TWI303249B - Receptor binding polypeptides - Google Patents

Description

1303249 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於冠狀病毒，特別是有關於嚴重急性呼吸道 症候群（S ARS)趣狀病毒之診斷與治療。 【先前技術】 病毒為多種疾病之病因。例如，冠狀病毒家族成員會在小 鼠造成肝炎，在豬造成腸胃炎，以及在鳥類與人類造成呼吸道 感染。於目前超過30種的分離株中，有三或四種會感染人類。 嚴重急性呼吸道症候群（severe acute respiratory syndrome，簡稱 SARS)為新發現的感染性疾病’與一新種冠狀病毒有關。這種致 命的呼吸道冠狀病毒係於2003年在世界各地爆發。目前正如火 如荼地進行抗SARS冠狀病毒（coronavirus，簡稱CoV)的疫苗與 藥物之研究。然而，受限於安全性考量，研究進展仍相當緩慢。 【發明内容】 本發明，或至少本發明之部分，係基於SARS CoV棘蛋白 質（Spike protein，簡稱S蛋白質）受體結合功能區之發現。各種 SARS CoV分離株之基因體序列可以由基因銀行（GenBank)取 得。基因銀行登錄號AY278741 (序列識別號：1)顯示SARS CoV 歐巴尼株（Urbani strain)之基因體序列，該序列包括一開放讀碼 區，其編碼長度為7,073胺基酸殘基（aa.)之多肽（序列識別號： 2)。編碼此分離株S蛋白質之核酸係對應到基因銀行登錄號 AY278741之第21，492-25,259個核苷酸（nt)。以下所列即為s蛋 白質之核酸與胺基酸序列。 21492 atgtttatt ttcttattat ttcttactct cactagtggt agtgaccttg 21541 accggtgcac cacttttgat gatgttcaag ctcctaatta cactcaacat acttcatcta 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow ⑧ 13.03249

21601 tgaggggggt ttactatcct gatgaaattt ttagatcaga cactctttat ttaactcagg 21661 atttatttct tccattttat tctaatgtta cagggtttea tactattaat catacgtttg 217 21 gcaaccctgt catacctttt aaggatggta tttattttgc tgccacagag aaatcaaatg 21781 ttgtccgtgg ttgggttttt ggttctacca tgaacaacaa gtcacagteg gtgattatta 21841 ttaacaattc tactaatgtt gttataegag catgtaactt tgaattgtgt gacaaccctt 21901 tetttgctgt ttctaaaccc atgggtacac agacacatac tatgatattc gataatgeat 21961 ttaattgeae tttcgagtac atatetgatg cctttteget tgatgtttca gaaaagtcag 2 2 0 21 gtaattttaa acacttaega gagtttgtgt ttaaaaataa agatgggttt ctctatgttt 2 2 0 81 ataagggeta tcaacctata gatgtagttc gtgatctacc ttctggtttt aacactttga 22141 aacctatttt taagttgcct cttggtatta acattacaaa ttttagagee attcttacag 2 2 2 01 ccttttcacc tgctcaagac atttggggca egteagetgc agcctatttt gttggetatt 22261 taaagccaac tacatttatg ctcaagtatg atgaaaatgg tacaatcaca gatgctgttg 22321 attgttetea aaatccactt gctgaactca aatgctctgt taagagettt gagattgaca 22381 aaggaattta ccagacctct aatttcaggg ttgttccctc aggagatgtt gtgagattee 22441 ctaatattac aaacttgtgt ccttttggag aggtttttaa tgctactaaa ttcccttctg 22501 tetatgeatg ggagagaaaa aaaattteta attgtgttgc tgattactct gtgctctaca 22561 actcaacatt tttttcaacc tttaagtgct atggcgtttc tgccactaag ttgaatgatc 22621 tttgcttctc caatgtctat gcagattett ttgtagtcaa gggagatgat gtaagacaaa 2 2 6 81 tagcgccagg acaaactggt gt tat tgctg attataatta taaat tgcca gatgatttea 2 2 741 tgggttgtgt ccttgcttgg aatactagga acattgatgc tacttcaact ggtaattata 2 2 8 01 at tataaata taggtatct t agacatggca aget taggee c11 tgagaga gacatateta 22861 atgtgccttt ctcccctgat ggcaaacctt gcaccccacc tgctcttaat tgttattggc 22921 cattaaatga ttatggtttt tacaccacta ctggcattgg ctaccaacct tacagagttg 22981 tagtaettte ttttgaactt ttaaatgeae cggccacggt ttgtggacca aaattatcca 23041 ctgaccttat taagaaccag tgtgtcaatt ttaattttaa tggactcact ggtactggtg 2 3101 tgttaactcc ttcttcaaag agatttcaac catttcaaca atttggccgt gatgtttctg 23161 atttcactga tteegttega gatcctaaaa catctgaaat attagacatt tcaccttgct 2 3 2 21 cttttggggg tgtaagtgta attacacctg gaacaaatgc tteatctgaa gttgctgttc 23281 tatatcaaga tgttaactgc actgatgttt ctacagcaat tcatgcagat caactcacac 23341 cagcttggcg catatattct actggaaaca atgtattcca gactcaagca ggctgtctta 23401 taggagetga gcatgtegae acttettatg agtgcgacat tcctattgga gctggcattt 6 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow

1303249 23461 gtgctagtta ccatacagtt tctttattac gtagtactag ccaaaaatct 23521 atactatgtc tttaggtgct gatagttcaa ttgcttactc taataacacc 23581 ctactaactt ttcaattagc attactacag aagtaatgcc tgtttctatg 23 641 ccgtagattg taatatgtac atctgcggag attctactga atgtgctaat 23701 aatatggtag cttttgcaca caactaaatc gtgcactctc aggtattgct 2 3 7 61 atcgcaacac acgtgaagtg ttcgctcaag tcaaacaaat gtacaaaacc 23821 aatattttgg tggttttaat ttttcacaaa tattacctga ccctctaaag 23881 ggtcttttat tgaggacttg ctctttaata aggtgacact cgctgatgct 23941 agcaatatgg cgaatgccta ggtgatatta atgctagaga tctcatttgt 24001 tcaatggact tacagtgttg ccacctctgc tcactgatga tatgattgct 24061 ctgctctagt tagtggtact gccactgctg gatggacatt tggtgctggc 2412 1 aaataccttt tgctatgcaa atggcatata ggttcaatgg cattggagtt 24181 ttctctatga gaaccaaaaa caaatcgcca accaatttaa caaggcgatt 24241 aagaatcact tacaacaaca tcaactgcat tgggcaagct gcaagacgtt 243 01 atgctcaagc attaaacaca cttgttaaac aacttagctc taattttggt 24361 gtgtgctaaa tgatatcctt tcgcgacttg ataaagtcga ggcggaggta 24421 ggttaattac aggcagactt caaagccttc aaacctatgt aacacaacaa 24481 ctgctgaaat cagggcttct gctaatcttg ctgctactaa aatgtctgag 24 541 gacaatcaaa aagagttgac ttttgtggaa agggctacca ccttatgtcc 2 4 6 01 cagccccgca tggtgttgtc 11cctacatg tcacgtatgt gccatcccag 24661 tcaccacagc gccagcaatt tgtcatgaag gcaaagcata cttccctcgt 24721 ttgtgtttaa tggcacttct tggtttatta cacagaggaa cttcttttct 24781 ttactacaga caatacattt gtctcaggaa attgtgatgt cgttattggc 24841 acacagttta tgatcctctg caacctgagc tcgactcatt caaagaagag 24901 acttcaaaaa tcatacatca ccagatgttg atcttggcga catttcaggc 24961 ctgtcgtcaa cattcaaaaa gaaattgacc gcctcaatga ggtcgctaaa 2 5021 aatcactcat tgaccttcaa gaattgggaa aatatgagca atatattaaa 2 5 0 81 atgtttggct cggctteatt gctggactaa ttgccatcgt catggttaca 25141 gttgeatgae tagttgttgc agttgcctca agggtgcatg ctcttgtggt 2 5 2 01 agtttgatga ggatgactct gagccagttc tcaagggtgt caaattacat 25259 (序列識別號：3) attgtggctt attgctatac gctaaaacct ttgcttctcc gctgaacagg ccaactttga ccaactaaga ggettcatga gcgcagaagt gcctacactg gctgctcttc acccaaaatg agtcaaattc gttaaccaga gcaatttcaa caaattgaca ctaatcaggg tgtgttettg ttcccacaag gagaggaact gaaggtgttt ccacaaataa atcattaaca ctggacaagt attaaegett aatttaaatg tggccttggt atcttgcttt tcttgctgca tacacataa 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 7 ⑧ 1303249

MFIFLLFLTLTSGSDLDRCTTFDDVQAPNYTQHTSSiyiRGVYYPDEIFRSD

TLYLTQDLFLPFYSNVTGFHTINHTFGNPVIPFKDGIYFAATEKSNVVRG

WVFGSTMNNKSQSVIIINNSTNVVIRACNFELCDNPFFAVSKPMGTQTHTM

IFDNAFNCTFEYISDAFSLDVSEKSGNFKHLREFVFKNKDGFLYVYKGYQP

IDVVRDLPSGFNTLKPIFKLPLGINITNFRAILTAFSPAQDIWGTSAAAYF

VGYLKPTTFMLKYDENGTITDAVDCSQNPLAELKCSVKSFEIDKGIYQTSN

FRVVPSGDVVRFPNITNLCPFGEVFNATKFPSVYAWERKKISNCVADYSVL

YNSTFFSTFKCYGVSATKLNDLCFSNVYADSFVVKGDDVRQIAPGQTGVI ADYNYKLPDDFMGCVLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRHGKLRPFERD工

SNVPFSPDGKPCTPPALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFELLN

APATVCGPKLSTDLIKNQCVNFNFNGLTGTGVLTPSSKRFQPFQQFGRDV

SDFTDSVRDPKTSEILDISPCAFGGVSVITPGTNASSEVAVLYQDVNCTD

VSTAIHADQLTPAWRIYSTGNNVFQTQAGCLIGAEHVDTSYECDIPIGAGI

CASYHTVSLLRSTSQKSIVAYTMSLGADSSIAYSNNTIAIPTNFSISITTE

VMPVSMAKTSVDCNMYICGDSTECANLLLQYGSFCTQLNRALSGIAAEQDR

NTREVFAQVKQMYKTPTLKYFGGFNFSQILPDPLKPTKRSFIEDLLFNKVT

LADAGFMKQYGECLGDINARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDDMIAAYTAALV

SGTATAGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKQIANQFNK

AISQIQESLTTTSTALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDI

LSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSE

CVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAIC HEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTDNTFVSGNCDVVIG工工

NNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEI

DRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYVWLGFIAGLIAIVMVTILLC CMTSCCSCLKGACSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT (序列識別號：4; 上列兩下標片段代表兩受體結合功能區。） 本發明之一型態特徵為一種單離的多肽，包括序列識別 號：4或源於序列識別號：4之免疫性片段。上述免疫性片段為 至少10個胺基酸殘基長，即，介於10至1255個胺基酸殘基長 8 0707- A20956TWF(N2);chiumeow 1303249 (序列識別號：4之長度）。此等免疫性片段之例子包括以下所示 之功能區： 功能區名稍· 在序列識別號：4中 對應胺基酸位置 序列識別號 受體結合功能區1 (RBD1) 80-227 序列識別號：6 受體結合功能區2 (RBD2) 284-735 序列識別號：8 S1 1-333 序列識別號：18 "S2 334-666 序列識別號：20 "S3 667-1000 序列識別號：22 RBD2-共有（consensus) (RBD2-C) 434-467 序列識別號：24 RBD-5 5 564-613 序列識別號：26 穿膜功能區(TM) 1128-1255 序列識別號：28 相關例子亦包括兩個或多個上列功能區之融合體，例如 RBDl-(Gly)8-TM (序列識別號：10)，RBD2_(Gly)8-TM (序列識 別號：12)，RBDl-(Gly)8-RBD2 (序列識別號：14)，以及 RBDl-(Gly)8-RBD2-(Gly)8-TM (序列識別號：16)。在這些融合 體中，不同S蛋白質片段係以8個甘胺酸之連接蛋白質連結。 其他例子包括列於表2者，請參考以下實施例6。較佳地，本發 明之多肽包括序列識別號：24或26。於一實施例中，上述多肽 為糖蛋白，其包括一多醣，如肺炎鏈球菌（S. pneumococcus)來源 之多。於另一實施例中，上述多狀為一融合蛋白，其包括一 異源多肽，上述異源多肽包括免疫球蛋白，如IgGl，之Fc分段。 較佳地，上述免疫球蛋白為IgGl，且更佳地，為人類IgGl。上 述融合蛋白也可以包括一異源多肽，上述異源多肽包括一致病 原之蛋白質的表面分段，如感冒病毒之血球凝集抗原（HA)或神 經氨酵素抗原（NA)。 一「單離的多肽」係指一多肽實質上游離於其天然存在之 相關分子，即，其乾重有至少75% (也就是介於75%至1〇〇%之 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow ⑧ 1303249 間）純度。純度可以由任何適當的標準方法測量，例如，經由管 柱層析，聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis)，或高效液態層析（HPLC analysis)。本發明之單 離的多肽可以由天然來源純化，由重組DNA技術生產，或由化 學方法取得。一「異源（heterologous)」蛋白質或核酸係由外來 種來源，或由相同種來源，但實質上由原型修飾過者。 本發明之特徵亦為一種單離的核酸，其包括編碼上述多肽 之一的序列。上述序列之例子包括（1)編碼S，RBD1，RBD2， SI，S2，S3，RBD-2C，RBD-55，以及TM者，上述分別對應 φ 於基因銀行登錄號AY278741之序列中核苷酸21492-25259， 21516-22173 ， 22344-23697 ， 21492-22481 ， 22482· 23480 ， 23481-24479，22791-22892，23181-23330，以及 24876-25257(分 別為序列識別號：3，5，7，17，19，21，23，25，以及27)。 以下所列為編碼 RBDl_(Gly)8_TM，RBD2_(Gly)8-TM， RBDl-(Gly)8-RBD2,以及 RBDl-(Gly)8-RBD2-(Gly)8-TM 融合蛋 白之例示序列（依序分別為序列識別號：9，11，13，以及15 ; 其間連接係以大寫字母表示）： 序列識別號：9

catacgtttg aaatcaaatg gtgattatta gacaaccc11 gataatgcat gaaaagtcag ctctatgttt aacactttga GAATTCGGGG act tcaaaaa gcaaccctgt ttgtccgtgg ttaacaattc tctttgctgt ttaattgcac gtaattttaa ataagggcta aacctatttt GCGGGGGTGG t catacat ca catacctttt ttgggttttt tactaatgtt 11ctaaaccc tttcgagtac acacttacga tcaacctata taagttgcct AGGTGGTGGC ccagatgt tg aaggatggta ggttctacca gttatacgag atgggtacac atatctgatg gagtttgtgt gatgtagttc cttggtatta t cat t atct tggcga tttattttgc tgaacaacaa catgtaac11 agacacatac ccttttcgct t taaaaataa gtgatctacc acat tacaaa caaagaagag ca111 caggc tgccacagag gt cacagteg tgaattgtgt tatgatattc tgatgtttca agatgggttt ttctggtttt ttttagagee ctggacaagt attaaegett 10 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 1303249. ctgtcgtcaa cattcaaaaa gaaattgacc gcctcaatga ggtcgctaaa aatttaaatg aatcactcat tgaccttcaa gaattgggaa aatatgagca atatattaaa tggccttggt atgtttggct cggc11catt gctggactaa ttgccatcgt catggttaca atcttgcttt gttgcatgac tagttgttgc agttgcctca agggtgcatg ctcttgtggt tcttgctgca agtttgatga ggatgactct gagccagttc tcaagggtgt caaattacat tacaca 序列識別號：11 gagattgaca aaggaattta ccagacctct aatttcaggg ttgttccctc aggagatgtt gtgaga11 cc ctaatattac aaacttgtgt ccttttggag aggtttttaa tgctactaaa ttcccttctg tctatgeatg ggagagaaaa aaaatttcta attgtgttgc tgattactct gtgctctaca actcaacatt tttttcaacc tttaagtgct atggcgtt tc tgccactaag ttgaatgatc tttgettctc caatgtctat gcagattctt ttgtagtcaa gggagatgat gtaagacaaa tagcgccagg acaaactggt gt tat tgctg at tataat ta taaattgcca gatgatttea tgggttgtgt ccttgcttgg aatactagga acattgatgc tacttcaact ggtaat t a ta attataaata taggtatett agacatggca agettaggee ctttgagaga gacatateta atgtgccttt ctcccctgat ggcaaacctt gcaccccacc tgetettaat tgttattgge cattaaatga ttatggtttt tacaccacta ctggcattgg ctaccaacct tacagagt tg tagtactttc ttttgaactt ttaaatgcac cggccacggt ttgtggacca aaat tat cca ctgaccttat taagaaccag tgtgtcaatt ttaattttaa tggactcact ggtactggtg tgttaactcc ttcttcaaag agatttcaac catttcaaca atttggccgt gatgtttctg atttcactga ttccgttcga gatcctaaaa catctgaaat attagacatt tcaccttget cttttggggg tgtaagtgta attacacctg gaacaaatgc ttcatctgaa gttgctgttc tatatcaaga tgttaactgc actgatgttt ctacagcaat teatgeagat caactcacac cagcttggcg catatattet actggaaaca atgtattcca gactcaagca ggctgtct ta taggagctga gcatgtcgac acttettatg agtgcgacat tcctattgga gctggeat 11 gtgctagtta ccatacagtt tetttattac gtagtactag ccaaaaatct attgtggctt atactatgtc tttaggtgct gatagttcaa ttgettactc taataacacc at tgetatac ctactaactt ttcaattagc at tactacag aagtaatgee tgtttetatg gctaaaacct ccgtagattg taatatgtac atctgcggag at tctactga atgtgctaat ttgcttctcc aatatggGCG GCCGCCTGGG GGCGGGGGTG GAGGTGGTGG Ctcatt caaagaagag ctggacaagt act tcaaaaa tcatacatca ccagatgt tg at ct tggega 11 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 1303249 catt tcaggc attaacgc11 ctgtcgtcaa cattcaaaaa gaaattgacc gcctcaatga ggtcgctaaa aat11aaatg aatcactcat tgaccttcaa gaattgggaa aatatgagca atatattaaa tggccttggt atg11tggct cggcttcatt gctggactaa ttgccatcgt catgg11 aca atcttgcttt gttgcatgac tagttgttgc agttgcctca agggtgcatg ctct tgtggt tcttgctgca agtttgatga 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attataatta taaattgcca gatgatttea tgggttgtgt ccttgcttgg aatactagga acat tgatgc tacttcaact ggtaattata at tataaata taggtatett agacatggca agettaggee ctttgagaga gacatatcta atgtgccttt ctcccctgat ggcaaacc11 gcaccccacc tgctcttaat tgt tat tggc cattaaatga ttatggtttt tacaccacta ctggcattgg ctaccaacct tacagagttg tagtaetttc ttttgaactt t taaatgcac cggccacggt ttgtggacca aaattatcca ctgaccttat taagaaccag tgtgtcaat t ttaattttaa tggactcact ggtactggtg tgttaactcc ttcttcaaag agat 11caac catttcaaca atttggccgt gatgtttctg atttcactga ttccgttcga gatcctaaaa catctgaaat attagacatt tcaccttgct cttttggggg tgtaagtgta 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 12 ⑧ 1303249 attacacctg actgatg111 actggaaaca acttcttatg tctttattac gatagt t caa attactacag atctgcggag gaacaaatgc ctacagcaat atgtattcca agtgcgacat gtagtactag ttgcttactc aagtaatgcc attctactga ttcatctgaa tcatgcagat gactcaagca tcc tattgga ccaaaaatct taataacacc tgtttctatg atgtgctaat gttgctgttc caactcacac ggctgtctta gctggcattt at tgtggct t at tgctatac gctaaaacct ttgcttctcc tatatcaaga 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acattgatgc tacttcaact ggtaattata attataaata agacatggca age11aggee etttgagaga gacatatcta atgtgccttt ggcaaacc11 gcaccccacc tgetettaat tgttattgge cattaaatga tacaccacta ctggcattgg ctaccaacct tacagagttg tagtaetttc 11aaatgeae cggccacggt ttgtggacca aaattatcca ctgaccttat tgtgt caa11 ttaattttaa tggactcact ggtactggtg tgttaactcc tgccacagag gtcacagtcg tgaattgtgt tatgatattc tgatgt 11ca agatgggt 11 ttctggtttt ttttagagee ccagacctct aaacttgtgt ggagagaaaa tttttcaacc caatgtctat acaaactggt ccttgcttgg taggtatett ctcccctgat ttatggtttt 111 tgaac11 taagaaccag 11 c11caaag

0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 13 ⑧ 13,03249 agatttcaac catttcaaca atttggccgt gatgtttctg atttcactga ttccgttcga gatcctaaaa catctgaaat attagacatt tcaccttget cttttggggg tgtaagtgta attacacctg gaacaaatgc 11catctgaa gttgctgttc tatat caaga tgttaactgc actgatgttt ctacagcaat tcatgcagat caactcacac cagct tggcg catatattct actggaaaca atgtat tcca gactcaagca ggctgtctta taggagctga gcatgt egae acttcttatg agtgcgacat teetattgga gctggcattt gtgctagtta ccatacagtt tctttattac gtagtactag ccaaaaatct attgtggctt atactatgtc tttaggtgct gatagttcaa ttgettactc taataacacc attgctatac ctactaactt ttcaattage attactacag aagtaatgee tgtttctatg gctaaaacct ccgtagat tg taatatgtac atctgcggag attctactga atgtgctaat ttgettctcc aatatggGCG GCCGCCTGGG GGCGGGGGTG GAG6TGGTGG C t c a 11 caaagaagag ctggacaagt acttcaaaaa teatacatca ccagatgt tg atettggega cattteagge at taaegett ctgtcgtcaa cattcaaaaa gaaattgacc gcctcaatga ggtcgctaaa aatttaaatg aatcactcat tgaccttcaa gaat tgggaa aatatgagea atatattaaa tggeettggt atgtttggct cggcttcatt gctggactaa ttgccatcgt catggttaca atcttgcttt gttgeatgae tagt tgt tgc agttgcctca agggtgcatg ctcttgtggt tcttgctgca agtttgatga ggatgactct gagccagttc tcaagggtgt caaat tacat tacaca 本發明之 核酸的其他例子包括編碼列示於表2之多肽的核

