[go: up one dir, main page]

TWI394573B - Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for Liver Protection - Google Patents

Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for Liver Protection Download PDF

Info

Publication number
TWI394573B
TWI394573B TW096121548A TW96121548A TWI394573B TW I394573 B TWI394573 B TW I394573B TW 096121548 A TW096121548 A TW 096121548A TW 96121548 A TW96121548 A TW 96121548A TW I394573 B TWI394573 B TW I394573B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
liver
compound
carbon tetrachloride
control group
damage
Prior art date
Application number
TW096121548A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200848066A (en
Inventor
劉勝勇
溫武哲
郭茂田
Original Assignee
國鼎生物科技股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 國鼎生物科技股份有限公司 filed Critical 國鼎生物科技股份有限公司
Priority to TW096121548A priority Critical patent/TWI394573B/zh
Priority to JP2007240271A priority patent/JP2008308479A/ja
Priority to US11/902,599 priority patent/US7456225B1/en
Priority to KR1020070098585A priority patent/KR101069959B1/ko
Priority to DE102007049063A priority patent/DE102007049063A1/de
Priority to FR0758451A priority patent/FR2917407B1/fr
Priority to GB0724748.9A priority patent/GB2450189B/en
Publication of TW200848066A publication Critical patent/TW200848066A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI394573B publication Critical patent/TWI394573B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C403/00—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone
    • C07C403/02—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone having side-chains containing only carbon and hydrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/16—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring the ring being unsaturated

