TWI304095B - Stereoselective bioconversion of aliphatic dinitriles into cyano carboxylic acids - Google Patents

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1304095 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 發明領域 本發明係關於一種經選定之脂族二腈進行區域選擇性 5 與立體選擇性轉化成為對應氰基羧酸之新穎生物催化方 法。特別’本發明提供2_異丁基_丁二腈轉化成為（S)-3_氰基 曱基己酸之方法，後者為合成(S)-3-(胺基曱基)-5-曱基己 酸（普加巴林(Pregabalin))之有用中間物。普加巴林可用於治 療若干腦部疾病，例如普加巴林可用於治療與預防癲癇發 1〇作病症、疼痛及精神病症。因普加巴林可有效改善腦功能， 因此也可用於老年病人之治療。 發明背景 有機腈類藉酶水解成為對應羧酸類及醯胺類，提供寬 15 廣多種有用化合物之重要替代合成方法。習知腈類以化學 水解成為對應羧酸類及醯胺類典型係使用強酸或強鹼催化 劑於高反應溫度進行。因此該水解反應與含有敏感官能基 之化合物不相容。此外，化學水解之選擇性不良，結果可 能導致非期望之副產物以及大量無機鹽類。相反地，酶催 20 化腈水解係於溫和條件（中性pH，30°C)下進行，提供高度 化學選擇性、區域選擇性及立體選擇性之可能。另一優點 為可避免生成副產物無機鹽類。 最佳已知之腈轉化酶之產業應用係使用得自玫瑰色紅 球菌（Rhodococcus rhodochrous) J1之腈水解酶而製造丙烯 1304095 醯胺（Τ· Nagasawa等人，Tibtech·，1992, vol· 10, 402-408)及 於驗醯胺（Τ· Nagasawa等人，Appl· Environ· Microbiol·，1998, vol 54，1766-1769)。若干晚近綜論(L· Martinkov4等人，流 行有機化學，2003, vol. 7，1279-1295及D· Cowan等人， 5 Extremophiles，1998, vol·，2, 207-216)說明腈轉化酶之生物 化學以及可能之產物應用性。 酵素催化之腈水解係藉腈酶，腈酶將腈轉成對應之羧 酸，以及藉腈水解酶催化，該酶將腈轉成對應之醯胺類。 醯胺酶將醯胺催化成為對應之羧酸，醯胺酶可組合腈水解 10 酶用來將腈轉變成羧酸。 使用腈酶酵素來由對應之腈製備羧酸係揭示於w〇 01/072856。以交聯將酶結合入聚合物基體可提供具有改良 之物理完好及生物化學完好之催化劑。 使用生物催化劑由脂族〇；、〇_二腈類進行區域選擇性 15製備ω腈羧酸係揭示於美國專利第5,814,508號。例如具有 骑酶活性之催化劑可用於將2_甲基戊二腈催化成為1氣基 戊酸。 Κ· Yamamoto等人發酵生物工程期刊，1992, Μ乃， 125-129說明使料有腈水解酶及醯胺酶活性二者之微生 物細胞來將反]，4·二氰基環⑽轉成反_4·氰基環己㈣ 酸 曰，，工對系、列月曰族α、ω_二猜化合物，報告使用具有 脂族骑酶活性或腈水_與醯胺酶活性組合之微生物細 胞’對二腈類進行區域選擇性生物催化轉化成為經氛基取 20 •1304095 代之羧酸(J.E· Gavagan等人，J· Org. Chem·，1998, vol. 63, 4792-4801) 〇 已經說明腈之立體選擇性酶催化轉化作用，來製備富 含一種對映異構物之對掌性羧酸類及醯胺類(M Wieser等 5 人’立體選擇性生物催化章郎’ Marcel Dekker Inc.:紐約， 2000，461-486)。得自糞產驗菌（Alcaligenes faecalis) ATCC 8750之立體選擇性腈酶酵素用來由外消旋扁桃腈製備(R)_ 扁桃酸(Κ· Yamamoto等人，Appl. Environ· Microbiol·，1991， vol· 57, 3028-3032)。得自玫瑰色紅球菌NCIMB 11216之腈 10 酶偏好水解2-曱基己腈之外消旋混合物中之(+)_2-曱基己 腈’而留下(+)-2-甲基己腈未反應(M. Gradley等人，生物技 術函件，1994, vol· 16, 41-46)。美國專利第5,593,871號揭示 使用含有立體選擇性腈水解酶之微生物，由腈類製備富含 一種對映異構物之2-烷酸醯胺類之方法。對映異構純質之 15 ^ -胺基酸類及醯胺類可使用含有立體選擇性腈水解酶及 立體選擇性胺酶之紅球菌屬（Rhodococcus sp.) AJ270，而 由外消旋α -芳基取代之及經α _烷基取代之甘胺酸腈類製 備(M.-C· Wang等人，J· 〇rg· Chem·，2002, vol. 67, 6542)。 前述參考文獻全文以引用方式併入此處。 20 外消旋普加巴林之治療價值，特別其用作為抗驚厥劑 之功效發現主要係歸因於(S)-對映異構物。為了提供具有成 本效益之普加巴林藥物治療，曾經研究多種合成富含（S)-異構物化合物之合成途徑。舉例言之，非對稱性氫化適當 經氰基取代之烯烴，接著還原氰基成為對應之胺，可獲得 1304095 實質富含(s)-對應異構物之普加巴林（美國專利案申請公告 案第 2003/0212290號）。 普加巴林、其衍生物及類似物藉純粹化學方法之合成 係揭示於美國專利案6,642,398 ; 6,635,673 ;及6,046,353。 5 【發明内容】 發明概要 於本發明方法，使用具有腈酶活性之酵素催化劑，達 成脂族二腈類之區域選擇性及立體選擇性之生物催化轉化 成為氰基魏酸類。 10 本發明係關於一種製備式I化合物之(S)-對映異構物之 新穎方法：

