TWI328613B - Neurodegenerative disease treatment - Google Patents

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1328613 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於使用SIMP活化蛋白質激酶抑制劑來治療神 經退化疾病。 【先前技術】 神經退化疾病是一種逐步喪失神經細胞的病症。這類疾病的 例子包含阿茲海默氏症（Alzheimer’s disease)、帕金森氏症 (Parkinson’s disease)及漢丁頓舞蹈症（Huntington’s disease)，其中 漢丁頓舞蹈症是一種體染色體顯性缺陷（autosomal dominant disorder)的神經退化疾病，係因Huntingtin (Htt)基因第一表現子 上出現多餘的CAG三核苷酸序列重複片段而造成該疾病。相關 文獻例如可參考 Perutz et al.，Trends Biochem. Sci. 1999;24:56-63 及 Rubinsztein et al·, J. Med. Genet. 1999; 36:265-270.。漢 丁頓舞 蹈症病人會有異常的身體動作、痴呆及精神方面的問題。醫療藥 品，如多巴胺阻斷劑（dopamine blocker)，可減少異常的動作及行 為，但無法阻止神經退化。因此，需要一種可有效治療漢丁頓舞 蹈症及其他神經退化疾病的新的藥物。 【發明内容】 本發明係關於使用5’AMP活化蛋白質激酶抑制劑來治療神 經退化疾病。 在一方面，本發明係關於一種辨識用於治療神經退化疾病（例 如’漢丁頓舞蹈症）之化合物的方法。該方法包含：使表現5 ’AMP 活化蛋白質激酶(AMPK)的第一細胞與一化合物接觸；及決定該 5’AMP活化蛋白質激酶的表現量、填酸化程度或酵素活性。相較 於不與前述化合物接觸之第二細胞，如果第一細胞的5 ’AMP活化 蛋白質激酶表現量、鱗酸化程度或酵素活性低於以相同方法決定 的第二細胞5’AMP活化蛋白質酵素表現量、鱗酸化程度或酵素活 5 1328613 性，則該化合物係為可有效治療神經退化疾病之化合物。第一及 第二細胞的例子包含神經膠細胞及神經元細胞。本發明之辨識方 法係可在體内或體外進行。在一體内實施態樣中，第一及第二細 胞係存在於非人類動物中，例如，存在於非人類動物的紋狀體 (striatum)中。適當的非人類動物係為老鼠，例如R6/2老鼠。 前述5’AMP活化蛋白質激酶係指一全長5’AMP活化蛋白質 激酶多胜肽（例如Carling等人所描述的哺乳動物、酵母菌或植物 AMP 活化蛋白質酵素，1994, J. Biol. Chem. 269:11442-11448)或 具有相同功能的等同物（equivalent)。相同功能的等同物係指 5’AMP活化蛋白質激酶蛋白質衍生之多胜肽，例如，融合多胜 · 肽、具有一或多個突變、插入、刪除、截斷之多胜肽或其結合。 該多胜肽大致上可保有5’AMP活化蛋白質激酶之酵素活性，換言 之，可保有使目標蛋白質磷酸化之能力，例如下列參考文獻中所 描述者：Lee et al·，J. Biol. chem. 2003;278:39653-39661; Hong et al·，J. Biol Chem. 2003; 278:27495-27501;及 Fryer et al，J. Biol.

Chem. 2002;277: 25226-25232 « 另一方面’本發明係關於一種治療神經退化疾病（例如，漢丁 頓舞蹈症）的方法。該方法包含辨識對象已罹患神經退化疾病或存 在發展成神經退化疾病的風險，並提供對象有效劑量之5’AMP # 活化蛋白質激酶抑制劑《名詞”抑制劑”係指具有可抑制5，AMP活 化蛋白質激酶基因表現量、後轉譯修飾（例如，磷酸化）或酵素活 性能力的化合物，且該抑制具有統計上的意義。這些試劑包含， 但不限於，非有機小分子、有機小分子、胜肽、抗體及核酸（例如， 反義RNA、核醣酵素或RNA干擾試劑）。例如，有機小分子可為 · 下述實施方式及實施例中的CGS21680。 另一方面，本發明係關於一種治療5’AMP活化蛋白質激酶相 關疾病的方法。該方法包含辨識對象已罹患5’AMP活化蛋白質酵 6 1328613

