TWI393778B - Recombinant swine fever virus E2 glycoprotein, its single source antibody and its application in diagnostic reagents and subunit vaccines (2) - Google Patents
Recombinant swine fever virus E2 glycoprotein, its single source antibody and its application in diagnostic reagents and subunit vaccines (2) Download PDFInfo
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Description
本發明乃利用桿狀病毒表現系統於昆蟲細胞製造源自豬瘟病毒之重組E2醣蛋白，並測試所製得重組E2醣蛋白於豬隻之免疫性，以評估其作為次單位疫苗之可利用性以及用於檢測受野外病毒株感染之豬隻的用途。
[發明背景]
豬瘟(hog cholera；HC)目前已被正式定名且在國際間廣泛使用classical swine fever(CSF)的疾病名稱，是一種具高度傳染性與高致死性的豬隻病毒性疾病。被感染的豬隻臨床上以發燒與全身各臟器出血為主要病徵(van Oirschot，於：Straw，B.E.等人編著，豬隻疾病，第8版，愛荷華州立大學出版，艾米斯，愛荷華，159-172，1999)，而本病之爆發往往造成養豬產業重大的經濟損失。因此國際疫病組織(OIE)及我國動物傳染病分類表分別將其列為A表(List A)與甲類的重大動物疾病。而對於豬瘟疫情的防治，許多國家是以施打豬瘟活毒減毒疫苗作為安全且有效的預防措施，或進行嚴格撲殺政策以達到清除豬瘟之目標(Edwards等人，Vet Microbiol 73:103-119，2000)。
在台灣，自日據時代就有豬瘟病例發生，且曾對本省養豬產業造成極重大之威脅，而自田間採行全面施打LPC臟器或組織培養疫苗作為豬瘟之防治措施後，本省之豬瘟疫情便逐漸獲得良好之改善。對於豬瘟之預防，早期只有活毒減毒疫苗(live-attenuated vaccines)可供使用，包括LPC豬瘟疫苗、日本天竺鼠昇揚-陰性(GPE-
)株與Thiverval株。其中GPE-
與Thiverval株分別是由ALD與Alfort以細胞連續繼代而馴化。而目前廣泛使用的活毒減毒疫苗為LPC豬瘟疫苗，其可提供豬隻非常良好的免疫保護效力。然而以活毒減毒疫苗進行免疫時，卻常因移行抗體之干擾，而不易掌控其適當之免疫時機(van Oirschot，J.T.，Vet Microbiol 73:103-119，2003)，且所誘發的抗體反應，亦無法與野外病毒感染之抗體作區分，因而增加撲滅豬瘟之困難度。因此雖然LPC疫苗具有高度安全性與保護性，仍然有許多研究學者致力於標識疫苗(marker vaccine)之開發。
豬瘟病毒的三種封套蛋白在1994年之前的舊名分別為E2(gp44/48)、E3(gp33)及E1(gp55)，之後便以其在基因體的排列順序而正式更名為Erns
(E0，gp44/48)、E1(gp33)及E2(gp55)(Rmenapf等人，J. Virol. 67:3288-3294，1993；及Stark等人，Virology 174: 286-289，1990)。在三種豬瘟病毒之醣蛋白中，E2醣蛋白是最早被發現且研究較多的主要封套蛋白(Hulst等人，J Virol 67: 5435-5442，1993；Moormann等人，Virology，177: 184-198，1990)。其重要性乃是因E2蛋白為豬瘟病毒表面最主要的成分，也是豬瘟病毒感染豬隻引發免疫反應的主要抗原(林等人，J Virol 74: 11619-11625，2000)。目前許多研究均顯示，豬隻單獨免疫E2醣蛋白後所引發之免疫反應，即可產生足夠的免疫保護效力(Hulst等人，如前述；Knig等人，J Virol 69:6479-6486，1995)。由於豬瘟病毒之E2醣蛋白，一直被認為是主要引發豬隻產生中和抗體的病毒封套蛋白，因此E2次單位疫苗則成為豬瘟標識疫苗研發的主要目標之一。
由文獻指出，E2醣蛋白為高度結構依賴性(highly conformation-dependent)之抗原，且必須形成正確之構型(conformation)才可具有良好之免疫原性(Andrew等人，Vaccine 18: 1932-1983，2000)。而昆蟲細胞具有和哺乳動物等真核細胞相類似之轉譯後修飾能力，因此可提供蛋白質一個真核表現環境(reilly等人，於：桿狀病毒表現載體，實驗室手冊，牛津大學出版，紐約，27-29，1994)。自從桿狀病毒表現系統成功的被建立之後，即廣泛應用於許多種病毒與真核細胞基因之表現，包括C型肝炎病毒(HCV)之封套蛋白(Hssy等人，Virus Res 45: 45-57，1996)、豬繁殖與呼吸道症候群病毒(PRRSV)之核殼蛋白(Denac等人，J Virol Methods 65: 169-181，1997)、豬瘟病毒之結構與非結構蛋白(Hulst等人，如前述；Knig等人，如前述；Steffens等人，Gen Virol 80: 2583-2590，1999)、人類的基質金屬蛋白酵素-9(MMP-9)(Sadatmansoori等人，Protein Express Purif 23: 447-452，2001) 與三酸甘油酯水解酵素(hTGH)(Alam等人，Protein Express Purif 24: 33-42，2002) 等，並藉由重組蛋白質之特性分析，以進一步瞭解病毒或人類蛋白質之功能，或應用於疫苗與ELISA檢測試劑之開發。本實驗即嘗試以桿狀病毒表現系統進行豬瘟病毒株之E2蛋白的選殖表現，期望發展兼具保護效益之豬瘟標識疫苗。
由於標識疫苗可配合檢測豬瘟E2或Erns
抗體之酵素結合免疫吸附法(ELISA)進行檢出野外毒感染的豬隻(Floegel-Niesmann，G.，Vet Microbiol 83: 121-136，2001；Moormann等人，Vet Microbiol 73: 209-219，2000)，因而有利於豬瘟之清除。但目前以E2次單位疫苗進行免疫之族群中，由於野外病毒感染的豬隻，其Erns
抗體生成之時機較難掌控，而使得Erns
ELISA檢測套組在檢出野外病毒感染豬隻方面，無法提供足夠的敏感性與特異性(van Oirschot，如前述)。因此與E2標識疫苗配合之檢測套組方面，仍有許多努力的空間。