其中C3具有（S)組態； R1為氫、（CrC6)烷或苯基；及 R2為（Ci-C8)烧基、（C2-C8)稀基、（C3_C8)環烧基、 -〇(CrC6)烷基、-CH2_CH2-0-(CrC6)烷基、（CrC6)烷基 -OH、-笨基-(CVC6)烷基-OH、-笨基-(CrC6)烷基、苯基或 經取代之苯基； 但當R2為曱基時，R1為氫、（CrC6)烷基、或苯基； 該方法包含下列步驟： (la)式II化合物： 1304095

lGN

與具有腈崦活性之酶催化劑於反應介質接觸；以及 (lb)由該反應介質回收式1化合物之(S)-異構物；以及 選擇性地回收未經改變之式II化合物之(R)-異構物。 式1化合物可用於合成具有藥學活性之化合物，諸如普 加巴林。 本發明之較佳具體例中，R1及R2各自分別為氫或(^至 c3烷基。 10

15 本發明之較佳具體例中，式Η化合物為包含3R異構物 與3S異構物之外消旋混合物。 本i月之較佳具體例為該種方法，藉該方法將外消旋 孓異丁基-丁二腈（式11化合物其中R1為H及R2為甲基）轉化 ()氰基甲基己酸（式1化合物其中R1為H及R2為甲 基），該方法包含下列步驟： ()卜消旋2-異丁基丁二腈與具有腈酶活性之酶催化 劑於反應介質接觸；以及 ⑽由水性混合物回收(S)-3-氰基-5-甲基己酸 ;以及 選擇性地回收未改變之叫2·異丁基丁二腈。 較佳反應介質為水性介質。 20 1304095 _ 外消旋化。較佳鹼為1，8-二吖雙環[5.4.0]十一碳-7-烯，而較 佳溶劑為甲苯。選擇性地，結果所得化合物Η之外消旋產物 可於步驟（la)或步驟(2a)循環至前述方法。 ' 本發明之一較佳具體例中，酶催化劑係呈全微生物細 5 胞形式、微生物細胞萃取物、部分純化酶、純化後之酶、 或制動於撐體上之酶催化劑。 本發明之另一具體例中，酶催化劑為部分純化酶。部 分純化酶例如包括（但非限制性）NIT-101、NIT-102、 參 ΝΙΤ-1〇3(生物催化公司（Bi〇Catalytics Inc.)，加州巴薩迪 10那）’以及得自阿拉伯芥之腈酶（茱麗 (Jtilich)精細化學品公司，德國茱麗）。 本發明之較佳具體例中，腈酶催化劑係制動於撐體 上。被制動之腈酶催化劑例如包括（但非限制性）NIT-102 C2(生物催化劑公司，加州巴薩迪那）、nit_1〇2制動於尤坡 15吉㊉叩叫⑷(羅門（R6hm)公司，德國丹史塔）、及得自制動 於尤坡吉之阿拉伯芥之腈酶。較佳具體例中，制動之腈酶 _ 催彳為ΝΙΤ·102 C2。 另一具體例中，反應介質係由蒸餾水或緩衝水組成。 較佳緩衝水被緩衝至pH於約5.0至約ι〇·〇之範圍，及最佳ρΗ 20 於約6.0至約8·0之範圍。 本發明亦係關於一種製備（S)-3-(胺基甲基)-5-甲基己 酸（普加巴林(pregabalin))之方法，該方法包含下列步驟： (a)外消旋2-異丁基-丁二腈於反應介質接觸具有腈酶 活性之酶催化劑； 10 1304095 (b) 由該反應介質回收(s)-3-氰基_5_甲基己酸； (c) 將（S)-3-氰基-5-曱基己酸轉成酸鹽；以及 (d) 氫化酸鹽而生成（S>3乂胺基甲基)-5-甲基己酸（普 加巴林）。 5 較佳酸鹽具有式