素相關疾病或存在發M ^廿捍祝财么 展成5，AMP活化蛋白質激酶相關疾病的風 有致劑量之前述__。“價P活化蛋白質 酵素相關疾病’’係指邀 Λ ^ 、5 AMP活化蛋白質激酶基因表現、磷酸化 程度或酵素活性提昇古 有關之病症。這類疾病包含，但不限於，糖 尿病及肥胖症。 圍亦包含兩種組裝產品（package product)。一組 裝產品包含一容考、—士 ° 有效量之5’AMP活化蛋白質激酶抑制劑及 —附於谷器之說明，兮％ 邊説明指出提供5’AMP活化蛋白質激酶抑制 劑係用於/α療已罹患神經退化疾病或存在發展成神經退化疾病 風險的對f另—組裝產品包含-容器、-有效量之CGS21680 及附，於令器之說明’該說明指出提供CGS21680係用於治療已 羅心’ 5 AMP ’g·化蛋白質激酶相關疾病或存在發展$ 颜p活化 蛋白質激酶相關疾病風險的對象。 本發明之-個或多個實施態樣係詳述如下，本發明之特色、 目的及優點皆描述於實施方式及中請專利範圍中。 【實施方式】 本發明係根據-項超出預期的發現，ΑΜρκ抑制劑，例如 CGS2168G，·可有效改善R6/2老鼠模型的數種主要漢丁頓舞蹈症 病理特徵。③些AMPK抑制财用來治療漢了頓舞蹈症及其他神 經退疾病6 SUb >本發明係’關於—種辨㈣於治療神經退化疾病之 AMPK抑制劑的方法。ΑΜρκ抑制劑可自市面購得或依循下述方 法或其他本技術領域已知的方法來辨識。 候選化合物（例如，蛋白質、胜肽、模擬胜肽 (PePtld〇mimetlC)、甘胺酸胺基取代的陽離子募聚合物 (peptcuds)、抗體、小分子或其他藥物）可使用本技術領域已知 的組合資料庫方法中的任何方法獲得。這些資料庫包含：胜肽資 1328613 料庫、peptoid資料庫（骨幹為一新穎、非胜肽骨幹，但具有胜肽 功能並能抑制酵素降解的分子資料庫）；空間定位（spatial ly addressable)平行固相或液相資料庫；藉由去迴旋 (deconvolutiuon)或親和性色層分析選擇獲得之合成資料庫；及” 一珠粒一化合物”資料庫。例如可參考Zuckermann et al. 1994, J. Med. Chem. 37:2678-2685; and Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145.。合成資料庫的合成方法例子可參考下列文獻，例 如，DeWitt et al. , 1993，PNAS USA 90:6909; Erb et al.，1994, PNAS USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. , 1993, Science 261 : 1303; Carrel 1 et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and Gallop et al.，1994 J. Med. Chem. 37:1233.。這些化合物資料庫可出現 在溶液中（例如，Houghten，1992，Biotechniques 13:412-421)， 或珠粒上（Lam, 1991，Nature 354:82-84)、晶片（Fodor，1993, Nature 364:555-556)、細菌（美國專利第5, 223, 409號）、種子（美 國專利第 5,223,409 號）、質體（Cull et al·，1992，PNAS USA 89:1865-1869)、或嗟菌體（Scott and Smith 1990，Science 249:386-390； Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, PNAS USA 87:6378-6382; Felici 1991, J. Mol. Biol. 222:30卜310; and U.S. Patent No. 5,223,409)。 為了辨識AMPK抑制劑，可使候選化合物與一包含AMPK的系 統接觸；該系統可為不含細胞的系統或包含細胞的系統，例如， 體外細胞株模型或體内動物模型。在包含細胞的系統中，細胞可 自然地表現AMPK基因，或被修飾來表現重組核酸。前述重組核 酸可包含：融合於異源啟動子之AMPK基因密碼區或融合於報導 基因之AMPK基因啟動子序列。然後量測AMPK的表現量、磷酸化 1328613 能力或酵素活性。 表現量可藉由mRNA表現量或蛋白質量來決定。量測組織或 體液樣本中mRNA表現量的方法已是本技術領域熟悉的技術。為 了量測mRNA表現量，可溶解細胞，然後決定細胞溶解物、或細 胞溶解物中純化或半純化RNA中的mRNA量，測量mRNA量的方法 可為’例如’雜父檢測（hybridizaiton assay)(使用可偵測之標 記基因專一 DNA或RNA探針）及定量或半定量rT_pcr(使用適當的 基因專一引子）。或者，可使用組織切片或未水解細胞懸浮液及 可偵測的（例如，螢光或酵素）已標記DNA或RNA探針來執行定量 或半定量原位雜交檢測。其他mRNA定量方法包含RNA保護檢測 (RPA)及 SAGE。 量測組織或體液樣本中蛋白質表現量的方法也已是本技術 領域熟悉的技術。這些量測方法中有多種方法使用可與目標蛋白 質專一性結合的抗體（例如’單株抗體或多株抗體）。在這些檢測 中’抗體本身或與其結合的第二抗體可被標記以供偵測。或者， 這些抗體可與生物素結合’並可使用具可偵測標記之抗生物素蛋 白（可與生物素結合的多胜肽）來偵測該生物素化抗體的存在。 結合前述方法（包含’’多層三明治”檢測）可提升這些方法的靈 敏度。部分蛋白質檢測方法（例如，ELISA或西方墨點法）可用於 檢測體液或細胞溶胞產物，其他方法（例如，免疫組織方法或營 光流式細胞儀）則可用於檢測組織切片或未水解之細胞懸浮液。 