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

牛樟芝環己烯酮化合物在製備用於護肝之藥物的應用
本發明係關於一種用於護肝之化合物，尤其係關於一種自牛樟芝(Antrodia camphorata)萃取物中分離純化而得且可用於保護肝臟並減緩肝臟損傷及纖維化程度之環己烯酮化合物。
肝臟為人體最大、機能最複雜的重要代謝器官，其於醣、脂質、蛋白質、維生素、激素、膽汁等物質代謝中，均有重要作用；同時肝臟還有分泌、排泄、生物轉化等方面的功能；肝臟也是機體重要屏障器官，其解毒功能對機體有重要保護作用，因此當肝功能損傷時會導致代謝障礙，並影響其他臟器功能，嚴重則危及生命。而國人肝臟疾病罹患率甚高，根據行政院衛生署的統計資料顯示，慢性肝病及肝硬化為十大死亡原因之第六位，且每年死亡人數在三千人以上，且該數值仍逐漸攀升中，因此研發出可有效保護肝臟並可應用於預防或治療肝臟相關疾病之物質，實為當務之急。
牛樟芝(Antrodia camphorata )，又稱樟芝、牛樟菇或紅樟芝等，屬於非褶菌目(Aphyllophorales )、多孔菌科(Polyporaceae )之多年生蕈菌類，為台灣特有種真菌，僅生長於台灣保育類樹種－牛樟樹(Cinnamoum kanehirai Hay)之中空腐朽心材內壁上。由於牛樟樹分布數量極為稀少，加上人為的盜伐，使得寄生於其中方能生長之野生牛樟芝數量更形稀少，且由於其子實體生長相當緩慢，生長期亦僅在六月至十月之間，因此價格非常昂貴。
牛樟芝之子實體為多年生，無柄，呈木栓質至木質，其具強烈之樟樹香氣，且形態多變化，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。初生時為扁平型並呈鮮紅色，之後其周邊會呈現放射反捲狀，並向四周擴展生長，顏色亦轉變為淡紅褐色或淡黃褐色，並有許多細孔，且其係為牛樟芝之藥用價值最豐富的部位。
在台灣民俗醫學上，牛樟芝具有解毒、減輕腹瀉症狀、消炎、治療肝臟相關疾病及抗癌等功用。牛樟芝如同一般食藥用之蕈菇類，具有許多複雜的成分，已知的生理活性成分中，包括：三萜類化合物(triterpenoids)、多醣體(polysaccharides，如β－D－葡聚醣)、腺苷(adenosine)、維生素(如維生素B、菸鹼酸)、蛋白質(含免疫球蛋白)、超氧歧化酵素(superoxide dismutase,SOD)、微量元素(如：鈣、磷、鍺)、核酸、固醇類以及血壓穩定物質(如antodia acid)等，此些生理活性成分被認為具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗過敏、抗病菌、抗高血壓、降血糖、降膽固醇、保護肝臟及抗疲勞等多種功效。
牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多，三萜類化合物是由三十個碳元素結合成六角形或五角形天然化合物之總稱，牛樟芝所具之苦味即主要來自三萜類此成分。1995年時，Cherng等人發現牛樟芝子實體萃取物中含有三種新的以麥角甾烷(ergostane)為骨架的三萜類化合物：antcin A、antcin B與antcin C(Cherng,I.H.,and Chiang,H.C.1995.Three new triterpenoids fromAntrodia cinnamomea .J.Nat.Prod.58：365－371)。Chen等人以乙醇萃取樟芝子實體後發現zhankuic acid A、zhankuic acid B及zhankuic acid C等三種三萜類化合物(Chen,C.H.,and Yang,S.W.1995.New steroid acids fromAntrodia cinnamomea ,－a fungus parasitic onCinnamomum micranthum .J.Nat.Prod.58：1655－1661)。此外，Chiang等人於1995年也由子實體萃取物中發現另外三種分別為倍半萜內酯(sesquiterpene lactone)與兩種雙酚類衍生物的新三萜類化合物，此即antrocin,4,7－二甲氧基－5－甲基－1,3－苯並二氧環(4,7－dimethoxy－5－methy－1,3－benzodioxole)與2,2',5,5'－四甲氧基－3,4,3',4'－雙－亞甲二氧基－6,6'－二甲基聯苯(2,2',5,5'－teramethoxy－3,4,3',4'－bi－methylenedioxy－6,6'－dimethylbiphenyl)(Chiang,H.C.,Wu,D.P.,Cherng,I.W.,and Ueng,C.H.1995.A sesquiterpene lactone,phenyl and biphenyl compounds fromAntrodia cinnamomea. Phytochemistry.39：613－616)。到了1996年，Cherng等人以同樣分析方法再度發現四種新的三萜類化合物：antcin E、antcin F、methyl antcinate G、methyl antcinate H(Cherng,I.H.,Wu,D.P.,and Chiang,H.C.1996.Triteroenoids fromAntrodia cinnamomea .Phytochemistry.41：263－267)；而Yang等人則發現了二種以麥角甾烷為骨架的新化合物zhankuic acid D、zhankuic acid E，和三種以羊毛甾烷(lanostane)為骨架的新化合物：15 α-乙醯-去氫硫色多孔菌酸(15 α-acetyl-dehydrosulphurenic acid)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid)與去水硫色多孔菌酸(dehydrasulphurenic acid)(Yang,S.W.,Shen,Y.C.,and Chen,C.H.1996.Steroids and triterpenoids ofAntrodia cinnamomea -a fungus parasitic onCinnamomum micranthum .Phytochemistry.41：1389-1392)。
雖然由目前諸多之實驗可得知牛樟芝萃取物具有前述功效，且其所含成分亦陸續被分析出，但究竟萃取物中之何種有效成分可促成牛樟芝之護肝功效，並未發表具體之相關有效成分，有待進一步實驗研究來釐清，故若能找出該萃取物中所含真正有效保肝成分，將有利於牛樟芝護肝相關機轉的研究，並對牛樟芝應用於肝臟相關疾病之治療與預防有莫大的助益。
為明瞭牛樟芝萃取物中究竟為何成分具有護肝之效果，本發明由牛樟芝萃取物中分離純化出具式(1)結構式之化合物；
其中，X係氧(O)或硫(S)，Y係氧或硫；R1 係氫基(H)、甲基(CH3 )或(CH2 )m －CH3 ，R2 係氫基、甲基或(CH2 )m －CH3 ，R3 係氫基、甲基或(CH2 )m －CH3 ，m＝1~12；n＝1~12。
如式(1)結構式之化合物中，較佳者為如下所示式(2)之化合物：
式(2)之化合物，其化學名為4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮(4－hydroxy－2,3－dimethoxy－6－methy－5(3,7,11－trimethyl－dodeca－2,6,10－trienyl)－cyclohex－2－enone)，分子式為C24 H38 O4 ，外觀為淡黃色粉末狀，分子量為390。
本發明中式(1)、式(2)之環己烯酮化合物係分離純化自牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物，有機溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或鹵烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，但並不以此為限，其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。
藉由前述式(1)、式(2)之環己烯酮化合物，本發明係將其應用於肝臟保護以及預防與減緩肝臟損傷上，當以四氯化碳誘發大鼠肝損傷後，餵食牛樟芝環己烯酮化合物係有助於減緩大鼠肝臟組織之損傷及纖維化程度，並可降低大鼠血漿中丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase,ALT)以及天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase,AST)之濃度，進而達到護肝之功效；此外，牛樟芝環己烯酮化合物亦有助於增進肝臟中麩胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)以及過氧化氫酵素(CAT)之濃度含量，藉以降低自由基對肝臟細胞造成之損傷及其承受之氧化壓力，而可提升肝臟組織之抗氧化能力。
