TWI398262B - 腫瘤相關抗原之免疫性肽類及其於癌症治療上的用途 - Google Patents

Description

腫瘤相關抗原之免疫性肽類及其於癌症治療上的用途

本發明係關於一種含有衍生自腫瘤相關抗原L6(TAL6)之T細胞抗原表位的免疫肽，及編碼該免疫肽之核酸。

相關申請案

本發明係對於2010年7月29日提出申請之美國申請案No. 12/846,092主張優先權；該先申請案之內容皆以引用方式納入本文做為參考。

發明背景

腫瘤相關抗原L6(TAL6)屬於跨膜-4超家族(TM4SF)之一成員，其為一種表現於各種不同癌細胞，例如肺癌、乳癌、大腸癌及卵巢癌細胞上的腫瘤標記抗原。過去的研究發現，抗-TAL6抗體可對表現TAL6之癌細胞產生抗體-依賴性細胞毒性，並於裸鼠中抑制腫瘤生長，表示TAL6係一種可用於癌症免疫療法的標靶抗原。

以毒殺性T淋巴細胞(CTL)抗原表位為主之癌症疫苗，是一種可行的抗癌藥物。此類癌症疫苗含有衍生自腫瘤標靶抗原之CTL-抗原表位，可誘發對抗表現該標靶抗原之腫瘤細胞的毒殺性T細胞反應，而藉此消滅該腫瘤細胞。對於以CTL抗原表位為主之癌症疫苗的研發，從腫瘤標靶抗原鑑定出其CTL-抗原表位是必要的工作。

於一方面，本發明特徵在於一種具有最多50個胺基酸之經單離免疫肽，其包括衍生自腫瘤相關抗原L6(TAL6)之T細胞抗原表位的胺基酸序列，或編碼此類免疫肽之核酸。

術語“經單離之肽”用於本文意指一種實質上不含天然締合分子之肽類，亦即，以含有該肽之製劑的乾重計，其天然締合分子佔至多20%。純度可藉由任何適當方法，例如管柱層析術、聚丙烯醯胺凝膠電泳術及HPLC等測量得。

於一項實例，此免疫肽含有HLA-A2特異性T-細胞抗原表位，例如CIGHSLVGL(SEQ ID NO:1)、SLVGLALLC(SEQ ID NO:2)、ALLCIAANI(SEQ ID NO:3)、LLMLLPAFV(SEQ ID NO:4)、MLLPAFVFI(SEQ ID NO:5)、AMLSSVLAA(SEQ ID NO:6)、MLSSVLAAL(SEQ ID NO:7)、SVLAALIGI(SEQ ID NO:8)、GLAEGPLCL(SEQ ID NO:9)、HIVEWNVSL(SEQ ID NO:10)、SILLALGGI(SEQ ID NO:11)、ALGGIEFIL(SEQ ID NO:12)或VINGVLGGI(SEQ ID NO:13)。於另一項實例，該免疫肽含有HLA-A24特異性T-細胞抗原表位，例如CYGKCARCI(SEQ ID NO:14)、HSLVGLALL(SEQ ID NO:15)、LYFPNGETKY(SEQ ID NO:16)、KYASENHLS(SEQ ID NO:17)、RFVWFFSGI(SEQ ID NO:18)、FFSGIVGGGL(SEQ ID NO:19)、GYCVIVAAL(SEQ ID NO:20)、TFASTEGQYL(SEQ ID NO:21)、QYLLDTSTW(SEQ ID NO:22)及EWNVSLFSI(SEQ ID NO:23)。

除了TAL6-衍生之T-細胞抗原表位以外，本發明之免疫肽可進一步包含一種T輔助細胞刺激片段，例如QYIKANSKFIGITE(SEQ ID NO:24)或AKFVAAWTLK(SEQ ID NO:25)，及/或一種內質網標靶序列(例如，MRYMILGLLALAAVCSA；SEQ ID NO:26)。

於另一方面，本發明特徵在於一種免疫性組成物，其包含任一種前述之免疫肽，一種醫藥上可接受之載體及(視需要地)一種佐劑。該免疫性組成物可用於治療癌症(例如，肺癌、乳癌、結腸癌或卵巢癌)，或用於增強對抗TAL6的免疫反應。

於又一方面，本發明特徵在於一種與具有選自下列組群之胺基酸序列的TAL6片段專一性結合之抗體：CIGHSLVGL(SEQ ID NO:1)、SLVGLALLC(SEQ ID NO:2)、ALLCIAANI(SEQ ID NO:3)、LLMLLPAFV(SEQ ID NO:4)、MLLPAFVFI(SEQ ID NO:5)、AMLSSVLAA(SEQ ID NO:6)、MLSSVLAAL(SEQ ID NO:7)、SVLAALIGI(SEQ ID NO:8)、GLAEGPLCL(SEQ ID NO:9)、HIVEWNVSL(SEQ ID NO:10)、SILLALGGI(SEQ ID NO:11)、ALGGIEFIL(SEQ ID NO:12)、VINGVLGGI(SEQ ID NO:13)、CYGKCARCI(SEQ ID NO:14)、HSLVGLALL(SEQ ID NO:15)、LYFPNGETKY(SEQ ID NO:16)、KYASENHLS(SEQ ID NO:17)、RFVWFFSGI(SEQ ID NO:18)、FFSGIVGGGL(SEQ ID NO:19)、GYCVIVAAL(SEQ ID NO:20)、TFASTEGQYL(SEQ ID NO:21)、QYLLDTSTW(SEQ ID NO:22)及EWNVSLFSI(SEQ ID NO:23)。