量測標記物質數量的方法係根據該標記物質的特性，這些方法已 是本技術領域熟悉的技術。適當的標記物質包含放射性同位素 (例如，125I、131I、35S、3H、或32P)、酵素（例如，鹼性磷酸酵素 (alkaline phosphatase)、山葵過氧化酵素（horseradish peroxidase)、冷光素（luciferase)、或β-半乳糖酵素 (β-galactosidase)、螢光物質（例如：螢光素（fluorescein)、 1328613 羅單明（rhodamine)、藻紅素（phycoerythrin)、綠色螢光蛋白 (GFP)或藍色螢光蛋白（BFP))或發光物質（例如：QdotT!i奈米粒 子，由 Quantum Dot Corporation, Palo Alto，CA 所提供）；其 他可應用的檢測法包含定量免疫沈激法（immunoprecipitation) 或補體結合試驗（complement fixation assay)。 AMPK的磷酸化能力及酵素活性可藉由實施例甲所述的方法 量測，或使用本技術領域已知的方法，例如下列參考資料中所述 的方法：Rutteret al.，2003，Biochem. J. ; 375:1-16; Lee et al., J. Biol. Chem. 2003; 278:39653-39661 ； Hong et al., J. Biol. Chem. 2003; 278:27495-27501 ;及 Fryer etal·，J. Biol. Chem. 2002; 277:25226-25232.。 為了決定候選化合物抑制AMPK的能力，比較存在候選化合 物之實驗組及缺乏候選化合物之控制組的AMPK磷酸化程度及酵 素活性’測量方法係使用前述方法。如果實驗組的磷酸化程度或 酵素活性低於控制組，則該候選化合物可被視為具備有效治療神 經退化疾病的能力。 進一步可使用動物模型來驗證前述化合物的功效。例如，可 利用基因轉殖R6/2老鼠模型來驗證化合物對漢丁頓舞蹈症的療 效（Mangiarini etal.，1996，Celll; 87:493-506) °R6/2 小鼠 會表現人類Huntingtin(Htt)基因第一表現子，具有122個或更 多的CAG三核芬酸序列重複片段，牠們會逐漸表現出漢丁頓舞蹈 症神經學上的顯性特徵，包含類舞蹈動作、非自願的固定動作、 震顔、癲癇發作及非動作異常的症狀。提供前述候選化合物給 R6/2小鼠並依下列實施例所述的方法或其他標準方法進行試 驗。R6/2小鼠精神狀況任何統計學上有意義的改善都顯示該化合 物係為治療漢丁頓舞蹈症的候選化合物。 本發明亦關於一種治療神經退化疾病的方法。被處理的對象 1328613 =猎=經退化疾病（例如，漢丁頓舞蹈症）的標準診斷方 理對象也可選擇性地藉由前述方法檢測其順基因表 性;如果該對象樣本中的基因表現或酵素活性程度較 候=本^則該對象係為施予有效劑量之綱抑制劑治療的 化广療，ting)”係指為提供一化合物予罹患神經退 ^調_、緩和、醫治、預防，或改 。^失調症狀、續發失調疾病體f或後天失調。，，有效量 =產生預期醫療效果之化合物劑量，例如：前述料—受測對 方^量。治Ϊ方法係以活體内（in viv〇)或活體外(ex vivo)的 方式把仃，可卒獨或與其他藥物或治療方式合併使用。 〜療方法中，係提供職抑制劑給對象。一般而 :该化。物懸洋於一藥物學上可接受之載體(例 水），亚以口服方式提供，或用靜脈注入、注射，或皮下、肌t 鞘内、腹膜内、直腸内、陰㈣、# : 、 直接運送至紋狀體，換言之，芦由纹莫^貝舞心症），該化合物可 提供該化合物。 胃⑽㈣（齡astriatal)注射 質，^:^大=選重^^路#%配方性質，病人疾病性 的藥物，及醫師的判斷來決定。適當積的二二別：被提供 大的調整範圍’例如：口服方式需要比靜脈:主射：ί二:：有很 藥劑量的變動可根攄木Λ靜脈射更冋的劑置。用 來調整1用適當的運送料(例如被瞭解的最佳標準經驗法則 包覆藥物能增加運送效率，特別是；：或可植入裝置） 此外了提供—含有順抑制劑編碼核酸序列之聚核普酸 1328613 給對象。前述核酸序列的編碼包含可辨識ampk並抑制其表現或 酵素活性之抗AMPK抗體、反義RNA(anti-sense RNA)或小型干擾 RNA ( small interference RNA)。前述聚核苷酸可使用本技術領 域已知的高分子、生物可降解微粒或微膠囊輸送裝置來提供給對 象。另一種達到攝取核酸的方法係使用標準程序製備的微脂粒 (liposome)。前述聚核苷酸係可單獨或與組織專一抗體一起併入 運輸載具（delivery vehicle)中。並且也可視需要選擇性地製備 由質體或其他藉由靜電力或共價鍵連結在聚-L-賴胺酸 (poly-L-lysine)之載體組成的分子共軛化合物，聚-L-賴胺酸與 一可與目標細胞上受體結合之配體（ligand)鍵結（Cristiano，et al. (1995) J. Mol. Med. 73:479)。再者，係可視需要選擇性 地藉由本技術領域所熟悉的組織特異性轉錄調節元件 (transcriptional regulatory elements，TRE)來標定特定組 織。