另一方面，本發明中亦可將式(1)或/與式(2)之化合物利用於治療肝臟損傷之醫藥組成物的成分中，藉以改善哺乳動物例如人類因肝臟損傷所引發之症狀。前述醫藥組成物除包括有效劑量之式(1)或/與式(2)之化合物外，尚可包括藥學上可接受的載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或澱粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此。本發明醫藥組成物可依一般習知藥學之製備方法生產製造，將式(1)或/與式(2)有效成分劑量與一種以上之載體相混合，製備出所需之劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其他液體製劑，但未以此為限。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
首先取牛樟芝(Antrodia camphorata )菌絲體、子實體或二者之混合物，利用習知萃取方式，以水或有機溶劑進行萃取，藉以取得牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物。其中，有機溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或鹵烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，但並不以此為限。其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。
經萃取過後之牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物，可進一步藉由高效液相層析加以分離純化，之後再對每一分液(fraction)進行與護肝功能相關之生化測試。最後，則針對具護肝效果之分液進行成分分析，再將可能產生護肝功效的成分進行其對減緩肝臟損傷之影響等相關生化試驗。最終即發現本發明中如式(1)/式(2)之化合物係具有可減緩肝臟損傷以保護肝臟之功效。
為方便說明本發明，以下將以式(2)之4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮化合物進行說明。此外，為證實4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮化合物係具保肝效果，本發明中係藉由經化學物質四氯化碳(CCl4 )誘導大鼠產生慢性肝損傷後，投予不同劑量之牛樟芝環己烯酮化合物，並檢測其肝損傷程度、肝臟纖維化程度、丙胺酸轉胺酶(ALT)與天門冬胺酸轉胺酶(AST)濃度、以及麩胱甘肽酶(glutathione，GSH)、麩胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSHPx)、過氧化氫酵素(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)肝臟抗氧化酵素等肝臟損傷指標，以測得牛樟芝環己烯酮化合物之護肝能力。
由該些肝臟組織觀察結果以及生化測試數值證實4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮化合物係可減緩化學性肝損傷所致肝臟組織傷害及纖維化之功效，並可降低丙胺酸轉胺酶(ALT)與天門冬胺酸轉胺酶(AST)等肝功能發炎壞損指標於血液中之濃度，同時亦可增進肝臟中麩胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)以及過氧化氫酵素(CAT)之含量，以降低自由基對肝細胞造成之損傷及其承受之氧化壓力，提升肝臟組織之抗氧化能力，進而達到保護肝臟之目的。茲對前述實施方式詳盡說明如下：
實施例1：
4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮的分離將100克左右之牛樟芝菌絲體、子實體或二者之混合物，置入三角錐形瓶中，加入適當比例的水與醇類(例如70%以上之醇類水溶液，於20~25℃下攪拌萃取至少1小時以上，之後以濾紙及0.45 μm濾膜過濾，收集萃取液。
將前述收集之牛樟芝萃取液，利用高效能液相層析儀(High Performance Liquid chromatography)，以RP18的層析管(column)進行分析，並以甲醇(A)及0.1%~0.5%醋酸水溶液(B)做為移動相(mobile phase)(其溶液比例係：0~10分鐘，B比例為95%~20%；10~20分鐘，B比例為20%~10%；20~35分鐘，B比例為10%~10%；35~40分鐘，B比例為10%~95%)，在每分鐘1 ml之速度下沖提，同時以紫外－可見光全波長偵測器分析。
將25分鐘至30分鐘之沖提液收集濃縮即可得淡黃色粉末狀之固體產物，此即4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮。經分析，其分子式為C24 H38 O4 ，分子量390，熔點(m.p.)為48℃~52℃。核磁共振(NMR)分析值則如下所示：1 H－NMR(CDCl3 )δ(ppm)：1.51、1.67、1.71、1.75、1.94、2.03、2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07與5.14。13 C－NMR(CDCl3 )δ(ppm)：12.31、16.1、16.12、17.67、25.67、26.44、26.74、27.00、39.71、39.81、4.027、43.34、59.22、60.59、120.97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、138.05、160.45與197.12。
實施例2：
牛樟芝環己烯酮化合物之護肝測試由於造成肝臟疾病之主要因素有病毒性、酒精性與化學性三大類，而在老鼠動物模式之病理切片中與人體有一致之病理現象者為化學性肝損傷，因此本評估方法係針對化學性肝損傷進行護肝功能之評估；藉由四氯化碳(CCl4 )誘導大鼠慢性肝損傷的實驗模式，並測檢肝損傷生化數值與肝臟組織切片，探討牛樟芝環己烯酮化合物之處理對於大鼠慢性肝損傷的影響。其中，四氯化碳的毒性會造成肝細胞壞死，進一步發展成肝臟纖維化(fibrosis)，若持續投予則會造成不可逆之肝硬化(cirrhosis)的發生；其誘導肝損傷之原理係因四氯化碳可受肝微粒酵素活化成三氯甲烷自由基(trichloromethyl radical,CCl3 ．)，再與蛋白質結合導致蛋白質合成受阻，並引起脂質分解代謝失調，引起肝細胞內三酸甘油酯蓄積，另外三氯甲烷自由基所形成之過氧化物，亦會導致脂質過氧化而使得肝細胞膜損傷，造成肝中酵素滲出及細胞病變而壞死。因此，四氯化碳的肝損傷模式乃模擬人類之肝硬化疾病，故可應用於評估治療肝纖維化等肝臟疾病之藥物或食物成分之治療效果。其測試步驟詳述如下：(1)四氯化碳誘發肝損傷動物模式之建立實驗動物係為五週齡之大鼠(Sprague－Dawley，SD)，購自樂斯科生物科技股份有限公司，購得後將該些大鼠留置動物飼育室觀察兩週，取體重相近(約220克~270克)之健康成鼠進行試驗。實驗前將大鼠分為六組，每組12隻，每日秤量紀錄大鼠體重，以作為後續實驗給藥劑量之依據，並進行表一所示分組實驗，分別為控制組、負對照組、正對照組以及分別餵食300 mg/kg、1000 mg/kg與3000 mg/kg之三組實驗組。其中，水飛薊(silymarin)係可緩解肝臟部位的發炎反應，降低肝臟的損傷程度，其亦可藉由中和毒性物質的毒性，或與毒性物質一起競爭肝臟的結合位質，而減少肝臟對毒性物質的吸收份量；而水飛薊所具抗氧化功效，能保護肝臟細胞免受自由基破壞。由於水飛薊在許多不同的肝臟損傷研究，包括大量動物實驗與一些臨床試驗，均顯示具有相當良好護肝的功能，因此，在近代醫學上被公認為肝臟疾病之治療藥物，且於肝損傷之動物實驗模式中也被當作正對照組使用之藥物。
表一中之A組為控制組，其係以玉米油(購自Sigma chemical co.)進行胃管灌注；B至F組均以胃管灌注由玉米油所配製成之20%(v/v)四氯化碳(購自日本之島九藥品)，每隻大鼠依其體積重給予2 ml/kg之灌食量，且每週2天(星期二、四下午)給予胃管灌注，連續進行8週；C組係以胃管灌注由生理食鹽水配製成200 mg/kg劑量之水飛薊；D至F組係分別以胃管灌注由實施例一所製備並以生理食鹽水配製成300 mg/kg、1000 mg/kg與3000 mg/kg等濃度劑量之牛樟芝4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮化合物，而C至F組之灌食量係依每隻大鼠體積重給予10 ml/kg之上述物質，且每週5天(上午)給予胃管灌注，連續進行8週。實驗期間所測得大鼠體重及大鼠進食情況之結果係如第一圖與第二圖所示。