I I I \ Θ© 、cq2m 其中 μ為 Na、K、Li、NH4、NH2R6R7、NHsR1 或 NH(R6)2r7 其中R6及R7各自分別為(CVQ)烧基。 為求方便，本說明書、實施例及隨附之申請專利範圍 10 使用之若干術語集合於此處。除非另行定義，否則此處使 用之全部技術及科學術語具有本發明所屬業界熟諳技藝人 士一般所瞭解之相同定義。 「烷基」一詞為含1至8個碳原子之直鏈或分支基團包 括(但非限制性）甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基及第三丁基。 15 「環烷基」一詞用於此處包括含3至7個環碳原子之衍 生自環狀烴類之部分，包括經以直鏈或分支烷基部分取代 之環狀烴部分。 燒氧基」一詞用於此處表示「烧基-〇_」，其中「烧 基J係定義如前。 20 ^ 「烯基」一詞意圖包括一或多個碳_碳雙鍵之直鏈或分 支組態之烴鏈，雙鍵可出現於碳鏈沿線之任何穩定點，諸 1304095 如乙稀基及丙浠基。烯基典型含2至約⑵固碳原子，更典型 為2至約8個碳原子。 卜消旋此口 巧用於此處表示_對對映異構物之等 莫耳混合物。外消旋混合物通常係於合成產生立體中心時 5生成#此處使用外〉肖旋混合物_詞表示外消旋產物。 如此處使用，對映異構物一此表示於分子層面與其鏡 像彼此無法重合之化合物。對映異構物可呈⑻組態或⑻ 組態存在。 如此處使用’立體選擇性合成一詞表示一種化學反應 1〇結果導致有兩種或兩種以上可能之立體異構物，生成單一 立體異構物或異構物之一種對映異構物豐富異構物混合物 之化學反應。 如此處使用，區域選擇性一詞表示可於選自二或二個 以上了此原子或原子團之單一原子或原子團進行反應。二 15腈之區域選擇性水解結果導致單一腈基轉化成為羧基。 「°c」表示攝氏度數； 「酶催化劑」一詞用於此處表示一種催化劑其係以腈 峰活性為特徵，或以腈水解酶活性與醯胺酶活性之組合為 特徵。催化劑可呈全微生物細胞形式、被滲透之微生物細 20 胞、微生物細胞萃取物之一或多種細胞成分、部分純化酶、 或純化酶等形式。 如此處使用，對映異構物過量一詞表示主要對映異構 物於對映異構混合物之莫耳分量，以百分比表示。 「水性反應混合物」一詞表示酶基質與酶催化劑於大 12 1304095 量水性介質之混合物。 厂腈酶活性」一詞表示可將腈基轉成羧酸基之酶活性。 「腈水解酶活性」一詞用於此處，表示可將腈基轉成 醯胺基之酶活性。 5 「醯胺酶活性」一詞表示可將醯胺基轉成羧酸基之酶 活性。 ATCC^美國種型培養收集會，位於10801 University

Boulevard，Manassas，Va·，20110-2209, U.S.A。生物催化公 司係位於 129 Ν· Hill Avenue，如如 1〇3, pasadena，CA， 10 91106，U.S.A。茱麗精密化學品公司係位於

Rud〇lf_Sdmlten_StraBe 5, d-52428 Jiilich，Germany。 較佳實施例之詳細說明 本發明提供一種由式11二腈類製備式i脂族氰基羧酸類 15之酶催化方法。技藝界常用之任一種適當方法皆可用來製 備二腈(II)起始物料。 反應圖1表示本發明之特定具體例，其中化學酶催化方 法用來將2-異丁基-丁二腈(v)轉成⑻^氛基甲基己酸 ㈤。化合物VI可用作為普加巴林(νπ)合成時之中間物， 20如反應圖2所不。反應圖i之步驟3顯示副產物⑻_異構物㈤ 之外消旋化，以及隨後循環進入步驟2。 於反應圖1之步驟1，外消旋2-異丁基·丁二腈(V)係經由異 戊酸(III)契氰基乙酸乙酿(Iv)縮合，接著加入而形成。外 消旋混合物係經由於V<C3碳原子形成之立體中 心所產生。 13 1304095 及立體:=2顯示二腈V外消旋混合物之區域選擇性 擇水解，結果獲得⑻錢15、甲 未改變之V之(R)-異構物。 土己s夂（） 2-異丁基-丁二(V)藉腈酶催化水解，成 甲基己酸m)具有區域選擇性及立體選擇性二者。區^擇 性係基於氰基只於C1碳原子轉賴基。反料立體選擇 性，在於V之(S)對映異構物主要涉及轉化，而留下對映 異構物大致上不變。

如反應圖2所示，s-氰基酸VI之酸鹽Via於隨後步驟氫 10化而獲得（S)-3-(胺基甲基)-5_甲基己酸（普加巴林）。反應係 於氫化催化劑較佳為阮尼鎳存在下進行。可接受之酸鹽包 括式Via化合物，其中μ為Na、K、Li、NH4、NH2R6R7、 NH#或NH(R6)2R7其中R6及R7分別為(C「C6)烧基。 + ,C02Et

V

及應圖1 ι·哌啶比烷 步驟1 (R，S)-2異丁基-丁二腈(外消旋潞舍翁)

(S)-3-氰基-5-甲基已酸 及應圖2 (R)-2-異丁基-丁二腈

(S )-3-氰基-5-甲基己酸鹽

RaNi, H2

普加巴林 14 1304095 如反應圖I所示，當外、、古 卜4¼混合物V進行區域選擇性及 立體選擇性轉化成為 * 物時，腈酶主要係與⑻異 構物反應。如此隨著轉仆夕 之違行，反應混合物之(R)對應異 構物Va之含量逐漸豐富。 本毛月之另目的係經由循環或再使用未改變之⑻_ 二腈Va而避免經濟上的浪此本發明提供—種盼二膽 之外消旋反應(反應圖1步驟3)，以及隨後循環通過反應圖i 步驟2之方法。 本毛月之各種梅具有腈梅活性、或腈水解酶活性與醯 1〇胺酶活性之組合，可經由篩選方案例如豐富分離技術而找 出本發明之各種酶，該豐富分離技術最初基於微生物於含 有豆S腈之培養基之能力而選擇微生物。豐富分離技術典 型涉及使用補充豐富腈之碳有限或氮有限培養基，該豐富 腈可為用於期望之生物轉化之腈酶基質，或結構類似之腈 15化合物。具有腈酶活性之微生物初步係基於微生物於含豐 备腈之培養基之生長能力而選出。Gavagan等人（Appl.