本發明範圍亦包含(1)一種用於治療癌症或增強對抗TAL6之免疫反應的醫藥組成物，該醫藥組成物包含任一種前述之免疫肽，或用於生產該肽之表現載體，及(2)該免疫肽或用於生產其之表現載體於製造所欲目的之醫藥品的用途。

於下述實施方式中例舉本發明之一或多項具體態樣的詳細內容。本發明之其他特色或優點將由下列說明與圖示，以及由申請專利範圍彰顯出。

本發明特徵在於一種具有至多50個胺基酸殘基之免疫肽。該免疫肽包括一種衍生自TAL6，且特異於特定HLA等位基因，例如HLA-A2或HLA-A24，之T-細胞抗原表位(例如CTL抗原表位)。T細胞抗原表位係指一種能夠活化T細胞，並後續引發由受活化之T-細胞介導之免疫反應的肽。CTL抗原表位係指，一種能夠活化CTL(亦已知稱作Tc或殺手T細胞)之肽，其接著刺激CTL反應，亦即包括異常細胞(例如，經病毒感染或腫瘤細胞)死亡。CTL抗原表位(代表性地包括8-11胺基酸殘基)與存在抗原-展現細胞表面上之特定第I類MHC分子(包括重鏈與β2微球蛋白)形成複合體。此複合體在與一種T細胞(例如CD8 T細胞)之T細胞受體結合時，會活化該T細胞並接著引發CTL反應。

TAL6係一種表現於各種不同癌細胞上之已知腫瘤標靶抗原。其胺基酸序列列示於下(SEQ ID NO:30)：Met Cys Tyr Gly Lys Cys Ala Arg Cys Ile Gly His Ser Leu Val Gly Leu Ala Leu Leu Cys Ile Ala Ala Asn Ile Leu Leu Tyr Phe Pro Asn Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Ser Glu Asn His Leu Ser Arg Phe Val Trp Phe Phe Ser Gly Ile Val Gly Gly Gly Leu Leu Met Leu Leu Pro Ala Phe Val Phe Ile Gly Leu Glu Gln Asp Asp Cys Cys Gly Cys Cys Gly His Glu Asn Cys Gly Lys Arg Cys Ala Met Leu Ser Ser Val Leu Ala Ala Leu Ile Gly Ile Ala Gly Ser Gly Tyr Cys Val Ile Val Ala Ala Leu Gly Leu Ala Glu Gly Pro Leu Cys Leu Asp Ser Leu Gly Gln Trp Asn Tyr Thr Phe Ala Ser Thr Glu Gly Gln Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Thr Trp Ser Glu Cys Thr Glu Pro Lys His Ile Val Glu Trp Asn Val Ser Leu Phe Ser Ile Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ile Glu Phe Ile Leu Cys Leu Ile Gln Val Ile Asn Gly Val Leu Gly Gly Ile Cys Gly Phe Cys Cys Ser His Gln Gln Gln Tyr Asp Cys。

衍生自TAL6之T細胞抗原表位可以下述方法鑑定得。可藉由習知方法(例如化學合成法)製備得橫跨整個TAL6胺基酸序列之肽(例如，含有8-12胺基酸)。並藉由該項技藝已知之分析，測定其特異於特定HLA等位基因之作用。於一項實例中，係如下述進行MHC-肽複合體形成分析，來測定TAL6肽之第I類HLA特異作用。表現並純化得由第I類HLA等位基因(例如HLA-A2或HLA-A24)編碼之重鏈及β2微球蛋白。然後將彼等與前述任一肽類混合，並可藉由(例如)ELISA偵測任何經此形成的MHC-肽複合體。已熟知，由特定第I類HLA等位基因編碼之重鏈，只在有特異於該類HLA等位基因之肽存在下，才會與β2微球蛋白形成複合體。因此，有MHC-肽複合體形成即表示，該肽含有特異於第I類HLA等位基因之抗原表位。

在決定某一TAL6肽係特異於第I類HLA等位基因後，則可接著將其進行活體外或活體內分析，以確定其是否含有T細胞抗原表位(例如CTL抗原表位)。下述為一項活體外分析之實例。藉由使用該項技藝已知方法之基因定型，確定出帶有第I類HLA等位基因之人類。收集他或她的周邊血液單和細胞(PBMC)，並將其於自身抗原展現細胞存在下暴露至該肽。如果該合成肽會活化PBMC，則表示於其中所包括之抗原表位是一種特異於第I類HLA等位基因之T細胞抗原表位。於另一項實施例，係使用下述之活體內分析來測定該肽是否包括T細胞抗原表位。將表現第I類HLA等位基因之轉殖基因小鼠以該肽進行免疫。有誘發免疫反應(例如，分泌諸如IFN-γ與IL-2等細胞因子，或誘導產生細胞毒性)則表示，該肽含有特異於第I類HLA等位基因之T細胞抗原表位。

