TWI307278B - Mixtures of polysaccharides derived from heparin, their preparation and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Description

1307278 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明有關一種自肝素衍生之多醣混合物、其製備方法 及含有彼等之醫藥組合物。 肝素係爲動物經硫故化黏多醋之混合物，特別可使甩其 抗凝血及抗血栓性質。’ 然而，肝素具有限制其使用條件之缺點。尤其，其高度 抗凝血活性（抗-Ila活性）會導致出血。

Ip 已有人提出藉肝素酯之鹼性解聚合所得之低分子量肝素 (EP40144);然而，此等產物仍具有高度抗_Ha活性。 本發明有關一種自肝素衍生之多醣混合物，對於活性因 子X(因子Xa)及活性因子π(因子na)具有高於肝素之選擇性 活性。 本發明之目的尤其爲一種經硫酸化之多醣混合物，具有 肝素之組成多醣的一般結構，且具有以下特徵： -具有1500至3000道耳呑之平均分子量，抗_Xa活性爲1〇〇 至150 IU/毫克’抗-na活性爲〇至1〇出/毫克，而抗_Xa活性/ φ 抗-Ila活性比例高於1〇， -該混合物之組份多醣含有2至26醣單元，且於其末端中之 一具有4，5 -不飽和葡糖趁酸2 - 〇 _藏酸醋單元， 其爲鹼金屬或鹼土金屬鹽形式。 就驗金屬或鹼土金屬鹽形式而言，以鈉 '鉀、鈣及鎂鹽 爲佳。 該平均分子量係使用兩串聯管柱，例如市售商標TSK G3 000 XL及TSK G2000 XL.藉高壓液體層析測定。該偵測 係藉繞射進行。所使用之溶離劑係爲硝酸鋰，流速係爲〇. 6 -4 - 本紙張尺度適用中a國家標準(CNS) A4规格(210X297公藿)

袭 訂

1307278 A7 B7 五、發明説明（2 ) 毫升/分鐘。該系統使用藉伊諾沙帕林（enoxaparin) (AVENTIS)分餾製備之標準物藉著於瓊脂-聚丙烯醯胺凝膠 (IBF)上層析而校正。此種製備係根據Barrowcliffe等人之 Thromb.Res.，12，27-36(1977-78)或 D_A.Lane等人之Thromb. Res.，12，257-271(1977-78)所述之技術進行。結果使用 GPC6軟體（Perkin Elmer)計算。 _ 該抗-Xa 活性係使用 Teien 等人之 Thromb.Res., 10，399-410 (1977)所述之醯胺分解方法於發色基質上測量，使用第一種 内部標準物作爲低分子量肝素之標準物。 該抗-Ila活性係使用Anderson L.O.等人於Thromb. Res.， 15, 53 1 -54 1 (1979)所述之技術測量，以第一種内部標準物作 爲低分子量肝素之標準物。 前述混合物以具有介於125及150 IU/毫克之間的抗-Xa活 性爲佳。 前述混合物以具有介於140及150 IU/毫克間之抗-Xa活性 >，且具有介於2000及3000道耳吞之間的平均分子量最佳。 本發明混合物以具有0至5 IU/毫克之抗-Ila活性爲佳。 該混合物具有大於25之抗-Xa活性/抗-Ila活性比例更佳。 本發明寡醋之混合物可藉著肝素之苄酷的四級按鹽於有 機介質中，i使用pka大於20之強有機驗或咪唆納進行解聚， 將經解聚之肝素之芊酯的四級銨鹽轉化成鈉鹽，將該酯皂 化，視情況進行純化而製備。 肝素之+醋的四級銨鹽以节乙氧按 '十六基，比咬錯或十 六基三甲基銨鹽。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1307278 A7 B7 五、發明説明（3 ) 該解聚通常係於惰性有機溶劑諸如經氯化溶劑（例如二氣 甲烷）、四氫呋喃、苯甲醚中，於-2(TC至40X：之溫度下進 行。 pka大於20之強有機鹼可使用1，5,7-三氮雜-二環[4.4.0]癸-5-烯、2-第三丁基亞胺基-2-二乙胺基- i，3-二甲基全氫_ 1，3,2_二氮雜磷素（phosphorine)，胍及磷腈（phosphazenes) 族之驗。 胍族之鹼以具有下式爲佳： /R1

R4 R3 其中R,係爲氫或烷基，R2、R3、114及R5係相同或相異，各 表示烷基。 尤其R,係爲氫，且R2、R3、114及115係爲甲基。 磷腈族之強有機驗係根據例如R.Schwesinger等人， Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 26, 1167-1 169 (1987), R. Schwesinger 等人，Angew. Chem. 105, 1420(1993)所定義。 磷腈族之鹼中，以使用具有下式者爲佳：