第一圖係控制組以及經口服20%(v/v)四氯化碳並給予水飛薊或牛樟芝環己烯酮化合物之各對照組與實驗組於八週實驗期間，其大鼠之體重變化。由第一圖可知，在初始體重的部分，各組之間均無顯著差異，經口服20%(v/v)四氯化碳處理一週後，相對於未經四氯化碳處理之控制組，各對照組與實驗組之大鼠體重均呈現下降之趨勢；且於第八週時，未給予水飛薊或牛樟芝環己烯酮化合物之負對照組所測得之最終體重為366.9克，顯著低於控制組之最終體重448.7克，此表示四氯化碳之處理會引起大鼠體內之病變，進而使大鼠體重下降。此外，口服水飛薊之正對照組呈現之最終體重為375.8克，體重減輕較負對照組少，此表示大鼠體重雖受四氯化碳影響而下降，但藉由水飛薊之作用，使大鼠體重不致於驟降；而餵食不同濃度劑量牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組，當餵食劑量分別為300 mg/kg、1,000 mg/kg與3,000 mg/kg時，其所示大鼠體重則分別為386.6克、365.1克與355.0克，此顯示濃度為300 mg/kg之牛樟芝環己烯酮化合物可有效緩和四氯化碳所致體重下降之狀況。
第二圖係控制組以及經口服20%(v/v)四氯化碳並給予水飛薊或牛樟芝環己烯酮化合物之各對照組與實驗組於八週實驗期間，對大鼠進食飼料量之影響。由第二圖可知，在處理後第1－5週各組大鼠飼料消耗呈現上升，但於第5週後，各組之飼料消耗量開始減少並呈現下降趨勢，此顯示經四氯化碳誘發大鼠肝損傷，會影響實驗動物的進食量。
(2)四氯化碳對肝、腎及脾臟重量之影響大鼠於第八週結束時全部犧牲，並將大鼠剖腹取出肝、腎及脾臟秤重之，再將所測得之肝、腎及脾臟重量數值比上取得該些臟器之大鼠總體重，以換算成該些臟器佔大鼠總體重之比值(%)，以觀察經四氯化碳處理以及投予牛樟芝環己烯酮化合物後對肝、腎及脾臟重量之影響，此外，各試驗組數據以平均值及標準差值(mean±SD)表示，以單因子變異數方法分析(One－way analysis of variance,ANOVA)，經由變異數分析結果得知有顯著差異時，再進一步利用LSD法進行多重比較，或以獨立t檢定(Student t－test)統計程式，比較牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組與控制組、正對照組及負對照組間之差異，而p<0.05則具顯著性差異，其結果如表二所示。
表二、四氯化碳誘發肝損傷後餵食牛樟芝環己烯酮化合物對實驗動物臟器重量之影響(%)
由表二可知，經四氯化碳處理而未給予水飛薊或牛樟芝環己烯酮化合物之負對照組所測得之肝、腎及脾臟重量與總體重之百分比(%)，均顯著(p <0.05)高於控制組，此顯示四氯化碳已造成肝、腎及脾臟之病變，而使該些臟器重量上升；口服水飛薊之正對照組所示肝臟、腎臟與脾臟重量係因四氯化碳之影響而高於控制組，但因水飛薊本身之護肝作用，使得增加之該些臟器重量仍比負對照組所測得重量為低。此外，相較於控制組，餵食不同濃度劑量牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組所顯示之肝臟、腎臟與脾臟重量百分比(%)均有增加之趨勢，但該些臟器之重量仍比負對照組所測得重量為低，此結果表示以牛樟芝環己烯酮化合物餵食大鼠，可有效減輕四氯化碳所引起之肝臟、腎臟以及脾臟的傷害，使得該些大鼠臟器之重量不致持續攀升。
(3)肝臟組織病理觀察剖腹取出大鼠肝臟時，先以肉眼觀察肝臟表面病理變化，並進行肝臟組織切片。肝臟依解剖學位置，將五個肝小葉平均切採一半肝組織，置於－80℃的冷凍櫃中冷凍，以備後續檢測抗氧化酵素的活性。其餘肝組織放入10%的中性福馬林溶液內固定一週，經粗修及石蠟包埋後，製成2 μm厚度之組織切片，再分別以蘇木紫－伊紅染色法(Hematoxyline－eosin satin,H&E)觀察脂肪堆積、發炎、細胞壞死與纖維化的情形，及膠原纖維的特殊染色(Masson’s trichromc,MT)將網狀纖維及膠原纖維染色以評估肝臟纖維化之程度，於一般光學顯微鏡下(Opticphot－2,Nikon,Tokyo,Japan)觀察經上述病理染色後，肝損傷之各種組織病理變化。
慢性肝損傷之評估係依據Jonker等人發表文獻(Jonker,A.M.,Dijkhuis,F.W.,Boes,A.,Hardonk,M.J.and Grond J.1992.Immunohistochemical study of extracellular matrix in acute galactosamine hepatitis in rats.Hepatology.15(3)：423－31.)中所載方法進行之，將肝細胞發炎的程度、空泡化變性、肝細胞壞死及膽管增生等予以半定量分析；評估分數為0~4個等級，其中，等級0代表無病變(－,none)、等級1代表輕微(＋,slight)、等級2代表輕度(＋＋,mild)、等級3代表中等程度(＋＋＋,moderate)以及等級4代表顯著(＋＋＋＋,remarkable)。
對於肝纖維化的半定量分析，則可以依據Gabriele(Gabriele,B.1997.Silymarin retards collagen accumulation in early and advanced biliary fibrosis secondary to complete bile duct obliteration in rats.Hepatology 26：643－649.)及Wang(Wang,G.S.,Eriksson,L.C.,Xia,L.,Olsson,J.and Stal,P.1999.Dietary iron overload inhibits carbon tetrachloride－induced promotion in chemical hepatocarcinogenesis：effects on cell proliferation,apoptosis,and antioxidation.J.Hepatol.30(4)：689－98.)等人所發表的方法，將肝纖維化區分為以下0~4個等級：等級0代表無任何肝纖維化現象之正常(normal)肝組織、等級1代表有膠原的增生，但沒有形成中隔(在中央靜脈或門脈區有放射狀纖維增生)、等級2代表在中央靜脈和門脈區二者間，形成不完全的中隔(此中隔彼此沒有交會)、等級3代表形成完整的中隔，中間彼此交會並將肝實質分割成許多結節，但此中隔尚很薄以及等級4代表形成完全的中隔，且中隔變厚，亦即完全的肝硬化，其結果如第三圖至第五圖以及表三所示。
第三圖係為控制組以及經四氯化碳誘發肝損傷並給予水飛薊或牛樟芝環己烯酮化合物之各對照組與實驗組大鼠肝臟表面病理變化之觀察結果。由圖中可知，控制組之肝臟表面平滑完整(請參閱第三A圖)；經四氯化碳處理之負對照組所顯現之肝臟色澤偏黃、表面粗糙、觸感變硬且凹凸不平，並出現有腫脹情況(請參閱第三B圖)；經四氯化碳處理並餵食水飛薊之正對照組以及經四氯化碳處理並餵食不同濃度劑量牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組，其肝臟表面雖因四氯化碳影響而有腫脹及表面病變現象(請參閱第三C圖至第三F圖)，但程度都較負對照組輕微，其中又以餵食3000 mg/kg劑量牛樟芝環己烯酮化合物實驗組之肝臟表面的腫脹及病變狀況最輕微(請參閱第三F圖)，此結果表示牛樟芝環己烯酮化合物可有效改善四氯化碳所引起之肝臟表面損傷病變症狀。
1) 評估慢性肝損傷依據Jonker等(1992)之方法，將肝細胞發炎的程度、空泡化變性、肝細胞壞死及膽管增生等予以半定量分析。評估分數由0~4個等級，其中0為無明顯病變(none)、1輕微(slight)、2輕度(mild)、3中等度(moderate)及4顯著(remarkable)。2) 大鼠產生慢性肝損傷病理積分＝病變隻數總分÷鼠隻總數。3) 肝纖維化的半定量分析，則依據Gabriele等(1997)及Wang等(1999)等方法，將肝纖維化區分為0~4個等級，0為正常(normal)肝組織、沒有任何肝纖維化、1為有膠原的增生，但沒有形成中隔(在中央靜脈或門脈區有放射狀纖維增生)、2為中央靜脈和門脈區二者間，形成不完全的中隔(此中隔彼此沒有交會)、3為形成完整的中隔，中間彼此交會並將肝實質分割成許多結節，但此中隔尚很薄及4為形成完全的中隔且中隔變厚，形成完全肝硬化。4) 大鼠產生纖維化病理積分＝病變隻數總分÷鼠隻總數5) 大鼠產生病變隻數。＊ 各處理組與對照組之數據以Student’s t－test進行組間差異之比較，p －值小於0.05者即視為具顯著性差異。a 各處理組與負對照組之數據以Student’s t－test進行組間差異之比較，p －值小於0.05者即視為具顯著性差異。