本發明之免疫肽可進一步包括一種T輔助細胞刺激片段，例如QYIKANSKFIGITE(破傷風類毒素830-843；SEQ ID NO:24)或AKFVAAWTLK(PADRE肽；SEQ ID NO:25)。或者或額外地，其可進一步包括一種內質網標靶序列。此標靶序列有助於使含有它的多肽進入第I類抗原展現途徑，其中該多肽之T-細胞抗原表位可與第I類HLA分子形成複合體。標靶序列之實例包括肽MRYMILGLLALAAVCSA(SEQ ID NO:26)與RYMILGLLALAAVCSA(SEQ ID NO:27)，二者皆衍生自腺病毒E3蛋白質。其他標靶序列包括(但不限定於)肽MRAAGIGILTVAAAAAG(SEQ ID NO:28，參見Minev等人2000,Eur J Immunol . 30(8): 2115-24)，及肽MAGILGFVFTLAAAAAG(SEQ ID NO:29，參見Gueguen等人,1994,J Exp Med . 1994,180(5): 1989-94)。

本發明之免疫肽可藉由習知方法，例如化學合成多肽或重組技術獲得。為製備重組肽類，可將編碼其之核酸與另一編碼融合夥伴，例如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、6x-His標記或M13基因3蛋白之核酸連接。將所成之融合核酸於適宜宿主中表現，並可藉由該項技藝已知之方法單離出融合蛋白質。經單離之融合蛋白質可進一步(例如以酵素分解)處理，而移除該融合夥伴，並獲得本發明之重組免疫肽。若此免疫肽含有衍生自TAL6(一種癌症標劑抗原)之T-細胞抗原表位，則其可用於增強對抗癌症，例如肺癌、結腸癌、乳癌、卵巢癌、胃癌、卡波西肉瘤及肝癌之免疫反應(例如，CTL反應)。當投藥予個體(較佳地帶有HLA-A2、HLA-A24或相等的HLA等位基因)時，此組成物有效於治療癌症。HLA-A2或HLA-A24之相等的HLA等位基因，為一種與特異於HLA-A2或HLA-A24之肽交叉反應的等位基因。實例包括(但不限定於)HLA-A3與HLA-A11。

為於有其需要的個體中治療癌症或增強對抗TAL6之免疫反應，可將前述之任一免疫肽，或能夠表現該免疫肽之表現載體與醫藥上可接受的載體混合，而形成一種免疫原性組成物(例如疫苗)。

免疫肽可能需要先進行化學修飾，因為彼等可能不具有顯著長的半衰期。經化學修飾之肽或肽類似物包括任何，其特徵在於增加活體內或活體外關於本發明實施之安定性及/或功效的該肽之功能性化學同等物。術語肽類似物亦指如本文所述肽之任何胺基酸衍生物。肽類似物可藉由其包括(但不限定於)對側鏈進行修改、併入非天然胺基酸與/或其於肽合成期間之衍生物及使用交聯劑之程序，與其他在肽或其類似物上進行強制構型限制之方法製得。側鏈修改之實例包括胺基之修飾，例如藉由與醛反應，隨後以NaBH₄ 還原之還原性烷基化作用；與甲基乙醯亞胺之亞醯胺化作用；與乙酸酐之乙醯化作用；與氰酸酯之胺甲醯基化作用；胺基與2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)之三硝基苯甲基化作用；胺基與琥珀酸酐及四氫酞酸酐之烷基化作用；及賴胺酸與吡哆-5'-磷酸酯隨後以NaBH₄ 還原之吡哆基化作用。精胺酸之胍基可藉由與諸如2,3-丁二酮、苯基乙二醛及乙二醛之試劑形成雜環縮合產物而進行修飾。羧基可藉由經o-醯基異脲形成之羰二醯亞胺活化作用，隨後進行衍生化作用(例如)呈相對應之醯胺而修飾。硫氫基可藉由例如與碘乙酸或碘以醯胺之羧甲基化；過甲酸氧化成胱胺酸；與其他硫醇化合物形成混合二硫化物；與馬來醯亞胺、馬來酸酐或其他經取代醯亞胺反應；使用4-氯汞苯甲酸酯、4-氯汞磺酸、氯化苯基汞、2-氯汞-4-硝基酚與其他汞基化合物形成汞基衍生物；與氰酸酯於鹼性pH值下進行胺甲醯基化作用等方法修飾。色胺酸殘基可藉由(例如)與N-溴琥珀西亞胺氧化，或其吲哚環與溴化2-羥基-5-硝基苯甲基或磺醯基鹵化物之烷基化作用修飾。酪胺酸殘基可藉由與四硝基甲烷之消化作用形成3-硝基酪胺酸衍生物而修改。組胺酸殘基之咪唑環可藉由與碘乙酸衍生物之烷基化，或與二碳酸二乙酯之N-碳乙氧基化作用完成修飾。於肽合成期間併入非天然胺基酸及衍生物之實例包括(但不限定於)，使用正亮胺酸、4-胺基丁酸、4-胺基-3-羥基-5-苯基戊酸、6-胺基己酸、t-丁基甘胺酸、正纈胺酸、苯基甘胺酸、鳥胺酸、肌胺酸、4-胺基-3-羥基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙胺酸及/或胺基酸之D-異構物。