其中心至!^相同或相異，且表示烷基。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐) 1307278 A7 ___B7 五、發明説明（4 ) " '~' -- 前述通式中，該燒基含有1至6個 β主6個碳原子，且爲直鏈或分 枝鏈形式。 具有大於20之pka的強有機驗或咪唆鈉/肝素爷醋之四級按 鹽的莫耳比介於0.2及5之間爲佳，介於之間較佳。 肝素苄酯之四級銨鹽的酯化程度尤其是介於5〇及ι〇〇百分 比之間，以介於70及90百分比之間較佳。此種醋化程度係 對應於肝素之糖酸酸的酯度莫耳百分比。 經解聚之肝f的爷西旨之四，級按鹽轉化成納鹽通常係藉著 使用乙酸鈉之醇溶液處理該反應介質而進行，使用ι〇百分 比乙酸鈉於曱醇中之溶液（重量/體積）爲佳，溫度介於15及 25 C <間。乙酸鹽之添加重量當量以較該解聚反應中所使 用之肝素之苄酯的四級銨鹽質量大3倍爲佳。 該皂化通常係藉鹼金屬氫氧化物諸如氫氧化鈉、氫氧化 鉀或氫氧化鋰，於含水介質中，於介於〇及2(rc間之溫度， 較佳介於0及l〇°C間進行爲佳。通常使用！至5莫耳當量之鹼 金屬氫氧化物。該皀化以於2至3莫耳當量之龄金屬氫氧化 物存在下進行爲佳。 最終產物可視情況藉任何已知用以純化經解聚肝素之方 法而純化，尤其是根據專利EP 00373 19所描述之方法。該 純化較佳係藉過氧化氫於含水介質中於1 〇至5crc溫度下進 行。該操作以於介於20及4CTC間進行爲佳。 肝素芊酯之四級銨鹽可根據以下反應流程圖製備： a)藉氣化芊乙氧銨將鈉鹽形式之肝素轉化，以得到肝素芊 乙氧按， 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1307278 _ Α7 " -------- Β7 五、發明説明（5 ) b)前述笮乙氧銨鹽藉苄基氣酯化，使用乙酸鈉之醇溶液處 里’以4于到肝素之爷酉旨的鈉鹽， ο肝素之苄酯的鈉鹽進行鹽基轉移成爲四級銨鹽，以成爲 乙氧錄、十六基吡啶鑌或十六基三甲基銨鹽爲佳。 步驟a)i反應係於含水介質中，在15至25。〇之溫度範圍内 ，藉由過量之氣化苄乙氧銨作用於鈉鹽形式之肝素上而進 丨·仃。氯化苄乙氧銨/鈉鹽形式肝素莫耳比以介於2及3之間爲 佳，尤其是2.5。 所使用之鈉鹽形式起始肝素以豬隻肝素爲佳。後者可根 據專利FR2663639所述之方法預先純化，以降低其硫酸皮膚 素濃度。 步驟b)之酯化較佳係於經氯化有機溶劑（例如氯仿或二氣 甲烷）中，於介於25及45。(：間之溫度下進行，以介於3〇及4〇 力之間爲佳。鈉鹽形式之酯隨之藉乙酸鈉於醇諸如曱醇中 在10百分比重量/體積下沉澱而回收3⑹分體積反應介質通 «常使用m2份體積之醇。爷基氯之量及反應時間係調整 至得到介於50及100百分比間之酯度程度，以介於兀及卯百 分比之間爲佳。1重量份數之肝素苄乙氧銨鹽使用〇5至15 重量份數之卞基氣爲佳。相同地，反應時間以介於1〇及35 小時之間爲佳。 步驟c)之鹽基轉移係藉氣化四級銨，以氣化；乙氧銨、氣 化十六基吹症錄或氣化十六基三甲基銨爲佳，於含水介質 中，於介於丨0及25。〇間之溫度下進行。該氣化四級=銨/肝素 之芊酯的鈉鹽莫耳比以介於2及3之間爲佳。 本紙伕尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐〉 -8- 1307278 A7 B7 五、發明説明（6 ) 本發明之鈉鹽形式混合物可轉化成驗金屬或鹼土金屬鹽 之另一種鹽。由一種鹽變成另一種鹽的路徑係視情況使用 專利US4168377所述之方法達成。 本發明混合物非毒性，因此可作爲醫藥。 本發明混合物可作爲抗血栓劑。尤其可用以預防靜脈血 栓、動脈血栓發作，尤其是心肌梗塞。亦可用以預防及治 φ 療平滑肌細胞之增殖、血管生成，及作爲供動脈粥樣硬化 及供動脈硬化使用之神經保護劑。 本發明亦有關一種醫藥組合物，含有本發明多醣混合物 以作爲活性成份，視情況組合一或多種惰性賦形劑。 該醫藥組合物係爲例如溶液，可藉皮下或靜脈内路徑注 射。其亦可使用於肺路徑（吸入）。 該劑量可視患者之年齡、重量及健康狀態而決定。就成 人而言，通常藉肌内或皮下路徑每日使用20及100毫克之 間。_ 0 以下實施例係用以説明本發明。 實施例A:肝素之芊酯的苄乙氧銨鹽之製備 肝素苄乙氧銨 25克氣化苄乙氧銨於125毫升水中之溶液係於20°C附近之 溫度下，添加於10克鈉鹽形式肝素於100毫升水中之溶液中 。遽出產物，以水洗滌’並乾燥。 肝素之苄酯（鈉鹽） 16毫升苄基氣添加於20克肝素苄乙氧按於80毫升二氣甲 烷中之溶液中。該溶液於3 〇°c溫度下加熱12小時。添加1 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公爱） 1307278 A7