豬瘟之單源抗體最早在1986年由Wensvoort等人首次發表，當時共製備出13株單源抗體(Wensvoort等人，Vet Microbiol 12: 101-108，1986)。豬瘟單源抗體成功之製備，對於豬瘟病毒的研究有著極大的貢獻。例如豬瘟病毒醣蛋白E2的結構區即是利用這13株單源抗體進行分析而確認(van Rijn等人，Vet Microbiol 33: 221-230，1992；van Rijn等人，J Gen Virol,74: 2053-2060，1993；及Wensvoort，J Gen Virol 70: 2865-2876，1989)。之後豬瘟單源抗體亦不斷由各國之研究學者陸續製備，並使用於鑑別豬瘟病毒醣蛋白E0與E2之抗原性分析(Weiland等人，J Virol 64: 3563-3569，1990；Weiland等人，J Virol 66: 3677-3682，1992)及豬瘟病毒分離株之抗原分型等(Kosmidou等人，Vet Microbiol 47: 111-118，1995；西森等人，J Vet Med Sci 58: 707-710，1996)。
在臨床應用上，豬瘟單源抗體也可進一步應用於發展抗原捕捉分析法以檢測豬瘟病毒抗原(Colijn等人，Vet Microbiol 59: 15-25，1997)；或發展複合捕捉-阻斷型酵素結合免疫吸附法(CTB ELISA)，以更具敏感性與特異性之能力偵測豬瘟之特異性抗體(Clavijo等人，Vet Microbiol 60: 155-168，1998；Wensvoort等人，J Gen Virol 70: 2865-2876，1988)，為豬瘟之診斷與監控上提供許多有用的工具。
本發明於一方面係關於利用桿狀病毒表現系統於昆蟲細胞製造源自豬瘟病毒(classical swine fever virus；CSFV)第II型野外分離株分離株之重組豬瘟病毒E2醣蛋白，而所製得之重組E2醣蛋白特徵在於其於豬隻中產生之免疫反應與野外豬瘟病毒感染產生者相似。
因此，本發明於另一方面亦關於利用根據本發明方法製得之重組E2醣蛋白製備豬瘟次單位標識疫苗。該疫苗特徵在於可供廣效保護豬隻抵抗不同分子分型的豬瘟病毒。
於一項具體態樣中，根據本發明方法所製得之重組E2醣蛋白CSFV-G1E2可由轉感染昆蟲細胞宿主分泌至培養液中，其分子量為約56kDa，且在非還原條件下可形成分子量大小為約115kDa之homodimer蛋白結構。
於另一項具體態樣中，係製備得源自第二型(2a)分離株之重組E2醣蛋白CSFV-G2E2A及CSFV-G2E2B，分子量分別為約55kDa及27kDa，且在非還原條件下亦可形成homodimer蛋白結構。
於一方面，本發明亦關於可特異辨識呈homodimer蛋白結構之E2醣蛋白的單源抗體TY125。於一項具體態樣中，該單源抗體TY125可辨識諸如LPC、S-59、TD/96/TWN、0406/CH/01/TWN、38/KS/93/TWN及94.4/IL/94/TWN等不同分子分型之豬瘟病毒株。
於是，本發明亦關於一種用於偵測樣本中是否存在豬瘟病毒之診斷試劑，其特徵在於包含單源抗體TY125。以及關於用於偵測豬隻是否受豬瘟病毒感染之診斷試劑，其特徵在於包含根據本發明之方法所製得之重組型豬瘟病毒E2醣蛋白。
[發明詳述]
豬瘟最早被認為是由Bacillus cholerasuia
(hog cholera bacillus)所引起，而於1904年由de Schweinitz與Dorset證實是由濾過性病毒所引起。豬瘟病毒(classical swine fever virus;CSFV)早期歸類為Togaviridae
病毒科中之Pestivirus
屬。而近年來由於分子生物學上的研究發現，Pestivirus
病毒屬的基因組成及病毒複製方式與Flaviviridae
病毒科類似，因此已於1991年第五屆國際病毒會議上，將Pestivirus
屬歸類於Flaviviridae
病毒科中。同屬中尚有牛病毒性下痢病毒(bovine viral diarrhea virus;BVDV)與羊之Border disease病毒(border disease virus;BDV)。這三種病毒除了在結構上與抗原性有某種程度之相似外，所引起之抗體也被認為具有不同程度的交叉反應。
病毒基因型分類法(genetic typing)可顯示不同豬瘟病毒株間的基因相關性，再經由分子流行病學分析不同毒株間之親緣性，以追溯病毒的起源、病毒的演化與傳播路徑，進而訂定適合的防治策略。選擇適當的基因體位置做為基因序列之比對，才能建立豬瘟病毒之演化親緣樹(phylogenetic trees)，進一步解釋病毒之變異與世界分佈。
而一般做為基因序列比較之區域則包含保留區(conservative regions)與變異區(variable regions)。早期之比對均以E2及NS5B這兩段基因序列，個別進行不同病毒分離株之核酸序列比對，發現兩者之比對分析結果最為相似。其中若以E2基因序列進行比對，可將豬瘟病毒分成兩型(groups)。其中第一型(group Ⅰ)被歸屬於非歐洲株，以Brescia strain為代表，包含一些歷史較悠久的分離株、美國及亞洲分離株等；而第二型(groupⅡ)則歸屬於歐洲分離株來源之系統，是以Alfort strain為代表。根據這分類系統之基礎架構，Paton等人則分別再加入以5’端非轉譯區(5’non-translated region;5’-NTR)進行比對，並與E2及NS5B之部分基因，或合併三段序列進行更進一步之分析後，則可將豬瘟病毒主要分成三型。第一型為歷史較悠久的分離株，以ALD、Alfort 187與Brescia strain等為代表，且可再分為1.1、1.2與1.3等三個亞型。第二型則為現今歐洲等國家流行之分離株，也分為2.1、2.2與2.3等三個亞型。但第三型之豬瘟病毒則只曾出現於韓國、泰國、日本與台灣等地，也可被區分為3.1、3.2、3.3與3.4等四個亞型。而近年來多數研究學者即以Paton等人之分類標準，作為研究目前豬瘟病毒之分子流行病學的主要依據。
由近年來之研究顯示，歐洲在1920至1970年間僅出現少數豬瘟病毒分離株，且都隸屬於第一型，但自1980至1990年代間起，以第二型分子分型豬瘟病毒為主之爆發病例則陸續出現於歐洲等其他國家，而自1997年後，2.1亞型甚至已在歐洲國家成為豬瘟感染病例中，病毒基因型之主流。至於台灣在90年代以前的分離株，其基因型可被定位並歸類為第三型(或稱本土型)，且應在日據時代前即已存在於台灣。然而依據1993～2001年台灣地區之豬瘟病毒分子流行病學分析結果顯示，1996年後台灣之豬瘟病毒分離株，其基因型已完全被境外侵入之2.1亞型豬瘟病毒所取代。
豬瘟病毒的三種封套蛋白在1994年之前的舊名分別為E2(gp44/48)、E3(gp33)及E1(gp55)，之後便以其在基因體的排列順序而正式更名為Erns
(E0;gp44/48)、E1(gp33)及E2(gp55)。