傳送”裸露DNA(naked DNA)”（換言之，不需運輸載具）到肌 肉、皮内、皮下處係為另一種達到體内表現的方法。 在前述的聚核苷酸中，例如，表現載體，編碼AMPK抑制劑 之核酸序列係與啟動子或增強子-啟動子組合相連結。合適的表 現載體包含質體和病毒載體，例如：泡療病毒（herpes viruses)、 反轉錄病毒（retroviruses)、牛痕病毒（vaccinia viruses)、減 毒牛殖疫苗（attenuated vaccinia viruses)、金絲雀痕病毒 (canary pox viruses)、腺病毒（adenoviruses)及腺病毒之相關 病毒（adeno-associated viruses) ° 如醫藥領域人士所熟知，病人所需之藥劑量係根據許多因素 決定，包含：病人體重、身體表面積、年齡、所施予藥物的特殊 性、性別、時間、給藥途徑、一般健康狀態以及是否有其他同時 施用之藥物。劑量可以改變，但施予聚核苷酸之較佳劑量係為 106-1012個聚核苷酸分子。如果需要，可重複施予該劑量，給藥 12 1328613 途徑可為前述之任何途徑。 以活體外方式治療對象之神經退化疾病可包含轉染 (transfecting)或轉導（transducing)可編碼AMPK抑制劑之聚核 苷酸至受測對象之細胞。另外，亦可設計載體，使其於活體外轉 染細胞，以便藉由同源重組（homologous recombination)的方 式，於細胞基因組中内源性AMPK抑制劑之轉錄起始位置前插入 一段新的、具活性的啟動子。經挑選及放大該可表現所需量之 AMPK抑制劑之細胞後，將前述經轉染或轉導細胞送回受測對象體 内。這些細胞包含神經細胞（neural cel Is )、造血細胞 (hemopoietic cel Is)(例如：骨髓細胞（bone marrow cel Is)、 巨嗟細胞（macrophages )、單核白血球（monocytes)、樹突細胞 (dendritic cells)、T 細胞（T cells)或 B 細胞（B cells))、 纖維細胞（fibroblasts)、上皮細胞（epithelial cells)、内 皮細胞（endothelial cells)、角質細胞（keratinocytes)或 肌肉細胞（muse 1 e ce 11 s )。前述經轉染或轉導細胞只要存活於 受測對象體内即可作為AMPK抑制劑之來源。 前述活體外方法之步驟係包含：從對象獲取細胞；培養細 胞；轉導表現載體於前述細胞；及維持細胞生長於可表現AMPK 抑制劑之適當環境。轉導作用係可藉由任何活體外基因治療之標 準方法實施，包含：破酸約（calcium phosphate )、微脂粒感染 (lipofection)、電穿孔（electroporation)、病毒感染以及基因 搶（biolistic)基因轉殖，亦可視需要選擇使用微脂粒 (liposomes)或高分子微粒（polymeric microparticles);細 胞成功轉殖基因後，接著被篩選出來以表現轉殖之基因，例如表 現AMPK抑制劑；然後，該成功轉殖基因之細胞以注入或植入方 式送回到對象體内。 本發明之目的進一步包含一種組裝產品，包含：一容器、一 13 1328613 有效量之AMPK抑制劑及一附於容器之說明，該說明指出提供ΑΜρκ 抑制劑用於治療已罹患神經退化疾病或存在發展成神經退化疾 病風險的對象。前述抑制劑可與醫藥可接受性之載體混合，係包 含：溶劑、分散媒介（dispersion medium)、包覆外衣（coating)、 抗細菌（antibacterial)及抗黴菌（antifungal)試劑、及等 滲透壓之延遲吸收試劑（absorption delaying agent)。 前述抑制劑可使用傳統方法製成不同施藥途徑的藥劑配方 令’例如·可製成膠囊、密封凝膠（gel seal)或口服錠劑中；膠 囊可包含任何醫藥可接受之材料，例如：明膠（gelatin)或纖 維素（cellulose);錠劑可依照傳統的程序配製，係藉由壓縮抑 制劑、固悲載體及潤滑劑而製成’固態載體包含，例如：殿粉 (starch)和糖膨潤土（sugar bentonite);該抑制劑亦可以一 含有黏結劑（binder )(例如：乳糖（iactose )或甘露醇 (mannitol))、傳統常用的填充物及製錠試劑（tabletingagent) 之硬设旋劑或膠囊形式施用。前述抑制劑可經由非腸胃途徑服 用，非腸胃藥劑形式包括，例如：水溶液、等張性生理食鹽水、 含5%葡萄糖之活性試劑、或其他習知醫藥可接受之賦形劑 (excipient )，環糊精（cyclodextrins)或其他本技術領域所熟 悉的助溶劑（solubilizing agent)可作為藥物賦形劑以運送治療 藥劑。此外，前述抑制劑可更進一步經由大腦手術直接注入紋狀 體。 抑制劑的功效可經由活體内和活體外（in vi tr〇)的方式評 估，例如：該抑制劑可在活體外測試其抑制ΑΜρκ基因表現或酵 素活性之能力；在活體内研究中，可將該抑制劑注射至一動物體 内（例如：一動物模型），並獲得其對神經退化疾病之功效。