Microbiol· Biotechnol· (1999) vol. 52, 054-659)使用豐富技 術使用2-乙基丁二腈作為唯一氮源而由土壤中分離出革蘭 氏陰性菌 Acidovorax facilis 72W (ATCC 55746)。Acidovorax 20 facilis 72W (ATCC 55746)顯示可用於將2-甲基戊二腈選擇 性轉化成為4-氰基戊酸。豐富技術也可用於分離嗜熱菌（蒼 白芽孢桿菌（Bacillus pallidus) Dac52l，該嗜熱菌催化3-氰 基ϋ比。定轉化成為於驗酸（Almatawah及Cowan, Enzyme

Microb. Technol. (1999) vol. 25, 718-724)。藉豐富技術分離 15 1304095 之微生物可測試其腈水解活性，測試方式係將微生物細胞 懸浮液接觸腈化合物，使用諸如高效液相層析術、氣液層 析術、或液相層析術質譜術(LCMS)等分析方法而測試是否 存在有對應之羧酸。測定Acidovorax facilis 72W (ATCC 5 55746)之腈水解活性之技術報告於美國專利第5,8i4,508 號0 一旦已經分離具有腈酶活性或腈水解酶與醯胺酶活 性之微生物後，可採用酶工程處理來改良酶之各方面。此 等改良可用於本發明，此等改良包括高酶選擇性、催化效 10率、對較高溫及較寬廣pH範圍之安定性、且讓酶可於包括 水性緩衝液與有機溶劑之混合物之反應介質操作。 本發明有用之多種技術，該等技術可用來製造酶催化 劑，該酶催化劑除了對特定生物轉化方法具有改良產率、 產出量及產品品質外，也具有腈酶活性或腈水解酶與醯胺 15酶活性，該等技術包括（但非限制性)酶工程技術，諸如合理 設計方法包括針對位置之突變發生、以及利用隨機突變發 生或DNA穿梭技術之導向演化技術。 式11化合物轉化成為式I化合物之適當酶催化劑係呈 全微生物細胞、經過滲透之微生物細胞、微生物細胞萃取 20物、部分純化酶或純化酶等形式，此等催化劑可制動於 體上。 、、筹 本方法可於單相經由2·異丁基丁二腈於蒸餘水接觸崎 催化劑，或於水性緩衝液接觸酶催化劑進行，水性緩衝夜 可維持反應之初pH於約5.〇至1〇〇，且較佳6〇至8〇之^ 16 1304095 圍。適當緩衝劑包括磷酸鉀及乙酸鈣。隨著反應之進行， 由於由二腈之對應腈官能基，生成羧酸之銨鹽，故反應混 合物之pH改變。反應可於未控制pH下進行，或於反應過程 可添加適當酸或鹼來維持期望之pH。但如前文指示，可使 5用諸如嗨工程及導向演化其可於更寬廣之pH範圍有效操 作’等技術來製造酶催化劑。 本方法可於包含二相之反應混合物進行··水相最初含 有酶且溶解之孓異丁基-丁二腈；有機相主要係由外消旋2- 異丁基·丁二腈組成。二相反應混合物之製法係經由將2_異 10 丁基-丁二腈加至酶與緩衝劑之水溶液，讓2-異丁基_丁二腈 之添加量超過其水中溶解度限度。2_異丁基_丁二腈於5〇 mM石粦酸鉀(3叱，ρΗ 7·5)之水中溶解度約為〇 〇6m。反應過 私中，生成（S)-3-氰基-5-曱基己酸銨鹽，於水相之濃度增 高，有機相之體積縮小，而變成富含(R)_2_異丁基_丁二腈。 15另外，此種方法也可於包含以下三相之反應混合物進行·· 水相其初部含有溶解之2_異丁基_了二腈；有機相其主要係 由外消旋2_異丁基_丁二腈組成；及固相主要係由酶制動於 不溶性擇體組成。王相反應混合物係經由對二相反應混合 物所述程序製備，但制動於不溶性樓體之酶係用來替代未 20 被制動之酶。 選擇性地’峰可制動於聚合物基體或不溶性樓體。制 動後之酶催化劑可重複使用或以連續方法使用，制動後之 酶催化劑比未經制動之峰催化劑更容易由峰催化方法產物 分離。酶鑛於聚合物基體(例如褐驗w丙稀酿胺）， 1304095 或制動於不溶性撐體（例如西萊特（celite))之方法為熟諳技 蟄人士眾所周知。NIT-102 C2(生物催化公司，加州巴薩迪 那）為制動於不溶性撐體之腈酶酵素，由於可重複用於批次 去或連續法，因此特別可用於II轉化成為III。NIT-102 C2 用於反應之》農度係選擇可獲得預定反應速率，且該濃度係 依據催化劑之比活性及酶基質濃度決定。典型地，NIT-102 C2之用量為每毫升反應體積約〇 〇〇1克至〇·3克濕重，較佳為 每冤升反應體積〇·〇1至〇·15克濕重之範圍。 