豬瘟病毒的蛋白質前驅物在細胞質中轉譯形成，之後醣蛋白部分則會進入內質網腔中(endoplasmic reticulum lumen)，在此同時，細胞的訊息酵素(signalase)會將位於核蛋白與E2醣蛋白C端的內源性signal sequence末端切斷，形成E0-E1-E2之蛋白質複合物；隨後再將E1醣蛋白C端的內源性signal sequence末端切斷，產生成熟的E2醣蛋白；最後蛋白酵素將E0-E1蛋白質複合物切割形成醣蛋白E0與E1。由於醣蛋白E1與E2之C端皆具有一段疏水性(hydrophobic)的氨基酸序列，被認為可形成蛋白的跨膜片段(transmembrane region;TMR)，因而使蛋白固定於病毒之封套上；而醣蛋白E0不具有TMR，因此可能是以共價鍵結合方式連接於病毒封套上。此外，醣蛋白E1之TMR尚可作為E2蛋白之signal sequence，且具有將E2蛋白轉移至內質網腔的功能。
此三種封套醣蛋白在純化之病毒顆粒或被感染的宿主細胞中，甚至以重組vaccinia virus於細胞進行表現之醣蛋白，大部分均是以雙硫鍵形成二聚體(dimer)的形式存在。其中E0與E2除了各自形成大小約100kDa的E0-E0、E2-E2同源性聚合體(homodimer)之外，E2也會與E1形成大小約75kDa的E1-E2異源性聚合體(heterodimer)。
在三種豬瘟病毒之醣蛋白中，E2是最早被發現且研究較多的主要封套蛋白。其重要性乃是因E2蛋白為豬瘟病毒表面最主要的成分，也是豬瘟病毒感染豬隻引發免疫反應的主要抗原。目前許多研究均顯示，豬隻單獨免疫E2醣蛋白後所引發之免疫反應，即可產生足夠的免疫保護效力。另外，醣蛋白E2也被認為與豬瘟病毒對宿主細胞之感染能力有關。
早期研究學者曾利用13個豬瘟單源抗體，將E2醣蛋白的抗原決定位(antigenic determinant或epitope)區分為A、B、C與D四個結構區(domain)；其中A、B與C為具有中和能力相關之結構區，而A結構區被認為在不同的豬瘟病毒株間仍具有高度保留性。而這些結構區均位於醣蛋白E2的N端，並組成兩個獨立的抗原結構單位；其中一個抗原結構單位由B、C結構區組成(unti B/C)，另一個則包含A部位之結構區。B/C結構單位是連接於訊號signal sequence之後，而A結構單位則連接於B/C的C端。在A結構單位中，尚具有一段高度疏水性的區段(hydrophobic region)，且此區段在不同的pestivirus
之間亦具有高度保留性。單獨免疫E2醣蛋白的B/C或A結構單位，即可使豬隻產生足夠的中和抗體，以抵抗致死劑量之豬瘟病毒的攻擊。
豬隻感染豬瘟病毒強毒株時，在形成急性豬瘟之臨床病徵下，豬隻在尚未產生免疫反應時即已死亡，但如有耐過豬隻，日後則會產生相當高的體液性免疫反應。一般而言，在急性豬瘟感染期，於豬隻血液中應無法偵測到中和抗體的存在，此可能與豬瘟的感染造成血液及淋巴組織中B淋巴球數量急速減少，且大部分病毒在淋巴組織發生中心增殖複製，並破壞周圍之淋巴細胞有關。至於中、弱毒力之豬瘟病毒，在病程較為長久時，則可誘發宿主產生不同程度的抗體反應。而若母豬於懷孕第85天以前，感染豬瘟病毒弱毒株，由於大部分胎豬之免疫系統尚未發展健全，易導致免疫耐受性，因此其產下之仔豬日後多數不會有抗豬瘟病毒之抗體產生。
感染pestivirus
的動物均會產生對抗結構蛋白Erns
、E2與非結構蛋白NS3的抗體。其中NS3蛋白在不同的pestiviruses
之間，具有較為相似之高度保留性，且於CSFV、BVDV與BDV之間可造成抗體的交叉反應。至於豬瘟病毒之E2醣蛋白，則為主要引發豬隻產生中和抗體的病毒封套蛋白，而Erns
與NS3所誘發之抗體對病毒之中和能力均較低。此外，由於醣蛋白Erns
與E2在pestiviruses
之間有較大的變異性，因此大部分豬瘟抗體檢測套組，則均以偵測豬瘟之Erns
與E2抗體為主。
在1950至1960年間，微生物學家利用電子顯微鏡觀察桿狀病毒，並研究其致病機序。於1960年代晚期至1970年代早期，便發展出昆蟲細胞之細胞株，使桿狀病毒可利用細胞株繼代。而美國環境保護局(the Environmental Protection Agency)於1975年首次將桿狀病毒應用於生物性殺蟲劑之使用。此後，經由許多科學家對桿狀病毒的多方面研究，進一步將桿狀病毒發展成為一種真核表現載體。
在桿狀病毒表現系統建立初期，由於重組病毒在子代病毒中所佔的比例甚低，造成篩選上極大的困難。早期，大多是以外來基因取代polh
基因，以利用其啟動子調控重組蛋白質基因的表現。且由於野外型桿狀病毒以細胞繼代時會形成核多角體，因而表現出occlusion-positive(occ+
)之表現型；但缺乏polh
基因的重組桿狀病毒則無法形成核多角體，因此於細胞培養時，可依其occlusion-negative(occ-
)之表現型作為篩選標記。Occ-
病毒的另一項附加優點則是，其無法在昆蟲幼蟲間造成自然感染，因此可排除環境安全上之顧慮。但occ-
之表現型在細胞培養時並不易觀察，因此可於轉殖載體上再加入lacZ
基因，與外來基因同時轉換進入重組病毒之基因體內，再以X-gal挑選形成藍色病毒斑之重組病毒，以增加重組病毒篩選之敏感性。
近年來，研究學者利用桿狀病毒製造不含病毒核酸之類病毒顆粒(virus-like particles;VPLs)，除應用於發展疫苗，且已被證實可誘發具保護能力之免疫反應外，也可進一步探討病毒組裝過程。此外，VPLs也具有發展作為基因傳遞系統(gene delivery system)工具之潛力。此外，桿狀病毒表現系統也被使用於真核病毒表面呈現(eukaryotic virion display)之應用上，其原理與噬菌體表面呈現(phage display)之機制相似，主要是將欲表現之蛋白質與桿狀病毒之封套蛋白gp67融合，使外來蛋白質能夠被正確的表現在桿狀病毒的表面，並藉由此種方式可探討未知蛋白質在細胞中與細胞間之功能，為研究蛋白質結構與其實際調控功能之重要方法之一。
因此，本發明乃利用桿狀病毒表現系統於昆蟲細胞製造源自豬瘟病毒之重組E2醣蛋白，並測試所製得重組E2醣蛋白於豬隻之免疫性，以評估其作為次單位疫苗之可利用性以及用於檢測受野外病毒株感染之豬隻的用途。
一般脊椎動物受到抗原刺激時，會經由免疫反應誘發B淋巴球分化為具有分泌特異性抗體能力之漿細胞(plasma cell)，由一個B淋巴球分化增殖而來的漿細胞群(clone)具有分泌一種抗體的能力，但由於一個抗原分子上通常具有許多抗原決定位，且每個決定位至少都可誘發出一種抗體，再加上動物接觸之抗原種類繁多，因此在傳統抗血清中，含有多種不同的抗體，即稱為多源抗體。而為研究與醫療之需求，需取得辨識單一抗原決定位之抗體，因而發展出單源抗體技術。
