TWI312010B - A producing method of using control reactive temperature of a living catalyst of chemical compound - Google Patents

Description

1312010 9291 pifl 玖、發明說明： 發明領域 本發明是關於一種製造使用活體觸媒的化合物的方 法。 發明背景 囷胞(cell)、固定化囷胞（immobilized cell)或固定化酵 素（immobilized enzyme)等的活體觸媒（以下統稱活體觸媒） 係具有簡化反應流程、或減少副產物之產生以提高反應生 成物之純度、或是在穩定之反應條件下穩定地進行富含反 應性之物體的製造等優點。因此，近年來常被使用於大多 數之化合物的製造中。 然而，活體觸媒在反應中，會導致其觸媒活性之降低 (失去活性）。因此，爲了提高每單位觸媒量之化合物之生 成量，亦即觸媒之生產性（以後，統稱單位生產性），因而 對如何抑制失去活性的方法進行硏究。例如是，在從冰點 至攝氏15度的低溫下進行反應的方法（日本專利特公昭 56-381 18號公報）、從多個供應口連續提供低濃度之基質的 方法（日本專利特公昭57-1234號公報）、在有機溶劑中對 微生物或其處理物進行處理的方法（日本專利特開平 5-308980號公報）、在高級不飽和脂肪酸存在之下進行反應 的方法（日本專利特開平7-265090號公報）、以及菌胞以戊 二醛(glutaraldehyde)等進行架橋處理的方法（日本專利特 開平7-265091號公報、日本專利特開平8-154691號公報）等。 然而，使用上述方法僅僅能使觸媒之生產性變得充 1312010 9291 pifl 分，仍然無法降低化合物製造時之觸媒使用量’因而導致 化合物之製造原價仍然居高不下，且其處理方法中也存在 有廢觸媒過多的問題。 發明槪述 本發明之目的係提供一種在低成本下可以有效率 的、低環境負荷型的化合物製造方法，藉由有效率地使用 活體觸媒，已在提高觸媒之生產性的同時可以降低化合物 製造時之觸媒比例的費用，並減少其廢棄物。 本發明提出一種使用活體觸媒之化合物的製造方 法，其方法係在使用活體觸媒進行化合物之製造之際，爲 了抑制其失去活性，較佳係在低溫下進行反應。另外’本 發明者發現在此反應槽內之觸媒所流經之抽出觸媒側的反 應槽溫度高於添加觸媒側時，會提高觸媒之生產性’進而 進行深入硏究而得到本發明。另外’在反應爲發熱反應時’ 可以藉由減少反應槽之除熱量，而以操作上較爲經濟且容 易的方法達成本發明。 亦即，本發明具有下列特徵： (1) 一種化合物的製造方法，係適用於在兩個以上之複 數個反應槽內，對使用活體觸媒之化合物進行連續製造的 方法，活體觸媒係選自於微生物菌胞及其處理物等所組成 之族群，所製造之化合物包括醯胺化合物，此方法包括在 反應槽內或反應槽之間的抽出觸媒側反應溫度高於添加觸 媒側反應溫度。 (2) 如（1)所述之化合物的製造方法，其中在反應槽內或 1312010 9291 pifl 反應槽之間的抽出觸媒側反應溫度至少比添加觸媒側反應 溫度高攝氏1度以上。 (3) 如（1)所述之化合物的製造方法，其中在反應槽內或 反應槽之間的抽出觸媒側反應溫度至少比添加觸媒側反應 溫度高攝氏5度以上。 (4) 如（1)所述之化合物的製造方法’其中所製造之化合 物係選自於丙烯醯胺、煙醯胺、5_氰戊醯胺等所組成之族 群。 (5) 如（1)至(4)中任一項所述之化合物的製造方法，其 中在反應槽內之活體觸媒之流向係與反應液之流向並行流 動。 爲讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明 顯易懂，下文特舉較佳實施例作詳細說明如下： 較佳實施例之詳細說明 接著，對本發明進行詳細的說明。 本發明係適用於將使用活體觸媒之化合物於反應槽 中進行連續製造的方法。此將使用活體觸媒之化合物於反 應槽中進行連續製造的方法，對使用含有生化學反應器（酵 素反應器）及生物反應器（微生物反應器）的生化反應器 (bioreactor)的化合物製造方法而言，係使用攪拌槽型、固 定層型、流動層型、移動層型等種種形式的反應器進行操 作。此時，在反應槽內進行製造化合物的反應時’反應槽 可以爲1個也可以爲多個。當反應槽使用2個以上之個數 時，可以提高溫度控制或易於進行觸媒置換等之操作性， 1312010 9291 pif 1 並提高反應效率等。 在本發明中，所使用之活體觸媒係爲可反應得到目的 產物的觸媒，此觸媒包括含有酵素之動物細胞、植物細胞、 細胞小器官、菌胞（生菌胞或死菌胞）或其處理物。對處 理物而言，係包括從細胞所抽出之粗酵素或精製酵素、或 利用包括法、架橋法、擔體結合法等方法將動物細胞、植 物細胞、細胞小器官、菌胞（生菌胞或死菌胞）或酵素本 身固定化之物體。