酸。於一較佳實施例中，上述核酸包括序列識別號：23或25。

一「核酸」係指一 DNA分子（如一 cDNA或基因體DNA)， 一 RNA分子（如一 mRNA)，或一 DNA或RNA之類似物。一 DNA 或RNA之類似物可以由核苷酸之類似物合成。核酸分子可以為 單股或雙股，但較佳為雙股DNA。一 r單離的核酸」為一核酸 其結構不同於任何天然存在之核酸或任何天然存在之基因體核 酸片段。因此，此用語包含，例如（a)具有天然存在基因 分子之部分序列，但不為該生物體天然存在時之基因體中跨越 該分子部分之兩編碼序列所跨越；（b)併入一載體或一原核或真 核生物基因體DNA之核酸，其導致該分子不同於任何天然存^ 之載體或基因體DNA ; (c)—單離的分子，如一 cDNA，一基因 14 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow ⑧ 1303249 . 體片段，一聚合健反應（PCR)產生之片段，或一限制片段；以 及（d) —重組核苷酸序列’其為一雜合基因之部分，即編碼一融 合蛋白之基因。上述核酸可用於表現本發明之多肽。由此’可 操作性地將上述核酸連接到適當調控序列以得到一表現載體。 一「載體」係指一核酸分子可轉移另一核酸分子至其連接 者。載體可以自主複製（autonomous rePlicati〇n)或插入一宿主 DNA。載體的例子包括質體，粘接質體（cosmid)，或病毒載體。 本發明之載體包栝〆核酸於適於一宿主細胞表現該核酸之型 態。較佳地，上述載體包或一或多個調控序列’操作性地連結 φ 到欲表現之核酸上。一「調控序列」包括啟動子，增強子，以 及其他表現控制元件（例如多聚腺核脊酸化訊息）。調控序列包括 指引核苔酸序列構造表現者，以及組織專一性調控及/或誘導序 列。表現載體之設計可依以下因子而定’如欲轉形之宿主細胞 的選擇，所欲表現之蛋白質的表現程度等。表現載體可以導入 宿主細胞以產生本發明之多肽。本發明之範疇亦包括一宿主細 胞，其包括上述核酸。宿主細胞的例子包括大腸桿菌（E. coli)細 胞，昆蟲細胞（如採用桿狀病毒表現載體（baculovirus expression vectors))，酵母細胞，或哺乳類細胞。請參考如Goeddel，（1990) _ Gene Expression Technology： Methods in Enzymology 185, Academic Press，San Diego, CA。為得到本發明之多肽，可將宿 主細胞培養於允許編碼本發明核酸之多肽表現的培養基中，以 及由培養細胞或該細胞之培養基純化上述多肽。或者，本發明 之核酸可以於活體外轉錄以及轉譯，例如，採用T7啟動子調控 序列以及T7聚合酶。 本發明之多肽及核酸可用於誘導一個體之免疫反應（即產 生專一性抗體）以對抗冠狀病毒，係經由投與上述個體一有效量 之多肽或編碼上述多肽之核酸。也可以用於產生專一性抗體， 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 15 1303249. 其可專一性結合至具有序列識別號：4之序列或其片段的多 肽。更特別地，可經由投與一非人類動物上述多肽或核酸而產 生抗體。因此，本發明之範疇内亦包括一組合物，其含有上述 多肽或核酸；以及一藥學上可接受載體。上述組合物可以用於 產生抗體。可由上述個體或上述非人類動物純化該抗體，並經 標準程序產生單株抗體。 。 可採用上述抗體診斷一個體之冠狀病毒感染，如 SARS-CoV感染，其係經由偵測含有序列識別號·· 4之多肽或其 免疫性片段存在於個體取得之測試樣品中。測試樣品中存有多 鲁肽代表該個體受冠狀病毒感染。也可以經由偵測存在於試驗樣 品中之專一性抗體，其可抗含有序列識別號：4之多肽或其免疫 性片段，而診斷個體之冠狀病毒感染。測試樣品中存有抗體亦 代表該個體受冠狀病毒感染。 本發明之範疇亦包括一種治療冠狀病毒感染的方法。上述 方法包括投與有需要的個體一有效量之一或多個上述多肽或抗 體。用語「治療」係定義為投與一組合物至一個體，以治療， 緩和，減輕，治療，預防，或改善一失調，該失調之症狀，繼 發於該失調之疾病狀態，或易染該失調之傾向。一「有效量」 籲為該組合物之劑量可產生醫藥上所欲達到的效果，例如，如上 述治療個體。 本發明之一或多個實施樣態的詳細内容將於以下說明。本 發明之其他優點，特徵，以及目的將經由以下詳細說明與申請 專利範圍而更為顯明。 【實施方式】 本發明係有關於冠狀病毒，如SARS病毒，之S蛋白質的 受體結合功能區或免疫性片段。由於這些功能區媒介了冠狀病 〇707-A20956TWF(N2)；chiumeow 16 1303249 , 毒之標定細胞結合與進入或誘導免疫反應，其可作為診斷或治 療冠狀病毒感染之標的。 本發明之多肽包括S蛋白質之序列，如序列識別號·· 4或 其免疫性片段。其亦可包括SARS CoV TW1，Tor-2，SIN2500， SIN2774，SIN2748，SIN2677，SIN2679，CUHK-W1，HKU39849， GZ01，BJ01，BJ02，BJ03，BJ04以及其他分離株之S蛋白質序 列。於一特定實施例，該多肽包括S蛋白質之受體結合功能區 或其功能性等價物。蛋白質受體結合功能區之功能性等價物係 才曰由私狀病毒S蛋白質衍生之多狀，如融合多狀或具有一或多 # 個點突變，插入，缺失，截短，或上述組合之多肽。特別是， 此等功能性等價物包括不同於s蛋白質之多肽，其序列有一或 多個保留性胺基酸取代，或其序列有一或多個非保留性胺基酸 取代、缺失、或插入。此等功能性等價物可以由一核酸所編碼， 該核酸係於高度嚴苛條件下雜交於一探針，該探針係由以下序 列所組成：序列識別號：3，5，7，9，11，13，15，17，19， 21 ’ 23，或25 °用語「高度嚴苛條件下雜交」係指於6χ氣化 鈉/擰檬酸納（SSC)，約45°C下雜交，接著以〇·2 X SSC，0.1% SDS’於50-65°C下清洗一或多次。上述功能性等價物保有實質 ® 上冠狀病毒之受體結合功能區，如SRAS CoV S蛋白質，即結 合至標的細胞，包括VERO E6，NIH3T3細胞。此活性可由以下 實施例所述之試驗所彳貞測。 本發明之多狀可以由合成多肽或重組多肽獲得。為製備重 組多肽，編碼該多肽的核酸可連接到另一編碼融合對象之核 酉文’例如谷胱每肽硫轉移酶（Giutathione-S-Transferase，簡稱 GST) ’ 6x-His抗原決定位標籤，或M13基因3蛋白質。所得融 合核酸於適當宿主細胞表現一融合蛋白，其可由習知方法分 離。所分離之融合蛋白可以再度處理，例如經酵素消化，以除 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow ^ 1303249 去融合對象’並獲得本發明之重組多狀。 本發明之多肽可用於動物（以生產抗體）或人類（以治療疾病） 產生抗體。在動物中製備單株與多株抗體及其片段的方法皆為 習知方法。請參考如 Harlow 與 Lane，（1988) Antibodies: A Laboratory M anual，Cold S pring Harbor L aboratory，N ew York。 用語「抗體」包括完整分子及其片段，如Fab，F(ab，)2, Fv，scFv (單鏈抗體），以及dAb (功能區抗體；Ward等人（1989) Nature，341， 544)。這些抗體可以用於偵測s多肽，如偵測是否一個體取得 之測試樣品含有冠狀病毒，或鑑定結合至該多肽之化合物。由 • 於這些抗體干擾冠狀病毒之細胞結合與進入，故可用於治療冠 狀病毒感染。 一般而言’為產生抗一多肽之抗體，將該多肽結合至一載 體蛋白質，如KLH，與一佐劑混合，且注射入一宿主動物。該 動物所產生之抗體可以經胜肽親和性層析純化。常用的宿主動 物包括兔，小鼠，天竺鼠，以及大鼠。各種可用於增強免疫反 應之佐劑，係依據宿主種類以及包括費氏佐劑（Freund’s adjuvant，完全或不完全），礦物膠如氫氧化鋁，CpG，表面活性 劑如脫脂酸卵填脂（lysolecithin)，普朗尼克多元醇（pluronic Φ polyols)，聚陰離子（polyanions)，胜肽，油乳化劑，透孔帽貝血 氰蛋白（keyhole limpet hemocyanin)，以及二石肖基紛 (dinitrophenol)。有用的人類佐劑包括卡介苗（簡稱BCG，bacille Calmette-Guerin)以及短小棒狀桿菌（Corynebacterium parvum) 〇 多株抗體，即抗體分子之異源性族群，會存在於接受免疫 之個體的血清中。單株抗體，即抗本發明多肽之抗體的同源性 族群，可以標準融合瘤技術製備（參見，如Kohler等人（1975) Nature 256，495; Kohler 等人（1976) Eur. J· Immunol. 6，511; Kohler 等人（1976) Eur J Immunol 6, 292;以及 Hammerling 等人 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 18 ⑧ 1303249 (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier， N.Y_)。特別是，單株抗體可以由任何提供生產抗體分子之技術 獲得，例如經由培養連續細胞株，如Kohler等人所述（1975) Nature 256, 495以及美國專利第4,376,110號；由人類B細胞融 合瘤技術（Kosbor 等人（1983) Immunol Today 4，72; Cole 等人 (1983) Proc· Natl· Acad. Sci· USA 80, 2026 ;以及 EBV-融合瘤技 術（Cole 等人（1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy， Alan R. Liss，Inc·，pp· 77-96)。此等抗體可以屬於任何免疫球蛋 白類，包括IgG，IgM，IgE，IgA，IgD，以及其次類。產生本 φ 發明之單株抗體的融合瘤可以培養於活體外或活體内。於活體 内產生高力價單株抗體之能力將為特別有用的生產方法。 此外，也可以採用為生產「後合抗體（chimeric antibodies) 」所發展之技術。可參考Morrison 等人（1984)Proc·Natl·Acad· Sci. USA 81，6851; Neuberger 等人（1984) Nature 312，604;以及 Takeda等人（1984) Nature 314:452。嵌合抗體為其中不同部分源 自不同動物種類者，例如具有源自一鼠類單株抗體之可變區以 及一人類免疫球蛋白固定區。選擇性地，生產單鏈抗體之技術 (美國專利第4,946,778號及第4,704,692號）可以改造為生產單 # 鏈Fv抗體之噬菌體基因庫。單鏈抗體係經由胺基酸橋連接Fv 區域之重鏈與輕鏈片段。而且，抗體片段可以由習知技術產生。 例如，此等片段包括，但不限於，由胃蛋白酶消化抗體分子而 得之F(abf)2片段，減少F(ab’)2片段之雙硫架橋而產生之Fab片 段。抗體也可以由習知方法人類化。例如，帶有所欲結合專一 性之單株抗體可以以商業方式人類化（Scotgene，Scotland; and Oxford Molecular，Palo Alto, Calif·)。完全人類抗體，如表現於 轉基因動物者，也為本發明之特徵（參見如Green等人（1994) Nature Genetics 7，13;以及美國專利第5,545,806號及第 0707-A20956TWF(N2);ch 丨 umeow 19 1303249 · 5,569,825 號）。 本發明之多肽也可以用於製備一種免疫性組合物（如疫 苗），以於一對冠狀病毒有感受性之個體產生抗冠狀病毒（如 SRAS CoV)之抗體。此等組合物可以經由如以下實施例所列示 之方法，或任何其他等效習知方法所製備。上述組合物包括一 有效量之本發明多肽，以及一藥學上可接受載體，如磷酸生理 鹽水或重碳酸溶液。上述載體係基於投與方法與途徑，以及標 準藥學實踐（pharmaceutical practice)而選擇。適當的藥學載體與 稀釋劑，以及藥學上必須使用者，如Remington’s Pharmaceutical ^ Sciences所述。視需要，本發明之組合物亦可包括一佐劑，如 霍亂毒素，大腸桿菌财熱腸毒素（heat-labile enterotoxin，簡稱 LT)，微脂粒，免疫刺激複合物（immune-stimulating complex，簡 稱ISCOM)，或免疫刺激序列寡去氧核苔酸（immunostimulatory sequences oligodeoxynucleotides，簡稱 ISS-ODN)。S 蛋白質， 其片段或類似物或胜肽可以為抗呼吸道疾病疫苗之多價組合物 的成分。此等多價組合物包括至少一上述S蛋白質之免疫性片 段，以及至少一由感冒病毒、副感冒病毒3 (para-influenza virus 3)、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)、卡他布蘭漢氏菌 _ (Branhamella (Moroxella) catarrhalis)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、或呼吸道融合瘤病毒（respiratory syncytial virus)分離之保護抗原，佐劑則可有可無。 製備疫苗之方法通常為本領域所熟知，例如美國專利第 4,601，903 號；第 4,599,231 號；第 4,599,230 號；以及第 4,596,792 號。疫苗可以製備為注射用，為液體溶液或乳劑。S蛋白質，其 片段或類似物或對應於S蛋白質之胜肽可以與生理上可接受與 可相容之賦形劑混合。賦形劑可包括水，生理鹽水，右旋糖 (dextrose)，甘油，以及上述之組合。疫苗可更包括少量輔劑， 20 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 3 1303249· 如濕化或乳化劑，pH緩衝劑，或佐劑以增強疫苗效果。使疫苗 達到佐劑效果之方法包括採用氫氧化鋁，或磷酸鹽（明礬），常採 用於磷酸生理鹽水之0.05至0·1百分比溶液。疫苗可以非經胃 腸投與，經由皮下或肌肉注射。選擇性地，包括栓劑與口服配 方之其他投與方式也可以使用。使用栓劑時，黏結劑與載體可 包括，例如聚亞烧基二醇（polyalkyleneglycols)或三酸甘油6旨。 使用口服配方時，可包括一般使用之起始劑（incipients)，例如醫 藥級的糠精，纖維素，碳酸鎂等。這些組合物可為溶液，懸浮 液，錠劑，藥丸，膠囊，持續釋放配方或粉末，且包括10-95% φ 之S蛋白質，其片段或類似物，或胜肽。 上述疫苗係以適合的劑量配方投與，且其含量具有醫療上 有效性，保護性以及免疫性。