此外’若干由微生物細胞製備且定名為ΝΙΤ-101、 10 NIT-102、ΝΙΤ-1〇3(生物催化公司，加州巴薩迪那）及得自阿 拉伯芥之腈酶（茱麗(J汕ch)精細化學品公司，德國茱麗）製 備之/東乾水解產物也可用於將II轉化成為III。NIT-101、 NIT-102、ΝΓΜ03及阿拉伯芥腈酶與]；於水性反應混合物接 觸’結果導致生成II。使用NIT_101、NIT_102、NIT_103及 15得自阿拉伯芬之腈酶之反應可於二相反應混合物，使用催 化劑濃度於每毫升反應體積0 001_0 04克乾重之範圍進 行’較佳催化劑濃度為每毫升反應體積0 002-0 02克乾重之 範圍。 水角午反應溫度係選定為可最佳化反應速率及酶催化 20劑活性安定性之溫度。反應溫度係於恰高於懸浮液冰點（約 0C)至60C之範圍，較佳反應溫度係於5°c至35°C之範圍。 式I化合物之(3S)異構物之回收、及式η化合物之未改 變（3R)異構物之回收可使用熟諳技藝人士眾所周知之分 離、單離與純化技術進行。 18 1304095 於較佳回收方法，式11化合物之未改變之（3R)異構 物，係經由使用諸如乙酸乙酯之有機溶劑萃取，而由鹼性 水性反應混合物分離。式1化合物之(3S)異構物之酸鹽偏好 溶解於水層，以及隨後藉酸化以及使用諸如乙酸乙g旨之有 5 機溶劑萃取而分離。 式I化合物可用於合成諸如普加巴林之化合物，該等化 合物可用於治療癲癌、抽搐、焦慮、疼痛及神經退化病變， 包括阿茲海墨氏病、亨丁頓氏病及帕金森氏病等病症。 特定式I化合物例如為下列化合物： 10 (S)-3-氰基-5-甲基-辛酸； (S)-3-氰基-5-甲基-庚酸； (S)-3-氰基-5-甲基-己酸； (S)-3-氰基-5-甲基-壬酸； (S)-3-氰基-5-乙氧基-己酸； 15 (S)-3-氰基-5-環己基·己酸；以及 (S)-3-氰基-5-三氟甲基-己酸。 丁基-丁二腈之製備 氰基乙酸乙酯（733克，6.48莫耳），異戊醛(613·9克，7.13 2〇莫耳），哌啶(5·5克，0·065莫耳）及己烷(0.5升）之混合物置於 回流下，連續去除水。當未再收集得額外水時，混合物經 =卻，真空蒸德去除溶劑。以醇⑽)添加至剩餘油，接 著加入氰化鉀(422克’ 6.48莫耳)於水⑽）。於添加氰化奸 心液期間’反應混合物係維持於低於饥，然後維持於約 19 1304095 35 C 4小日守。反應混合物於大氣壓下蒸館至達到95°c溫度， 然後於此溫度回流5小時。反應混合物經冷卻，以水升) 稀釋，及以1升曱基第三丁基曱醚(MTBE)萃取。MTBE萃取 物以水(0.5升）洗滌，以無水硫酸鎂脫水，過濾及真空濃縮， 5獲付8?3·4克2_異丁基-丁二猜，呈油。藉真空蒸德(9〇。0於 0.275毫米汞柱)獲得純化後之2-異丁基-丁二腈樣本。 !H NMR (CDC13，400 MHz): 5 0.93-0.99 (m，6H)， 1.43-1.50 (m，1H)，1.71-1.78 (m，1H)，1·81-1·91 (m，1H)， 2.69 (d，2H，J=6.5 Hz)，2.90-2.97 (m，1H)· 10 實施例2 丛NIT-101、NIT-102、NIT-103及阿拉伯界l酶而由2•異丁 基-丁二腈製備（SV3-氰基-5-曱某己酸 三個8毫升有螺帽之玻璃小瓿内各自進料2-異丁基_丁 二腈(20毫克），1毫升50 mM構酸卸緩衝液(pH 7.5, 2mM二 15 硫赤絲醇(DTT))，及10毫克選自NIT-101、NIT-102或 NIT-103(生物催化公司，加州巴薩迪那）之腈酶酵素。一個8 毫升有螺帽之玻璃小瓶内進料2-異丁基-丁二腈（2〇毫克）及 1毫升阿拉伯芥腈酶於含100 mM伸乙基二胺四乙酸(edta) 及2 mM DTT之5〇 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7·8)之溶液（茱麗精 20細化學品公司，德國茱麗）。四種反應混合物於30°C使用磁 攪棒攪拌15小時，然後以乙酸乙酯（2 X 6毫升)個別萃取。移 開乙酸乙酯萃取物後，水性部分使用4N鹽酸(0.15毫升）處 理，使用乙酸乙酯（3 X 6毫升）萃取。酸化水性部分之乙酸乙 酯萃取物經真空濃縮，對使用NIT-101、NIT-102、NIT-103 20 1304095 及阿拉伯芥腈酶進行之反應分別獲得7.8毫克（34.2%產 率），8.8¾克(38.6%產率），8.1毫克(35.5。