離心10 分鐘且移至聚丙烯管，可得到血漿樣品。將 血漿樣品貯存於深度冷凍中（約-20°C)。 10 於以下時間點，自所有動物取樣： 第1曰 於第1次治療後2、4、6、8、10、12及16小時 第2曰 於第1次治療後24及36小時 第3曰 於第1次治療後48小時 第4曰 於第1次治療後72小時 第5曰 於第1次治療後96及108小時 第15曰 於第2*次治療後2、4'6、8、10、12及16小時 第16曰 於第2*次治療後24及36小時 第17曰 於第2*次治療後48小時 第18曰 於第2*次治療後72小時 第19曰 於第2*次治療後96及108小時 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 *於分析第一週藥效學數據後，確認第二欠施藥(第15日欣用之取樣排程；藉由規範修 办乂定義時間點。 15 數據評估 藥效學數據評估： 繪製所有藥效學（血液）參數之组平均值圖。藉線性 梯形規則（根據Bailer (1988))，估計於參數-時間曲 -42- 1332845 A7 B7 五、發明說明（4i) 線下之面積（基線調整過的參數之AUC(0·最後 >)。此 技術 a月參照 A.J. Bailer, «/. (1988) 16:3 03-309。使用以下規則，僅計算平均參 數-時間曲線下之正面積： 5 1) 每一個別參數基線係以逐案基準決定，於使用 第1日或第3日之數值時，二者中較小值設 定基線。 2) 只要曲線落於基線下方，則考慮的時間點經指 10 定為基線值；此僅適用於AUC(0_最後）之計 算。 算數組平均及標準差值係就每一參數及其個別 AUC(0_最後>計算之。 15 蘯物動力學數據評估 經濟部智慧財產局員工洧費合作社印製 最大平均血漿濃度（cmax)及其出現時間（Tmax)係為觀 察值。藉線性梯形規則’（根據Bai丨er)估計血聚濃 度-時間曲線下之面積（AUCt)及其變異。必要時， 20 藉著使對數平均濃度對時間之線性迴歸（使用隨機 分布早一直線附近之數據點）以估計终端速率常數 (k)。以LU/k及清除率（C1+獲致的劑量AUCt)計算 末端半衰期。此技術請參照A.J. Bailer，j （1988) 16:303-309。 •43· 1332845 A7 B7 五、發明說明（42) 圖1 :以平均血漿Epogen Alfa濃度對時間說明持 續釋放調配物CMC-1、CMC-2、CMC-3、CMC-4之藥 物動力學性質。 圖2 :以網織紅血球之變化百分率對時間說明持續 5 釋放調配物CMC-1 ' CMC-2、CMC-3、CMC-4之藥效 學性質。 圖3 :以血紅素量之變化對時間說明持續釋放調配 物 CMC-1、CMC-2、CMC-3、CMC-4 之藥效學择質。 圖4 :以紅血球量變化對時間說明持續釋放調配物 10 CMC-1、CMC-2、CMC-3、CMC-4 之藥效學性質。 圖5 :以平均血漿Epogen Alfa濃度對時間說明臨 床批量CMC-EPO之藥物動力學性質。 圖6 :以網織紅血球之變化百分率對時間說明臨床 批量CMC-EPO之藥效學性質。

15 圖7 :以血紅素量對時間說明臨床批量CMC-EPO 之藥效學性質。 圖 8 ··以紅血球量對時間說明臨床批量CMOEPO 之藥效學性質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4-

Claims (1)