投與的量係依據受治之個體，包 括，例如個體免疫系統合成抗體之能力，以及若需要時，產生 細胞媒介之免疫反應的能力。精確地活性成分投與需要量係依 臨床醫師之判斷。然而，適當劑量範圍可容易地由熟於此技藝 人士所決定，且可屬本發明多肽指示之毫克數。開始投與與後 續劑量之適當療法也是可改變的，但可包括一開始之投與，接 著再次投與。疫苗之劑量可依投與途徑與宿主大小而異。 • 因多肽可能不具備足夠長的半衰期，在活體内使用時也許 需先將胜肽以化學方法修飾過。化學修飾過之胜肽或胜肽類似 物包括任何該胜肽之功能性化學等價物，以其實施於本發明時 增加活體類或活體外之穩定性及/效力為特徵。此處所述之用語 「胜肽類似物」，也指一胜肽之任何胺基酸衍生物。胜肽類似 物可以經由以下方法產生，包括，但不限於，側鏈之修飾，在 胜肽合成時併入非自然之胺基酸及/或其衍生物，以及應用交聯 劑與其他方法對該胜肽或其類似物加入構造限制。側鏈修飾的 例子包括胺基酸修飾，如經由與醛反應，接著以NaBH4還原使 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 21 1303249 其還原烧基化；以甲基亞氨逐乙酸酯（methylacetimidate)使其醯 胺化；以醋酸酐使其乙醯化；以氰酸酯使胺基發生胺基甲醯化 (carbamylation);以 2, 4, 6-三硝基苯確酸（2, 4, 6, trinitrobenzene sulfonic acid，簡稱 TNBS)使胺基發生三硝基苄基化 (trinitrobenzylation); 以無水琥ίό酸與四氳苯酐 (tetrahydrophthalic anhydride)使胺基發生燒基化；以及以填酸°比 口多酸（pyridoxa-5’-phosphate)使離胺酸發生ϋ比口多酸化 (pyridoxylation)，再以NABHU還原之。精胺酸殘基之脈基可經 由如 2,3_丁二酮，苯乙二駿（phenylglyoxal)以及乙二酸（glyoxal) φ 之反應劑形成異環縮合產物而修飾。羧基之修飾可以經由〇-醯 基異脲形成作用而造成碳二亞胺（carbodiimide)活化，接著進行 後續之衍生化，例如至一對應之醯胺。硫氫基之修飾可經由如 以碘代乙酸或碘代乙醯胺進行羧甲基化；對半胱胺磺酸之過氧 酸氧化作用；以其他硫醇化合物形成混合的二硫化物；與馬來 硫亞胺、馬來酐或其他經取代的馬來硫亞胺反應；採用4-氣汞 苯曱酸酯（4-chloromercuribenzoate)，4_氯汞苯基確酸 (4-chloromercuriphenylsulfonic acid)，氯化苯基采 (phenylmercury chloride) ， 2氣汞-4-石肖 基酴 鲁 （2-chloromercuric_4-nitrophenol)以及其他汞製劑以形成汞衍生 物；於鹼性pH環境下以氰酸酯進行胺甲醯化。色胺酸殘基之修 飾可以經由，例如，以N-溴琥珀硫亞胺氧化或以2-羥基-5-硝基 T基嗅化物（2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide)或石黃醯鹵化物 (sulphonyl halides)烧化引 D朵環。酷胺酸殘基可經由以四石肖基 甲烷進行硝化反應形成一 3-硝基酪胺酸衍生物。組胺酸殘基之 咪唑環的修飾可以經由以碘乙酸衍生物進行烷基化或以焦碳酸 二乙酯進行N-碳乙氧基化而達成。在胜肽合成過程併入非自然 胺基酸與衍生物的例子包括，但不限於，使用正白胺酸，4-胺 0707-A20956TWF(N2) ；chiumeow 22 ⑧ 1303249 基丁酸，4-胺基-3-羥基-5-苯基戊酸，6-胺基己酸，t-丁基甘胺 酸，正纈胺酸，苯基甘胺酸，鳥胺酸，肌胺酸，4-胺基-3-羥基 -6-甲基庚酸，2-—硫二烯伍圜基丙胺酸以及/或胺基酸之右旋異 構物（D-isomers)。 本發明之核酸分子也可以直接用於進行免疫，係將核酸以 活載體，如沙門氏菌，BCG，腺病毒，疫病毒或牛痘病毒直接 投與個體。以核酸進行之免疫方法係本領域所熟知。 對於冠狀病毒感染具感受性之個體經鑑定後可投與本發明 之含有多狀的組合物。上述組合物之劑量係依熟於本技術領域 φ 者所決定，例如，在特定多肽，是否同時投與佐劑，同時投與 之佐劑的種類，投與方式與頻率等。視需要可重複投與，此亦 可由熟於本技術領域者決定。例如，初始劑量後可隔週補強三 次。補強注射可在第一次免疫後第4至8週給予，而第二次補 強注射可在第8至12週給予，並採用同樣配方。由個體取得血 清或T·細胞以測試上述組合物所激發之抗冠狀病毒S蛋白質或 感染之免疫反應。測試抗體或細胞毒性T細胞抗一蛋白質或感 染之方法係本領域所熟知。另加的補強劑可以視需要給予。當 改變多狀的量，組合物的劑量，以及投與頻率時，可相應修正 # 免疫程序以激發最大免疫反應。大規模投與之前，需進行效力 試驗。於進行效力試驗時，可經口服或非經胃腸道投與本發明 之組合物至一非人類個體。初始投與或適當補強投與之後，測 試個體與對照個體（接受偽投與）會接受ld5G劑量的冠狀病毒之 挑戰。結果亦可採用終點（end point)而非致死率。效力係以是否 接受組合物之個體死亡速度慢於對照個體決定。死亡率之差異 即具有統計上顯著差異。 上述S蛋白質及其片段可以作為載體並連接至另一感興趣 之抗原以產生抗該抗原的抗體。S蛋白質或其片段通常可以用於 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 23 ⑧ 1303249 製備嵌合分子與共軛組合物以抗致病菌，包括有莢膜包覆的細 菌。例如本發明之糖共軛物可應用於免疫一個體以產生抗細菌 之抗體以及賦予該個體抗任何具有多糖抗原細菌之感染的保護 作用，上述具有多糖抗原細菌為如流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae)，肺炎鍵球菌（Streptococcus pneumoniae)，大腸桿菌 (Escherichia coli)，腦脊髋膜炎雙球菌（Neisseria meningitides)， 沙門氏傷寒桿菌（Salmonella typhi)，轉糖鏈球菌（Streptococcus mutans)，新生隱球菌（Cryptococcus neoformans)，克雷伯菌 (Klebsiella)，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)，以及綠 • 膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa)。此外，S蛋白質或其片段作為 載體時，可以用於誘導針對腫瘤細胞異常多糖之免疫性，由此 產生抗腫瘤抗體，而可應用於化學治療或診斷。 本發明之範疇亦包括一種診斷方法，其係採用上述多肽或 抗體。個體中存在有多肽或抗體代表該個體受冠狀病毒感染。 為偵測抗體或多肽，可由個體取得試驗樣品，並以標準技術偵 測樣品中是否有抗體或多肽，上述標準技術包括ELISA，免疫 沈澱，免疫螢光染色，EIA，RIA，以及西方墨潰分析。 本發明之核酸可作為雜交探針以於樣品中鑑定冠狀病毒， _ 如SARS C〇v。上述樣品可以為臨床樣品，包括滲出物，體液（如 血清，羊水，中耳滲出液，痰，肺泡灌洗液）以及組織。可採用 各種雜交條件以達到探針對標的序列不同程度的選擇性。高度 選擇性需要嚴苛條件，如發明内容中所述者。 雜父反應可以於溶液或固態環境中進行，於固態環境中， 樣品中之測試序列會固定於一選擇性基質或表面。固定的核酸 會在所需環境下專一性雜交於其所選擇的、包括本發明之核酸 的探針。所選擇的環境係依基於特定條件之特定環境而定，例 如，基於G+C含量，標的核酸種類，核酸來源，雜交探針之大 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 24 ⑧ 1303249 小等。清洗雜交表面以去除非專一性結合的探針分子後，以標 定方法偵測或定量專一性的雜交。所選擇的探針應為至少18 bp，且介於30 bp至90 bp的長度之間。 此外，對應於本發明之含有S蛋白質受體結合功能區如 RBD1與RBD2之核苷酸序列的小干擾RNA (SiRNA)也可以用 於活體内阻斷SARS CoV複製。 本發明之多肽也可以用於一種鑑定用於治療冠狀病毒，如 SARS CoV之感染的化合物之篩選方法。上述方法包括（1)將本 發明之多肽與一適當細胞接觸，該細胞結合有冠狀病毒；以及 φ (2)在一測試化合物存在或不存在時，偵測該多肽與該細胞之結 合程度。在該測試化合物存在時之結合程度若低於該測試化合 物不存在時，代表該測試化合物可用於治療冠狀病毒感染。上 述細胞的例子包括VERO E6細胞’ NIH3T3細胞’ HeLa細胞’ BHK-21細胞，以及COS-7細胞。其他能結合冠狀病毒的細胞 也可以使用。 上述多肽與抗體可用於治療一冠狀病毒，如SARS，之感 染。因此，本發明之特徵亦為一種治療SARS的方法，例如， 經由投與一所需個體一有效量的本發明之多肽，抗體，或化合 Φ 物。待治療的個體可以鑑定為具有，或有危險獲得，一 SARS 特徵症狀。上述方法可以單獨施行或與其他藥物或治療法一起 進行。 因此，本發明之範疇亦包括一種藥學組合物，其包括一藥 學上可接受載體以及一有效量之本發明的多肽，抗體，或化合 物。上述藥學組合物可用於治療冠狀病毒，如SARS，之感染。 上述藥學上可接受載體包括一溶劑，一分散介質，一包覆劑， 一抗細菌與抗黴菌劑，以及一等張與延緩吸收劑。 於一活體内方法中，本發明之組合物（如含有本發明之多 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 25 ⑧ 1303249 肽’抗體，或化合物之組合物）係投與至一個體。通常上述抗體 或化合物係懸浮於一藥學上可接受載體中（如生理鹽水），並經由 口服投與，或經由靜脈點滴，或皮下，肌肉内，椎管内，腹腔 内，直腸内，陰道内，鼻内，胃内，氣管内，或肺内注射或植 入投與。 所需劑量係依投與途徑之選擇；配方之性質；個體疾病性 質；個體大小，重量，表面積，年齡，及性別；其他投與之藥 物；以及主治醫師之診斷而定。適當劑量係介於0〇1_1〇〇〇毫 克/公斤。考量到可用的組合物種類與種種投與途徑之不同效 力，可預期所需劑量將會有很大的差異性。例如，可預期口服 投與需要高於靜脈注射之劑量。這些劑量範圍的差異性可採用 本領域熟知之一般經驗程序進行最佳化調整。將組合物封裝於 適當遞送載體（如，高分子微粒（P〇lymeric micr〇particle)或可植 入之裝置）可以增加遞送效力，特別是口服遞送時。 本發明之藥學組合物可以採用傳統方法配方為不同投與途 徑之劑量形式。例如，可以配方為膠囊，凝膠密封seai)， 或錠劑，以便口服投與。膠囊可包括任何標準藥學上可接受材 料，如明膠或纖維素。錠劑可以依照一般程序配方，係壓縮上 述組合物之混合物與一固態載體及一潤滑劑。固態載體之例子 包括澱粉及糖黏土（sugar bentonite)。上述組合物可以配方為劑 型為-硬殼錠齊 1或一含黏結劑之膠囊，i述黏，吉劑為如乳糖或 甘露糖醇，-般填充劑，以及製錠劑。上述藥學組合物也可以 非經胃腸道途徑投與。非經胃腸道之劑型的例子包括水溶液， 等張鹽水或5%葡萄糖之活性劑，或其他習知之藥學上可接受軾 形劑。裱糊精，或其他本領域所熟知之溶解劑可作為藥學賦形 劑以遞送治療劑。 ^ 本發明之組合物的效力可以在活體外或活體内進行評估。 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 26 1303249 簡單地說，可於活體外測試上述組合物抑制冠狀病毒與其標的 細胞間結合之能力。至於活體内實驗，上述組合物可注射入一 動物（如，一小鼠模式），再評估其治療效果。基於以上結果，可 確定適當劑量範圍與投與途徑。 以下特定實施例僅係用以說明本發明，而非限定本發明揭 露之任何範圍。不需另加闡述，相信熟於此技藝領域人士可基 於本發明說明，對本發明作最廣度之應用。此處所引用之所有 出版品皆以其整體列入本案作為參考。 實施例1 於此實施例中，選殖出編碼SARS CoV之S蛋白質的基因。 由台灣之病患分離出一株SARS CoV，命名為“SARS-CoV TW1”。根據歐巴尼株（Urbani strain)(序列識別號：1)或SARS CoV TOR2株之序列，設計七組PCR引子。引子5’端在歐巴尼 株基因體中之位置列示於下表。 5’引子 3’引子 第 1 對 21，492 22,000 第 2 對 22,000 22,600 第 3 對 22,600 23,100 第 4 對 23,075 23,780 第 5 對 23,765 24,320 第 6 對 24,300 24,875 第 7 對 24,850 25,244 經PCR反應分別產生7個產物，將之連接起來以形成編碼 S蛋白質之序列。將上述序列次選殖到pUC 19以得到pUC 19/S， 並用於轉形至大腸桿菌HB101株。由兩大腸桿菌HB101之選質 株製備質體DNA，並以ABI 370A DNA定序儀定序。之後的序 列分析顯示此序列有3個鹼基對不同於TOR2株取得者，而與 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 27 1303249. 由人類229E株取得者有約30.1%相同。 同時選殖與表現SARS CoV之Μ與E蛋白質（基因銀行登 錄號ΑΑΡ13443與13444)。E-Μ融合蛋白對應到序列識別號：1 之第一個開放讀碼區的8751至9057殘基。含有Ε與Μ蛋白質 基因之DNA質體的構築係經由一般分子生物方法進行 (Sambrook 等人（1989) Molecular cloning: a laboratory manual· 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York.)。構築體採用一以PUC為基之表現載體，其可達到報導 基因之最理想表現狀態。每個載體採用人類巨細胞病毒啟動 φ 子，增強子，内含子A，以及牛生長荷爾蒙之終止與多聚腺苷 酸酸化序列。並採用組織胞漿素原活化子訊息序列以增強表現 程度。更將Μ與E蛋白質表現於宿主細胞以產生類病毒顆粒。 實施例2 已知在SARS CoV中原產S蛋白質僅有小量表現。為得到 大量S蛋白質，需要將之表現於異源系統，如大腸桿菌，或修 飾SARS CoV以便增加原產S蛋白質之表現。 將上述PUC19/S轉形至大腸桿菌以表現S蛋白質。發現全 長重組S(rS)蛋白質並不能在大腸桿菌中表現。故構築出編碼融 # 合到Myc-His標籤之不同S蛋白質片段的載體，並轉形到大腸 桿菌中。上述片段包括S蛋白質之N端第80-228個胺基酸（受 體結合功能區1 ;簡稱RBD1)，包括S蛋白質第284-735個胺基 酸的中間區域（受體結合功能區2 ;簡稱RBD2)，穿膜功能區（簡 稱TM)，以及上述之融合體。 為檢驗表現蛋白質，先生產抗各種SARS CoV蛋白質的抗 血清。以標準程序合成以下所列的SARS CoV多肽：