對活體觸媒所使用之菌胞而言，例如是， 如Rhodococcus rhodochrous、Pseudomonas chlororaphis 等 的微生物之菌胞、或是如由酵素或前述微生物所產生之腈 水化酶(nitril hydratase)。在此，包括法係爲將菌胞或酵素 包入高分子凝膠之細微的晶格中，並以半透膜性之高分子 皮膜覆蓋的方法。架橋法係爲將含有2個或2個以上的官能 基的酵素作爲測試藥品（多官能性架橋劑）的方法。擔體 結合法係爲在水不溶性之擔體上結合酵素的方法。用以固 定化的固定化擔體例如是玻璃氣泡珠（glass bead)、矽膠 (silica gel)、聚氨基甲酸酯(poly urthane)、聚丙稀醯胺(p〇iy acrylamide)、聚乙稀醇（poly vinyl alcohol)、角叉菜 (carrageenan)、炔竣酸（alkynecarboxylic acid)、瓊脂（agar)、 明膠(gelatin)等。 在對菌胞進行固定化的方法中，由於包括固定法所 到之固定化菌胞的菌胞濃度較高，因此在工業上，大多係、 使用此種方法。例如，使用丙烯醯胺(acrylamide)及/或汽稀 醯胺的衍生物作爲包括固定化用單體(monomer)，如同日φ 1312010 9291 pif 1 專利特公昭58-35078號公報或日本專利特開平7-203964號 公報所揭露之內容。本發明所製造之化合物並不限於在活 體觸媒之作用下所製造的化合物。例如，醇(alcohol)類或醯 胺（amide)類等泛用化學品、或氨基酸(amino acid)或抗生物 質•生理活性物質等的食品·化妝品•醫藥品或其原材料 或中間體等。較特別的是，對泛用化學品之製造而言，從 經濟性之觀點來看，係爲減少觸媒使用量之重要且不可或 缺的因素。因此，本發明較佳係於泛用化學品之活體觸媒 之下進行製造。具體而言，使用目前活體觸媒進行大量製 造時，較佳係爲屬於泛用化學品的醯胺化合物之製造。對 醯胺化合物而言，例如是丙稀醢胺、煙醯胺(nicotinamide)、 5-氰戊醯胺(5-cyanovaleramide)。 本發明之連續製造方法，係爲將原料化合物以連續的 或間斷的添加入反應槽內，且以連續的或間斷的方式抽出 反應液，以順利地將反應槽內之反應液之全量抽出的製造 方法。亦即，定期將所製造之反應液之全量抽出。而不是 意指所謂的間歇反應或半間歇反應（批次(batch)或半批次 (semi-batch)反應）。在使用本發明之活體觸媒的化合物進行 連續製造的反應樣式中’可考慮使用固定層、移動層、流 動層、攪拌槽等進行反應的樣式。在前述任何一種樣式中， 本發明所使用之反應槽可藉由裝備套管(jacket)、冷卻或加 熱旋管(coil)、外部循環冷卻裝置或外部循環加熱裝置等的 冷卻或加熱裝置，或是將反應器之全體或部分置入恆溫槽 內等的方法，進行冷卻或加熱。再者，也可以在反應槽之 1312010 9291 pif 1 間插入熱交換器。 在上述之樣式中’爲避免活體觸媒在任一情形下所發 生之過時的失去活性’因此活體觸媒必需在連續的或間斷 的加入反應槽內之同時’從反應槽內抽出。爲此，在連續 的製造方法中，活體觸媒保持有一定之流動，亦即發生從 上流側至下流側的流動。本發明之上流側係意指反應槽內 添加觸媒之一側，而下流側則意指與前述相反方向之抽出 觸媒的一側。 對反應之樣式進行具體的說明’在固定層之情形下， 所使用之多槽的固定層係以使用疑似移動層（使用旋轉 (merry-go-round)方式）爲前提，而在流動層或攪拌槽之情 形下，則以多槽連續的方式爲前提。此情形的上流側的反 應槽係爲多個反應槽中位於添加觸媒之一側的反應槽，而 下流側的反應槽則爲位於將觸媒從反應系統中抽出之一側 的反應槽。再者，當在1個反應槽內活體觸媒隨著反應液之 流動而移動之移動層的情形時，上流側係在所謂之反應槽 輸入口附近添加觸媒，而下流側則在所謂之反應槽輸出口 附近將觸媒從反應系統中抽出。而且，此時之移動層也包 括使用流通管形反應槽的反應樣式。 因此，在反應槽內之觸媒之流動的下流側反應溫度比 上流側反應溫度之一方高，此意指上述之觸媒在下流側之 反應溫度會比上流側之溫度高。具體而言，在使用多槽的 連續樣式中，多槽中之位於較下流側之位置的反應槽的溫 度高於位於較上流側之位置的反應槽的溫度。例如當使用4 1312010 9291 pif 1 槽的反應槽時，第4槽的反應槽溫度高於第1槽的反應槽溫 度。再者，當使用移動槽等的單槽的連續樣式時，靠近反 應槽出口之部分的溫度係高於靠近反應槽入口之部分的溫 度。在此，較高之反應溫度係指在量測範圍內確認至少高 出攝氏0.1度以上。爲使本發明可更有效果地進行，因此較 佳係爲至少高出攝氏1度以上，更佳係至少高出攝氏5度以 上。再者，反應溫度較佳係依據反應中所使用之觸媒的安 定性等進行適當地選擇。