由於漿細胞之壽命很短，且無法以人工培養方法維持體外生長，而BALB/c小鼠來源之骨髓瘤細胞株(myeloma cell line)能以體外培養方式長期生長，因此Khler及Milstein(1975)首次將骨髓瘤細胞與漿細胞融合，獲得能於體外長期培養而又具有分泌功能之細胞，稱為融合瘤細胞(hybridoma cell)。融合瘤細胞經進一步篩選後，獲得具有分泌特定抗體之細胞株，其所分泌的抗體即為一種單源抗體(monoclonal antibody)。近年來也有許多研究學者利用骨髓瘤表現系統(myeloma expression system)成功的生產重組單源抗體，並使用於診斷與治療等用途。
在細胞融合過程中，並不是所有漿細胞與骨髓瘤細胞都能成功的形成融合瘤細胞，因此仍須以含有HAT之培養液抑制未融合之骨髓瘤細胞的生長。
正常細胞一般以從頭合成(de novo
synthesis)進行核酸之合成，當此路徑被某種因素(如胺基蝶呤aminopterin)阻斷時，細胞可由救急代謝路徑(salvage pathway)取用胸(T)及次黃嘌呤(H)來合成DNA以組成核酸。但使用於融合作用之骨髓瘤細胞株，如NS-1由於缺乏胸 激(TK)及次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移(HGPRT)兩種酵素，因而無法利用胸 與次黃嘌呤，而使NS-1在胺基蝶呤存在下無法生長；雖然正常細胞(如B淋巴球)可經由救急代謝路徑繼續生長，但脾臟細胞於體外培養一週後會自然死亡，因此在HAT培養液中，只有NS-1與脾臟細胞融合成功之融合瘤細胞，能以體外培養方式維持生長，且因其具有TK及HGPRT兩酵素的基因，因此在胺基蝶呤抑制從頭合成時，可以救急代謝路徑進行核酸合成。
由於融合瘤細胞可於體外長期培養，而穩定地持續生產單源抗體，且單源抗體具有較高的抗原專一性，近年來已被廣泛使用於疾病之診斷與治療。在人類醫學之臨床應用方面，單源抗體可作為診斷或治療腫瘤、心血管疾病、病毒感染及免疫失調(inflammatory disorders)上之應用。在動物醫學方面，單源抗體最常使用於傳染性病原之抗原或抗體檢測。在學術研究方面，單源抗體可應用於特異性蛋白之純化、蛋白結構與特性之研究及病原之抗原特性分析與分型。例如Paton等人(於Vet Res 26:92-109，1995)則利用76個pestiviruses
的單源抗體，將66個由反芻動物與豬隻分離的pestiviruses
鑑別出四個不同的抗原分型。
本發明亦創先製得可對抗形成homodimer結構之E2醣蛋白的單源抗體。根據病毒力價測定結果顯示，單源抗體TY125所能辨識位於E2醣蛋白上之抗原決定位，在各不同分子分型豬瘟病毒株之間應具有高度保留性。於是，本發明之單源抗體TY125極具應用於檢測豬瘟病毒存在之檢測試劑的潛力。
以下實施例係為更詳細描述本發明之目的，不應被認為係用以限制本發明的範圍。
在預定進行細胞融合試驗前一個月，先將保存在液態氮中的NS-1骨髓瘤細胞進行解凍。其步驟首先將細胞冷凍管由液態氮筒中取出，置於37℃水浴，使細胞快速溶解，並以10mL含15%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；)之RPMI-1640培養液懸浮，以800rpm離心5分鐘後去除上清液，而細胞再以10mL含15%胎牛血清之RPMI-1640培養於25cm2
細胞培養瓶中，置於37℃含5%CO2
恆溫培養箱中培養，待細胞長至8成滿後，再將細胞繼代至75cm2
細胞培養瓶，並於融合前3天開始，每天以1:1繼代，維持細胞的最佳活性，並儘量使細胞密度維持在5×105
cell/mL。
以實施例三所製備之CSFV-G1E2免疫BALB/cByj小鼠後，於第二次免疫後七天，即可偵測到小鼠血清中具有抗豬瘟病毒之特異性抗體，其可辨識感染PK-15細胞之S-59豬瘟病毒株，且於IFA染色下可呈現明顯綠色螢光之病毒斑。
取免疫完成之小鼠，以無菌方式灌洗其脾臟細胞，每隻小鼠之脾臟細胞灌洗液中約含有1～2×108
個脾臟細胞。將脾臟細胞與NS-1細胞融合後分裝於10盤96孔微量培養盤中，並以HAT-RPMI/FBS培養液，於培養箱中培養7～10天，再觀察細胞生長情形，結果幾乎於每一孔都可觀察到1～2個細胞株生長。
於融合後14天，將10盤96孔微量培養盤之細胞培養液，以酵素結合免疫吸附法進行初步篩選，同時更換1/2之培養液。總共篩選960個樣品，其中共有140個樣品呈現陽性反應，陽性率約為14.58%。接著於融合後18天，將這140個樣品，再以IFA進行篩選，結果共有8個樣品仍可呈現陽性反應，陽性率約為5.71%。遂將這8個陽性細胞株(分別編號為007、051、071、085、090、117、125與134)，依序擴大培養至24與12孔細胞培養盤，且於細胞融合後第26天，抽取細胞培養液，並再度以IFA進行豬瘟病毒斑之染色確認，結果所有樣品中，只有編號125細胞株的培養液依然呈現陽性反應。
於是將編號125之融合瘤細胞株，以極限稀釋法進行單株化。實驗中發現，將融合瘤細胞進行極限稀釋後約7～10天，即可觀察到單株細胞之生長，且所有細胞株之培養液於IFA篩選結果中，皆可觀察到明顯綠色螢光之病毒斑呈色反應。因此推測，編號125之融合瘤細胞株可能本身即為單一細胞來源之細胞株。經連續兩次單株化後，證實獲得一株融合瘤細胞，並命名為TY125細胞株。
為進一步瞭解單源抗體TY125對於不同分子分型之豬瘟病毒株的辨識能力，遂將腹水生產之單源抗體TY125進行500倍稀釋，並利用IAPICC作為偵測豬瘟病毒力價之染色，且再進一步將其測定結果與Pno.13進行IFA法之偵測結果相互比較(結果參見圖1)。本實驗中共使用下列不同分子分型之豬瘟病毒株，包括第一型的LPC與S-59，第二型的TD/96/TWN、0406/CH/01/TWN以及第三型的38/KS/93/TWN、94.4/IL/94/TWN等病毒株，進行抗體力價測定。將PK-15細胞以含5% FBS之DMEM培養於96孔微量平底培養盤，每一孔接種50μL含0.5～1×104
個細胞之懸浮液，置於37℃含5% CO2
恆溫培養箱中培養隔夜。將待測病毒液以不含血清之DMEM作連續10倍稀釋，稀釋倍數由10-1
至10-6
，再將每個稀釋倍數的病毒液接種到96孔微量平底培養盤中，每一孔加入50μL之病毒稀釋液，且每一稀釋倍數進行4重複。將96孔培養盤置於37℃含5% CO2
恆溫培養箱中培養3天後，倒去培養液，再以PBST清洗三次，置於37℃烘箱中烘乾，並進行後續染色。將各種分子分型之豬瘟病毒株，以上述方法製備兩盤抗原盤，其中一盤以稀釋100倍之豬瘟多價血清抗體Pno.13，進行間接免疫螢光染色，二次抗體則使用兔抗豬IgG FITC標示抗體(Sigma)。另一盤以腹水生產之E2單源抗體(TY125)，經500倍稀釋後進行間接鹼性磷酸酶免疫細胞化學(IAPICC)染色，比較兩種免疫染色方法所測得之病毒力價是否相符。間接鹼性磷酸酶免疫細胞化學染色法與間接免疫螢光染色相似，唯二次抗體改為山羊抗老鼠IgG鹼性磷酸酵素標示抗體，並於感作後以NBT/BCIP受質(Sigma)於室溫下進行呈色約20分鐘。結果列示於下表1。