1332845 AS B8 C8 D8 專利申請案第91丨32632號 ROC Patent Application. No. 91132632 條正祛盔釗绐之申馇糞利g ffl中女太-附钵f二、 六、申請專利範圍 Amended Claims in Chinese - Encl.ll R@99^03 h 31 (>ubmitted on March 年月日 補充I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1. 一種醫藥調配物，其包含： a) 醫藥活性量之紅血球生成素； b) 醫藥上可接受之pH緩衝劑，俾提供pH範圍為約 pH 6 至約 pH 9 ; 5 c)滲透壓調節劑，係具濃度範圍為約0至約200毫 莫耳；及 d)羧曱基醚纖維素鈉（CMC)，係具濃度範圍為總式 量之約0.5%至約7%，該CMC具分子量範圍為約 50,000道爾頓至約1,000,000道爾頓。 10 2.如申請專利範圍第1項之調配物，其中該紅血球生 成素係選自由重組人類紅血球生成素、愛普丁 -a(epoetin alfa)、愛普丁 -co(epoetin omega)、促紅血 球生成素（darbepoetin alfa)及PEG共輛的紅血球生 成素組成之群。 15 3.如申請專利範圍第1項之調配物，其中該pH緩衝劑 濃度係在約10 mM至約30 mM之範圍内，且其中 該pH緩衝劑係為磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩衝系 統。 4. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該滲透壓調 20 節劑係選自由Naa、KC1及甘胺酸組成之群。 5. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該滲透壓調 節劑係為NaCl，且該NaCl濃度為約75 mM至約 1 25 mM。 6. 如申請專利範圍第1項之調配物，其中該調配物之 25 pH係在約6.5至約7.4之範圍内。 -45 -

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 91492B-接 2 A8 B8 C8

10 15 7. 如申請專利範圍第1 項之醫藥調配物，其中該醫藥 調配物係根據每二週=·Α w —次、母週一次、每二週一 次、每三週一次、每 %月~次、每五週一次或每六週 一次之施藥療法施藥。 8. 如申請專利範圍第7 項之醫藥調配物，其中紅血球 生成素之有效每曰劍& & 剛 Ϊ 為約 4000 至 9000 I.U. » 9.如申請專利範圍第7項 $ <醫樂調配物，其中紅血球生 成素之有效每日劑量為大於1G，_LU。 1 〇. —種醫藥調配物，其包含： a) 醫藥活性量之蛋白質’其係為粒細胞粒性群刺激 因子（G-CSF); b) 醫藥上可接受之pH緩衝劑，俾提供pH範圍為約 pH 4.5 至約 pH 9 ; C)滲透壓調節劑’係具濃度範圍為約〇至約2〇〇 莫耳；及 d)缓甲基醚纖維素鈉（CMC)，係具濃度範圍為總 量之約0.5%至約7%，該CMC具分子量範圍為 50,000道爾頓至約1，〇0〇,〇〇〇道爾頓。 毫 式 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 25 11. 如申請專利範圍第1 〇項之調配物，其中該pH緩衝 劑濃度係在約10 mM至約3 0 mM之範圍内，且| 中該pH緩衝劑係為磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩衝系 統。 12. 如申請專利範圍第10項之調配物，其中該滲透廢調 節劑係選自由NaC卜KC1及甘胺酸組成之群。 -46 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1332845 A8 B8 C8 I-----D8____ 六、申清專利範圍 13. 如申請專利範圍第i〇項之調配物，其中該滲透壓調 節劑係為NaCl，且該NaCl濃度為約75 mM至約 125 mM。 14. 如申請專利範圍第1〇項之調配物，其中該調配物之 5 PH係在約6.5至約7.4之範圍内。 15. 如申請專利範圍第項之醫藥調配物’其中該醫藥 調配物係根據每二週三次、每週一次、每二週一 次、每三週一次、每月一次、每五週一次或每六週 一次之施藥療法施藥。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2]0x297公釐） 專利申請案第91132632號 ROC Patent Appln. No. 91132632 中文圏式备正頁-附件(五） AmendedPages-of the Qi'insseOrawing^-^-nc] fV)' 民國99年0¾月的日送呈） (Sijbmi輩d on? .，、，2〇1 〇) 圖1

時間（曰） Dog Study : 平均 N=3(每組) 15.000 IU/g CMC1 ： 15.000 IU/g CMC2 ： 15.000 IU/g CMC3 ： 15.000 IU/g CMC4 ： 0.5% CMC，iOmM 磷酸Na，15 mg/g.甘胺酸 ’ pH7 10/〇 CMC，lOmM 磷黢Na，15 mg/g 甘胺缓 ’ pH7 2% CMC，10 mM 磷酸 Na，15 mg/g 甘胺酸，pH 7 0.5% CMC，10 mM 磷酸 Na，50 mg/g 甘露糖醇 ’ pH 7