毫升乙酸納於甲醇中之10百分比溶液，過遽該混合物，以 Π洗擦，並乾燥。因此得到7.6克肝素宇醋之納鹽形式， 其酯化程度係爲77百分比。 肝素之苄酯（苄乙氧銨鹽）

J克（0.0549莫彳）肝素爷醋（鈉鹽）及⑽毫升蒸銷水導入2 公升廣口燒瓶A中。於約赃之溫度下均質化之後，得到淡 黃色溶液。在磁性攪拌下…公升廣口繞瓶B中製備— 克（0.U38莫耳）氣化爷乙氧銨與45〇毫升水之溶液。廣口燒 瓶B中〈落敗使用約35分鐘在授拌下倒入廣口燒瓶a中之溶 液I。發現形成大量白色沉澱物。該廣口燒瓶B使用2〇〇毫 升崧餾水淋洗，洗滌濾導入該廣口燒瓶A中。停止攪拌，懸 :敗沉降12小時。移除且丟棄上清液之澄清部分。添加％。 尾升水於所沉降之沉澱（漿液外觀）中，混合物攪拌2〇分鐘。 使沉澱物再沉降約30分鐘。取出上清液並丟棄（56〇毫升）。 使用约5 6 0毫升蒸餾水之洗滌操作於所沉降之沉澱上重複兩 次。最後一次洗滌操作中，沉澱物保留於懸浮液中，過濾 於燒結玻璃3上。濾渣使用200毫升蒸餾水洗滌4次。將潮濕 白色固體中之水份排乾’於減壓下（2 7仟帕司卡）於約6<rc 溫度下乾燥。乾燥12小時之後，得到87 5克肝素之苄酯， 苄乙氧銨鹽。所得產率係爲94.9百分比。 實施例1 解聚及轉化成鈉鹽： 2 8宅升—氯曱坑導入5 〇毫升廣口燒瓶a中。於撥拌下緩緩 置入4克（0.00238莫耳）如實施例A所述般製得之肝素苄酯（酯 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1307278 A7 B7 五、發明説明（8 ) 化程度：77百分比，芊乙氧銨鹽）。完全溶解之後，添加 1.32 克（0.00948莫耳）l，5,7-三氮雜二環[4.4.0]十一碳-5-烯 3 混合物於約20°C之溫度下攪拌3小時3 0分鐘。此期間，於4 °C下於廣口燒瓶B中製備在120毫升曱醇中有12克乙酸鈉的 溶液。廣口燒瓶A中之反應混合物於磁石攪拌下倒入乙酸鈉 之曱醇溶液中。出現實際上半透明之膠狀黃色沉澱。停止 A 擾拌，'懸浮液沉降一小時以進行分離。取出上清液之澄清 部分並丢棄（62毫升）。50毫升甲醇添加於所沉降之沉澱物 (黃色漿狀）’混合物攪拌20分鐘。沉澱物再沉降3 〇分鐘。取 出上清液並丟棄（49毫升）。添加50毫升甲醇於所沉降之沉濺 中’混合物攪拌20分鐘。懸浮液中之沉澱物過濾於燒結玻 璃4上。所得之金黃色濾渣使用25毫升曱醇洗滌兩次。排乾 潮濕固體之水分’之後於減壓下（2,7仟帕司卡）於約6(TC溫度 下乾燥。乾燥1 2小時之後，得到1.21克經解聚之肝素（芊酯 ’鈉-鹽）。所得產率爲77.2百分比。 ψ tit 1.21克（0.00 18莫耳）前述所得之經解聚肝素（苄酯，鈉鹽） 及U耄升水導入25毫升廣口燒瓶中。於磁性攪拌下導入 〇.丨8毫升（〇.〇〇18莫耳）30百分比苛性蘇打。添加之後，該混 合物冷卻至4。(：，攪拌2小時。添加1.43克NaCl，溶液藉著 添加1莫耳/公升之HC1 (14毫升）而中和。該混合物移至1〇〇 毫升廣口燒瓶中，添加52毫升曱醇。得到黃色沉澱。停止 攪拌，懸浮液於約20°C之溫度下沉降丨2小時。取出上清液 ，之後丟棄（44毫升卜添加25毫升甲醇於所沉降之沉澱（黃 -11 - 本紙張尺度it财@目家料(CNS) A4規格(21G x 297公爱) -------- 1307278 A7 B7 五、發明説明（9 )