針對第一型豬瘟病毒株之力價測定結果，均是以Pno.13測得之力價較高，約是TY125測得之病毒力價的2倍。對於第二型豬瘟病毒株之測定結果顯示，兩種抗體皆測得相同之力價。但對於第三型豬瘟病毒株之測定結果，則有較大之差異性，以TY125測得之38/KS/93/TWN病毒力價，較Pno.13測得之力價高約2倍；然而針對94.4/IL/94/TWN之病毒力價測定則呈現相反的結果，是以Pno.13所測得之力價較高，且比TY125所測得之病毒力價高10倍；由於Pno.13為實驗感染CSFV 94.4/IL/94/TWN strain所獲得之豬隻高免疫血清，因此Pno.13對此病毒株之辨識能力有較高之敏感性。而單源抗體TY125對於分子分型歸屬於第二型的TD/96/TWN與0406/CH/01/TWN豬瘟病毒株之辨識能力與感染第三型病毒所產生的多源抗體Pno.13相當。依據黃等人(黃金城、鄧明中、黃天祥、鍾明華、林士鈺。台灣畜牧獸醫學會聯合年會論文摘要。50，2001)針對1993～2001年台灣地區之豬瘟病毒流行病學分析結果顯示，目前台灣田間之分離株即是以第二型豬瘟病毒為主，因此單源抗體TY125可應用於分離病毒與篩檢時，作為豬瘟病毒檢測之用。
為進一步確認單源抗體TY125在豬瘟病毒蛋白上的辨識位置，實驗中將經由PK-15細胞增殖之豬瘟病毒CSFV PT/99/TWN與0406/CH/01/TWN病毒株，以蔗糖梯度-cushion半純化法進行純化，並將此半純化之病毒液於還原與非還原條件進行蛋白質電泳，再將其轉印至ImmobilonTM
-NC Transfer Membranes後，使用WH303與細胞培養法生產之TY125作為一次抗體，以進行西方墨點法分析。結果單源抗體WH303與TY125皆可清楚辨識豬瘟病毒PT/99/TWN與0406/CH/01/TWN strain之病毒蛋白中，分子量約為55kDa之E2醣蛋白，且亦可辨識非還原條件中，分子量分別為105kDa與54kDa之E2蛋白homodimer及monomer結構。顯示TY125為抗豬瘟病毒E2醣蛋白之特異性單源抗體(圖1)。
本實驗所使用之構築套組為pENTR DirectionalCloning Kits(InvitrogenTM
)與BaculoDirectTM
Baculovirus Expression System(InvitrogenTM
)，構築方法則依照製造廠商建議之步驟進行。
本實驗以第一型豬瘟病毒作為次單位E2基因之標準選殖株，並利用實驗室已構築完成之第一型豬瘟病毒cDNA做為模版，以Pfu
聚合酵素(recombinant)(MBI，Fermentas)進行E2基因之blunt-end聚合酵素連鎖反應(PCR)，引子選用：
CSFV-G1E2-F1與CSFV-G1E2-R1引子分別依據第一型豬瘟病毒(GenBank accession number: AF352565)序列之2351～2371bp與3440～3463bp所設計，其中2351～2440bp為轉譯E2蛋白signal sequence之基因序列。此外，利用此對引子在PCR產物的5，端創造出選殖位置及包含ATG之Kozak轉錄起始序列。PCR詳細步驟如下：取1μL已純化之cDNA做為模版，接著加入上述引子(10μM)各1μL，5μL dNTPs(2.5mM)，5μL 10倍PCR buffer，1μLPfu
聚合酵素，36μL SDDW。先以95℃加熱3分鐘，再於94℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 1分鐘的狀態下作用35個週期。反應後以2%瓊脂凝膠於100伏特電壓進行電泳分析。分析結果若與預期產物大小相符則進一步以QIAguickTM
PCR Purification Kit回收增幅之E2基因PCR產物，並保存於-20℃下備用。
以pENTR DirectionalCloning Kits進行桿狀病毒E2基因轉殖載體之構築。將先前製備且已純化之E2基因與cloning反應液混和均勻後，置於室溫(22-23℃)感作15分鐘，使E2基因接合於pENTR/D-vector上。之後再以熱休克作用將此接合反應產物轉型進入OneTOP 10 Competent細胞中，並以LB-kana平板進行培養與篩選。隔日，於培養基上可見許多具抵抗kanamycin能力之單一菌落生長。因此自培養基上隨機挑選24個菌落，以PCR進行重組轉殖載體之初步篩選；實驗中利用BacE2-F1與BacE2-R1引子增幅這24個菌株之質體中的E2基因，而將PCR產物以電泳分析後，只有20號菌株無預期之產物條帶，而5及10號菌株之產物條帶則較不明顯，其餘菌株皆可見明顯PCR產物條帶，且產物大小與預期相符，為1,120bp。
選取1及6號菌株以M13 Forward(-20)與M13 Reverse引子，進行標的基因E2全長序列之雙向定序與比對。定序結果顯示，6號菌株之E2基因序列與實驗中所使用之cDNA序列完全相同。萃取6號菌株之重組載體並溶於DDW中，再以光電比色計測得載體濃度為392.6ng/μL。因此取1μL重組載體溶液與BaculoDirectTM
Linear DNA(含300ng)混和，並加入LR於25℃感作18小時，使E2基因經由LR重組反應，轉換至桿狀病毒DNA之特定位置。初代重組病毒經極限稀釋法與點雜交反應連續純化並篩選兩次後，獲得一重組桿狀病毒株：CSFV-G1E2桿狀病毒。將此重組桿狀病毒接種至Sf9細胞，並於27℃培養72小時後分離病毒，共增殖獲得PⅠ、PⅡ與PⅢ等三代重組桿狀病毒。
取經重組桿狀病毒感染之昆蟲細胞及其培養液，以蛋白質膠體電泳(SDS-PAGE)與西方墨點法分析重組蛋白之分子量與抗原性。
將重組蛋白萃取後，於還原及非還原條件下，以蛋白質膠體電泳與西方墨點法確認萃取之蛋白產物。但於蛋白質膠體電泳之膠片上，並未明顯呈現重組蛋白之染色條帶，因此將膠片上之蛋白轉漬於ImmobilonTM
-NC Transfer Membranes後，再利用單源抗體WH303進行西方墨點法染色。則WH303可辨識由細胞與培養液中萃取之CSFV-G1E2重組蛋白，經由immage system估計其分子量大小，結果顯示，由培養液中所萃取之CSFV-G1E2重組蛋白分子量約為56kDa，而在非還原條件下，此重組蛋白則可形成分子量大小約為115kDa之homodimer蛋白結構。自細胞內萃取之CSFV-G1E2重組蛋白之分子量較大，約為59kDa，且可形成分子量大小約為117kDa之homodimer蛋白結構，此外，尚可見一分子量約為42kDa之E2蛋白產物(圖2)。由結果顯示CSFV-G1E2重組蛋白可由桿狀病毒成功表現，並仍具有其抗原性，且由細胞內及培養液中萃取之重組蛋白，於非還原條件下皆可形成homodimer之蛋白結構。此外，CSFV-G1E2重組蛋白於Sf9細胞表現後，可藉由signal sequence之作用與切割而成功的分泌至培養液中。