在本發明中，觸媒之流動方向較佳係與反應液之流動 方向並行，觸媒之流動方向與反應液之流動方向並行係意 指反應液與觸媒之流動方向在同一方向上。其中，觸媒與 反應液在同一方向上流動，且反應係爲發熱反應的情形 時，則可以藉由對除熱量的調節而進行反應溫度的調節， 因此可以輕易地使觸媒在反應槽內流動之下流側反應溫度 高於上流側反應溫度。

以下藉由實例對本發明進行具體的說明。但，本發明 所提及之實例並不限定本發明之技術範圍。 實例1 (1)活體觸媒之調製 具有腈水化酶活性的Rhodococcus rhodochrous J1株 (受託號碼FERM BP-1478，於1987年9月18日寄託於獨立 行政法人產業技術總合硏究所特許生物寄託中心（曰本 國茨城縣市東1 丁目1番地1中央第6))係在含有葡萄糖 (glucose)2%、尿素 1%、胴（peptone)0.5%、酵母萃取物 11 1312010 9291 pif 1 (extract)0.3%、氯化鈷0.05% (全質量％)的培養環境 (pH7.0)中，於攝氏30度之下細心培養而得。再將前述產 物利用離心分離機及50mM磷酸緩衝液（pH7.0)，以得到已 集菌洗淨的菌胞懸浮混濁液（乾燥菌胞15質量％ )。