根據 前述結果，可決定適當的劑量範圍及藥物施用途徑。 前述ΑΜΡΚ抑制劑，例如CGS21680，可用於治療其他與ΑΜΡΚ 1328613 基因表現量或酵素活性異常高有關的疾病（例如，糖尿病或肥胖 症）。被處理對象也可選擇性地藉由前述方法或檢測對象樣本中 AMPK多胜肽基因表現或酵素活性來辨識；如果該對象樣本中的 AMPK多胜肽的基因表現或酵素活性程度較正常樣本高，則該對象 係為施予有效量之AMPK抑制劑治療的候選者。 下列實施例係僅用於說明本發明，非用於限制本說明書所揭 露之内容，任何熟習本技術領域的人士，皆可根據本說明書中揭 露之内容，進一步做任何可能的更動與潤飾以達到最大功效，所 有詳列於本說明書之著作係以全文引入作為參考資料。 實施例一 在本實施例中使用R6/2基因轉殖小鼠來研究CGS21680對 AMPK 的功效。來自 Jackson Laboratories(BarHarbor, Me, USA) 的雄性R6/2小鼠與同窩出生之控制組小鼠，與雌性控制組小鼠 (B6CBAFI//)交配。為確保其後代的CAG片段保持在約150個重 複長度，自鼠尾組織萃取基因組DNA ( genomic DNA)，並利用兩 段位於轉基因（transgene)上的引子（primer) (5’-ATGAAGGCCT TCGAG TCCCT CAAGT CCTTC-3’ ，及 5’-CTCAC GGTCG GTGCA GCGGC TCCTC AGC-3’）來進行 PCR 基因定性分析（PCR genotyping ) (Hogan # et al. (1994)In: Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, Ed 2. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory)。動物實驗係遵循台灣中央研究院動物保護 及利用委員會所認證的規範與步驟進行。 CGS21680 (Research Biochemicals, Natick, MA)溶解於含 1% DMS0的食鹽水溶液中，然後提供給小鼠。更具體而言，將16 隻7週大的R6/2小鼠分為兩組（每組8隻），然後分別從腹臈内 注射CGS21680(5pg/g體重）及同樣劑量之載體溶劑，每天注射一 15 1328613 次持續3. 5週。 之後，收集每隻老鼠的紋狀體組織細胞溶解碎片，並使用 Rutter等人在Biochem. J. 2003;375:1-16.中描述的標準西方 墨點法進行分析。更具體而言，膜碎片與包含125 mMTris-HCl(pH 6. 8)、20%甘油、1% SDS、15% 2-乙基硫醇（2-mercaptoethanol)、 200 mM二硫秀克糖醇（dithiothreitol)及0.01%溴盼藍 (bromphenol blue)的2X樣本緩衝液混合，並沸騰5分鐘；離心 移除不溶解的物質；並在8%分離凝膠上分離。在完成電泳分析之 後，將蛋白質轉移至聚乙二烯二氟薄膜上，以5%脫脂牛奶磷酸緩 衝液封鎖，並與抗AMPK抗血清（1:1〇〇〇，Abeam Limited, Cambridge, UK)或抗 AMPKP 抗血清（1:1〇〇〇，Cell Signaling Technology, Beverly，MA，USA)於 4°C 隔夜培養。之後以 PBS 清 洗三次，每次5分鐘；該薄膜自室溫下於過氧酵素-驢抗兔子免 疫球蛋白(peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit IgG)(l :5000，Amersham，UK)中培養1小時，然後以PBS清洗三 次。免疫反應帶使用非放射性發光方法（light emitting nonradioactive method)(ECL, Amersham，UK)顯現。AMPK 在 Thrl72 中的構酸化程度係使用 ImageQuant v. 3. 15(Moiecular dynamics)密度檢測儀檢測抗AMPK-P免疫反應帶來定量。使用相 同的方法檢測未提供CGS21680之外的其他同窩出生的野生型小 鼠。 結果發現三組小鼠的AMPK蛋白質量都大致相同，但僅提供 載體的R6/2小鼠的磷酸化程度（超過1〇〇%)高於控制組小鼠，顯 示高AMPK蛋白質磷酸化程度與顯性漢丁頓舞蹈症有關。並且， 提供CGS21680可顯著降低R6/2小鼠約35%的AMPK磷酸化程度。 因為AMPK磷酸化程度反應出其活化程度，此一結果顯示CGS21680 可以抑制AMPK的酵素活性。 1328613 實施例二 R6/2小鼠顯示受損的行動能力，包含類舞蹈動作、非自願的 僵硬動作、震顫及癲癇發作。在本實施例中研究CGS21680對R6/2 小鼠這些行動能力的影響。 兩組R6/2小鼠（每組8隻）依實施例一所述之相同方法，分別 持續5週提供CGS21680及載體溶劑。在每次供藥24小時後，如 文獻所述量測行動能力1〇分鐘（Lee et al. Chin. J.