/〇產率）及4.〇毫克 (17·5〇/〇產率）(S)-3-氰基-5-甲基己酸((S)-CMHA)。得自各反 應之（S)-3 -鼠基-5-甲基己酸樣本使用過量（三曱基石夕烧基） 5重氮曱烷處理，獲得其曱酯衍生物，於開立迪斯(Chiraldex) G-TA官柱(30米χ〇·25毫米）内徑，15微米膜厚度谱氣相層 析術（GC)分析，來測定對映異構物純度。ΝΙΤ_1〇1、 NIT-102、NIT-103及阿拉伯芥腈酶反應產物之對映異構物 純度分別為96.3%、91.1%、95.5%及98.5% e.e· (e.e·表示「對 10 映異構物過量」）。 膏施例3 補用ΝΓΜ02由2-異丁基-丁二賸_製備(SV3-氰基-5-甲某己酸 125毫升有夾套之反應容器維持於3〇°c。容器内進料2_ 異丁基-丁二腈（3.33克）、ΝΙΤ-102 (〇·5克)及 122毫升50 mM 15 磷酸鉀緩衝液(PH 7.5)含5 mM DTT及1 mM EDTA(反應緩 衝液）。攪拌12·5小時後，反應混合物以乙酸乙酯（4 X 50毫 升）萃取。乙酸乙酯萃取物經去除，水性部分以4]y[鹽酸調整 至pH 2.5 ’及以乙酸乙S旨（3 X 50宅升）卒取。酸化水性部分 之乙酸乙酯萃取物經組合，以水性硫酸鎂酸化，過濾及真 2〇空濃縮，獲得丨·56克(S)_CMHA (41」％)。反應產物樣本使 用（三甲基石夕烧基）重氮甲烧處理，如實施例2所述藉GC分 析，顯示98.5% e.e·之對映異構物純度。 ]H NMR (CDC13? 400 MHz): δ 0.93-0.97 (m5 6Η)5 1·3(Μ·37 (m, 1Η)，1·61-1·68 (m，1Η)，1.82-1-89 (m，1Η), 21 1304095 2.57-2.63(m，1H)，2.72-2.78 (m，1H)，2.98-3.06 (m，1H). 實施例4 I _ΙΤ-102 C2由^^丁基·丁二腈製備V3_氰基_5_甲某 己酸鉀 5 兩個125毫升維持於30°C之有夾套之反應容器内，各別 進料2-異丁基-丁二腈（6.81 克），NIT-102 C2 (1-70克）及 118.2 毫升反應缓衝液。攪拌24小時後，產物混合物經傾析，留 下酶催化劑於反應容器。反應緩衝液(2〇毫升）添加至各個反 應容器’約攪拌2分鐘，然後經過傾析及添加至產物混合 1〇物。藉將異丁基—丁二腈（6·81克)及反應緩衝液（118.2毫升） 添加至各個反應容器，反應混合物攪拌24小時而重複反 應。於各容器完成四次反應（總共8批次反應）後，產物混合 物故組合，以MTBE (3 X 500毫升）萃取。MTBE萃取物經取 出，水性部分以磷酸調整至pH 2.1，以MTBL· (2x500毫升） 15 ^ _ 平取。酸化後之水性部分之MTBE萃取物經真空濃縮，留下 ’由，油以水（100毫升）及氫氧化鉀（8·5克）處理。所得溶液經 真空濃縮獲得24.2克(31.3%)(S)-3-氰基_5_甲基己酸鉀。由 (S>3-氰基-5-甲基己酸甲酯，藉對掌性Gc分析顯示991% e-e•對映異構物純度。 2〇 】 H NMR (D205 400 MHz): ^ 0.75-0.78 (m? 6H)? L18-1.25 (m，1H)，1.43-1.50 (m，1H)，(m，1H)， 2-28^2.38 (d? 2H? J=6.5 Hz)? 2.86-2.93 (m? 1H). 复选例5 意遐卫IT-102 C2於氮氣氣氛下由n 丁某-丁二腈製備 22 1304095 (8)-3-鼠基-5-甲基己酸 125毫升維持於3〇°〇之有夾套反應容器内進料2_異丁 基-丁二腈（6·53克）’ NIT-102 C2 (2.61 克），120克反應缓衝 液，且以氮氣掃除。所得混合物攪拌24小時，然後傾析至 5 250毫升玻璃瓶，將催化劑留在反應容器内。經由對含有用 過之催化劑之反應容器内重新進料2-異丁基_丁二腈（6·53 克）及120克反應緩衝液，使用氮氣掃除，攪拌所得混合物 24小時，重複反應。反應樣本(〇·ι毫升)混合〇·4毫升)水：甲 醇：三氟乙酸（60:4〇:〇·〇9，ν/ν/ν)，藉HPLC於西美崔 10 (Symmetry) C8管柱（150 X 3.9毫米）維持於3(rC 藉HPLC分 析。管柱以水·甲醇·二氟乙酸(60:40:0.09，ν/ν/ν)洗提， 使用折射率檢測器進行檢測。