前述之組成物可經由習知之方法製備得。其含有本發明之免疫肽/表現載體、醫藥上可接受之載體例如磷酸鹽緩衝食鹽水、碳酸氫鹽溶液與/或佐劑。當免疫肽不包括如前所述之T輔助細胞刺激片段時，則此類片段可包含於組成物中，以增強免疫反應。載體之選擇係基於投藥形式與途徑，及標準製藥實施程序。適宜之醫藥載體與稀釋劑，以及針對其使用之製藥必要組成，係經描述於雷明頓製藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)。若需要，亦可將佐劑例如霍亂毒素、大腸桿菌熱不安定性內毒素(LT)、脂質體、免疫刺激複合體(ISCOM)或免疫刺激性序列寡去氧核苷酸(ISS-ODN)包括於本發明之組成物中。組成物亦可包括一種有助於活體內遞送之聚合物。參見Audran R.等人，疫苗 21: 1250-5,2003；及Denis-Mize等人Cell Immunol .,225: 12-20,2003。於一項實例，免疫肽為對抗癌症之多價疫苗組成物的組成份。此多價組成物含有至少一種前述之免疫肽，與至少一種單離自流感病毒、副流感病毒3、肺炎鏈球菌、布藍漢氏球菌、金黃色葡萄球菌或呼吸道合胞病毒之保護性抗原，有或無佐劑存在。於另一項實例，免疫肽係經調配呈一種病毒體，其含有功能性病毒外膜糖蛋白，例如流感病毒血液凝集素(HA)。

用於製備疫苗之方法為該項技藝所一般熟知，如由美國專利4,601,903；4,599,231；4,599,230及4,596,792所例舉。

疫苗可製備呈可注射物，呈液體溶液或乳液。本發明之免疫肽可與生理上可接受且可相容之賦形劑混合。賦形劑可包括水、食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其組合。疫苗可進一步含有次要量之輔助物質，例如溼潤劑或乳化劑、pH緩衝劑或用於增強疫苗有效性之佐劑。達到疫苗之佐劑功效的方法包括，使用諸如氫氧化鋁或磷酸鋁(礬土)之試劑，一般使用呈0.05至0.1百分比溶於磷酸鹽緩衝食鹽水之溶液。疫苗可非經腸道投藥，藉由皮下或肌肉內注射。或者，可希望其他投藥形式包括栓劑與口服調配物。對於栓劑，可包括黏著劑與載體，例如聚烷二醇類或三酸甘油酯。口服調配物可包括正常使用之賦形劑，例如製藥級糖精、纖維素、碳酸鎂等類。此等組成物採取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉末之形式，且含有10-95%之本文所述的免疫肽。

前述之免疫性組成物亦可為一種樹狀細胞-為基礎之疫苗，其含有以本文所述之任一免疫肽脈的樹狀細胞。

用於製備樹狀細胞-為基礎之疫苗的方法，為該項技藝所熟知。參見Slingluff等人，Clin Cancer Res . 12 :2342s-2345s,2006；Buchsel等人，Clin J Oncol Nurs . 10 :629-40,2006；及山內等人，Expert Opin Biol Ther . 7 :645-9,2007。

經由習知用於治療癌症或增強對抗TAL6-表現細胞之免疫反應的途徑，將有效量之組成物投藥予個體(例如人類)。例舉之投藥途徑包括(但不限定於)口服、非經腸道、吸入噴霧、局部、直腸、鼻部、頰的、陰道，或經由植入容器進行投藥。術語“非經腸道”用於本文包括皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、腹板內、鞘內、損傷內及頭顱內注射或浸入技術。術語“有效量”用於本文意指各活性劑欲給予個體產生治療功效所需之量，單獨或與一或多種其他活性劑組合。有效量(如習於該項技藝人士所認知)係隨投藥途徑、賦形劑使用及與其他活性劑共同使用而有所改變。欲投予之量係取決於受治療的個體，包括(例如)個體之免疫系統可合成抗體，及若需要可產生細胞-介導之免疫反應的能力。所需要被投藥之活性成份確實量由醫師的判斷決定。然而，適宜之劑量範圍可由習於該項技藝人士容易地測定得，且可為含有微克範圍之本發明多肽。用於初始投藥及追加劑量之適宜療程亦可能有所不同，但可包括初始投藥隨後進行後續的投藥。疫苗之劑量亦可視投藥途徑而定，且根據宿主的大小而變化。

可確認出癌症患者，並投藥予前述之免疫性組成物。組成物之劑量係取決於(例如)特別的免疫肽、是否有佐劑與該免疫肽共同投藥、共同投藥佐劑之類型、投藥形式與頻數，如可由習於該項技藝人士測定得。若需要，可由習於該項技藝人士決定是否重複進行投藥。例如，在引發劑量後，可以每週間隔方式施予三次追加劑量。在第一次免疫後4至8週可給予追加注射，且於8至12週可給予第二次追加，使用相同的調配物。可從個體採集血清或T細胞，以供測試由本文所述之免疫性組成物所引起的免疫反應。分析對抗某一種蛋白質之細胞毒性T細胞的方法為該項技藝已熟知。若需要可給與額外的追加。可藉由改變免疫肽之量、組成物劑量與投藥頻數，而使免疫程序最適化以引起最大的抗癌免疫反應。

本發明之免疫肽亦可用於在動物(目的在於製造抗體)或人類(目的為治療疾病)產生抗體。於動物中製造單株與多株抗體及其片段之方法為該項技藝已知。參見，例如，Harlow與Lane,(1988)抗體：實驗室手冊，冷泉港實驗室，紐約。術語“抗體”包括完整免疫球蛋白分子、其抗原結合片段(例如Fab、F(ab')₂ 、Fv)，及經過遺傳工程改造之抗體，例如嵌合型抗體、人源化抗體與單鏈抗體及dAb(功能域抗體；Ward等人(1989)Nature ,341 ,544)。此等抗體可用於偵測表現TAL6之癌症，或用於癌症治療。

一般，為製造對抗某一種肽之抗體，可將該肽與載體蛋白質(例如KLH)偶合，與佐劑混合，並注射入宿主動物中。

然後可藉由肽親合層析術，將於動物中製得之抗體純化出。一般所使用之宿主動物包括兔子、小鼠、天竺鼠與大鼠。各種可用於增加免疫學反應之佐劑是取決於宿主物種，且包括弗氏佐劑(完全與不完全)、礦物凝膠例如氫氧化鋁、CpG、界面活性劑例如溶血卵磷脂、普羅類多醇類(pluronic polyols)、多陰離子、肽類、油性乳液、匙孔戚血藍蛋白及二硝基酚。可使用之人類佐劑包括BCG(卡介苗)與小棒桿菌。

多株抗體(異源性抗體分子族群)存在於經免疫個體之血清中。單株抗體(針對於本發明多肽之同源性抗體族群)可使用標準融合瘤技術製備得(參見，例如，Kohler等人(1975)Nature 256 ,495；Kohler等人(1976)Eur. J. Immunol. 6 ,511；Kohler等人(1976)Eur J Immunol 6 ,292；及等人(1981)單株抗體與T細胞融合瘤,Elsevier,N.Y.)。尤其，單株抗體可藉由任何用於藉由連續培養細胞系製造抗體分子之技術製得，例如描述於Kohler等人(1975)Ndture 256, 495與美國專利4,376,110；人類B-細胞融合瘤技術(Kosbor等人(1983)Immunol Today 4 ,72；Cole等人(1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026)；及EBV-融合瘤技術(Cole等人(1983)單株抗體與癌症治療,Alan R. Liss,Inc.,pp. 77-96)。此類抗體可為任一類免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何次類。製造本發明單株抗體之融合瘤可於活體外或活體內進行培養。於活體內製造高力價單株抗體之能力，可使其成為特別有用的製造方法。

此外，可使用為製造“嵌合型抗體”而發展出之技術。參見，例如，Morrison等人(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851；Neuberger等人Nature 312, 604；及武田等人(1984)Nature 314: 452。嵌合型抗體為其中不同部份衍生自不同動物品種之分子，例如該等具有衍生自鼠類單株抗體之可變區，及人類免疫球蛋白恆定區者。或者，可適用供製造單鏈抗體所述之技術(美國專利案號4,946,778與4,704,692)，來製造單鏈Fv抗體之噬菌體文庫。單鏈抗體係藉由將Fv區之重與輕鏈片段，經由胺基酸橋聯連結而形成。而且，抗體片段可藉由已知技術產生。例如，此類片段包括(但不限定於)可藉由抗體分子之胃蛋白酶分解產生之F(ab')₂ 片段，及可藉由將F(ab')₂ 片段之雙硫化物橋聯還原產生之Fab片段。

亦可藉由該項技藝已知之方法將抗體人源化。例如，具有所希望結合活性之單株抗體可經商業方法人源化(Scotgene,Scotland；及Oxford Molecular,Palo Alto,Calif.)。完全人類抗體，例如該等表現於轉殖基因動物者亦為本發明之特徵(參見，例如，Green等人(1994)Nature Genetics 7 ,13；及美國專利案號5,545,806與5,569,825)。

本發明特徵亦在於一種編碼本發明免疫肽之經單離核酸，包括使該免疫肽能表現之載體。此類核酸可(作為DNA疫苗)用於藉由將該核酸經由活載體，例如沙門氏桿菌、BCG、腺病毒、痘病毒、痘苗病毒或非病毒載體直接投藥予個體進行免疫。以核酸為主之免疫方法為該項技藝所熟知。

以下之特別實施例僅為例舉說明，並非意欲以任何方式限制本發明揭示之其餘部份。無需進一步詳細描述，據相信習於該項技藝人士可基於本文中之描述，利用本發明至其最完全程度。所有於本文中引用之公開文獻，皆以其完整性以引用方式納入。而且，以下所提出之任何機制，不以任何方式限制本發明之範圍。

實施例1：衍生自TAL6蛋白質之HLA-A2特異性T細胞抗原表位之鑑定

藉由化學合成方法合成得十六種肽(所有皆衍生自TAL6)，列示於下表1。將此等肽進行MHC-肽複合體形成分析(描述於美國專利申請案No. 12/235,872)，以從彼等鑑定出特異於HLA-A2者。

簡述之，依照下述程序將His-Tag融合之人類HLA-A2重鏈(His-HLA-A2)，及His-Tag融合之人類β2-微球蛋白(His-β2)於大腸桿菌進行表現，得到His-Tag融合蛋白質。將編碼融合蛋白質之表現載體導入大腸桿菌BL2(DE3)。將因此產生之轉形株培育於37 ℃下。當其O.D.值達到0.5時，將0.1 mM異丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)加至該大腸桿菌培養物中。再於37 ℃下培養3-4小時後，藉由於6000 rpm下離心20分鐘收取大腸桿菌細胞。將細胞團懸浮於含有8 M尿素、20 mM HEPES(pH 8.0)與50 mM NaCl之緩衝液A中，然後進行超音波震盪。再次將經超音波震盪之細胞離心，並收集因此形成之上清液，加樣於Ni-NTA-瓊脂糖管柱，以純化His-HLA-A2或His-β2。

將His-A2、His-β2及各種列示於上表1之肽(測試肽)或陽性對照組肽，一起於含有100 mM Tris-Hcl(pH 8)、400 mM L-精胺酸、2 mM EDTA、5 mM還原型谷胱甘肽、0.5 mM氧化型谷胱甘肽之再折疊緩衝液中，於4 ℃下培育72小時。測定MHC-肽複合體形成分析之方法描述如下。

將ELISA平盤覆蓋以抗-HLA抗體W6/32(HB-95;ATCC.)(50 μL，濃度5 μg/ml溶於100 mM碳酸鹽緩衝液，pH 9.6於4 ℃下過夜)。將平盤以250 μl/孔5% w/v脫脂奶粉溶於PBS於室溫下進行封阻2小時，然後以300 μl/孔0.05% Tween-20(Sigma)溶於PBS清洗三次。將複合體稀釋於含有1% BSA之PBS溶液中，接著將其加至該經抗體覆蓋之平盤。將平盤於室溫下培育2小時，以使複合體結合至抗-HLA抗體。經培育後，將平盤清洗兩次，然後加入100 μl/孔辣根過氧化酶(HRP)標定之兔抗人類β2-微球蛋白抗體(DAKO，日本；以1:2500稀釋於含有1% BSA之PBS溶液)。將平盤於室溫下培育2小時，以PBS/0.05% Tween 20清洗六次，然後加入HRP-共軛之抗-兔抗體(1:2000)。待於室溫下培育一小時後，將3,3'-5,5'-四甲基聯苯胺(TMB,Sigma)加至平盤，培育30分鐘，並使用ELISA計讀器於450 nM下讀取各孔中因此顯色出的色度。顏色的強度表示肽之MHC-肽形成率。基於各肽之MHC-肽形成率相對於陽性對照組肽之MHC-肽形成率，依照下列公式定出相對結合活性：相對結合活性=(測試肽之MHC-肽形成率－空白對照組肽之MHC-肽形成率)/(陽性對照組肽之MHC-肽形成率－空白對照組肽之MHC-肽形成率)。各測試肽之相對結合活性列示於上表1中。具有相對結合活性大於50%的肽，即為特異於HLA-A2之T細胞抗原表位。

實施例2：HLA-A2轉殖基因小鼠以衍生自TAL6之HLA-A2特異性T細胞抗原表位之免疫

將一毫克各種於前述實施例1中經鑑定為HLA-A2特異性T細胞抗原表位之肽(測試肽)，及1毫克PADRE肽(AKFVAAWTLKAAA;SEQ ID NO:25)(二者皆溶於0.5 ml PBS中)，與0.5 mL不完全Freund氏佐劑(IFA)混合在一起。使用EBV-衍生之HLA-A2-特異性抗原表位(即，GLCTLVAML(GLC;SEQ ID NO:35))作為陽性對照組，及EBV-衍生之HLA-A24-特異性抗原表位(即，TYGPVFMCL(TYG;SEQ ID NO:37))作為陰性對照組。將100 μl混合物(含有50 μg測試肽)經皮下注射入HLA-A2轉殖基因小鼠之尾基部，每7天一次共進行兩次。在第二次注射後7天，從經處理之小鼠收取脾臟細胞，並培養於含有10 μg/mL測試肽之培養基中。將細胞培養物之上清液進行ELISpot分析，以檢測其中所含的IFN-γ總量，其係與該測試肽刺激T細胞之活性成正比。如圖1所示，有一些測試肽(例如肽2與5)會誘導T細胞分泌IFN-γ，指示彼等為HLA-A2特異性T細胞抗原表位。

實施例3：衍生自TAL6之HLA-A24特異性T細胞抗原表位之鑑定

將下表2所列示之TAL6肽，依照前述實施例1中所述之程序進行MHC-肽複合體形成分析，以鑑定出可與人類HLA-A24及β2-微球蛋白形成MHC複合體者。經此得到之結果列示於下表2中。具有相對結合活性大於50%之肽，即確認為特異於HLA-A24之TAL6 T細胞抗原表位。

實施例4：HLA-A24轉殖基因小鼠以衍生自TAL6之HLA-A24-特異性T細胞抗原表位之免疫

使用各種於前述實施例3中經鑑定為HLA-A24-特異性T-細胞抗原表位之肽(測試肽)，依照前述實施例2中所述之程序來免疫HLA-A24轉殖基因小鼠。使用EBV肽GLC及TYG分別作為陰性與陽性對照組。如圖2所示，有一些測試肽(例如，肽27、29與30)會誘導T細胞分泌IFN-γ，指示彼等為HLA-A24特異性T細胞抗原表位。

實施例5：HLA-A2轉殖基因小鼠以製造TAL6之表現載體免亦可誘導專一於TAL6肽之T細胞反應

藉由習知重組技術使用表現載體pCIneo(Promega,Madison,WI,USA)構築得表現質體pEK/TAL6，其經設計用於表現一種含有內質網標靶序列、H-2Kb-特異性序列SIINFEKL(SEQ ID NO:46；衍生自卵白蛋白)、HLA-A2-特異性序列GILGFVFTL(SEQ ID NO:47；衍生自流感病毒之M蛋白)與TAL6之融合蛋白質。

將小鼠經由肌肉內注射以pEK/TAL6或pCIneo於3-週期間免疫2-3次。於最後一次注射後7天，將經免疫之小鼠犧牲，收集其脾臟細胞並以各種測試TAL6肽刺激。以IFN-γ ELISpot測定是否存在由測試TAL6肽活化而分泌IFN-γ之細胞。如圖3所示，得自經pEK/TAL6免疫之小鼠的脾臟細胞，對列示於上表1中之肽2及5產生反應。此結果顯示，表現TAL6之DNA疫苗可誘發專一於某些特定TAL6肽之T細胞反應。

實施例6：以TAL6肽免疫可抑制HLA-A2轉殖基因小鼠中之腫瘤生長

將列示於上表1中之肽2或肽5(已與IFA混合)經皮下投藥予HLA-A2轉殖基因小鼠(50 μg/小鼠)或野生型C57BL/6小鼠，兩週內施予兩次。二十一天後，將每隻經免疫的小鼠以皮下植入2 x 10⁵ 腫瘤細胞EL4/TAL6/HLA-A2(穩定地表現TAL6與HLA-A2之EL4細胞)，以於經免疫的小鼠中誘導腫瘤生長。每2-3天偵測經處理小鼠體內的腫瘤尺寸。使用下列公式計算腫瘤體積：腫瘤體積=長度×寬度×寬度/2。

肽5之免疫作用顯著抑制HLA-A2轉殖基因小鼠中之腫瘤生長，但是不會抑制野生型小鼠之腫瘤生長。參見圖4。肽2之免疫作用亦可減少HLA-A2轉殖基因小鼠中之腫瘤生長，但是減少的程度較低。此等結果顯示，以衍生自TAL6之HLA-A2特異性免疫肽進行免疫，可有效抑制於HLA-A2攜帶者中之腫瘤生長。

其他具體態樣

本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。於是，本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。

從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。

<110>　國家衛生研究院

<120>　腫瘤相關抗原之免疫性肽類及其於癌症治療上的用途

<130>　38301-014001

<150>　61/233,229

<151>　2009-08-12

<160>　47

<170>　PatentIn第3.5版

<210>　1

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之9-17 aa)

<400>　1

<210>　2

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人造序列

<220>

<223>　合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之13-21 aa)

<400>　2

<210>　3

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之18-26 aa)

<400>3

<210>　4

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之58-66 aa)

<400>　4

<210>　5

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之60-68 aa)

<400>　5

<210>　6

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之89-97 aa)

<400>　6

<210>　7

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之90-98 aa)

<400>　7

<210>　8

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之93-101 aa)

<400>　8

<210>　9

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之114-122 aa of)

<400>　9

<210>　10

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之154-162 aa)

<400>　10

<210>　11

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之164-172 aa)

<400>　11

<210>　12

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之168-176 aa)

<400>　12

<210>　13

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之181-189 aa)

<400>　13

<210>　14

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之2-10 aa)

<400>　14

<210>　15

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之12-20 aa)

<400>　15

<210>　16

<211>　10

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之28-36 aa)

<400>　16

<210>　17

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之36-44 aa)

<400>　17

<210>　18

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之45-53 aa)

<400>　18

<210>　19

<211>　10

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之49-57 aa)

<400>　19

<210>　20

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之105-113 aa)

<400>　20

<210>　21

<211>　10

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之131-140 aa)

<400>　21

<210>　22

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之138-147 aa of)

<400>　22

<210>　23

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之157-165 aa)

<400>　23

<210>　24

<211>　14

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型T輔助細胞刺激片段

<400>　24

<210>　25

<211>　10

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型T輔助細胞刺激片段

<400>　25

<210>　26

<211>　17

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>　合成型內質網標靶序列

<400>　26

<210>　27

<211>　16

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>　合成型內質網標靶序列

<400>　27

<210>　28

<211>　17

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>　合成型內質網標靶序列

<400>　28

<210>　29

<211>　17

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>　合成型內質網標靶序列

<400>　29

<210>　30

<211>　202

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　30

<210>　31

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之53-61 aa)

<400>　31

<210>　32

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之161-169 aa)

<400>　32

<210>　33

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A2特異性CTL抗原表位(TAL6之177-185 aa)

<400>　33

<210>　34

<211>　12

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型PADRE肽

<400>　34

<210>　35

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型EBV-衍生之HLA-A2-特異性抗原表位

<400>　35

<210>　36

<211>　12

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型EBV-衍生之HLA-A2-特異性抗原表位

<400>　36

<210>　37

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型EBV-衍生之HLA-A2-特異性抗原表位

<400>　37

<210>　38

<211>　12

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型EBV-衍生之HLA-A2-特異性抗原表位

<400>　38

<210>　39

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之22-30 aa)

<400>　39

<210>　40

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之131-139 aa)

<400>　40

<210>　41

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之155-163 aa)

<400>　41

<210>　42

<211>　10

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之157-166 aa)

<400>　42

<210>　43

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之170-178 aa)

<400>　43

<210>　44

<211>　10

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之170-179 aa)

<400>　44

<210>　45

<211>　10

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>合成型HLA-A24特異性CTL抗原表位(TAL6之154-163 aa)

<400>　45

<210>　46

<211>　8

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>衍生自卵白蛋白之合成型肽片段

<400>　46

<210>　47

<211>　9

<212>　PRT

<213>人造序列

<220>

<223>衍生自流感病毒M蛋白之合成型肽片段

<400>　47

圖1為顯示得自經數種衍生於TAL6之免疫性肽免疫的HLA-A2轉殖基因小鼠之脾臟細胞誘導產生IFN-γ的圖。“NP”代表無任何肽存在。

圖2為顯示得自經數種衍生於TAL6之免疫性肽免疫的HLA-A24轉殖基因小鼠之脾臟細胞誘導產生IFN-γ的圖。“N”係指陰性對照組，而“N”係指陽性對照組。

圖3為顯示於經質體pEK/TAL6 DNA免疫之小鼠誘發肽專一性T-細胞反應的圖。進行IFN-γ ELISpot分析來偵測分泌IFN-γ之細胞。“N”係指陰性對照組，而“N”係指陽性對照組。

圖4為顯示由衍生自TAL6之免疫肽抑制經免疫小鼠中腫瘤生長的圖。使用下列公式計算腫瘤體積：腫瘤體積=長度×寬度×寬度/2。平行組(a)：HLA-A2轉殖基因小鼠。平行組(b)：野生型小鼠。

Claims (9)

1. 一種經單離之免疫肽，其包含衍生自腫瘤相關抗原L6(TAL6)之特異於HLA-A2的T細胞抗原表位，其中該T細胞抗原表位係由SLVGLALLC(SEQ ID NO：2)或LLMLLPAFV(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列所組成。
2. 根據申請專利範圍第1項之經單離之免疫肽，其進一步包含內質網標靶片段。
3. 根據申請專利範圍第1項之經單離之免疫肽，其進一步包含T輔助細胞刺激片段。
4. 根據申請專利範圍第3項之經單離之免疫肽，其中該T輔助細胞刺激片段具有QYIKANSKFIGITE(SEQ ID NO：24)或AKFVAAWTLK(SEQ ID NO：25)之胺基酸序列。
5. 根據申請專利範圍第1項之經單離之免疫肽，其係由SLVGLALLC(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列所組成。
6. 根據申請專利範圍第1項之經單離之免疫肽，其係由LLMLLPAFV(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列所組成。
7. 一種免疫性組成物，其包含根據申請專利範圍第1項之免疫肽，及醫藥上可接受之載體。
8. 根據申請專利範圍第7項之免疫性組成物，其進一步包含佐劑。
9. 一種抗體，其專一性結合至具有SLVGLALLC(SEQ ID NO：2)或LLMLLPAFV(SEQ ID NO：4)的胺基酸序列之TAL6片段。