(2)從3-氰戊醯胺至煙醯胺的反應 內容積爲1L且附有套管的分離式燒瓶(separable flask) 以4槽直線排列之方式相連結。在第1號槽內，以20〇ml/hr 之流速連續添加溶解有15 %之3-氰戊醯胺的50mM之磷酸 緩衝液（PH8)，及以0.3ml/hr之流速連續添加菌胞懸浮混濁 液，並於添加之同時進行攪拌。此時，第1號槽至第4號槽 的反應槽之溫度分別利用套管之冷卻水（攝氏20度）將反 應溫度控制在攝氏30度、攝氏30度、攝氏32度、攝氏35度， 以進行反應。 3曰之後，將從第4號槽所流出之反應液，利用液體色

層分析法（chromatography)(試管（column) : ODS-80A (GL

科學公司製），溶解分離液：5 %乙腈(acetonitrile)，1 OmM 磷酸緩衝液（pH7)，檢測：200nm)進行分析，沒有檢測 出3-氰戊醯胺，而可檢測出17%左右的煙醯胺。 比較例1 使用由實例1所作成之菌胞懸浮混濁液’除了將4槽之 全部反應溫度變更成攝氏30度之外，其餘皆與實例1相同。 3日之後，同樣將從第4號槽所流出之反應液’利用液 體色層分析法進行分析，檢測出所生成的煙醯胺爲16%左 右，以及檢測出爲反應之3-氰戊醯胺爲1%左右。 12 1312010 9291 pifl 比較例2 使用由實例1所作成之菌胞懸浮混濁液，除了將4槽之 全部反應溫度變更成攝氏35度之外，其餘皆與實例1相同。 3日之後，同樣將從第4號槽所流出之反應液’利用、液 體色層分析法進行分析，檢測出所生成的煙醯胺爲15%左 右，以及檢測出爲反應之3-氰戊醯胺爲2%左右。 實例2