PhysioU992;35:317-336)。簡言之，將動物置於一具有16x16水 平感測器之行動監視器中（Coulbourn Instrument, Allentown, PA， USA)’這些感測器係用於定位動物之平面位置，行動能力係藉由 每10分鐘於X-Y平面上記錄到的光束打斷之全部次數來量測。 結果顯示：在供藥2週後，僅供給載體的小鼠表現出典型的 行動能力退化。相對地，供給CGS21680的小鼠則未表現出這些 退化行為’並且行動能力受到改善。這些存在這兩組小鼠間的差 異具有統計學上的意義（根據Student’s t-test)»此一結果說明提供 CGS21680可改善R6/2小鼠的行動能力。 每隻老鼠的動作協調度可使用標準滚輪實驗（rotarod performace)來檢測。檢測結果沒有發現差異。R6/2老鼠的動作協 調度在其4週大時開始退化，比提供CGS21680的R6/2老鼠開始 退化的時間早了 3週。因此，預期在老鼠4週大之前提供 CGS21680可改善R6/2老鼠的動作協調能力。 實施例三 在本實施例中檢測CGS21680在神經化學上對R6/2小鼠的的 影響。漢丁頓舞蹈症的病人其神經化學物質會發生變化，例如含 膽驗（choline)的化合物及N-乙酿天門東酸（N-acetylaspartate， 17 1328613 NAA)。含膽鹼(choline)化合物的增加及NAA的減少與神經創傷 及軸索（axonal)官能退化或喪失有關。例如參考…以“ et &1， biochem. Pharmacol. 2002;64:67-77;及 jenkins et al，j Neur〇chem 2000;75:2108-2119。因此，可使用標準方法來檢測R6/2小鼠令的 含膽鹼化合物及NAA量。 兩組R6/2小鼠（母組6隻）分別依前述方法提供cgs21680及 載體浴劑’另一組包含6隻野生型同窩出生小鼠亦提供載體溶 劑。在供藥2週後’利用體内質子定位磁譜分析儀（iH_MRS)分析 小鼠的神經化學改變。 更具體而言’利用腹腔注射水合氯醛（chl〇ral hydrate)(4. 088毫克/10克體重）麻醉動物。MRS係在一具有500 us 内 6. 5G/cm 主動遮蔽梯度（active shielding gradient)之 動物體内顯像儀（Biospec 4.7T spectrometer)中進行。小鼠置 於一具有頭部固定器之俯臥位置，一 20公分鳥籠狀線圈用於提 供RF射頻電波刺激訊號，一直徑2cm之表面線圈直接置於頭部 上方以接收訊號，欲使用1H-MRS量測的紋狀體上方之欲測目標容 積（volume of interest, V0I)係依據冠切擴散加權影像（coronal diffusion-weighted image)來選擇，該冠切擴散加權影像係使 用脈衝梯度迴聲擴散方法（pulse gradient spin-echo diffusion inethod)，其重複時間（repet it ion t ime，TR)為 1500 毫秒，迴 聲時間（echo time，TE)為62毫秒，可見區3公分x 3公分， 切片厚度為1毫米，b值1300秒/平方毫米，平均數2，一 256 X 128矩陣零填滿至256 X 156。擴散敏感梯度在重調焦距脈衝 波（refocusing pulse)之前或之後應用於讀取X方向。使用連續 三次化學位移選擇性飽和（chemical shift selective saturation，CHESS)脈衝來抑水，然後使用點解析波譜（PRESS) 序列來定位3.5 X 3.5 X 3. 5立方毫米（_3)紋狀體波睹體積 1328613 像素（voxel) ’ 光譜寬（Spectrai width，sw) 4000 赫茲（Hz)， TR: 3_5秒（s)，TE: 136毫秒，平均訊號256，及全掃瞄時間 8分32秒。辨識NAA、膽驗（Choi ine)及肌if (Creatine)的波峰 區面積’統計分析紋狀體代謝物及膽鹼相對於肌酐之比率。 結果顯示：提供載體之R6/2小鼠的平均膽鹼/肌酐比率遠高 於野生型小鼠（1. 74 ± 0. 12相對於1. 25± 0. 05)。相反地，提供 CGS21680可改變升高的R6/2小鼠的膽鹼/肌酐比率（分別為1.74 ± 0. 12及1. 44 ± 〇. 〇8，p = 〇· 023)。當含膽鹼之化合物含量的 改變影響到細胞膜時’可能會改變細胞膜的電生理活性及相關的 訊號傳遞（Gopalakrishna et al.， J. Cell. Biochem. 2000;77:517-528 及 Shander et al.， J. Mol. Cell. Cardiol. 1996;28:743-753.)。更明確而言，R6/2小鼠在其電生理特性上 顯示出明顯的改變（Klapstein et al.， J Neurophysiol. 2001;86:2667-2677)。因此，前述結果顯示CGS21680可降低膽 鹼含量’使膽鹼含量與野生型小鼠相似，進而改變R6/2小鼠的 病理發展β 小鼠的ΝΑΑ含量可藉由1H-MRS檢測。提供載體溶劑的R6/2 小鼠其平均ΝΑΑ/肌酐比率遠低於野生型小鼠（0.67 ± 0.02相對 於1· 12 ± 0. 04) ’顯示R6/2小鼠存在顯著的神經傷害。