以DNASTAR軟體預估CSFV-G1E2重組蛋白之分子量應為43.1kDa，若再加上signal sequence則分子量增加至46.3kDa，但實際表現之重組E2蛋白，其分子量則由預測之43.1與46.3kDa增加至56與59kDa。由此結果推測，CSFV-G1E2蛋白由Sf9細胞表現時，應有經過某種程度之轉譯後修飾作用。
為進一步瞭解CSFV-G1E2重組蛋白之抗原性，實驗中以CSFV-G1E2桿狀病毒感染Sf9細胞(約0.1MOI)，並於27℃培養4天後，將細胞直接固定於培養盤上，再利用單源抗體WH303、TY125與多源抗體Pno.13分別以IFA與IAPICC法進行染色。結果顯示，單源抗體WH303、TY125與多源抗體Pno.13皆可以IFA與IAPICC法，辨識Sf9細胞質內所表現之CSFV-G1E2重組蛋白(圖3)。顯示CSFV-G1E2蛋白於Sf9細胞內表現時，即具有其抗原性。
此外，實驗中也將萃取之CSFV-G1E2重組蛋白於還原與非還原條件中進行蛋白質電泳，再以西方墨點法進行其抗原性分析。結果，由細胞內及培養液中萃取之CSFV-G1E2蛋白，在還原條件中皆可被單源抗體WH303辨識(參見圖4)。而由圖5之重組E2蛋白質與單源及多源抗體之反應性結果顯示，豬隻高免疫血清(多源抗體)Pno.13、Pno.68與PHct，卻只能微弱的辨識細胞內萃取之重組蛋白，而無法辨識培養液中的重組蛋白。單源抗體TY125與多源抗體PM10-1、E101，則無法辨識還原條件下之CSFV-G1E2重組蛋白。然而，於非還原條件中，單源抗體WH303與多源抗體PM10-1、E101、Pno.13、Pno.68與PHct皆可辨識形成homodimer與monomer蛋白結構之CSFV-G1E2重組蛋白，表示重組E2醣蛋白在天然狀態下與豬瘟病毒的免疫性相似。單源抗體TY125則顯示只能辨識形成homodimer結構之CSFV-G1E2重組蛋白。因此由以上西方墨點法結果顯示，CSFV-G1E2蛋白所形成之homodimer與monomer蛋白結構，皆可被多種不同來源之豬隻高免疫血清所辨識，包括接種不同分子分型豬瘟病毒或免疫商品化E2次單位疫苗後，所製備之豬隻高免疫血清。然而以β-mercaptoethanol將CSFV-G1E2蛋白之雙硫鍵還原後所形成之線狀蛋白形式，則不易被豬隻高免疫血清所辨識。這顯示由雙硫鍵所形成之重組E2蛋白結構對於其維持如同豬瘟病毒E2蛋白的抗原性，具有決定性之影響。
為嘗試瞭解CSFV-G1E2重組蛋白是否可誘發動物產生具中和豬瘟病毒能力之中和抗體，因此在初步確認其具有高度抗原性後，便以Sf9細胞進行大量表現，並由培養液中萃取重組蛋白，再經UltracelTM
Low Binding Regenerated Cellulose(30,000 MWCO)將體積濃縮，以作為動物免疫實驗之免疫原。以此方式製備之重組E2蛋白，在其培養液中並未添加胎牛血清。
在小鼠免疫實驗方面，係在免疫前將重組蛋白濃縮液(總蛋白質濃度約為518.92mg/mL，以immage system估計重組E2蛋白約佔總蛋白質的20.1%，換算重組E2蛋白之濃度約為104.3μg/mL)以TNM-FH稀釋至所需濃度後，再與佐劑IMS 1113以1：1體積混和，作為小鼠之免疫原。以不同劑量之重組蛋白(4、8及16μg/mouse)分別免疫小鼠兩次，且於免疫後每隔兩週採血一次，並以S-59病毒株進行其血清中和抗體力價試驗。結果發現此重組蛋白可成功的誘發小鼠產生具中和豬瘟病毒能力之抗體(圖6)，但免疫最高劑量(16μg/mouse)之小鼠，其中和抗體力價才可呈現較明顯之反應，而在免疫後56天，測得其中和抗體力價可高達32與128倍。陰性對照組則無豬瘟之中和抗體揚升反應。
在豬隻免疫實驗方面，係將萃取之CSFV-G1E2重組蛋白濃縮後，測定其總蛋白質濃度約為7517.74mg/mL，而以immage system估計重組E2蛋白約佔總蛋白質的11.4%，換算CSFV-G1E2重組蛋白之濃度約為857.02μg/mL。在免疫前將重組蛋白濃縮液以TNM-FH稀釋至所需濃度後，再與佐劑IMS 1113以1：1體積混和，以肌肉注射方式進行免疫。而免疫後豬隻並未呈現任何不良之反應。
A組中1～4號豬隻，皆是以濃縮後再經稀釋之重組E2蛋白進行基礎免疫，且免疫劑量皆為100μg/pig。而於基礎免疫後2週，無論是以血清中和抗體力價試驗或CSF-SERO ELISA皆未測得抗體揚升反應(圖7)。因此在補強免疫時，便將編號A-1與A-2的豬隻，改以未經濃縮之CSFV-G1E2蛋白(含5%胎牛血清)，於基礎免疫後三週進行第一次補強。而在補強免疫後一週，於豬隻血清中即可測得豬瘟特異性之中和抗體揚升反應，其抗體力價分別高達512與128倍，且在補強免疫後三週，其中和抗體仍呈現持續揚升之反應。而仍以濃縮之CSFV-G1E2蛋白作補強免疫的豬隻(A-3、A-4)，其抗體反應雖較A-1與A-2為低，但抗體力價仍可高達128與32倍。此一結果顯示，豬隻經補強免疫後一週起，其所產生之中和抗體力價則會呈現快速而穩定的揚升反應，且未經濃縮之CSFV-G1E2蛋白即可誘發豬隻產生良好之中和抗體反應。此外，豬隻之血清中和抗體力價於試驗期間內，呈現隨時間逐漸揚升之趨勢，而在基礎免疫後42天，1～4號豬隻之中和抗體力價分別揚升至512、256、64及256倍。結果顯示，重組E2蛋白確實可誘發豬隻產生具豬瘟病毒中和能力之抗體，且以CSF-SERO ELISA亦可於豬隻血清中測得豬瘟特異性抗體之揚升情形，且其測得之ELISA力價與中和抗體力價呈現平行之趨勢。
以類似於實施例3所述之方法，利用桿狀病毒表現系統於昆蟲細胞表現並分泌源自豬瘟病毒第II型2a分離株之重組豬瘟病毒E2醣蛋白，並進行其抗原性分析，本實驗所使用之構築套組為pENTR Directional TOPOCloning Kits(InvitrogenTM)與BaculoDirectTM Baculovirus Expression System(InvitrogenTM)，構築方法則依照製造廠商建議之步驟進行。
本實驗所使用之豬瘟病毒株，為台灣野外所分離屬於第二型2a之豬瘟病毒株96TD，利用反轉錄酵素將其RNA反轉錄為cDNA，再以此cDNA作為次單位E2基因之模版，以Taq聚合酵素進行E2基因之放大，本實驗所選用的聚合酵素連鎖反應(PCR)之引子為：