請同時參閱第四圖及表三，第四圖係為以四氯化碳誘發大鼠肝損傷後，其肝臟組織損傷程度之病理變化切片結果。由第四圖中可觀察到，經四氯化碳處理後，肝臟細胞之組織切片呈現腫脹，且會引發肝細胞進行旺盛之有絲分裂，Kuffer’s細胞數量亦會增加(第四A圖與第四B圖)，且嚴重者會出現空泡化變性，纖維化之肝臟會將肝臟分割成許多結節狀，而形成肝硬化(第四C圖)。同時依據Jonker等人所發表之慢性肝損傷評估方式，經四氯化碳處理之負對照組所呈現之慢性肝損傷最為明顯，主要分布在3中等度(＋＋＋)與4顯著(＋＋＋＋)等級，病理積分可達3.2。相較於負對照組經四氯化碳處理並餵食水飛薊之正對照組，其慢性肝損傷程度則較輕微，主要分布在3中等度(＋＋＋)等級，病理積分為2.8；經四氯化碳處理並餵食不同濃度劑量牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組，皆可改善慢性肝損傷之程度，其中又以牛樟芝環己烯酮化合物劑量為300 mg/kg與1000 mg/kg之組別效果最顯著，主要分布在1輕微(＋)等級與2輕度(＋＋)等級，相較於負對照組，其病理積分則分別降低至1.8與2.0。
請同時參閱第五圖及表三，第五圖係為以四氯化碳誘發大鼠肝損傷後，其肝臟組織纖維化程度之病理變化切片結果。由第五圖中可觀察到，正常肝組織並無任何纖維化現象(請參閱第五A圖)，此時之肝臟係屬於Gabriele與Wang等人所發表之纖維化程度中之等級0；而經四氯化碳處理後，肝組織便出現不等程度之纖維化病變，其中，膠原增生但無形成中隔時之肝臟(請參閱第五B圖)係屬於纖維化程度中之等級1，當中央靜脈和門脈區二者間形成不完全中隔時之肝臟(請參閱第五C圖)係屬於纖維化程度中之等級2，若完整中隔已形成且中間彼此交會並將肝實質分割成許多結節，但此中隔尚很薄時之肝臟(請參閱第五D圖)係屬於纖維化程度中之等級3，而一旦所形成之中隔變厚，便成為肝硬化(請參閱第五E圖)，此時之肝臟則屬於纖維化程度中之等級4，且亦可由膠原纖維特殊染色(Masson’s trichromc,MT)結果中觀察到肝臟組織之膠原呈綠色，顯示肝臟已纖維化之病變狀況(請參閱第五F圖)。將各對照組與實驗組之組織切片依照前述該些組織病變程度觀察結果並經評估後，可發現肝臟纖維化程度以經四氯化碳處理之負對照組最為明顯，主要分布在等級3與等級4處，病理積分可達3.2。相較於負對照組，經四氯化碳處理並餵食水飛薊之正對照組，其肝纖維化程度則較輕微，病理積分為2.8；經四氯化碳處理並餵食不同濃度劑量牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組，皆可有效降低肝纖維化程度，其中又以劑量為300 mg/kg之牛樟芝環己烯酮化合物的組別效果最顯著，主要分布在等級1至等級2處，相較於負對照組，其病理積降低至1.8。
由上述該些結果可知，當以四氯化碳誘發大鼠肝損傷時，餵食牛樟芝環己烯酮化合物，可有效降低肝臟損傷與肝臟纖維化程度，且各濃度劑量之牛樟芝環己烯酮化合物保護肝組織之效果皆較優於投予水飛薊之正對照組，其中，又以餵食劑量為300 mg/kg之牛樟芝環己烯酮化合物的功效為最佳。
(4)肝功能指標生化數值測試丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase,ALT)以及天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase,AST)係為人體內各種臟器例如肝臟、心臟及肌肉等細胞內的重要酵素，用來參與體內重要胺基酸的合成，正常情況下，該些酵素在血清內維持穩定的低量，其中，丙胺酸轉胺酶正常值約在40 U/L以下，天門冬胺酸轉胺酶正常值約在50 U/L以下，當上述臟器的細胞發炎時，由於細胞通透性改變，或者細胞本身的破壞，導致細胞中之丙胺酸轉胺酶與天門冬胺酸轉胺酶被釋出，使得血清中該些酵素之濃度增加，因此丙胺酸轉胺酶與天門冬胺酸轉胺酶之活性高低與肝臟發炎狀況與肝細胞壞損狀況有關，可用作評估肝臟疾病的指標之一。
大鼠於第八週結束時全部犧牲，並於其腹大動脈(abdominal aorta)採血檢驗肝臟生化功能。將5毫升之血液置入血球血清分離管中並以775 xg離心15分鐘，取0.5毫升血清以血清生化測定儀(Express plus automatic clinical chemistry analyzer,Chiron diagnostics corporation,OH,USA)並利用可檢測麩氨酸丙酸轉氨酶(ALT；Bayer diagnostics,Cat No.E36941)、麩氨酸氨基轉氨酶(AST；Bayer diagnostics,Cat No.E37041)等肝臟酵素活性及膽固醇(cholesterol；Bayer diagnostics,Cat No.E33940)之商品化試劑測得該些肝損傷血清生化值，此外，各試驗組數據以平均值及標準差值(mean±SD)表示，以單因子變異數方法分析(One－way analysis of variance,ANOVA)，經由變異數分析結果得知有顯著差異時，再進一步利用LSD法進行多重比較，或以獨立t檢定(Studentt －test)統計程式，比較牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組與控制組、正對照組及負對照組間之差異，而p <0.05則具顯著性差異，其結果如表四所示。
1) 數據均以MS－Excels法求出其平均值及標準機差值(Mean±SD)。＊ 各處理組與對照組之數據以Student’s t－test進行組間差異之比較，p －值小於0.05者即視為具顯著性差異。a 各處理組與負對照組之數據以Student’s t－test進行組間差異之比較，p －值小於0.05者即視為具顯著性差異。
由表四中可觀察到，經四氯化碳處理之負對照組，其麩氨酸丙酸轉氨酶(ALT)、麩氨酸氨基轉氨酶(AST)與膽固醇之數值皆高於控制組，此顯示肝臟係因四氯化碳而受損，導致血漿中之肝損傷酵素活性上升，且膽固醇含量亦會微幅增加；相較於控制組，經四氯化碳處理並餵食水飛薊之正對照組，其麩氨酸丙酸轉氨酶(ALT)、麩氨酸氨基轉氨酶(AST)與膽固醇之數值雖偏高，但均低於負對照組，此結果顯示水飛薊具有減輕四氯化碳所致肝細胞損傷程度之效果；此外，經四氯化碳處理並餵食不同濃度劑量牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組，其麩氨酸丙酸轉氨酶(ALT)、麩氨酸氨基轉氨酶(AST)與膽固醇之數值雖較高於控制組，但均顯著(p <0.05)低於負對照組，其中尤以餵食劑量為1000 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物之組別，相對於負對照組，其數值降低最為明顯(分別為ALT：181.7±78.4 U/L以及AST：283.2±144.2 U/L)，由此可知，投予大鼠各劑量濃度(300 mg/kg、1000 mg/kg與3000 mg/kg)之牛樟芝環己烯酮化合物，可有效減輕所引起之氨酸丙酸轉氨酶(ALT)、麩氨酸氨基轉氨酶(AST)等肝酵素釋出作用。
(5)肝臟抗氧化酵素分析抗氧化酵素系統由麩胱甘肽酶(glutathione，GSH)、麩胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSHPx)、過氧化氫酵素(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等所構成，透過此一抗氧化系統，可在生物體內築起一道嚴密的防線，以於體內自由基增加時，防止器官組織之細胞受到氧化傷害，並降低其氧化壓力(oxidative stress)。本試驗係藉由檢測經四氯化碳誘發大鼠肝損傷並餵食牛樟芝環己烯酮化合物後，肝臟中抗氧化酵素含量，以評估牛樟芝環己烯酮化合物對肝臟抗氧化能力的影響。