然而， 提供CGS21680不會影響R6/2小鼠的ΝΑΑ/肌酐比率（未提供及提 供00521680小鼠之^八/肌酐比率分別為〇.67±0.02及0.69± 〇. 0 ’ ρ = 0. 691)。由於R6/2小鼠的ΝΑΑ含量在其4週大時開 始減少，在其7週時才開始提供CGS21680無法改變神經損害及 降低ΝΑΑ含量。因此，早期提供CGS21680C例如，4週大時）可能 可以增加ΝΑΑ含量。 實施例四 在本實施例中研究CGS21680紋狀體萎縮。紋狀體萎縮是漢 19 1328613 丁頓舞蹈症的主要特徵之一。在R6/2小鼠中，紋狀體顯著的萎 縮發展係在3至13週時發生（Ferrante et al.，J. Neurosci. 2000;20:4389-4397)。因此，檢測前述提供CGS21680及載體之 R6/2小鼠的紋狀體萎縮。 使用戊基巴比特魯納（sodium pentobarbital)(100微克/克） 深度麻醉動物，使溶於〇. 1莫耳濃度之磷酸鹽緩衝液（PB, pH7. 4) 之4%多聚甲搭（paraformaldehyde)灌注心臟，小心取出大腦， 以4%多聚甲醛/0.1莫耳濃度之pb後固定2-5小時，之後浸於 30%甘油（溶於〇. 1莫耳濃度pB)中，使用冷凍組織切片機（CM3050,

Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch，Germany)將組 織切成20微米厚度。從新紋狀體（neostriatum)頭端（rostral) 至前聯合（anterior commissure)(耳間（interaural) 5. 34mm/ 前囪（bregma) 1.54mm至耳間3. 7_/前囪〇.1_)連續冠切組織 切片以定義紋狀體萎縮及側腦室（laterai ventricle )之擴大 處。紋狀體及側腦室的所有區域皆使用NIH Image 1.62 Nissl 影像軟體來量測’並且GFAP染色之切片係藉由計算顯微攝影定 義區域内的相同種類細胞來定量，該顯微攝影照片係透過相位差 (phase contrast)顯微鏡拍攝。 提供CGS21680可減少12週大R6/2小鼠側腦室擴大處的大 小（提供載體溶液及CGS21680之R6/2小鼠分別為1.63 ±0.14及 0.91 ± 0.14 mm2，p < 0.001，„ = 5)。此一結果顯示提供 CGS21680 可改變漢丁頓舞蹈症的紋狀體萎縮。 實施例五 在本實施例中測試CGS21680對腺苷酸受體的效用。腺普酸 (Adenosine)是一種可調節不同生理功能的重要因子，包含四種 不同的腺苷酸受體次型（Αι、Αςα、An及A3)。以Ak-R腺苦酸受體 為例’ Au-R腺苷酸受體刺激可延遲人類嗜中性白血球的瑪亡，在 20 1328613 組織缺氧時增強細胞的存活能力。相關文獻可參考，例如，Walker et al., J. Immunol. 1997; 158:2926-2931; Jones et al., Neuroscience 1998;85:229-237; and Kobayashi et al., J. Biol,

Chem· 1999;274:20358-65.。此外，當 NGF 引起的 MAPK 下游蛋 白（cascade)表現受到抑制時，A2a-R刺激可恢復受到阻礙的NGF-誘發之神經發展。在中央神經系統中，A2A-R基因會在γ-氨基丁 酸紋狀體皮質神經（GABAergic striopal 1 idal neurons)中高度 · 表現，γ-氨基丁酸紋狀體皮質神經在漢丁頓舞蹈症病狀發展中會 選擇性退化（Glass etal.，Neuroscience 2000;97:505-519)。 紋狀體A2a-R之表現在HD病變過程中明顯降低，而此一現象可能 · 歸因於γ-氣基丁酸神經細胞之喪失（Sapp etal·，Neuroscience 1995:64: :397-4040)。因此，在本實驗中測試前述R6/2小鼠紋 狀體A2A-R的表現及功能，例如檢測腺苷酸環化酵素（adenylyl ’ cyalase)活性（Lai etal·，Mol. Pharmacol. 1999;56:644-650)。 以西方墨點法測試A2a-R的蛋白質表現量，步驟係如實施例 一所述。使用抗 Gsa 抗體（1:2000; DuPont New england Nuclear， Wilmington，DE，USA)及抗 AC5N(1:5000)抗體為一抗，其中抗 AC5N抗體會與包含第五型腺苷酸環化酵素（ACV，主要的紋狀體 AC)之1至240個胺基酸的重組蛋白質反應。 肇 檢測結果發現：R6/2小鼠的紋狀體A2a-R平均蛋白質量明顯 低於野生型小鼠，並發現R6/2小鼠的ACV表現量及短鏈（short form)Gsot蛋白質（GsaS)明顯降低。此發現與錦紫蘇（forskolin) 引起的腺苷酸環化酵素活性降低結果一致。相對地，R6/2小鼠中 長鏈（long form)Gsa蛋白質（GsaS)表現量上升，顯示伴隨大量表 現polyQ的突變Htt會分別調控不同訊號分子的表現。 腺苷酸環化酵素（Adenylyl cyclase，AC)活性係使用習知 檢測方法檢測（Chern et al· (1993) Mol. Pharmacol. 21 1328613 44:950-958)。