催化劑回收利用共進行50批次反應。得自連續兩批次 反應之產物混合物組合，使用乙酸乙酯（2 χ 150毫升）萃取。 15 水性部分以4Μ鹽酸調整至pH 2，以乙酸乙酯（2 χ 150毫升) 萃取。酸化後之水性部分之乙酸乙酯萃取物經組合，以無 水硫酸鎂脫水，過濾，及真空濃縮獲得(S)_CMHA。由50批 次反應共獲得⑽·8克(43·2%產率)(S)cMHA。第卜26及50 批次反應之初反應速率分別為148、17·4及15.1 mM 20 (S)-CMHA/小時。由批次反應39至50分離得自（S)-C1V[HA甲 酯衍生物，進行對掌性GC分析顯示99·〇 % e.e.平均對映異 構物純度。 實施例6 使用NIT-102 C2於周圍氣氛下由夂互基-丁二骑先废 23 1304095 乱羞-5-甲其p▲祕 如實施例5所述進行使用NIT-102 C2將2-異丁基-丁二 腈轉化成為（S)-CMHA之一系列批次反應，但反應係於周園 氣氣下而非於鼠氣氣氣下進行。反應樣本係如實施例5所述 5 藉HPLC分析。 於周圍氣氛下以催化劑回收利用共進行5 〇批次反應。4 小時時由反應樣本測得之初反應速率對批次反應1、26及50 分別為 14.2、13.2及9.3 mM (S)-CMHA/小時。 實施例7 10 (S)-3-氰基甲某己酸第三丁基銨之製兔 由2-異丁基-丁二腈轉化成為（s)-CMHA(實施例6,反應 37-44)之產物混合物經組合，以乙酸乙酯（2 χ 25〇毫升）萃 取。乙酸乙醋萃取物以無水硫酸鎮脫水，過渡及真空濃縮， 獲得油(32.5克，62.2%產率），主要為(R)_2_異丁基_丁二腑。 15水性部分以4M鹽酸調整為PH2，以乙酸乙酯（2χ25〇毫升) 萃取。乙酸乙酯萃取物經濃縮成470毫升體積，然後擾摔同 時逐滴加入第三丁基胺（15.9毫升，151.5毫莫耳）。所生成之 白色結晶鹽藉過濾收集及風乾隔夜，獲得3〇〇克(s)-3_氮基 -5-曱基己酸第三丁基銨。由（S)-3-氰基_5_甲基己酸第三丁 2〇基銨製備(S)-3-氰基-5-曱基己酸曱1旨，藉對掌性gc分析， 顯示99.5% e.e.對映異構物純度。 ln NMR (CDC13? 400 MHz): 5 0.90-0.94 (m? 6H) 1.26-1.32 (m，10H)，1.54-1.61 (m，1H)，1·78_188 (m，1H)， 2.30-2.35 (m，1H)，2.43-2.50 (m，1H)，2.96-3.04 (m，1H)· 24 1304095 實施例8 由（S)_：l-氧甲基己酸鉀製備(S)_3_胺基甲基-5_甲基己酸 (s)_3-氰基-5-甲基己酸鉀(20克，103.5毫莫耳），水(50 毫升）’ 45。/。氫氧化鉀（12克），異丙醇（12克)及阮尼鎳之混合 5物於巴爾振搖器於50 psi氫壓下振搖隔夜。混合物經過濾， 加熱至約50°C，以乙酸(6.5毫升）處理及於室溫攪拌隔夜。 然後混合物以45%氫氧化鉀調整至略高於pH 7，真空濃縮 去除大部分異丙醇。異丙醇(20毫升）添加至混合物，然後以 乙酸酸化，於室溫攪拌隔夜，過濾獲得4·3克(8)_3_胺基甲基 10 -5-甲基己酸，呈白色結晶固體。經由使用馬菲試劑(]V[arfey reagent)(N 〇： -(2,4-二硝基·5-氟苯基）-L-丙胺醯胺）製備 (S)-3-胺基甲基-5-甲基己酸衍生物，於BDS海坡西爾 (Hypersil)C18管柱(25〇χ4·6毫米，5微米）使用乙腈：1%三 乙基胺(pH 3)(38:62, ν/ν)洗提，藉HPLC分析，測得對映異 15 構物純度為100% e.e.。 實施例9 KS)-3-氰基-5-甲基己屋第三丁某銨製備脍篡甲其 二5-曱基己g参 (S)-3-氰基-5-甲基己酸第三丁基銨(26克，113.9毫莫 20耳），水(48·8毫升），乙醇(35.8毫升），氫氧化鉀(7.2克，91% 薄片）及海綿鎳（SpongeNickel)(A-7000, 16.3克水濕潤，活 化金屬化學品公司，田納西州西微微爾）之混合物於巴爾振 搖器内於50 psi氫壓下振搖隔夜。混合物經（西萊特）過濾， 濾餅以水（10宅升）及乙醇（5毫升）洗滌。添加乙酸(9·4毫升） 25 1304095 至濾液，所得混合物於4 c攪拌隔夜。產物經過濾，以10毫 升異丙醇清洗，真空脫水獲得11.1克(61%)白色固體。部分 (10.0克）材料由異丙醇與水之1:1混合物結晶，獲得8.8克 (S)-3-胺基曱基-5-曱基己酸，100% ee。 5 實施例10 佬用DBU外洁旋化丁基-丁二月眚 (R)-2-異丁基-丁二腈之外消旋化係於使用NIT_102 C2 生物轉化外消旋2-異丁基-丁二腈回收得之材料進行。（r)_2_ 異丁基-丁二腈（1.36克，10毫莫耳，69% ee)，甲苯(5毫升) 1〇 及丨，8-二吖雙環[5.4.0]十一碳_7_烯(DBU，0.076克，5毫莫耳) 之混合物回流2小時。水（10毫升）添加至反應，所得混合物 以乙酸乙酯（2 X 10毫升）萃取。組合有機萃取物循序以5%鹽 酸(20毫升）及飽和水性氣化鈉（2〇毫升）洗滌，以無水硫酸鎮 脫水’過濾及真空濃縮，獲得外消旋2-異丁基_丁二腈（114 克料％)。對映異構物純度係猎GC使用開立迪斯G-τα管 枝(3〇米X 0.25毫米内徑，125微米薄膜厚度）測定。 萊特（Amberlite) IRA-400外消旌化n?上2-異 丁美丁 戈伯萊特IRA-400樹脂（1克濕重，羅門哈斯(R〇hm& Η⑽s)公司，賓州費城)與5%氫氧化鈉（1〇毫升）共同攪拌… 刀鐘。以水洗滌至洗液變中性。添加乙醇(25毫升）及(r)_2 兴丁基-丁二腈（69% ee)至樹脂，所得混合物回流2小時。反 應化合物經過濾及真空濃縮。殘餘物攝取於乙酸乙酯（25毫 26 •1304095 升），以水(3 x 100毫升）洗滌。有機相以無水硫酸鎂脫水， 過濾，及真空濃縮，獲得外消旋(R)-2-異丁基-丁二腈（0.81 克，81%)。 L圖式簡單說明3 (無） 【主要元件符號說明】 (無）

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Claims (1)

1304095 一，.... ί^> 第94111638號專利申請案申請專利範圍修正

修正日期：97年6月

十、申請專利範圍： 1· 一種製備式I化合物之方法

其中C3具有（S)組態； R1為氫、（CrC6)烷基或苯基；及 R為（CVC8)烧基、（C2-C8)烯基、（c3-C8)環烧基、 -〇(Ci-C6)烧基、-CH2-CH2-0-(CVC6)烧基、（crc6)烧基 -OH、-本基烧基-OH、-苯基_〇-(〇ν(Ι；6)烧基、苯 基或經取代之苯基； 但當R2為甲基時，R1為氫、（CVC6)烷基、或苯基； 該方法包含下列步驟： (a)式II化合物：

與具有腈酶活性之酶催化劑於一反應介質中接觸；以及 (b)由該反應介質回收式I化合物之(3S)異構物；以 及選擇性地，回收未經改變之式II化合物之(3R)異構物。 1304095 2·如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟(b)回收之未 # 經改變之式II化合物之(3R)異構物係經由（3幻異構物與 鹼於一有機溶劑存在下加熱，而被外消旋化成為式IHb 合物之外消旋物(racemate)。 5 3·如申請專利範圍第2項之方法，其中使用由步驟(b)所回 收之未經改變之(3R)異構物外消旋化所得之該外消旋 物來重複進行步驟(a)。 • 4·如申請專利範圍第1項之方法，其中該酶催化劑係選自 於由NIT-101、NIT-102、NIT-103及得自阿拉伯芥 10 (Arabidopsis thaliana)之腈峰所組成之組群。 5·如申請專利範圍第1項之方法，其中該反應介質包含蒸 餾水或水，其係被緩衝至5.〇至1〇 〇之範圍内之。 6·如申請專利範圍第1項之方法，其中該式〗化合物為 (S)-3-氰基-5-曱基己酸，該式Π化合物為外消旋2_異丁美 15 "丁一腈，以及步驟(b)之該所回收之未經改變之異構物 φ 為（R)-2-異丁基丁二腈。 ' 7·如申請專利範圍第6項之方法，其中步驟作)之兮 溶劑 20 之未經改變之(R)-2-異丁基丁二腈係經由與鹼^回收 中加熱而外消旋化成為外消旋2_異丁基-丁二月主 8·如申請專利範圍第7項之方法，其中使用由步^卬)之节 所回收之未經改變之(R)-2-異丁基_丁二腈外消扩之5亥 得之外消旋2-異丁基-丁二腈來重複進行步驟(a)。斤 9· 一種製備（S)_3-(胺基甲基>5_甲基己酸 、曰如巴林 (pregabalin))之方法，該方法包含下列步驟： 29 1304095 (a) 使2-異丁基-丁二腈於反應介質接觸具有腈酶活 性之酶催化劑； (b) 由該反應介質回收(S)-3-氰基-5-甲基己酸； (c) 將(S)-3-氰基-5-甲基己酸轉化成一酸鹽；以及 (d) 氫化該酸鹽而生成（S)-3-(胺基甲基)-5-甲基己酸 (普加巴林）。 10·如申請專利範圍第9項之方法，其中由步驟(a)之該反應 介質回收未經改變之(R)-3-氰基-5-甲基己酸。 11·如申請專利範圍第9項之方法，其中步驟(a)之該未經改 變之(R)-3-氰基-5-甲基己酸係經由與鹼於一有機溶劑存 在下加熱被外消旋化以生成外消旋2-異丁基·丁二腈，以 及使用該外消旋2-異丁基-丁二腈來重複進行步驟(a)。 12·如申請專利範圍第9項之方法，其中該酶催化劑為呈全 微生物細胞、經過滲透之微生物細胞、微生物細胞萃取 物、部分純化酶、純化酶或固定於撐體(support)之||催 化劑之形式之腈酶。 13·如申請專利範圍第9項之方法，其中該酶催化劑係選自 於由NIT-HH、NIT_1〇2、NIT-103及得自阿拉伯界之骑崎 所組成之組群。 30