CSFV-G2E2A-F3-5’-AAG GAA AAA AGC GGC CGC CCC CTT CAC CAT GGC ATT TCT CAT CTG CTT 3’(48mer)
CSFV-G2E2A-R3-5’-TTG GCG CGC CCA CCC TTA AAT TCG GCG AAG TAG-3’(33mer)
其中CSFV-G2E2A-F3與CSFV-G2E2A-R3引子分別依據96TDE2 strain序列之2353～2373bp與3442～3465bp所設計，其中2353～2442bp為轉譯E2蛋白signal sequence之基因序列。此外，利用此對引子在PCR產物的5’端創造出含有AscI限制酵素切位及TOPOcloning site(C ACC)及包含ATG之Kozak轉錄起始序列(ACC ATG G)；而在3’端則含有NotI限制酵素切位。PCR詳細步驟如下：取1μL已純化之96TD strain cDNA做為模版，接著加入引子(10μM)各1μL，5μL dNTPs(2.5mM)，5μL 10倍PCR buffer，1μL Taq聚合酵素，36μL SDDW。先以95℃加熱2分鐘，再於94℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒的狀態下作用30個週期。反應後以2%瓊脂凝膠於100伏特電壓進行電泳分析。分析結果若與預期產物大小相符則進一步以QIAguickTM PCR Purification Kit回收增幅之E2基因PCR產物，而後將此PCR產物與pENTR/D TOPO vector，利用AscI及NotI限制酵素加以切割後，以PCR產物：質體=3：1莫耳數比之的比例混合後，加入2μL之10倍接合緩衝液(ligation buffer)與1μL之T4 DNA ligase，使反應體積為20μL，於16℃恆溫培養箱中作用16小時進行接合反應。而後以熱休克作用將此接合反應產物轉型進入One ShotTOP10 Competent細胞中，並以含有100μg/ml之LB平板進行培養與篩選。隔日隨機挑選15個菌落，以質體之抽取及PCR反應進行重組轉殖載體之篩選，最後選取編號6、8、22、23及29號菌株之質體進行PCR並以電泳分析其產物大小與預期1,120bp相符合。
選取6及8號菌株以M13 Forward(-20)與M13 Reverse引子，進行標的基因E2全長序列之雙向定序與比對。定序結果顯示，6號及8號菌株之E2基因序列與實驗中所使用之96TD strain的cDNA序列6號及8號菌株之E2基因序列與實驗中所選用之96TD strain之E2 cDNA序列則有4個核苷酸序列不同，分別位於96TDE2序列上的第2,613(t→c)、2,736(a→t)、2,763(c→t)與3,165(a→g)個核苷酸，其基因相似度為99.6%。而轉譯之氨基酸則只有在第3,165位置的核苷酸，其由原本的Lysine(Lys；K)轉變為Arginine(Agr；R)，氨基酸序列之相似度則為99.9%。
將所構築完成之含有TDE2之重組質體，以實施例三所述之方式進行LR重組反應，並利用混和，並加入LR Clonase於25℃感作18小時，使E2基因經由LR重組反應，轉換至桿狀病毒DNA之特定位置。初代重組病毒經極限稀釋法與點雜交反應連續純化並篩選兩次後，獲得一重組桿狀病毒株：CSFV-G2E2A桿狀病毒。將此重組桿狀病毒接種至Sf9細胞，並於27℃培養72小時後分離病毒，共增殖獲得PI、PII與PIII等三代重組桿狀病毒。
取經重組桿狀病毒感染之昆蟲細胞及其培養液，以蛋白質膠體電泳(SDS-PAGE)與西方墨點法分析重組蛋白之分子量與抗原性。
將重組蛋白萃取後，於還原及非還原條件下，以蛋白質膠體電泳與西方墨點法確認萃取之蛋白產物。於蛋白質膠體電泳之膠片上，並未明顯呈現重組蛋白之染色條帶，因此將膠片上之蛋白轉漬到ImmobilonTM-NC Transfer Membranes膜後，再利用單源抗體WH303進行西方墨點法染色。則WH303可辨識由細胞與培養液中萃取之CSFV-G2E2A重組蛋白，經由immage system估計其分子量大小，結果顯示，由培養液中所萃取之TDE2重組蛋白分子量約為56kDa，而在非還原條件下，此重組蛋白則可形成分子量大小約為115kDa之homodimer蛋白結構。由結果顯示CSFV-G2E2A重組蛋白可由桿狀病毒成功表現，並仍具有其抗原性，且由細胞內及培養液中萃取之重組蛋白，於非還原條件下皆可形成homodimer之蛋白結構。此外，CSFV-G2E2A重組蛋白於Sf9細胞表現後，可藉由訊號序列(signal sequence)之作用與切割而成功的分泌至培養液中。
以DNASTAR軟體預估CSFV-G2E2A重組蛋白之分子量應為43.1kDa，若再加上signal sequence則分子量增加至46.3kDa，但實際表現之重組E2蛋白，其分子量則由預測之43.1與46.3kDa增加至56與59kDa。由此結果推測，CSFV-G2E2蛋白由Sf9細胞表現時，應有經過某種程度之轉譯後修飾作用。
為進一步瞭解CSFV-G2E2A重組蛋白之抗原性，實驗中以RBV-CSFV-G2E2A桿狀病毒感染Sf9細胞(約1MOI)，並於27℃培養7天後，將細胞直接固定於培養盤上，再利用單源抗體WH303與多源抗體(包括麥寮株CSFV、PT strain CSFV、94.4混和麥寮株CSFV攻毒後高免血清)，分別以IFA與IAPICC法進行染色。結果顯示，單源抗體WH303與多源抗體皆可以IFA與IAPICC法，辨識Sf9細胞質內所表現之CSFV-G2E2A重組蛋白。顯示CSFV-G2E2A蛋白於Sf9細胞內表現時，即具有其抗原性。
此外，收集細胞培養液中之CSFV-G2E2A重組蛋白，以非還原條件中進行蛋白質電泳，再以西方墨點法進行其抗原性分析。由分別以單源抗體WH303(圖8)及TY125(圖9)，以及利用第一型(圖10)、第二型(圖11)及第三型(圖12)分子分型感染豬隻後所得豬瘟病毒多源抗體豬血清偵測之結果皆顯示，本發明CSFV-G2E2A醣蛋白亦能在非還原狀態下被該等單源及多源抗體辨認到。另外，若以還原條件進行相同實驗時可發現與實施例3所生產之重組蛋白相似，僅有單源抗體WH303可微弱辨識重組蛋白，TY125及豬多原抗體均無法辨識。
由西方墨點法之分析結果顯示，所表現之第二型(2a)豬瘟病毒E2蛋白質，其抗原性與CSFV-G1E2之重組醣蛋白相似，亦即，可被單源抗體WH303、TY125、豬隻抗第一型豬瘟病毒、豬隻抗第二型豬瘟病毒與豬隻抗第三型豬瘟病毒多價血清抗體所辨識。