簡述如下，先從小鼠身上取得紋狀體組織，然後 在水解緩衝液（0.4 mM EDTA，1 mM EGTA, 25 mM Tris-HCl，250 嚴糖，〇. 1 mM 留培丁（ leupeptin),及 40 μΜ PMSF，pH 7_ 4) 中以 W3-80 超音波震盈器（Ultrasonics Farmingadale，NY, USA) 震盪45秒，功率輸出設定為20%。然後以50, OOOg離心前述震盪 後的均質產物（homogenate) 30分鐘，並收集P1模碎片及溶解 部分。AC活性檢測係在37°C下與400微升之反應混合物作用10 分鐘，前述反應混合物包含1毫莫耳濃度（mM)之三磷酸腺苷 (ATP) ’ 1〇〇毫莫耳濃度氣化鈉（NaCl)，50毫莫耳濃度N-2-羥乙 基對二氮己瓖（Hepes)，0. 2毫莫耳濃度EGTA，0. 5毫莫耳濃度 3-異丁基-1-甲基黃嗓吟（3-isobutyl-l-methylxanthine)，6 毫 莫耳濃度氣化鎂（MgC12)，1微莫耳濃度（# M)鳥嘌呤三磷酸 (GTP)，及20微克（yg)之膜蛋白；並藉由加入0.6毫升（ml) 10% 三氣乙酸（TCA)來終止反應；cAMP以Dowex色層分析儀（Sigma, St. Louis, MO，USA)分離，並使用習知方法檢測（Chern et al. (1993) Mol· Pharmacol. 44:950-958)。酵素反應在3〇分鐘内與4〇微 升以内的膜蛋白呈現線性關係。 超出預期之外，測試結果發現：在R6/2小鼠中，CGS21680 所誘發的腺苷酸環化酵素活性遠高於野生型小鼠^相反地，在 R6/2小鼠中’由一般腺苷酸環化酵素活化劑錦紫蘇（sigma, St. Louis，M0)所誘發的腺苷酸環化酵素活性遠低於野生型小鼠。並 且’提供CGS21680給R6/2小鼠兩星期並不會明顯影響蛋白質表 現量或A2a-R活性，此結果說明緩慢提供CGS21680給R6/2小鼠 並不會使A2A-R失去敏感度。 前述結果顯示：雖然R6/2小鼠的a2a-R表現量降低了，但 刺激A2a-R可有效使cAMP含量提昇，使CAMP含量不低於野生型 小鼠。 22 1328613 實施例六 在漢丁頓舞蹈症病人及R6/2小鼠中都可發現血糖過高的現 象。因此，在本實施例中測試CGS21680對R6/2小鼠高血糖症狀 的影響。將前述R6/2小鼠及同窩出生的野生型小鼠斷頭，並使 用標準方法收集每隻小鼠的血液樣本（1至1.51)。使用ABBOTT Alcyon 300i(ABBOTT Labs，USA)測量血糖值。 檢測結果發現：未提供CGS21680的R6/2小鼠的血糖值比 野生型小鼠高出將近1倍，相反地，長期提供CGS21680可使R6/2 小鼠異常升高的血糖值降低至與野生型小鼠相近。此一結果顯示 CGS21680具有下列兩種功能：（1)可改善R6/2小鼠血糖調節及能 量代謝’及（2)可用於治療糖尿病或肥胖症。 其他實施態樣 在本說明書中所揭露的所有特徵都可能與其他方法結合，本 說明書中所揭露的每一個特徵都可能選擇性的以相同、相等或相 似目的特徵所取代’因此，除了特別顯著的特徵之外，所有的本 說明書所揭露的特徵僅是相等的基因序列或相似特徵中的一個 例子。 根據本說明書所揭露的内容，任何熟習本技術領域之人士 皆可基與本發明之特色’在不麟本發明精神與目的下，對本發 明做不同的更動與修飾’使其適用於不同的情況與對象，因此， 其他實施態樣也包含在本發明之申請專利範圍内。 23

Claims (1)

1. 驟 入、、A-^ or 申叫贼更)正本 種辨識用於減緩神料化疾病，包含下列步 使表現5，AMP 合物接觸；及 活化蛋白質激酶(AMPK)的第一細胞與一化 “ 活化蛋白質激酶的磷酸化程度或酵素活性； 产或酴il:前述第一細胞的5，amp活化蛋白質激酶磷酸化程 2^; 氐於以相同方法決定的第二細胞SIMP活化蛋白 化程度或酵素活性時，前述化合物係可狀為可有效 接觸？ 疾病之化合物，其中前述第二細胞未與前述化合物 接觸，4神經退化疾病係為漢丁頓舞蹈症。 二 2·如申5月專利範圍第1項所述之方法，其中前述第-細胞或第 細胞係為神經膠細胞或神經元細胞。 I 範圍第1項所述之方法，其中前述第-細胞或第二 、，田胞係存在非人類動物中。 4·如中請專利範圍第3項所述之方法，其中前述第—細胞或第二 細胞係為神經膠細胞或神經元細胞。 5. =請專利範圍第3項所述之方法，其中前述非人類動物係為 6. =申請專利範圍第5項所述之方法，其中前述老鼠係為咖 老鼠。 .如申請專利範圍第3項所述之方法，其中前述第一細胞或第二 細胞係存在於非人類動物之紋狀體中。 8·如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述第—細胞或第二 細胞係為神經膠細胞或神經元細胞。 9.^申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述非人類動物係為 老鼠。 1328613 10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中前述老鼠係為R6/2 老鼠。 11. 一種組裝產品，包含： 一容器； 一有效量之CGS21680 ;及 一附於容器之說明，其中該說明指出提供CGS21680係用 於減緩已罹患漢丁頓舞蹈症或存在發展成漢丁頓舞蹈症風險 的對象之症狀。 25