RBD1-專一性胜肽 KSGNFKHLRE FVFKNKDGFL

YVYKGQPIDV 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 28 1303249

RBD2-專一性胜肽 GNYNYKYRYL RHGKLRPFER disnvpfspd gkpc

TM-#-性胜肽 DSFKEELDRY FKNHTSPDVD LGDISGINAS VV

E-專-性胜肽 ALRLCAYCCN ivnvslvkpt vyvysrvknl NSSEG

M-專一性胜肽 MADNGTITVE ELKQLLEQWN LVICFLFLAW IML 具體地說’將每個胜狀取200 pg與完全費氏佐劑（completed Φ Fruend’s adjuvant)混合，並以標準程序於第0天注射到兔子體 内。在第14天與第56天對兔子補強一半量的、與完全費氏佐 劑混合的胜肽。在第78天，犧牲兔子，並以ELISA測試血液之 抗血清力價。結果列示於表1。 表1兔子對於SARSCoV胜肽之免疫性 _^胜肽之血清對標的胜肽的反應 胜肽 前-免疫 後-補強 最後犧牲 RBD1-專一性 0 5120 10240 RBD2-專 ^一 性 0 10240 41440 TM-專一性 0 5120 10240 E-專一性 0 1280 5120 M-專一性 0 5120 10240 為獲得編碼RBD1之載體，以下列兩引子進行pcr : 5,引 子· GGATCCGCCL4CC ATG catacgtttg g ;以及 3,引子：aa ttttagagcc GAATTC。兩引子包含EcoRI與BamHl切割位以便後 續轉殖PCR產物。獲得〜5〇〇驗基對（bp)之片段，並次轉瘦到

PCDNA-A4 以得到 pcDNA-A4-Dl 質體，其編碼 Myc_His_RBD 之融合蛋白。將此質體轉形到大腸桿菌ΗΒ1〇1株以表現重組 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 29 1303249 RBDl (rRBDl)。結果發現，在誘導後，轉形株表現一 20 kDa 蛋白質。此蛋白質以高量表現於包涵體内，且進行西方墨點方 析可被抗-RBD-1之抗血清與抗-His標籤之抗體辨認。同時發現 此蛋白質具有高度免疫性，但無法激發抗活病毒之保護性抗體。 本發明同時生產出一編碼RBD2的載體。更詳細地說，係 採用以下兩引子進行PCR反應，5’引子：GGATCCGCCACCATG gagattgaca 以及 3，引子：aatatgg GCGGCCGC，以獲得一 1 ·4 kb 之片段。以BamHl-Notl酵素處理後，所得片段次轉殖到 pcDNA·A4。以如上述之方法將得到的載體用於表現RBD2。發 φ 現在可溶性形式與包涵體内會表現高量的50_kDa蛋白質。西方 墨點分析顯示，此蛋白質可被S-專一性抗血清辨認。此rRBD2 片段也具有高度免疫性，且能激發更強的中和抗體’該抗體可 阻斷SARS CoV結合到Vero細胞（參見以下實施例9)。 將上述重組蛋白質由大腸桿菌分離。更詳細地說，係由一 250 mL培養液取得大腸桿菌沈澱物，再懸浮於一 40 mL之50 mM Tris，pH 8.0，並以超音波打破細胞（3X10分鐘，70%功率 循環）。所得混合物以20,000.x g轉速離心。沈澱物再以40 mL 之 50 mM Tris，0.5% Triton X-100, 10 mM EDTA，pH 8·0 萃取。 φ 懸浮液經超音波以70%功率循環處理10分鐘，於300 xg轉速 離心5分鐘。所得到的上清液再以20,000 X g轉速離心30分鐘。 沈澱物以 50 mM Tris，0_5% Triton X-100，10 mM EDTA，pH 8.0 再懸浮，並混合PBS/8 M尿素以達6 M尿素之最終尿素濃度。 將混合物以PBS透析除去尿素，再以300 X g轉速離心10分鐘。 保留上清液並儲存於4°C中。

以鎳親和性層析分離由包涵體分離rRBDl與rRBD2之融 合蛋白。將上述上清液注入一經含1% Triton X-100之PBS平衡 過的鎳親和性管柱（2 mL)。丟棄流經管柱之液體。待以20 mL 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 30 Ι3Ό3249 之PBS清洗管柱後，親和性管柱以50 mM之pH 8·0，含5 mM EDTA之Tris-HCl緩衝液洗提。收集含蛋白質之級分並以 SDS-PAGE分析純度。 估計由1 L之大腸桿菌細菌培養液回收約1〇 mg之 rRBD2。rRBD2屬性係以免疫墨點分析與蛋白質定序確認。發 現此多肽之N-端為Met-Ala-Glu-Leu-Lys-Cys，可對應到S蛋白 質序列之第284至288殘基。 實施例3 於此實施例中，將其他SARS冠狀病毒S蛋白質片段表現 φ 於桿狀病毒與SF21昆蟲細胞。 以下表所列之引子對，經PCR反應與類似實施例1所述之 方法，獲得編碼S蛋白質之1-333，334-666，及667-999胺基 酸（分別為 spikel，spike2，以及 spike3 ;簡稱 SI，S2，及 S3) 之核酸。 增幅片段 引子名 稱 序列(5’端至3’端） 順向 (S)或 反向 l(AS)_ Spikel (1-333 aa) S1F AGGGGATCCATGTTTATTTTCTTATTA TTTCTTACTC s SIR CCTGGATCCTTTAGTAGCATTAAAAA CCTCTCCA AS Spike2 (334-666 aa) S2F AGGGGATCCTTCCCTTCTGTCTATGC ATGGGAGA s S2R CCTGGATCCTAATAAAGAAACTGTAT GGTAACTA AS Spike3 (667-999 aa) S3F AGGGGATCCCGTAGTACTAGCCAAAA ATCTATTG s 0707-A20956TWF(N2) ；chiumeow 31 ⑧ 1303249

S3R CCTGGATCCTTCAGCAGCCCTGATTA GTTGTTGT AS RBD1 (74-253 aa) RBD1 F CATACGTTTGGCAACCCTGTC S RBD1 R AACATTACAAATTTTAGAGCC AS RBD2 (294-739 aa) RBD2 F GAGATTGACAAAGGAATTTAC S RBD2 R CTAATTTGCTTCTCCAATATGG AS RBD3 (713-1113 aa) RBD3 F ATGGCTAAAACCTCCGTAGAT S RBD3 R AATTGTGATGTCGTTATTGGC AS TM (1130-1255 aa) TM1F ACTTCAAAAATCATACATCA S TM1R GGTGTCAAATTACATTACACATAA AS