色漿狀）’混合物攪拌20分鐘。沉澱物再沉降約3 〇分鐘。取 出上清液並丟棄（2 1毫升）。添加25毫升甲醇於所沉降之沉澱 物中，混合物擾拌20分鐘。懸浮液中之沉澱物隨之於燒結 玻璃3上過濾。所得之濾渣使用丨〇毫升甲醇洗滌兩次。排乾 潮濕固體之水分，於減壓下（2.7仟帕司卡）於約6(TC之溫度 下乾燥。乾燥1 2小時之後，得到〇 66克粗製經解聚肝素（鈉 i 鹽）。所得產率爲60百分比D <9 純化： 0.66克前文所得之粗製經解聚肝素及5 9毫升蒸餾水導入 1 〇毫升廣口燒瓶中。該混合物於磁性授拌下加熱至40°c。 藉著添加0· 1莫耳/升之氫氧化鈉以將pH調至9與丨〇之間，添 加33微升30百分比過氧化氫水溶液。攪拌約2小時之後，添 加0.65克氣化鈉。混合物藉著添加〇1毫升/升之HC1而中和 。過濾該溶液，並移至25毫升廣口燒瓶中。倒入23.3毫升 甲醇_。發現形成白色沉澱。停止攪拌，懸浮液於約2〇。匸之 Φ 溫度下沉降12小時。取出上清液並丢棄（5毫升）。添加5毫升 甲醇於所沉降之沉澱物（漿狀）中，混合物攪拌2〇分鐘。沉澱 再沉降約30分鐘。取出上清液並丟棄（5毫升）。添加5毫升甲 醇於所沉降之沉澱物中，混合物攪拌2〇分鐘。懸浮液中之 沉澱物過濾於燒結玻璃3上。所得之白色濾渣使用5毫升甲 醇洗滌兩次。將潮濕固體之水分排乾，於減壓下（2 7仟帕司 卡）約60 C之溫度下乾燥。乾燥η小時之後，得到〇 5丨克經 純化之多醣（鈉鹽）混合物。所得產率爲77 2百分比。 該混合物之特徵如下： -12-

1307278 發明説明（10 平均分子量：1600道耳吞 抗-Xa活性：94 IU/毫克 抗-Ila活性：<0.1 IU/毫克 抗-Xa活性/抗-Ila活性tl：例：>ι〇〇 實施例2 解聚及轉化成鈉鹽： 丨_ 70耄升二氣曱烷導入10〇毫升廣口燒瓶A中。於攪拌下緩 緩置入10克（0.00595莫耳）如實施例a所述般製得之肝素苄酯 (酯化程度：77百分比，苄乙氧銨鹽^完全溶解之後，添加 1.7¾升（0.0〇587莫耳）2_第三丁基亞胺基_2·二乙胺基^，^二 曱基全氫-1，3，2 -一氮雜鱗素。反應於約2〇。〇之溫度下持續約 3小時30分鐘。此期間，於4。(：下於廣口燒瓶B中製備3〇克乙 酸鈉在300毫升甲醇中的溶液。廣口燒瓶A中之反應混合物 於磁石攪拌下倒入乙酸鈉之甲醇溶液中a出現實際上半透 明之膠狀黃色沉澱。停止攪拌，懸浮液沉降一小時以進行 W 分離。取出上清液之澄清部分並丟棄（204毫升）。將丨25毫升 曱醇添加於所沉降之沉澱物（黃色漿狀），混合物擾拌2〇分鐘 。沉藏物再沉降約3 0分鐘。取出上清液並丟棄（162毫升）。 添加125毫升曱醇於所沉降之沉澱中，混合物擾拌2〇分鐘。 懸浮液中之沉澱物過濾於燒結玻璃3上。所得之黃色膠狀虞 渣使用兩份63毫升曱醇洗滌。排乾潮濕固體之水分，之後 於減壓下（2.7仟帕司卡）於約60Ό溫度下乾燥。乾燥12小時 之後，得到3.34克經解聚之肝素（节酯，鈉鹽）3所得產率爲 85.3百分比。 -13- 本紙張尺度適用中國固家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）