綜合上述實施例之結果，本發明所製得之單源抗體TY125已證實可辨識感染PK-15細胞之三種不同分子分型的豬瘟病毒株，故極具有用於製備供偵測樣本中是否存在豬瘟病毒之診斷試劑的產業利用性。且單源抗體TY125僅能辨識E2醣蛋白之homodimer結構，而根據發明之研究顯示此homodimer蛋白結構與豬瘟病毒E2醣蛋白之活體免疫性有密切關係，因此本發明所製得之單源抗體TY125亦具有用以篩檢出具高免疫性豬瘟病毒E2醣蛋白及其片段類的潛力。
根據本發明方法利用重組桿狀病毒感染昆蟲細胞所表現之重組E2醣蛋白，在非還原條件下以西方墨點法分析，可被感染不同分子分型豬瘟病毒之豬隻高免疫血清所辨識，顯示其具有與天然豬瘟病毒E2醣蛋白極相似之抗原性，亦極具有用於製備廣效型次單位標識疫苗以及用做為供診斷出受豬瘟病毒感染豬隻之診斷試劑的產業利用性。
因此，本發明係利用自然法則之高度創作，其能達成本發明之預期目的，本發明是為一種前所未見之設計，極具實用之功效，故以上創造已符合發明專利高度創作之要件，爰依法提起發明申請，並請早日賜予專利，至感德便。
<110> 茂興生物科技有限公司
<120> 重組豬瘟病毒E2醣蛋白，其單源抗體及於診斷試劑與次單位疫苗之應用
<160> 2
<170> PatentIn Version 2.0
<210> 1
<211> 406
<212> PRT
<213> 豬瘟病毒(CSFV)第I型Brescia單離株
<400> 1
<210> 2
<211> 406
<212> PRT
<213> 豬瘟病毒(CSFV)第II型TD單離株
<400> 2
圖1列示經豬瘟病毒株感染之細胞上清液(Lanes 1與4：PT/99/TWN；Lanes 2與5：0406/CH/01/TWN)及未感染之細胞上清液(Lanes 3與6)於還原條件(A)或於非還原條件(B)下以抗-CSFV單源抗體WH303(Lanes 1、2與3)及TY125(Lanes 4,5與6)進行西方墨點法分析的結果。
圖2列示經CSFV-G1E2桿狀病毒感染之Sf9細胞的培養物上清液(A)及胞溶產物(B)於還原條件下電泳分離後以WH303進行西方墨點法分析的結果。
圖3列示藉由IAPICC(A)及IFA(B)偵測由經CSFV-G1E2桿狀病毒感染之Sf9細胞所製造的重組蛋白質CSFV-G1E2。其中係將Sf9細胞於固定後與WH303(A1及B1)、Pno.13(A2及B2)或TY125(A3及B3)進行免疫螢光染色。
圖4列示經重組桿狀病毒感染之Sf9細胞的培養物上清液(Lane 1)及胞溶產物(Lane 2)於還原條件(A)或於非還原條件(B)下電泳分離，後以WH303進行西方墨點法分析的結果。Lane 3：未經感染Sf9細胞之胞溶產物。
圖5列示重組E2蛋白質與個別單源抗體及多源抗體之反應性。其中Lane 1、4、7、10、13與16係加樣經重組桿狀病毒感染之Sf9細胞的培養物上清液；而Lane 2、5、8、11、14與17係加樣經重組桿狀病毒感染之Sf9細胞的胞溶產物於還原條件(A)或於非還原條件(B)下進行12.5% SDS-PAGE電泳分離。Lane 18：未經感染Sf9細胞之胞溶產物。
圖6列示BALB/c小鼠經疫苗接種後之中和性抗體反應。Dpv：疫苗接種後之天數。
圖7列示藉由血清中和性抗體測試(A)及CSF-SERO ELISA(B)偵測得自經重組E2蛋白質疫苗接種之豬隻血清中的抗體力價。Dpv：疫苗接種後之天數。
圖8列示以單源抗體WH303偵測非還原態之完整CSFV-G2E2A醣蛋白(Lane 1，CSFV-G2E2A，分子量約55kDa)及不同醣基化程度之CSFV-G2E2B醣蛋白(Lane 2，CSFV-G2E2B，分子量約27kDa)之西方墨點法分析的結果。
圖9列示以單源抗體TY125偵測非還原態之完整CSFV-G2E2A醣蛋白(Lane 1，CSFV-G2E2A，分子量約55kDa)及不同醣基化程度之CSFV-G2E2B醣蛋白(Lane 2，CSFV-G2E2B，分子量約27kDa)之西方墨點法分析的結果。
圖10列示以得自經第一型豬瘟病毒免疫之多價抗血清抗體偵測非還原態之完整CSFV-G2E2A醣蛋白(Lane 1，CSFV-G2E2A，分子量約55kDa)及不同醣基化程度之CSFV-G2E2B醣蛋白(Lane 2，CSFV-G2E2B，分子量約27kDa)之西方墨點法分析的結果。
圖11列示以得自經第二型豬瘟病毒感染之多價抗血清抗體偵測非還原態之完整CSFV-G2E2A醣蛋白(Lane 1，CSFV-G2E2A，分子量約55kDa)及不同醣基化程度之CSFV-G2E2B醣蛋白(Lane2，CSFV-G2E2B，分子量約27kDa)之西方墨點法分析的結果。
圖12列示以得自經第三型豬瘟病毒免疫之多價抗血清抗體偵測非還原態之完整CSFV-G2E2A醣蛋白(Lane 1，CSFV-G2E2A，分子量約55kDa)及不同醣基化程度之CSFV-G2E2B醣蛋白(Lane 2，CSFV-G2E2B，分子量約27kDa)之西方墨點法分析的結果。
Claims (4)
- 一種用於偵測豬隻是否受豬瘟病毒感染之診斷試劑，其特徵在於包含源自豬瘟病毒(CSFV)第II型TD單離株之重組型豬瘟病毒E2醣蛋白，且該豬瘟病毒E2醣蛋白具有如SEQ ID NO.2所載之胺基酸序列。
- 根據申請專利範圍第2項之診斷試劑，其中該重組型豬瘟病毒E2醣蛋白係於昆蟲細胞表現系統中製造得。
- 一種豬瘟次單位標識疫苗，其特徵在於包含源自豬瘟病毒(CSFV)第II型TD單離株之重組型豬瘟病毒E2醣蛋白及獸醫學上可接受之佐劑或賦形劑，其中該豬瘟病毒E2醣蛋白具有如SEQ ID NO.2所載之胺基酸序列。
- 根據申請專利範圍第3項之豬瘟次單位標識疫苗，其中該重組型豬瘟病毒E2醣蛋白係於昆蟲細胞表現系統中製造得，且於非還原條件下可形成homodimer蛋白結構並呈現與野外型豬瘟病毒株感染相似的豬隻免疫反應。
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Non-Patent Citations (2)
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| van Rijn PA et al., "An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on envelope glycoprotein E2 of classical swine fever virus (CSFV)", VACCINE 17 (5): 433-440, 1999/02/05 * |
| 郭自晏, "豬瘟病毒E2 醣蛋白之選殖表現及其單源抗體之製備", 國立中興大學獸 醫病理學研究所碩士論文, 2004/06 * |
Also Published As
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