將PCR產物以ΤΑ選殖方法插入pCR2· 1載體。以BamHI

酵素處理將編碼序列釋出，並連接到經切開BamHI位置之 pSecTagb/hlgGl.Fc載體，由此可將編碼S蛋白質之序列以框架 ® 内形式（in-frame)融合到編碼人類IgGl Fc之序列。所得載體即 編碼融合蛋白spikel-Fc，spike2_Fc，以及spike3-Fc。為產生對 應的桿狀病毒轉移載體，以Nhel/Xhol酵素處理將此三融合蛋 白基因釋放出來，再連接到經切開Xbal/Xhol位置之pBacPAK9 載體。 將上述pBacPAK9載體與經Bsu36 I酵素處理之BacPAK6 病毒 DNA 以 Bacfectin (Clontech 6144-1)共同轉染到 Sf21 細 胞。以溶菌斑試驗處理共同轉染後之上清液以取得每個病毒 斑。以PCR確認重組病毒。再以小規模病毒感染Sf21細胞以確 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 32 1303249 認基因表現並以標準程序偵測最佳收病毒時間與感染率。重組 病毒經增幅以達高病毒力價，而得到大規模感染所需工作用儲 備液。 為純化重組蛋白質，將Sf*2l細胞以2 χ1〇5細胞/ml之起始 濃度培養於旋轉角瓶3-5天。待達到U χ1〇β細胞/ml之濃度， 以上述重組桿狀病毒，於5-1〇之感染增殖率（M·0·1·)下感染上 述細胞。收集上清液，並以離心去除細胞碎片。將上清液注入 蛋白質 A Sepharose® 4 速流粒子（Amersham Biosciences 17-0974)。最後，以0·1 Μ之甘胺酸緩衝液（PH 3·0)洗提出結合 g 的Fc-融合蛋白，再經PBS透析。純化蛋白質之純度與濃度係 以標準銀染方法評估。 將以上述方法製備出的5mg之Sl-Fc融合蛋白粗萃取物溶 解於5 mL之含有1% Triton X-的磷酸緩衝鹽水（PBS)。此 溶液再注入一是先以含有1% Triton X-100之PBS平衡過的蛋白 質A-瓊脂糖4B管柱（2 mL)。丟棄通過管柱之液體。以20 mL 之PBS清洗管柱，並以50 mM之pH 3_0的Gly-HCl緩衝液洗 提Sl-Fc融合蛋白。洗提過程以280 nm吸光度監控。收集並集 合起來含蛋白質之級分（2 mL/級分）。該蛋白質之純度係以 0 SDS-PAGE 確認。 根據布達佩斯協定，上述的某些質體已於本案申請前寄存 於美國典型菌種保藏中心（American Type Culture Collection，簡 稱ATCC)，其位於美國20110-2209維吉尼亞州馬納薩斯市 (Manassas)大學路（University Boulevard)10801 號。在本申請案 獲准後，公眾可自由取得寄存質體之樣品。 實施例4 上述重組RBD1，RBD2，S1_FC，及S2-Fc係用於生產S-專一性抗血清。將純化的重組蛋白質以費氏完全佐劑（Freund，s 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 33 d 1303249 completeadjuvant)(Difco)乳化，並以每注l〇至l〇〇pg之劑量肌 肉注射（IM)至紐西蘭白兔（Maple Lane)或天竺鼠（Charles River)。於第28天以一半劑量之費氏不完全佐劑（Freund，s incomplete adjuvant)乳化的S片段補強該動物。在第42天，由 動物耳緣靜脈取得血液樣品，以標準程序進行力價偵測。將會 產生專一性抗體之動物犧牲以取得更多抗血清。 為檢測RBD1或2之融合蛋白的免疫性，將天竺鼠或小鼠 以不同劑量之RBD1或2免疫。當費氏佐劑或A1P04存在時， 劑量範圍介於10至l〇〇pg/注射之RBD1會在天竺鼠誘發高度 φ IgG力價。在小鼠中，RBD1或2在低於5pg/注射之含費氏佐劑 的劑量下就具有免疫性。 同時以貂模式檢測抗RBD1或2血清對抗SARS CoV感染 之保護能力。發現貂可經天竺鼠之抗-RBD2抗血清被動免疫而 具有較僅注射免疫前之血清的對照組顯著地保護作用，但抗 -RBD1血清無效。 上述Sl-Fc或S2-Fc融合蛋白係用於親和性層析以純化8 蛋白質-專一性多株抗體。將重組Sl-Fc或S2-Fc融合蛋白共輪 於經溴化氰活化之瓊脂糖以形成親和性管柱。此親和性管柱可 • 用於由兔超免疫抗不活化SARS CoV抗血清純化抗體。經親和 性純化之抗體以免疫墨點法顯示可與一存在於SARSCoV分離 株之溶菌體的200-kDa大小成分反應。相同地，經激發抗重組 融合蛋白或純化的RBD1，RBD2，S1與S2之抗血清也可以同 樣方法純化。 實施例5 依照美國專利第4,356,170號所述之高埃酸鹽氧化方法將 經純化的重組RBD2共輛於肺炎鏈球菌寡糖14 (14F)。肺炎鏈球 菌寡糖14係以控制的酸水解製備。用於共輛之14F分子的平均 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 34 1303249 分子大小約為20,000道耳呑。共軛反應係可於交聯劑存在或不 存在下進行。採用莫耳比約7的14/RBD2以提供過量的14F半 抗原。 高碘酸鹽氧化之14係將天然14F以水性過碘酸處理而製備 (Carlone 等人 1986 J· Clin. Microbiol· 24:330-331)。為製備 14-BSA共軛物，將0·5 mL之經高碘酸鹽氧化的14 (25mg溶於 1 mL之0·1 Μ磷酸鈉緩衝液，pH 6.0)加入溶於pH8.0、0.5 mL 之0·2 Μ磷酸鈉缓衝液的牛血清白蛋白（BSA) (1_32 mg; 0·02 μιηοΐ)，接著加入氰硼氫化鈉（14 pg; 〇·22 μηιοί;對於BSA為10 φ 當量）。於37°C培養5天後，以4 L之pH 7.5的0.1 Μ磷酸緩 衝液透析反應混合物。將所得溶液用於一經pH 7.2之0.2 Μ構 酸鈉緩衝液平衡之分析用Superose 12(屬於分離範圍廣泛之介 質）管柱（15x.300 mm，Pharmacia)，並以同樣緩衝液洗提。以230 nm之吸光度監控級分。收集第一個主要蛋白質波鋒並於一 Centriprep離心超濾器由30 mL濃縮至2 2 mL。再以Bio Rad 蛋白質試驗測定其蛋白質含量為3〇〇 ug/mL。另以苔黑酚 (Orcinol)試驗確認蛋白質共輛體内所存在之14寡糖。 接著將上述RBD2-14肺炎鏈球菌多糖共軛體用於動物中產 ® 生抗-14肺炎鏈球菌多糖之抗血清。以每毫升混有3 mg AlP〇4 之14-RBD2共軛體（5至50 pg i4之當量數）經肌肉注射免疫兔 子，再於兩週間隔補強兩次劑量（同樣免疫原之半量）。在第一次 注射後，每兩週收集一次抗血清，於56。^熱不活化3〇分鐘， 並儲存於-20。〇結果發現免疫敎發抗pRp-IgG與s蛋白質之初 次與-次免疫反應。經免疫墨點分析試驗發現兔抗_RBD2_14F 抗血清也會對天然S與rS強烈地反應。這些結果顯示rbd2可 作為共輛體疫田之載體蛋白吳。由於仙⑴以肺炎鍵球菌多糖 共輛體激發了抗MF與S之抗體，也可以用於對肺炎鍵球菌相 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 35 1303249 關疾病之增強保護作用，特別可用於嬰兒。 實施例6 為繪製SARS S蛋白質之線性B-細胞抗原決定位圖譜，合 成包括整個S蛋白質之重疊的合成胜肽。這些胜肽列示於下表 2 〇 表2 合成之SARS CoV S胜肽 胜肽識別號 分子量 RBD1-相關片段 1 1，681·2 2 1,652.0 3 1,602.9 4 1,649.9 5 1，623·8 6 1,644.9 7 1,597.8 8 1,626.1 9 1,666.1 10 1,742.3 11 1,727.2 12 1,643.9 13 1,675.0 14 1,682.0 15 1,811.3 16 1,711.1 17 1,705.0 18 1,584.9 19 1,741.2 20 1,833.4 21 1,860.5 22 1,807.4

序列

VIPFKDGIYFAATEK

DGIYFAATEKSNVVR

AATEKSNVVRGWVFG

SNVVRGWVFGSTMNN

GWVFGSTMNNKSQSV

STMNNKSQSVIIINN

KSQSVIIINNSTNVV

IIINNSTNVVIRACN

STNVVIRACNFELCD

IRACNFELCDNPFFA

FELCDNPFFAVSKPM

NPFFAVSKPMGTQTH

VSKPMGTQTHTMIFD

GTQTHTMIF DN AFNC

TMIFDNAFNCTFEYI

NAFNCTFEYISDAFS

TFEYISDAFSLDVSE

SDAFSLDVSEKSGNF

LDVSEKSGNFKHLRE

KSGNFKHLREFVFKN

KHLREFVFKNKDGFL

FVFKNKDGFLYVYKG 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 36 ⑧ 1303249 23 1，788·2 24 1，810·1 25 1,701.9 26 1,638.1 27 1，654_3

KDGFLYVYKGYQPID YV YKG YQPID V VRDL YQPIDVVRDLPSGFN VVRDLPSGFNTLKPI PSGFNTLKPIFKLPL RBD2-相關片段 28 1,636.2 29 1,684.0 30 1,751.0 31 1，663·8 32 1，684.9 33 1,614.0 34 1，688.1 35 1,636.1 36 1,685.0 37 1,826.2 38 1，810·3 39 1,752.2 40 1,658.1 41 1,696.0 42 1,759.3 43 1,669.2 44 1,644.3 45 1,656.1 46 1,689.1 47 1,644.9 48 1,601.8 49 1,522.6 50 1,569.7 51 1,617.9

AELKCSVKSFEIDKG

SVKSFEIDKGIYQTS

EIDKGIYQTSNFRVV

IYQTSNFRVVPSGDV

NFRVVPSGDVVRFPN

PSGDVVRFPNITNLC

VRFPNITNLCPFGEV

ITNLCPFGEVFNATK

PFGEVFNATKFPSVY

FNATKFPSVYAWERK

FPSVYAWERKKISNC

AWERKKIS NC VAD YS

KIS NC VAD YS VLYNS

VADYSVLYNSTFFST

VLYNSTFFSTFKCYG

TFFSTFKCYGVSATK

FKCYGVSATKLNDLC

VSATKLNDLCFSNVY

LNDLCFSNVYADSFV

FSNVYADSFVVKGDD

ADSFVVKGDDVRQIA

VKGDDVRQIAPGQTG

VRQIAPGQTGVIADY

PGQTGVIADYNYKLP 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 37 ⑧ 1303249 52 1,743.2 53 1,754.3 54 1,737.2 55 1,647.0 56 1,685.9 57 1,811.2 58 1,927.6 59 2,001.7 60 1,806.3 61 1,758.0 62 1,558.9 63 1,522.9 64 1,642.2 65 1,752.2 66 1，783·2 67 1,678.9 68 1,698.9 69 1,765.1 70 1,673.1 71 1,514.0 72 1，468·9 73 1,599.0 74 1,719.1 75 1,707.1 76 1,538.0 77 1,460.9 78 1,603.9 79 1,792.8 80 1,855.8 81 1,738.7 82 1,650.8

VIADYNYKLPDDFMG

NYKLPDDFMGCVLAW

DDFMGCVLAWNTRNI

CVLAWNTRNIDATST

NTRNIDATSTGNYNY

DATSTGNYNYKYRYL

GNYNYKYRYLRHGKL

KYRYLRHGKLRPFER

RHGKLRPFERDISNV

RPFERDISNVPFSPD

DISNVPFSPDGKPCT

PFSPDGKPCTPPALN

GKPCTPPALNCYWPL

PPALNCYWPLNDYGF

CYWPLNDYGFYTTTG

NDYGFYTTTGIGYQP

YTTTGIGYQPYRVVV

IGYQPYRVVVLSFEL

YRVVVLSFELLNAPA

LSFELLNAPATVCGP

LNAPATVCGPKLSTD

TVCGPKLSTDLIKNQ

KLSTDLIKNQCVNFN

LIKNQCVNFNFNGLT

CVNFNFNGLTGTGVL

FNGLTGTGVLTPSSK

GTGVLTPSSKRFQPF

TPSSKRFQPFQQFGR

RFQPFQQFGRDVSDF

QQFGRDVSDFTDSVR

DVSDFTDSVRDPKTS 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 38 ⑧ 1303249 ，，* s,， 83 1,671.0 84 1,618.1 85 1,489.0 86 1,374.8 87 1,357.6 88 1,503.8 89 1,593.7 90 1，608·7 91 1,570.7 92 1,521.7 93 1,724.1 94 1,701.9 95 1,766.8 96 1,504.7 97 1,570.8 98 1,579.1 99 1,631.0 100 1,495.1 101 1,499.1 102 1,560.2 103 1,676.0 104 1,636.0 105 1,538.9 106 1,481.0 107 1,512.9 108 1,548.9 109 1,624.0 110 1,588.0 111 1,638.0 112 1,575.9 113 1,659.1

TDSVRDPKTSEILDI

DPKTSEILDISPCAF

EILDISPCAFGGVSV

SPCAFGGVSVITPGT

GGVSVITPGTNASSE

ITPGTNASSEVAVLY

NASSEVAVLYQDVNC

VAVLYQDVNCTDVST

QDVNCTDVSTAIHAD

TDVSTAIHADQLTPA

AIH ADQLTPAWRIY S

QLTPAWRIYSTGNNV

WRIY S TGNN VFQTQ A

TGNNVFQTQAGCLIG

FQTQAGCLIGAEHVD

GCLIGAEHVDTSYEC

AEHVDTSYECDIPIG

TSYECDIPIGAGICA

DIPIGAGICASYHTV

AGICASYHTVSLLRS

SYHTVSLLRSTSQKS

SLLRSTSQKSIVAYT

TSQKSIVAYTMSLGA

IVAYTMSLGADSSIA

MSLGADSSIAYSNNT

DSSIAYSNNTIAIPT

YSNNTIAIPTNFSIS

IAIPTNFSISITTEV

NFSISITTEVMPVSM

ITTEVMPVSMAKTSV

MPVSMAKTSVDCNMY 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 39 1303249 114 1,589.1 115 1,621.1 TM-相關片段 116 1,883.3 117 1,790.1 118 1,627.0 119 1,441.8 120 1,481.8 121 1,637.9 122 1,721.9 123 1,767.1 124 1，667_1 125 1,696.1 126 1,794.1 127 2,013.2 128 2,060.4 129 1,831.5 130 1,584.3 131 1,525.4 132 1,583.4 133 1,604.6 134 1,482.4 135 1,435.4 136 1,522.1 137 1,626.0 138 1，673·0 S3片段 S3-1 S3-2

AKTSVDCNMYICGDS DCNMYIC GDSTEC AN

DSFKEELDKYFKNHT

ELDKYFKNHTSPDVD

FKNHTSPDVDLGDIS

SPDVDLGDIS GINAS

LGDIS GINAS VVNIQ

GINASVVNIQKEIDR

VVNIQKEIDRLNEVA

KEIDRLNEVAKNLNE

LNEVAKNLNESLIDL

KNLNESLIDLQELGK

SLIDLQELGKYEQYI

QELGKYEQYIKWPWY

YEQYIKWPWYVWLGF

KWPWYVWLGFIAGLI

VWLGFIAGLIAIVMV

IAGLIAIVMVTILLC

AIVMVTILLCCMTSC

TILLCCMTSCCSCLK

CMTSCCSCLKGACSC

CSCLKGACSCGSCCK

GACSCGSCCKFDEDD

GSCCKFDEDDSEPVL

FDEDDSEPVLKGVKL

GDSTECANLLLQYGS

LQYGSFCTQLNRALS 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 40 1303249

NRALSGIAAEQDRNT

QDRNTREVFAQVKQM

QVKQMYKTPTLKYFG

LKYFGGFNFSQILPD

QILPDPLKPTKRSFI

KRSFIEDLLFNKVTL

KVTLLADAGFMKQYG

MKQYGECLGDINARD

IN ARDLIC AQKFNGL

KFNGLTVLPPLLTDD

LLTDDMIAAYTAALV

TAALVSGTATAGWTF

AGWTFGAGAALQIPF

LQIPFAMQMAYRFNG

YRFNGIGVTQNVLYE

NVLYENQKQIANQFN

ANQFNKAISQIQESL

IQESLTTTSTALGKL

ALGKLQDVVNQNAQA

QNAQALNTLVKQLSS

S3-3 S3-4 S3-5 S3_6 S3-7 S3-8 S3_9 S3-10 S3-11 S3-12 S3-13 S3-14 S3-15 S3-16 S3-17 S3-18 S3-19 S3-20 S3-21 S3-22 S3-23 S3-24 S3-25 S3-26

KQLSSNFGAISSVLN

SSVLNDILSRLDKVEA

LDKVE AE VQID RLIT G

RLITGRLQSLQTYVTQQLIRA

RBD2 GNYNYKYRYLRHGKLRPFERDISNVPFSPDGKP

C

RBD55 DPKTSEILDISPCAFGGVSVITPGTNASSEVAVLY

QDVNCTDVSTAIHAD 註：RBD-55包括含S84至S91之胺基酸。 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 41 1303249 以ABI 433A胜肽合成器合成上述胜肽，並依照使用者手 冊最佳化F-Moc化學。合成的胜肽以三氟乙酸（TFA)由樹脂上切 割出。接著以反相高效液相層析（reversed-phase high performance liquid chromatography，簡稱 RP_HPLC)純化之，係 於一 Vydac C4半製備管柱（1 x 30 cm)採用一 15至55%乙腈梯 度，其係於0.1 %三氟乙酸中以2mL/分鐘之流速進行超過40分 鐘而得到。所有用於後續生化與免疫實驗之合成的胜肽皆以 HPLC確認純度大於95%。這些胜肽的胺基酸組合物係於一 Waters Pico-Tag系統之胺基酸組成分析儀測定。結果顯示與其 預期之組合物有良好一致性。 以ELISA進行B-細胞抗原決定位之圖譜繪製。在微量滴定 盤的孔洞中（Nunc_Immunoplate，Nunc，Denmark)塗覆 50 gL 之含 有200 ng之純化的重組S片段或500 ng之個別胜肽（如下表3 所列示）的包覆緩衝液（15 mM Na2C03，35 mM NaHC03，pH 9.6)，置於室溫16小時。將微量滴定盤以溶於磷酸緩衝鹽水（PBS) 之0.1% (w/v) BSA，在室溫下，封阻30分鐘。將系列稀釋抗血 清加入各孔，並於室溫培育1小時。除去抗血清後，將微量滴 定盤以含有 0.1% (w/v) Tween-20 與 0.1% (w/v) BSA 之 PBS 清洗 五次。由共軛至辣根過氧化酶（Jackson ImmunoResearch Labs Inc.，PA)之山羊抗-兔，抗-天竺鼠，抗-小鼠，或抗-人類IgG抗 體之Fab’2片段以清洗緩衝液稀釋（1/8,000)，並加入微量滴定盤 孔洞中。於室溫培育1小時後，以清洗緩衝液清洗孔洞五次， 接著採用基質四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，簡稱TMB) 與H2〇2 (ADI，Toronto)呈色。加入1N之H2S04以終止反應，並 以 Titretek Multiskan II (Flow Labs·，Virginia)於 450 nm 測量其 光學密度。以兩不相關胜肽作為陰性對照。所有試驗皆重複三 次，發現每個抗血清之反應力價與稀釋倍率具有一致性，對照 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 42 1303249 於陰性對照組織吸收值為2_倍增加。鑑定出免疫上顯著之B-細胞抗原決定位為殘基 125-146，334-348，409-423，449_468， 589-603，以及1232-1246。結果顯示這些區域包括線性B-細胞 抗原決定位序列，且可作為標的抗原，應用於如診斷套組以偵 測樣品中所存在之抗-S與抗-SARS CoV抗體。 實施例7 已知SRAS CoV可結合至VERO E6細胞。上述S蛋白質片 段係用於測試其結合至VERO E6細胞之能力。將Vero E6細胞 (每毫升1 X 104個細胞），於室溫下，在皆為體積ImL但不同濃 φ 度之Sl-Fc，S2-Fc，S3-Fc，或人類IgGl中培養2小時。接著 以含有0.5% BSA與0.1%NaN3之PBS清洗細胞，再培養於FITC-標定之山羊抗-人類IgG Fc (Sigma)，並以流氏細胞儀分析。結 果發現Sl_Fc與S2-Fc分別在1 pg/ml與0.1pg/ml之濃度下可結 合到VERO E6細胞。相反地，S3-fc與人類IgGl即使濃度高達 10 pg/ml也不會結合到VERO E6細胞。 上述VERO E6細胞模式係用以檢測抗_S1-Fc或抗_S2-Fc 血清抑制SARS CoV與VERO E6細胞結合的能力。將VERO E6 細胞培養於一 24-孔盤直到達到約50%細胞滿度。再將細胞與 • SARS_CoV Twl株（MOI 1:10)與具有1/128病毒中和力價之人 類血清，在0.1至10 pg/mL對應S融合蛋白之存在或不存在下 一起培養。24-48小時後，於顯微鏡下觀察細胞。多核巨大細胞 之存在代表感染的細胞。結果顯示人類血清阻斷了病毒感染， 且阻斷活性會受重組S融合蛋白之抑制。 實施例8

由於S2-Fc融合蛋白能強力結合至VERO E6細胞並抑制人 類中和抗體抗SARS CoV之活性，使本發明人等引起鑑定此S2 片段之保護性抗原決定位之興趣。基於SARS CoV TW1株之S 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 43 ⑧ 1303249 . 蛋白質序列，由S2合成了 88個胜肽（如上表2所示）。 5個康復中血清係由感染SARS CoV之病患取得，而3個 血清由以上實施例5與6所述之經RBD2免疫之天竺鼠取得。 將這些血清與表3之胜肽混合，上述胜肽包含S蛋白質之殘基 522至600。測定每個抗血清之反應性力價。結果總結於表3。 表3. 人類或天竺鼠抗-RBD2抗血清對於合成胜肽之反應性

胜肽識別號 合成之胜肽 反應力價 人類 天竺鼠 76 CVNFNFNGLTGTGVL 1/5 0/3 77 FNGLTGTGVLTPSSK 1/5 0/3 78 GTGVLTPSSKRFQPF 0/5 0/3 79 TPSSKRFQPFQQFGR 0/5 0/3 80 RFQPFQQFGRDVSDF 0/5 0/3 81 QQFGRDVSDFTDSVR 1/5 0/3 82 DVSDFTDSVRDPKTS 2/5 1/3 83 TDSVRDPKTSEILDI 15 1/3 84 DPKTSEILDISPCAF 0/5 0/3 85 EILDISPCAFGGVSV 1/5 0/3 86 SPCAFGGVSVITPGT 0/5 0/3 87 GGVSVITPGTNASSE 0/5 0/3 88 ITPGTNASSEVAVLY 5/5 3/3 89 N AS SE VAVLYQD VNC 5/5 3/3 90 VAVLYQDVNCTDVST 4/5 1/3 91 QDVNCTDVSTAIHAD 1/5 0/3 RBD-5 5 5/5 3/3 如表3所示，大部分胜肽皆可成功偵測到樣品中抗-S蛋白 質抗體之存在。 實施例9 以下實施例係為測定是否S2-Fc與VERO E6細胞之結合可 0707-A20956TWF(N2) ；chiumeow 44 B03249 . 以被s蛋白質或其片段所中和。 首先測試重組RBD2。取104之VER0E6細胞與330 ng/mL 之S2-Fc蛋白質於已知量之RBD2蛋白質溶液存在或不存在下 進行培養。結果發現1 Kg之RBD2可顯著降低S2-Fc結合至 VERO E6 細胞。 以11種雞尾酒式配方重複進行抑制試驗，以上配方含有9 個RBD2片段且包括（S28 to S115)。更詳細地說，收集VERO E6 細胞並以FACS染色/清洗緩衝液清洗兩次。將2 X 105之細胞與 各種胜肽一起培養，再於最終體積為100 ml下以重組S-Fc蛋白 • 質（1 mg)，S2-Fc蛋白質（0.2-0.3 mg)，或作為等張對照組之 hlgGl，於4°C下染色30分鐘。清洗細胞兩次並以RPE-結合之 抗-hlg抗體，於4°C下染色30分鐘。清洗後，於4°C下以固定 緩衝液固定細胞30分鐘，接著以流氏細胞儀FACS Calibur (Becton Dickinson)债測勞光。結果列示於下表4。受RBD2抑制 之程度設定為100%。 表4. S2-Fc/VERO E6細胞結合受S胜肽之抑制程度 阻斷劑 抑制百分比 合成胜肽之濃度（pg/mL) 1 10 100 陰性對照組 0 0 0 Gp(28-3 5) 0 0 0 Gp(3 6-43) 0 0 0 Gp(44_51) 0 0 0 Gp(5 2-5 9) 0 0 0 Gp(60-67) 0 0 0 Gp(68-75) 0 0 0 Gp(76-83) 0 0 0 Gp(84-91) 0 10% 30% 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 45 1303249

Gp(92-99) 0 0 0 Gp(100-107) 0 0 0 Gp(108-115) 0 0 0 RRBD2 100% 100% ΝΑ 如表4所示，含有S胜肽84至91 (群#8)之胜肽雞尾酒可 強烈抑制S2-Fc與VERO-6細胞間的結合，與RBD2組比較有 30%。此結果顯示S2主要的B-細胞抗原決定位在於這9個胜肽 包括的範圍，即S蛋白質之殘基540至600。 為更清楚定義S2片段之保護性抗原決定位，分別測試胜肽 S84-91。將 104 之 VERO E6 細胞與 330 ng/mL 之 S2_Fc 蛋白質 於上述胜肽個別存在或不存在下培養。結合S-Fc與VERO E6 細胞結合之抑制作用係以如上述之方法測定。採用含有包括S84 至S91之50個胺基酸的多胜肽（如上表2所示之“RBD-55”）重 複試驗。結果如下表5所示。 表5. S合成胜肽對於S2-Fc/VERO E6細胞結合之抑制活性 阻斷劑 抑制百分比 合成胜肽之濃度（pg/mL) 1 10 100 陰性對照組 0 0 0 Gp(76-83) 0 0 0 Gp(84-91) 0 10 30 S84 0 0 0 S85 0 0 0 S86 0 0 10 S87 0 0 0 S88 0 0 0 S89 0 0 10 S90 0 0 0 S91 0 0 0 0707-A20956TWF(N2) ；chiumeow 46 1303249 S86 + S87 0 20 40 S86 + S88 0 0 0 S86 + S89 0 20 40 S86 + S90 0 0 0 S86 + S91 0 0 0 RBD-5 5 10 30 60 rRBD2 100 100 未測試 如表5所示，S86與S89具有統計上顯著抑制S2-Fc/VERO 細胞結合之作用。此外，S86與S87，或S86與S89顯示加成效 • 果，且可抑制30%之S2-Fc/Vero細胞結合。S86與S89皆在其 末端具有兩個半胱胺酸殘基，此可形成一雙硫架橋並導致強抑 制作用。RBD-55抑制的S2-FC/VERO E6細胞結合較S86或S89 胜肽為顯著（60%抑制作用與10%抑制作用）。結果顯示RBD-55 可作為免疫原以誘發抗SARS CoV之保護性抗體。 實施例10 上述胜肽係用於產生S胜肽-專一性抗血清。將天竺鼠與兔 子以經費氏完全佐劑乳化之胜肽雞尾酒配方（50 to 200 pg)由肌 肉注射而免疫。在第14與28天以不完全費氏佐劑中等量的胜 • 肽鷄尾酒配方補強上述動物。在第42天收集抗血清並以ELISA 與免疫墨點分析測試。以胜肽專一性ELISA測試發現兔子與天 竺鼠皆顯示對於其各自免疫的胜肽具有單專一性。此外，免疫 墨點分析證實天竺鼠與兔子所激發抗S胜肽之抗血清皆可與 SARS CoV反應。由於大部分S胜肽會在至少一種動物誘發強 烈的抗-胜肽抗體反應，因此是適當的免疫原，可包括在免疫性 組合物中，如疫苗中。 實施例11 採用幼貂測試S-專一性抗血清對以如國家衛生研究院所述 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 47 ⑧ 1303249 , 之 SARS CoV 刺激的保護活性（Yang et al.，Nature (2004) 428:561-564)。5日齡之幼貂背部皮下接種0.15 mL之兩不同兔 子之抗-S片段。以前-免疫血清作為陰性對照組。被動免疫一天 後，對幼貂腹腔注射4000溶菌斑形成單位（cfu)之SARS CoV T〇f2株（0.1 ml)，其係新鮮生長與分離自添加有輔因子之Vero 細胞培養基並以含有0.5 mM MgCl2與0.15 mM CaCl2之PBS稀 釋過。一天後，於曱氧氟烧（methoxyflurane)麻醉狀態進行心臟 穿刺以收集血液樣品，並於Vero細胞培養基培養之。24小時後 測定每毫升血液之病毒數目。採用史氏t試驗（Student’s t-test) φ 分析觀察相對於對照組之病毒血症程度的差異性。結果顯示抗 體具有保護免受SARS CoV之測試（challenge)的作用。 於貂模式檢測抗-RBD1血清對抗SARS CoV感染之保護能 力。貂經被動免疫天竺鼠之抗-RBD1抗血清並不會比前犧牲血 清對照組具有更強保護作用。 實施例12 目前對於針對SARS CoV之細胞免疫反應以及其在抗 SARS CoV感染之保護角色僅略知一二。為測試由SARS CoV 激發之細胞免疫反應，以下述之傳統細胞激素試驗測定T-細胞 # 株對於S胜肽之增生反應。 先生產S-專一性Τ-細胞株。使BALB/c (H_2d)小鼠（Charles River Animal Farm，Montreal，Canada)接觸抗原，係皮下注射 20pg之重組S，其係於100 pg之CpG存在下吸附於1.5 mg之 磷酸鋁（alum)。將小鼠以同樣劑量之免疫原在3星期間隔補強兩 次。 最後一次補強之後10天，將每隻經免疫之小鼠的脾臟移 除。分離脾細胞並將之以微量滴定盤每孔5.75 X 105個細胞之密 度培養於200 μι之RPMI 1640培養基（Flow Lab)。培養基添加 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 48 ⑧ 1303249 有10%熱不活化胎牛血清（Gibson)，2mM之L·麩胺酸醯胺，100 U/mL之盤尼西林，以及5 χ.1(Τ5 Μ之2-酼基乙醇，並含有不同 濃度（每毫升1，10及100 pg)之個別S胜肽。將培養維持在潮 濕的、空氣中含有5% C02之培養箱。每個濃度的每種胜肽都進 行三次重複培養。5天後，將150 Ml之10%大鼠洋刀豆血球凝 集素A(concanavalin A)培養上清液稀釋於培養基中，並添加於 上述微量滴定盤之各孔。此上清液含有介白素-2 (IL-2)，將可增 生胜肽專一性T-細胞。 6天後，由每孔移除150 μί之上清液，再加入150 μί之新 φ 鮮的、含有IL-2之培養上清液以更進一步增生與維持胜肽專一 性Τ_細胞之存活率。再經過6天培養後，以200 kL之培養基清 洗細胞三次。以濃度1，10，及100 pg/mL之胜肽分別刺激每組 培養，且係於2 χ·105個放射線處理過的（1，500 rad) BALB/c脾 細胞存在下，最終體積為200 μί培養基。由每個重複的三次培 養取60 μι之上清液，並集合起來。以鼠類IL-2與IL-4 ELISA 套組（Endogen Inc，MA，U.S.A.)以及小鼠 IFN-gamma ELISA 套組 (Genzyme Corporation· MA，U.S.A.)試驗所有上清液之 IL-2， IL-4，及干擾素-gamma (IFN-gamma)。依照使用者手冊測試5 # 次稀釋後培養上清液。 結果顯示對應至殘基120-134，649_688，及699-713之胜 肽可激發增生反應以及專一性細胞激素之釋放。由於其強度誘 導細胞免疫反應之能力，這些免疫性顯著之T-細胞抗原決定位 可作為肺炎鏈球菌多糖及/或SB-細胞抗原決定位之載體以增強 免疫性。而由上述方法鑑定出之Thl細胞可作為SARS CoV疫 苗配方以誘導SARS-專一性細胞免疫反應。 實施例13 於此實施例中生產鼠類抗-S單株抗體。以經費氏完全佐劑 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 49 1303249 . 乳化之20至50 pg的RBD2腹腔注射免疫BALB/c小鼠。兩週 後，對小鼠注射同樣劑量、溶於費氏不完全佐劑之免疫原。測 試抗S力價。選擇陽性小鼠’採用標準細胞融合程序以製備雜 合瘤。融合前三天’對小鼠再補強同樣劑量、溶於費氏不完全 佐劑之免疫原。將經免疫之小鼠取得的脾臟淋巴球與非分泌型 Sp2/0 骨髓瘤細胞以 Hamel 專人論文 1987，J· Med. Microbiol· 23:163-170所述之方法進行融合而產生雜合瘤。以連續限制性 稀釋轉殖出S-專/性雜合瘤並筛選抗-S單株抗體之生產。以標 準程序鑑定出8株s-專一性細胞株，將之增生，並冷凍於液態 φ 氮中。 實施例14 SARS CoV感染之機制尚不清楚，僅有報導指出感染會經 由腸道、呼吸道、與皮膚發生。如以上研究結果，sl_Fc與S2-Fc， 但非S3_Fc，會結合到VER0細胞。爲測試是否S3-FC會結合到 其他細胞，對一組細胞株進行測試。將約1 X 1〇4細胞/mL與〇·1， 0.3，及1 pg之S3-FC或同樣劑量之Sl-Fc或S2-Fc —起於室溫 下培育2小時，總體積為1mL。以含有〇·5% BSA與0.1%NaN3 之PBS清洗細胞，培育於FITC-標定山羊抗-人類IgG Fc 修 （Sigma)，並以流氏細胞儀分析。 意外地發現S3-FC會強烈結合至NIH 3T3細胞，但不會結合 至Jarket細胞。S3-Fc所顯示強力結合至NIH 3T3細胞是即使在濃 度低到0.1 pg/niL也會發生。相反地，Sl-Fc不會結合到NIH3T3 細胞，即是濃度高達10 Kg/mL，且S2-Fc顯示某種程度地結合到 NIH 3T3細胞，約在濃度1 pg/mL時。這些結果顯示S3-Fc對於NIH 3 T3細胞之受體有專一性。 也意外地發現S蛋白質也可以結合至HeLa，BHK-21，以及 COS-7細胞。鑑定出S蛋白質之三個分離的受體結合功能區：（1) 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 50 ⑧ 1303249 低度親和性功能區位於N -端之3 3 3殘基，（2)中度親和性受體結合 功能區（帶有1 μΜ親和性）位於殘基334至666，以及（3)高度親和 性功能區位於殘基667至999。除了 VERO Ε6細胞，所有細胞株 都沒有被報導為SARS CoV複製之宿主過。這解釋了為何SARS CoV可以經由皮膚接觸感染性溶液而感染病患。 其他實施型態 本說明書所揭露之所有特徵皆可以組合為任何組合。本說 明書所揭露之每個特徵可以由具有相同，相等，或類似目的之 替代性特徵所取代。因此，除非特別聲明，此處所揭露之每隔 φ 特徵僅為一上位系列之相等或類似特徵的實施例之一。 由上述，熟於本技術領域者可容易地查明本發明之主要特 徵，且在不脫離本發明之精神與範疇内能對本發明作種種更動 與修飾以更適合於種種用途與壯況。因此，本發明之其他實施 型態亦包括在下述申請專利範圍之内。

0707-A20956TWF(N2) ；chiumeow 51 1303249

【圖式簡單說明】 無。 【主要元件符號說明】 無0 0707-A20956TWF(N2)；chiumeow 52 ⑧

Claims (1)

1303249 • I ,------ 今告本j '申請專利範圍 Qif if ν. .一種單離的多肽，其係為序列識別號：12之免疫性片段。 2·如申請專利範圍第1項所述之單離的多肽，其中該多 一醣蛋白，包括一多醣。 '、 3.如申請專利範圍第2項所述之單離的多肽，其中該多鳙為 一肺炎鏈球菌來源之多醣。 4·如申請專利範圍第1項所述之單離的多肽，其中該多肽為 一融合蛋白，包括一異源性多肽，其包括一免疫球蛋白之&部分、、、。 5.如申請專利範圍第4項所述之單離的多肽，其中該免疫球 蛋白為IgG。 又； 6·如申請專利範圍第5項所述之單離的多肽，其中該免疫 蛋白為IgGi。 •如申請專利範圍第6項所述之單離的多肽 蛋白為人類IgGi。

其中該免疫球 8·如申请專利範圍第工項所述之單離的多肽，其 :蛋白’包括一異源性多狀，其包括一致病原之蛋白質的: ”·如甲請專利 I早離的多 ， ，《τϋ 固矛 v / /| 的表面部分包括感冒病毒之HA或ΝΑ - ίο. -種單離的核酸，其係為序列識別號：u之核酸序列。 u.-種表現載體，包括—如中請專利顧第ig項之核酸。 泛-種宿主細胞，包括一如申請專利範圍第ι〇項之核酸。 如申Γ專；;種=如中請專利範圍第1項之多肽的方法，包括將 申印專利12項之宿主細胞培養於 二:見的培養基中，以及由該培養細胞或該細胞之： 1303249 性結合至申請專利範圍第J 14. 一種純化的抗體，其係專一 項之多肽。 15. 株抗體。 如申請專利範圍第14 項所述之抗體，其中該抗體為一單 16· -種診斷-個體感染—冠狀病毒之方法，包括 i)由該個體提供一測試樣品，以及

ii)測定該測試樣品中存在有 24、26之免疫性片段， 一多肽，其係為序列識別號·· 其中當該職樣品中存在有該多肽時代表該個體受該冠狀病 毒感染。 17· -種診斷一個體受一冠狀病毒感染之方法，包括： i)由該個體提供一測試樣品，以及 ϋ)測定_試樣品中存在有—抗—纽的專_性抗體，該多 肽係為序列識別號·· 24、26之免疫性片段， 、其中當該測試樣品中存在有該抗體時代表該個體受該冠狀病 毒感染。 18. —種治療一冠狀病毒感染之組合物，包括一有效量之序 列識別號· 20之多肽’以及一藥學上可接受之載體。 19· 一種鑑定一治療一冠狀病毒感染之化合物的方法，該方 法包括： 取得一第一細胞，其可結合至該冠狀病毒； 取得一如申請專利範圍第1項之多肽； 將該第一細胞與該多肽培養於一含有一化合物之培養基；以 測定該第一細胞與該多肽之結合程度， 1303249 、 其中若該結合程度低於以同樣方法測定一第二細胞與該多肽 之結合程度，除該第二細胞係培養於無該化合物之培養基，該化 合物係測定為有效於治療感染。 20. 如申請專利範圍第19項所述之鑑定一治療一冠狀病毒感 染之化合物的方法，其中該細胞為VEROE6細胞，NIH3T3細胞， HeLa細胞，BHK-21細胞，或COS-7細胞。 21. 如申請專利範圍第19項所述之鑑定一治療一冠狀病毒感 染之化合物的方法，其中該冠狀病毒為SARS CoV。