裝 訂

線 1307278 A7 B7 五、發明説明（11 皀化： 1 ·67克前述所得之經解聚肝素（苄酯，鈉鹽）根據實施例1 所述之包化方法進行皂化。得到〇 94克淡黃色粉末。粗製 經解聚肝素（鈉鹽）之產率爲61百分比。 純化： 0.94克前文所得之粗製經解聚肝素（鈉鹽）根據實施例1所 φ 述之純化方法進行純化。得到0.71克白色粉末。產率爲75.5 百分比。 所得之經純化多醣（鈉鹽）混合物具有以下特徵： 平均分子量：2500道耳吞 抗-Xa活性：146.6IU/毫克 抗-Ila活性：2.15 IU/毫克 抗-Xa活性/抗-Ila活性比例：68 實施例3 解聚及轉化成鈉鹽： 丨· 28毫升二氣甲烷導入50毫升廣口燒瓶A中。於攪拌下緩緩 置入4克（0.0023 8莫耳）如實施例A所述般製得之肝素芊酯（醋 化程度：77百分比，芊乙氧銨鹽）。完全溶解且冷卻至2r之 後，添加0.333克（0.00239莫耳）1，5,7-三氮雜二環[4.4.0]癸· 5-烯。反應於約20°C之溫度下持續約3小時30分鐘。此期間 ，於4°C下於廣口燒瓶B中製備在120毫升甲醇中有12克乙酸 鈉的溶液。廣口燒瓶A中之反應混合物於磁石擾拌下倒入乙 酸鈉之甲醇溶液中。出現黃色沉澱。停止檀拌，懸浮液沉 降一小時以進行分離。取出上清液之澄清部分並丟棄（9〇毫 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1307278 A7 !______ B7____ 五、發明説明（12 ) 升）°將50宅升甲醇添加於所沉降之沉澱物（黃色漿狀），混 合物撥拌20分鐘。沉澱物再沉降約30分鐘。取出上清液並 丢棄（61毫升）。添加5〇毫升甲醇於所沉降之沉澱中，混合物 擾掉20分鐘。懸浮液中·之沉澱物過濾於燒結玻璃4上。所得 <黃色膠狀渡渣使用25毫升曱醇洗滌兩次。排乾潮濕固體 疋水分’之後於減壓下（27仟帕司卡）於約6〇r溫度下乾燥 φ 。乾燥12小時之後，得到1.19克經解聚之肝素（；酯，鈉鹽） 。該固體爲暗黃色。所得產率爲75 9百分比。 皂化： 1·19克前述所得之經解聚肝素（苄酯，鈉鹽）根據實施例1 所述之皂化方法進行皂化。得到0 78克淡黃色粉末。粗製 經解聚肝素（鈉鹽）之產率爲71.5百分比。 純化： 0.78克前文所得之粗製經解聚肝素（鈉鹽）根據實施例1所 述之純化方法進行純化。得到〇 58克白色粉末。產率爲72 5 # 百分比3 所得之經純化多醣（鈉鹽）混合物具有以下特徵： 平均分子量：2700道耳吞 抗-Xa活性：loo.i ιυ/毫克 抗-Ila活性：3.3 IU/毫克 抗-Xa活性/抗_na活性比例：27.3 實施例4 解聚及轉化成鈉鹽： 28毫升二氣甲烷導入5〇毫升廣口燒瓶a中。於攪拌下緩緩 -15 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1307278 A7 ________B7 五、發明説明（13 ) 置入4克（0.00238莫耳）如實施例A所述般製得之肝素苄酯（酯 化程度：77百分比，苄乙氧銨鹽）。完全溶解之後，於2。〇下 添加0.6毫升（0.00222莫耳）2-第三丁基亞胺基-三（二甲胺基） 嶙燒。反應於約0°C之溫度下持續約3小時30分鐘。此期間 ’於4°C下於廣口燒瓶B中製備在120毫升甲醇中有12克乙酸 納的溶液。廣口燒瓶A中之反應混合物於磁石攪拌下倒入乙 φ 酸鈉之甲醇溶液中。出現實際上半透明之膠狀黃色沉澱。 停止擾拌，懸浮液沉降一小時以進行分離。取出上清液之 澄清部分並丟棄（108毫升）。將50毫升曱醇添加於所沉降之 沉澱物（帶黃色漿狀），混合物攪拌2〇分鐘。沉澱物再沉降約 30分鐘。取出上清液並丟棄（60毫升）。添加5〇毫升甲醇於所 沉降之沉澱中，混合物攪拌20分鐘。懸浮液中之沉澱物過 遽於燒結玻璃4上。所得之黃色膠狀遽;查使用2 5毫升甲醇洗 滌兩次。排乾潮濕固體之水分，之後於減壓下（2.7什帕司 卡）於約60°C溫度下乾燥》乾燥12小時之後，得到1.22克經 # 解聚之肝素（苄酯，鈉鹽）。所得產率爲77.8百分比。 皀化： 1.22克前述所得之經解聚肝素（苄酯，鈉鹽）根據實施例I 所述之皂化方法進行皂化。得到0.69克淡黃色粉末。粗製 經解聚肝素（鈉鹽）之產率爲61.6百分比。 純化： 0.69克前文所得之粗製經解聚肝素（鈉鹽）根據實施例1所 述之純化方法進行純化。得到〇. 6 7克白色粉末。產率爲9 7. 1 百分比。 -16 - 本紙張尺度適用中画國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐) 1307278 A7 B7

五、發明説明（U )

所得之經純化多醣（鈉鹽）混合物具有以下特徵： 平均分子量：2900道耳呑 抗-Xa活性：145.2 IU/毫克 抗-Ila活性：4.5 IU/毫克 抗-Xa活性/抗-Ila活性比例：32.6 實施例5