取出前述預留於－80℃的冷凍櫃中之肝臟，將其浸漬於含有0.16 mg/ml肝素(heparin)之PBS緩衝液(phosphate buffered saline solution,pH 7.4)中，除去紅血球，以均質機打碎組織，並於每1克組織加入10毫升之緩衝液(50 mM phosphate,pH 6~7，含1 mM EDTA)，以均質機(Brinkmann Polytron homogenizer,setting 5,PT 10 probe)打碎1分鐘後，於4℃下以10,000×g離心15分鐘後，取上清液，並以BCA protein assay kit(Pierce,IL,USA)於MAX ELISA Keader(Quant,Bio－Tek Instrument,Vermont,USA)，以550 nm測其吸光值，並測定蛋白質含量(mg/ml)。接著，藉由商品化套組(Cayman Chemical,Company,MI.USA)來檢測肝臟均質液中抗氧化酵素：麩胱甘肽酶(Glutathione Assay Kit,Cat No.703002)、麩胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase Assay Kit,Cat No.703102)、過氧化氫酵素(Catalase Assay Kit,Cat No.707002)以及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase Assay Kit,Cat No.706002)，並分別以波長405 nm、340 nm、540 nm以及450 nm經ELISA Reader 測得各酵素含量。此外，利用各商業套組檢測該些酵素時，除超氧化物歧化酶(SOD)外，其他酵素皆需進行去蛋白質步驟，係於待測樣品中加入與樣品體積相等量的10%(w/v)偏磷酸(Metaphosphoric acid,MPA)，並震盪搖晃均勻，室溫靜置5分鐘後，離心(2,000 xg,2分鐘)，取上清液檢測該酵素濃度，此外，各試驗組數據以平均值及標準差值(mean±SD)表示，以單因子變異數方法分析(One－way analysis of variance,ANOVA)，經由變異數分析結果得知有顯著差異時，再進一步利用LSD法進行多重比較，或以獨立t檢定(Studentt －test)統計程式，比較牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組與控制組、正對照組及負對照組間之差異，而p <0.05則具顯著性差異，其結果如表五所示。
GSH：Glutathion activity(mM/g protein)；GSHPx：Glutathion peroxidase activity(nmol/min/ml)one unit is defined as the amount of enzyme that will cause the oxidation of 1 nmol of NADPH to NADP＋ per minute at 25℃；Catalase and SOD：U/mg protein1) 數據為平均值及標準機差值(mean±SD)，＊ 各處理組與對照組之數據以Student’st －test進行組間差異之比較，p －值小於0.05者即視為具顯著性差異。a 各處理組與負對照組之數據以Student’st －test進行組間差異之比較，p －值小於0.05者即視為具顯著性差異。
由表五中可觀察到，經四氯化碳處理之負對照組，其所測得之各類肝臟抗氧化酵素濃度與控制組比較後，並無顯著差異；而經四氯化碳處理並餵食水飛薊之正對照組，其抗氧化酵素濃度與控制組及負對照組相比較後，亦無顯著差異；相較於控制組、負對照組及正對照組，餵食劑量為300 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組，其所顯現之超氧化物歧化酶(SOD)酵素濃度顯著(p <0.05)低於其他組別，而於餵食劑量為1000 mg/kg與3000 mg/kg之實驗組中，其麩胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)以及過氧化氫酵素(CAT)之含量係略高於其他組別，其中，麩胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)與過氧化氫酵素(CAT)係可將過氧化氫(H2 O2 )分解成對細胞不具毒性的水，以減少過氧化物對組織的損傷，因此，由該些結果可知，牛樟芝環己烯酮化合物係可藉由增加肝臟中麩胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)以及過氧化氫酵素(CAT)之濃度含量，降低自由基對肝細胞造成之損傷及其承受之氧化壓力，而可提升肝臟組織之抗氧化能力。
綜上所述，本發明分離自牛樟芝之4－羥基－2,3－二甲氧基－6－甲基－5(3,7,11－三甲基－2,6,10－十二碳三烯)－2－環己烯酮化合物，係可有效減緩化學性肝損傷所致肝臟組織傷害及肝臟纖維化程度，並可降低血液中丙胺酸轉胺酶(ALT)與天門冬胺酸轉胺酶(AST)等肝功能發炎壞損指標之濃度，同時亦可增進肝臟中麩胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)以及過氧化氫酵素(CAT)之含量，以降低自由基對肝細胞造成之損傷及其承受之氧化壓力，提升肝臟組織之抗氧化能力，藉以減緩人類等哺乳動物肝臟受損程度，進而達到保護肝臟之目的。另一方面，因牛樟芝環己烯酮化合物係為天然萃取之物質，故其應用於治療肝臟損傷或保護肝臟時，並不會引起服用者不適或產生毒性、併發症等其他副作用，且其亦具抗過氧化氫(H2 O2 )等自由基之功效，因此可將其製備成保健食品與飲食品等，藉其功效以預防肝臟損傷並有益於人體健康之增進；此外，亦可將牛樟芝環己烯酮化合物製備成醫藥組成物以減緩化學物質所致之肝臟損傷，其中，該醫藥組成物除包含有效劑量之牛樟芝環己烯酮化合物外，尚可包括藥學上可接受的載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或澱粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此。本發明醫藥組成物可依一般習知藥學之製備方法生產製造，將有效成分劑量之牛樟芝環己烯酮化合物與一種以上之載體相混合，製備出所需之劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其他液體製劑，但未以此為限。藉以達到預防並治療人類等哺乳動物之肝臟損傷並保護肝臟之目的。
第一圖係本發明實施例於四氯化碳誘發肝損傷時，牛樟芝環己烯酮化合物對於大鼠體重之影響結果。圖中＊：控制組；△：負對照組(20%四氯化碳)；□：正對照組(20%四氯化碳＋水飛薊)；■：經四氯化碳處理並餵食300 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組；▲：經四氯化碳處理並餵食1000 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組；●：經四氯化碳處理並餵食3000 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組。
第二圖係本發明實施例於四氯化碳誘發肝損傷時，牛樟芝環己烯酮化合物對於大鼠攝食量之影響結果。圖中＊：控制組；△：負對照組(20%四氯化碳)；□：正對照組(20%四氯化碳＋水飛薊)；■：經四氯化碳處理並餵食300 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組；▲：經四氯化碳處理並餵食1000 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組；●：經四氯化碳處理並餵食3000 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物之實驗組。
第三圖係本發明實施例經四氯化碳誘發大鼠肝損傷並給予牛樟芝環己烯酮化合物後，以肉眼觀察大鼠肝臟表面病理變化之結果。圖(A)係為控制組(僅給予玉米油)；圖(B)係為負對照組(給予20%四氯化碳)；圖(C)係為正對照組(給予20%四氯化碳以及200 mg/kg水飛薊)；圖(D)係為低劑量牛樟芝環己烯酮化合物實驗組(給予20%四氯化碳以及300 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物)；圖(E)係為中劑量牛樟芝環己烯酮化合物實驗組(給予20%四氯化碳以及1000 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物)；圖(F)係為高劑量牛樟芝環己烯酮化合物實驗組(給予20%四氯化碳以及3000 mg/kg牛樟芝環己烯酮化合物)。
第四圖係本發明實施例大鼠經四氯化碳誘發肝損傷後，其肝臟組織損傷程度之病理變化結果。圖(A)與圖(B)係為經蘇木紫－伊紅染色法(H&E stain)染色後，腫脹之肝細胞以及肝細胞再生時之旺盛有絲分裂之觀察結果(放大倍率為200x與400x)；圖(C)係為經膠原纖維特殊染色法(MT stain)染色後肝組織出現空泡化變性，且肝纖維化將肝實質分割成許多結節狀，而造成肝硬化之觀察結果(放大倍率為100x)。
第五圖係本發明實施例大鼠經四氯化碳誘發肝損傷前後，以膠原纖維特殊染色法(MT stain)染色並觀察肝臟組織纖維化之病理變化結果。圖(A)係為正常肝組織；圖(B)係為四氯化碳處理後，肝組織出現不等程度之纖維化病變且膠原增生；圖(C)係為四氯化碳處理後，肝臟之中央靜脈和門脈區二者間形成不完全中隔；圖(D)係為四氯化碳處理後，肝組織形成完整中隔已且中間彼此交會，並將肝實質分割成許多結節，但此中隔尚很薄；圖(E)係為四氯化碳處理後，肝組織之中隔變厚，形成肝硬化；圖(F)係為四氯化碳處理後，肝纖維化並呈綠色之膠原。第五A圖至第五E圖之放大倍率為40x，第五F圖之放大倍率為100x。