(1)活體觸媒之調製 具有腈水化酶活性的Pseudomonas chlororaphis B23

(受託號碼FERM BP-187，於1981年11月16日寄託於獨立 行政法人產業技術總合硏究所特許生物寄託中心（曰本 國茨城縣市東1 丁目1番地1中央第6))係在含有蔗糖 (811(^〇86)1.0%、甲基丙稀腈(11^113(^1〇1^1416)0.5%、胴0.3 %、磷酸2氫1鉀0.1%、磷酸1氫2鉀0.1%、硫酸鎂0.1%、 酵母萃取物0.3%、硫酸第一鐵0.001% (全質量％ )的培養 環境（pH7.5)中，於攝氏25度之下細心培養而得。再將前 述產物利用50mM磷酸緩衝液（pH7.0)洗淨，以得到菌胞 懸浮混濁液（乾燥菌胞12質量％)。 另一方面將丙烯醯胺、亞甲基-Ν,Ν’-雙丙烯醯胺 (]^,1''1'-11161；11716116-1)丨8-3(^)^111丨(16)及2-二甲胺基丙基甲基丙 嫌醯胺（2-dimethylamino propyl methacrylamide)分別以 30 質量％、1質量％、4質量％的比例調製成單體混合水溶液。 接著，將菌胞懸浮混濁液、單體水溶液、10質量％之 Ν,Ν,Ν’,Ν，-四甲基乙二胺（N,N，N，,N，-tetramethylethylene 13 1312010 9291 pif 1 diamine)水溶液、及10質量％之過硫酸銨水溶液分別以 5L/hi·、2 L/hf、〇_l L/hi·、〇·ι L/hr 的流速進行線性混合(line mixing)之聚合之後，得到截斷成lmm見方的粒子的固定化 菌胞粒子。此固定化菌胞粒子通過流動化之50mM磷酸緩衝 液（pH7.0)洗淨，而形成固定化菌胞觸媒（本觸媒中，乾 燥菌胞質量爲8%左右）。 (2)藉由固定化觸媒進行從丙烯腈（acrylonitrile)至丙 烯醯胺的反應 在與實例1相同之裝置中，於來自各反應槽之反應液 出口處安裝金屬網，以防止來自各反應層之固定化菌胞觸 媒流出。在各反應層中，添加50g之固定化菌胞觸媒。在第 1號槽中，以155ml/hr·之流速連續添加50mM磷酸緩衝液 (pH7)及以25g/hr之流速連續添加丙烯腈。在第2號槽中， 僅以20g/hr之流速連續添加丙烯腈。同時，於各槽中進行攪 拌。此時，第1號槽至第4號槽的反應槽之溫度分別利用套 管之冷卻水（攝氏5度）將反應溫度控制在攝氏1〇度、攝氏 10度、攝氏12度、攝氏15度’以進行反應。接著，一曰一 次，爲達到置換反應槽內之觸媒的目的，因此從第4號槽之 金屬網上抽出觸媒6g。再者’藉著分別從第3號槽抽出6g觸 媒至第4號槽、從第2號槽抽出6g觸媒至第3號槽、從第1號 槽抽出6g觸媒至第2號槽，以及在第1號槽中追加6g觸媒等 的動作，以連續進行丙烯醯胺製造反應。 將從第4號槽所流出之反應液，一日一次地利用氣體 色層分析法（試管：PraPak-PS ( Waters公司製）’ lm ’攝 1312010 9291 pif 1 氏180度，負載氣體（carrier gas):氮氣’檢測器：HD)進 行分析。在大約3個月的運轉中，僅檢測出30%之丙嫌酿 胺，而未檢測出未反應之丙烯腈。 比較例3 使用由實例2所作成之固定化菌胞觸媒，除了將4槽之 全部反應溫度變更成攝氏1〇度之外，其餘皆與實例2相同。

從第1.5個月開始，從第4號槽所流出之反應液開始殘 留未反應之丙烯腈，丙烯醯胺製品的品質開始降低。然， 當觸媒之添加抽取量變更爲一日8g時，則不會檢測出未反 應之丙烯腈。 產業上之利用性 藉由本發明’可以輕易地減少化合物製造時之活體觸 媒之使用量。此結果顯示，可以降低化合物製造時之觸媒 比例費用，並減少廢棄物。亦即，可於低成本之情形下， 提供有效率的、低環境負擔型的化合物製造方法。

在本說明書中所引用之全部刊物，其內容之全部係引 用於本說明書中。再者，雖然本發明已以較佳實施例揭露 如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在 不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤 飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界 定者爲準。 15

Claims (1)

13120¾¾ 91108316號cj·^：専刊範園無隱槐條y本 修正日期:97年3月4日 於年入月午日修(声)正本 丨公告本 拾、申請^翩* 1. 一種化合物的製造方法，係適用於在兩個以上之複 數個反應槽內，對使用一活體觸媒之一化合物進行連續製 造的方法，該活體觸媒係選自於微生物菌胞及其處理物所 組成之族群，所製造之該化合物包括醯胺化合物，該方法 包括：

在反應槽內或反應槽之間的一抽出觸媒側反應溫度 高於一添加觸媒側反應溫度，其中在反應槽內或反應槽之 間的該抽出觸媒側反應溫度至少比該添加觸媒側反應溫度 高攝氏5度以上。 2. 如申請專利範圍第1項所述之化合物的製造方法，其 中所製造之該化合物係選自於丙烯醯胺、煙醯胺、5-氰戊 醯胺等所組成之族群。 3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之化合物的製造 方法，其中在反應槽內之該活體觸媒之流向係與一反應液 之流向並行流動。

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