解聚及轉化成鈉鹽： 28毫升二氯甲燒導入50¾升廣口燒瓶a中。於擾拌下緩緩 置入4克（0.00238莫耳）如實施例a所述般製得之肝素爷自旨（酉旨 化程度：77百分比，苄乙氧銨鹽）。完全溶解之後，於4〇<>c 下添加0.95克（0.00949莫耳）咪唑鈉》反應於二氯甲燒回产 溫度下持續約4小時。此期間，於4°C下於廣口燒瓶b中製備 在120毫升曱醇中有12克乙酸鈉的溶液。廣口燒瓶a中之反 應混合物於磁石攪拌下倒入乙酸鈉之甲醇溶液中。出現實 際上—半透明之膠狀黃色沉澱。停止攪拌，懸浮液沉降—小 時以進行分離。取出上清液之澄清部分並丟棄（88毫升）。將 50毫升甲醇添加於所沉降之沉澱物（橙色漿狀），混合物檀掉 20分鐘。沉澱物再沉降約30分鐘。取出上清液並丟棄（5 !毫 升）。添加50毫升甲醇於所沉降之沉澱中，混合物挽拌2〇分 鐘。懸浮液中之沉澱物過濾於燒結玻璃4上。所得之黃色膠 狀濾渣使用25毫升甲醇洗滌兩次。排乾潮濕固體之水分， 之後於減壓下（2.7仟帕司卡）於約60°C溫度下乾燥。乾燥j 2 小時之後，得到1.34克經解聚之肝素（苄酯，鈉鹽）^所得產 率爲76.6百分比3 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210χ297公董）

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五、發明説明 皂化： 1.2克W述所得之經解聚肝素（芊酯，鈉鹽）根據實施例^斤 述之包化方法進行包化。得到〇 63克灰褐色粉末。粗製經 解聚肝素（鈉鹽）之產率爲52.5百分比。 & 純化： 0.63克前文所得之粗製經解聚肝素（鈉鹽）根據實施例1所 述之純化方法進行純化。得到〇 42克白色粉末。產率爲％ 7 百分比。 所得之經純化多醣（鈉鹽）混合物具有以下特徵： 平均分子量·· 2250道耳呑 抗-Xa活性：134.5 IU/毫克 抗-Ila活性：1.5 IU/毫克 抗-Xa活性/抗-Ila活性比例：90 5 實施例6 解聚及轉化成鈉鹽： 28毫升二氯甲烷導入50毫升廣口燒瓶a中。於攪拌下緩緩 置入4克（0.00238莫耳）如實施例a所述般製得之肝素芊酯（酯 化程度：77百分比，苄乙氧銨鹽）。完全溶解之後，添加 1.33克（0.00956莫耳）1，5,7-三氮雜二環[4.4.0]癸-5-晞。反應 於約20 C之溫度下持續約3小時3〇分鐘。此期間，於4下 於廣口燒瓶B中製備在120毫升甲醇中有12克乙酸鈉的溶液 。廣口燒瓶A中之反應混合物於磁石攪拌下倒入乙酸鈉之甲 醇溶液中。出現實際上半透明之膠狀黃色沉澱。停止攪拌 ’懸浮液沉降一小時以進行分離。取出上清液之澄清部分 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

袭 訂

1307278 A7 _______ B7 五、發明説明（16 ) 並丢棄（56耄升）。將60毫升曱醇添加於所沉降之沉澱物（黃 色漿狀）’混合物攪拌20分鐘。沉澱物再沉降約3 〇分鐘。取 出上清液並丢棄（70毫升）。添加5〇毫升曱醇於所沉降之沉澱 中，混合物攪拌15分鐘。懸浮液中之沉澱物過濾於燒結玻 璃4上。所得之黃色膠狀濾渣使用5〇毫升甲醇洗滌兩次。排 乾潮濕固體之水分，之後於減壓下（2 7仟帕司卡）於約6(rc 溫度下乾燥。乾燥12小時之後，得到0.92克經解聚之肝素（ 苄酯’鈉鹽）。所得產率爲64百分比。 邕化： 0.92克（0.0014莫耳）前述所得之經解聚肝素（芊酯，鈉鹽） 及Π.5毫升水導入25毫升廣口燒瓶中。於磁性攪拌下導入 0.38毫升（0.00379莫耳）30百分比苛性蘇打。添加之後，該 混合物保持於約20°C之溫度下並攪拌5小時。添加1_8克 NaCl，溶液藉著添加濃HC1(最終溶液體積約18毫升）而中和 。該混合物移至1〇〇毫升廣口燒瓶中，添加46毫升曱醇。發 Φ 現形成黃色沉澱。停止攪掉，懸浮液於約20T：之溫度下沉 降12小時。取出上清液，之後丢棄（52毫升）。添加25毫升甲 醇於所沉降之沉澱（黃色漿狀）’混合物授拌2〇分鐘。沉澱物 再沉降約1小時。取出上清液並丢棄（27毫升）。添加25毫升 甲醇於所沉降之沉澱物中，混合物攪拌約1小時。懸浮液中 之沉澱物隨之於燒結玻璃4上過濾。所得之濾渣使用丨〇毫升 一 甲醇洗滌兩次。排乾潮濕固體之水分，於減壓下（2.7仟帕司 卡）於約6CTC之溫度下乾燥。乾燥3小時之後，得到0.42克粗 製經解聚肝素（鈉鹽）。所得產率爲45.6百分比。 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(21〇x 297公釐) 1307278 A7 厂 ____B7 五、發明説明（17 ) 純化： 0.42克前文所得之粗製經解聚肝素及3 8毫升蒸餾水導入 1 〇笔升廣口燒瓶中。該混合物於磁性攪拌下加熱至38,c。 藉著添加0.1莫耳/升之氫氧化鈉及25微升之3〇%過氧化氫水 溶液，將pH調至9與1〇之間。攪拌約2小時3〇分鐘之後，添 加0.5克氯化鈉。混合物藉著添加〇1莫耳/升之HC1而中和。 φ 過濾該落液，並移至25毫升廣口燒瓶中。倒入1 1.3毫升甲 醇。發現形成白色沉澱。停止攪拌，懸浮液於約2crc之溫 度下沉降12小時。取出上清液並丟棄（9 8毫升）。添加5毫升 甲醇於所沉降之沉澱物（漿狀）中，混合物攪拌15分鐘。沉澱 物再沉降約3小時。取出上清液並丟棄（6·2毫升）。添加5毫 升甲醇於所沉降之沉澱物中，混合物攪拌2〇分鐘。懸浮液 中之沉澱物過濾於燒結玻璃3上。所得之白色濾渣使用5毫 升甲醇洗滌兩次。將潮濕固體之水分排乾，於減壓下（2.7仟 帕司卡）約60°C之溫度下乾燥。乾燥2小時20分鐘之後，得到 φ 0.39克純經解聚肝素（鈉鹽）。所得產率爲92.8百分比。 所得之經解聚肝素的特徵如下： 平均分子量：1950道耳呑 抗-Xa活性：115.6 IU/毫克 抗-Ila活性：< 2 IU/毫克 抗-X a活性/抗-11 a活性比例：>57 實施例7 解聚及轉化成鈉鹽： 140毫升二氣甲烷導入400毫升反應器A中。於攪拌下緩緩 -20 - 本紙珉尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐） 1307278 A7 B7 五、發明説明（

置入20克（0.0 119莫耳）如實施例a所述般製得之肝素苄酯（酯 化程度：77百分比，苄乙氧銨鹽）。完全溶解之後，使用 Karl Fisher方法測定反應介質之水含量。所得之値係爲〇 j 百分比之水。添加3.5毫升（0.0121莫耳）2-第三丁基亞胺基-2-二乙基-胺基-1,3 -二曱基全氫-1，3,2-二氮雜鱗素。反應於 約25°C之溫度下進行約24小時。此期間，於4°C下於廣口燒 瓶B中製備在300毫升曱醇中有3〇克乙酸鈉的溶液。反應器 Α中之反應混合物於磁石攪拌下倒入乙酸鈉之曱醇溶液中。 出現實際上半透明之膠狀黃色沉澱。保持攪拌一小時，懸 浮液於4X：下沉降約12小時以進行分離。取出上清液之澄清 部分並丢棄（220毫升）。將220毫升甲醇添加於所沉降之沉澱 物（黃色漿狀），混合物攪拌50分鐘。沉澱物再沉降約40分鐘 。取出上清液並丟棄（204毫升）。添加204毫升甲醇於所沉降 之沉澱中，混合物攪拌40分鐘。懸浮液中之沉澱物過濾於 燒結玻璃3上。所得之黃色膠狀濾渣使用2份丨0〇毫升甲醇洗 滌。排乾膠狀固體之水分，之後於減壓下（2.7仟帕司卡）於 約60 C溫度下乾燥。乾燥12小時之後，得到2 · 6克經解聚之 肝素（芊酯，鈉鹽）。所得產率爲70 6百分比（以經處理之反 應介質的一半計算）。 邕化： 2.6克前述所得之經解聚肝素（芊酯，鈉鹽）根據實施例1所 述之皂化方法進行皂化。得到丨48克淡黃色粉末。粗製經 解聚肝素（鈉鹽）之產率爲62.9百分比。 純化： -21 - 本纸張尺度適用中國國家捸準(CNS) A4規格(210X 297公爱)

裝 訂

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1.48克前文所得之粗製經解聚肝素及15毫升蒸餾水導入5〇 笔升廣口燒瓶中。該混合物於磁性攪拌下加熱至4〇。〇。藉 著添加1莫耳/升之氫氧化鈉以將pH調至9與1〇之間。該溶液 過濾於孔隙度爲1微米之濾膜上。添加76微升3〇百分比過氧 化氫水溶液。攪拌約2小時之後，添加15克氯化鈉。混合 物藉著添加1莫耳/升之HC1而中和。於孔隙度丨微米之濾膜 φ 上過濾該溶液。倒入38毫升曱醇。發現形成白色沉澱。停 止攪拌，懸浮液於約20X之溫度下沉降〗小時。取出上清液 並丟棄（37毫升）。添加37毫升甲醇於該沉澱物中，混合物攪 拌45刀4里。；几澱物再沉降約45分鐘。取出上清液並丟棄（3 4 毫升）。添加34毫升甲醇於所沉降之沉澱物中，混合物攪拌 15分鐘。懸浮液中之沉澱物過濾於燒結破璃3上。所得之白 色遽逢使用25毫升甲醇洗滌兩次。將潮濕固體之水分排乾 ’於減壓下（2.7仟帕司卡）約6(TC之溫度下乾燥。乾燥12小 時之後，得到1.29克純經解聚肝素（鋼鹽）。所得產率爲87 2 丨_ 百分比。 所得之經純化解聚肝素（鈉鹽）具有以下特徵： 平均分子量：2250道耳吞 抗-Xa活性：149.6 IU/毫克 抗-Ila活性：< 0.85 IU/毫克 抗-Xa活性/抗-Ila活性比例：176 -22- 本纸張尺度適用中國國家標準(CMS) A4规格(210 X 297公爱）

Claims (1)

13072祕17709號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(97年8月） A8 B8 C8 D8 六、申請專利範園 1. 種經硫酸化之多醣混合物，相較於肝素對xa因子及ila 因子具有較高的選擇性活性且具有肝素之組成多醣的一 般結構’且具有以下特徵： -具有1500至3000道耳吞之平均分子量，抗_Xa活性為 1〇〇至150 ιυ/毫克，抗_IIa活性為0至1〇 m/毫克，而抗_Xa 活性/抗-Ila活性比例高於1 〇， -該混合物之組份多醣含有2至26醣單元，且於其末端 中之一具有4,5-不飽和葡糖醛酸2·〇_硫酸酯單元， 其為驗金屬或驗土金屬鹽形式j 如申請專利範圍第i項之混合物，其特徵為該抗_xa活性 係介於125及150 IU/毫克之間。 3·如中請專利範圍第⑷項之混合物，其特徵為該抗❿活 性係介於刚及⑼117毫克之間，而平均分子量係介於 2000及3000道耳吞之間。 如申請專利範圍第丨或2項之混合物，其料鈉鹽、钟鹽 、在弓鹽或鎂鹽形式。 如申請專利範圍第丨或2項之混合物，其具有〇至5 ilj/毫 克之抗-Ila活性。 如申請專利範圍第…項之混合物，其具有高於25之抗_ Xa活性/抗-Ila活性比例。 一種製備如申請專利範圍第1項之混合物的方法，其特徵 為肝素苄酯之四級銨鹽係於有機介質中 八，| 0 ώ ^ t A I 貝丫 使用 pka大於 20 且選自1，5,7-二氮雜-二環[44〇]癸_5•烯、孓第三丁美 胺基—-乙胺基-1 3_ -甲其入_ λ ，甲基全虱二氮雜磷 2 4. 5. 6. 7. 亞 素 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱） ABCD 1307278 8. 9. 申請專利範園 (phosphorine) ’ 2-第三-丁基胺·三（二曱基胺）膦烷 (phosphaorane)及胍及磷腈（phosphazenes)族之鹼之強有 機驗或藉由咪唑鈉進行解聚，將經解聚之肝素之亨醋 的四級銨鹽轉化成鈉鹽’將鵁酯皂化，並視情況純化 產物。 如申請專利範圍第7項之方法，其中肝素苄酯之四級銨鹽 係為卞乙氧錢、十六基吡啶错或十六基三曱基錄鹽。 如申請專利範圍第7項之方法’其中該胍族之鹼係具有下 式之化合物：jT R5, .R2 N*IR4 •NIR3 其中R!係為氫或烷基，R2、R3、R4及Rs係相同或相異 ’各表示烷基’該烷基具有1至6個碳原子，且係直鍵咬 分枝鏈形式。 一 I 〇.如申請專利範圍第9項之方法，其中R,係為氫，且I、R 、及r5係為曱基。 3 II ·如申請專利範圍第7項之方法，其中磷腈族之鹼係具有下 式之化合物： R3 R2—N 尸 4 \ / R1一N=P~n—R5 /N—R6 R7/ •2- 1307278 A8 B8 C8 D8

申請專利範圍 其中Ri至R_7相同或相異，且表示含有i至6個碳原子且 係直鏈或分枝鏈形式之烷基。 12.如申請專利範圍第7至11項中之-項的方法，#中具有大 於20之pka的強有機鹼或咪唑鈉/肝素苄酯之四級銨鹽的 莫耳比係介於0.2及5之間。 13 如申明專利範圍第7至j j項中之一項的方法，《中肝素笔 醋之四級銨鹽具有介於5〇及1〇〇百分比之間的輯化程度: 14.如申請專1範圍第項中之—項的方法，纟中經解聚 之肝素的苄酯之四級銨鹽轉化成鈉鹽係藉著使用乙酸鈉 之醇溶液處理該反應介質而進行。 K如中請專利範圍第項中之—項的方法，纟中該息化 係藉著驗金屬氫氧化物進行。 16·如申請專利範圍第項中之—項的方法，纟中該純化 係藉者過氧化氯進行。 17·=申明專利範圍第1或2項之混合物，其係作為抗血检醫 〇 18. —種相較於肝素對Xa因子及IIa因子具有較高的選擇性活 性之醫藥組合物，包含如申請專利範圍第〗或2項的混合 物以作為活性成份》 D 19· 一種供抗血栓使用之醫藥組合物，包含如申請專利範圍 第1項之混合物及藥學上可接受之載體或稀釋劑。 -3-