Claims (10)

  1. 一種具有下列結構式之化合物在製備用於護肝之藥物的應用， 其中，X係氧(O)或硫(S)，Y係氧或硫；R1 係氫基(H)、甲基(CH3 )或(CH2 )m -CH3 ，R2 係氫基、甲基或(CH2 )m -CH3 ，R3 係氫基、甲基或(CH2 )m -CH3 ，m=1~12；n=1~12。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之應用，其中該化合物係為4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環己烯酮(4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,11-trimethyl-dodeca-2,6,1O-trienyl)-cyclohex-2-enone)。
  3. 如申請專利範圍第2項之應用，其中該化合物係由牛樟芝之乙醇萃取物中所分離製得。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之應用，其中該化合物係可預防並減緩哺乳動物肝臟之損傷及纖維化程度。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之應用，其中該化合物之使用濃度係為300 mg/kg~3000 mg/kg。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之應用，其中該哺乳動物係為人類。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之應用，其中該肝臟損傷係為化學性物質所致。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之應用，其中該化學性物質係為四氯化碳(CCl4 )。
  9. 如申請專利範圍第4項所述之應用，其中該化合物係藉由抑制丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase,ALT)以及天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase,AST)之濃度升高，而可保護肝臟。
  10. 如申請專利範圍第4項所述之應用，其中該化合物係藉由增加肝臟中麩胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx)以及過氧化氫酵素(catalase,CAT)之含量，而減緩自由基對肝臟造成之損傷。
TW096121548A 2007-06-14 2007-06-14 Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for Liver Protection TWI394573B (zh)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW096121548A TWI394573B (zh) 2007-06-14 2007-06-14 Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for Liver Protection
JP2007240271A JP2008308479A (ja) 2007-06-14 2007-09-14 肝臓の保護に用いるベニクスノキタケのシクロヘキサ−２−エノン化合物
US11/902,599 US7456225B1 (en) 2007-06-14 2007-09-24 Liver protection compounds of the cyclohexenone type from Antrodia camphorata
KR1020070098585A KR101069959B1 (ko) 2007-06-14 2007-10-01 안트로디아 캄포라타로부터 얻은 시클로헥세논 유형의 간보호 화합물
DE102007049063A DE102007049063A1 (de) 2007-06-14 2007-10-12 Leberschutzverbindungen des Cyclohexenontyps aus Antrodia camphorata
FR0758451A FR2917407B1 (fr) 2007-06-14 2007-10-22 Composes de protection du foie de type cyclohexenone provenant de l'antrodia camphorata
GB0724748.9A GB2450189B (en) 2007-06-14 2007-12-19 Liver protection compounds of the cyclohexenone type from Antrodia camphorata

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW096121548A TWI394573B (zh) 2007-06-14 2007-06-14 Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for Liver Protection

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200848066A TW200848066A (en) 2008-12-16
TWI394573B true TWI394573B (zh) 2013-05-01

Family

ID=39048353

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW096121548A TWI394573B (zh) 2007-06-14 2007-06-14 Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for Liver Protection

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7456225B1 (zh)
JP (1) JP2008308479A (zh)
KR (1) KR101069959B1 (zh)
DE (1) DE102007049063A1 (zh)
FR (1) FR2917407B1 (zh)
GB (1) GB2450189B (zh)
TW (1) TWI394573B (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI394573B (zh) * 2007-06-14 2013-05-01 國鼎生物科技股份有限公司 Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for Liver Protection
JP5203644B2 (ja) * 2007-07-13 2013-06-05 國鼎生物科技股▲ふん▼有限公司 自己免疫疾病の治療に用いるベニクスノキタケ由来の化合物
ES2574606T3 (es) 2009-11-26 2016-06-21 National Taiwan University Una sustancia activa contra el cáncer de Antrodia camphorata, método de preparación de la misma y uso de la misma
TWI409073B (zh) * 2010-11-26 2013-09-21 Univ China Medical 使用麥角甾-７，９（１１），２２Ｅ-三烯-３β-醇來治療疼痛、發炎與氧化性壓力關聯性疾病，以及保護肝臟
TWI452032B (zh) * 2011-01-21 2014-09-11 國鼎生物科技股份有限公司 治療腎病之醫藥組成物
US9675652B2 (en) 2011-07-29 2017-06-13 HXLS Charity Corp. Compositions and methods to relieve chronic diseases symptoms
US10905656B2 (en) * 2012-03-26 2021-02-02 Golden Biotechnology Corporation Methods and compositions for treating arteriosclerotic vascular diseases
CA2892084C (en) * 2012-11-21 2020-11-10 Golden Biotechnology Corporation Methods and compositions for treating neurodegenerative diseases
US20140274979A1 (en) * 2013-03-13 2014-09-18 Golden Biotechnology Corporation Method for the treatment of fatty liver disease
CN104115669B (zh) * 2013-04-27 2016-11-02 富裔实业股份有限公司 牛樟芝培养方法及牛樟芝酒萃物的制备方法
US9789153B2 (en) 2014-07-02 2017-10-17 Hsiu-Hsien Tsai Composition for preventing cancer and treating cancer and intensifying the effects of other anticancer drugs
CN104111302A (zh) * 2014-08-13 2014-10-22 中山安荞生物科技有限公司 一种牛樟芝保健食品中腺甘含量测定的方法
CN104940841B (zh) * 2015-07-16 2018-06-08 北京市平谷区中医医院 一种中药组合物及其用途
KR102399856B1 (ko) * 2016-02-17 2022-05-20 골든 바이오테크놀러지 코포레이션 간암 치료용 조성물 및 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005247724A (ja) * 2004-03-02 2005-09-15 Simpson Biotech Co Ltd ＡｎｔｒｏｄｉａＣａｍｐｈｏｒａｔａの菌糸体から得た新規な混合物及び化合物、並びにその使用
US7456225B1 (en) * 2007-06-14 2008-11-25 Golden Biotechnology Corporation Liver protection compounds of the cyclohexenone type from Antrodia camphorata

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1386545A (zh) * 2001-05-18 2002-12-25 葡萄王企业股份有限公司 樟芝保肝制剂
US6740517B2 (en) * 2001-12-14 2004-05-25 Ming-Huang Lan Incubation method for obtaining solid culture of Zang Zhi, solid culture obtained therefrom, processed products and use thereof
TW200829234A (en) * 2007-01-08 2008-07-16 Golden Biotechnology Corp Antrodia camphorata isophorone extract
TWI394575B (zh) * 2007-07-09 2013-05-01 Golden Biotechnology Corp Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for the Suppression of Hepatitis B Virus
JP5203644B2 (ja) * 2007-07-13 2013-06-05 國鼎生物科技股▲ふん▼有限公司 自己免疫疾病の治療に用いるベニクスノキタケ由来の化合物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005247724A (ja) * 2004-03-02 2005-09-15 Simpson Biotech Co Ltd ＡｎｔｒｏｄｉａＣａｍｐｈｏｒａｔａの菌糸体から得た新規な混合物及び化合物、並びにその使用
US7456225B1 (en) * 2007-06-14 2008-11-25 Golden Biotechnology Corporation Liver protection compounds of the cyclohexenone type from Antrodia camphorata

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Planta Med 2007:73:1412-1415 Accepted Sep 5,2007 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE102007049063A1 (de) 2008-12-18
TW200848066A (en) 2008-12-16
GB0724748D0 (en) 2008-01-30
US20080312335A1 (en) 2008-12-18
US7456225B1 (en) 2008-11-25
GB2450189A (en) 2008-12-17
GB2450189B (en) 2012-03-21
KR20080110444A (ko) 2008-12-18
FR2917407B1 (fr) 2011-07-22
FR2917407A1 (fr) 2008-12-19
KR101069959B1 (ko) 2011-10-04
JP2008308479A (ja) 2008-12-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI394573B (zh) Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for Liver Protection
TWI394575B (zh) Application of Cynanchum auranthone Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for the Suppression of Hepatitis B Virus
JP5014959B2 (ja) ベニクスノキタケ抽出物から分離させた新化合物
US9376369B2 (en) Anti-cholesterolemic compounds and methods of use
TWI394572B (zh) Application of Cynanchum aurantii Cyclohexenone Compounds in the Preparation of Drugs for the Treatment of Autoimmune Diseases
US20110212909A1 (en) Use of Ginsenoside Compound K in the Preparation of a Medicament for the Prevention and Treatment of Atherosclerosis
JP2008169194A (ja) ベニクスノキタケのシクロヘキサンケトン抽出物
CN101357883B (zh) 治疗自体免疫疾病的牛樟芝环己烯酮化合物及医药组成物
JP7012379B2 (ja) 視神経症を処置するためのトリテルペノイドを含む組成物およびその使用
CA2847543C (en) Annatto extract compositions, including geranyl geraniols and methods of use
Jiang et al. Mushroom-derived bioactive components with definite structures in alleviating the pathogenesis of Alzheimer’s disease
Sindhu et al. Phytosterols: Physiological functions and therapeutic applications
CN101376624B (zh) 用于护肝的牛樟芝环己烯酮化合物
EP1827136B1 (en) Formulation for oral administration having a health-promoting effect on the cardiovascular system
JP5203644B2 (ja) 自己免疫疾病の治療に用いるベニクスノキタケ由来の化合物
TWI383790B (zh) Used to inhibit the growth of oral cancer cells of the cattle Antrodylcyclohexenone compounds
CN113350453B (zh) 用于升高hdl-c的组合物
CN100475229C (zh) 预防动脉硬化的组合物
KR20040006823A (ko) 항산화 기능성 건강식품 및 그의 제조방법
CN104622861B (zh) E-10-羟基-2-癸烯酸在防治化学肝损伤的药物中的应用
EP4588470A1 (en) Pharmaceutical composition comprising curcumin and the preparation thereof
Ijeh et al. Ameliorative effects of saponins from Vernonia colorata and Vernonia amygdalina on high-fat-diet-induced dyslipidaemia in albino rats
CA2558465C (en) Fat metabolism improving agent
WO2023178840A1 (zh) 一种基于维生素k2提高老年人生命质量的药物组合物及其制备方法与应用
Sratongfaeng Effects of astaxanthin supplementation on biological parameters in Thai healthy volunteers

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees