TWI393562B - 左旋丁基苯酞在製備預防和治療腦梗塞的藥物中的應用 - Google Patents

Description

左旋丁基苯酞在製備預防和治療腦梗塞的藥物中的應用

本發明涉及左旋正丁基苯酞和含有左旋正丁基苯酞的組合物的在製備預防和治療腦梗塞的藥物的應用，尤其是局部腦缺血導致腦梗塞。

腦血管病已成為我國主要的病死原因之一。對急性缺血性腦卒中的治療，國內外尚缺乏較好的治療藥物。美國FDA於1996年批准第一個治療該病的溶栓藥t－PA，由於有顱內出血高的不良反應，對其療效尚有爭議。對各種類型腦保護劑的研究結果表明，很多藥物臨床療效不夠好，或有較嚴重副作用。有幾個藥物仍在臨床驗證階段。

十餘年來，我們發現消旋丁基苯酞（或丁苯酞，NBP）是一個對急性缺血性腦卒中有明顯效果的藥物。它的藥效學特點涵蓋了很多方面作用：1.能改善缺血腦能量代謝；2.明顯縮小大鼠局部腦缺血腦梗塞面積，改善神經功能缺失；3.改善局部腦缺血引起的腦水腫；4.對缺血區局部腦血流和軟腦膜微循環有明顯改善作用；5能顯著改善局部腦缺血引起的記憶障礙。而毒副作用較小。我們先後申請並獲准了兩項用途專利，分別是(1)"芹菜甲素作為製備預防和治療腦缺血引起的疾病的藥物中的應用"（1999年授權，專利號ZL93117148，2，國際專利分類號A61K31/34）；(2)"丁基苯酞在製備抗血栓形成藥物中的應用"（2002年授權，專利號ZL981 25618．X，國際專利分類號A61K31/34）。

在臨床前研究後，經II期和III期臨床試驗共觀察542例（其中用多中心、隨機、雙盲安慰劑對照192例），發現給藥組總有效率為70.7%，安慰劑組為41.0%，得到較好治療效果。於2002年9月國家藥品監督管理局批准一類新藥NBP治療急性缺血性腦卒中的新藥證書和生產批件（國藥證字H20020374；H20020375和2002H0551；2002H0552）。

我們對消旋丁基苯酞（以下簡稱d1－NBP）進行化學拆分，分別製得左旋丁基苯酞（以下簡稱1－NBP）和右旋丁基苯酞（以下簡稱d－NBP），並申請了中國專利"製備光學活性3一正丁基苯酞的方法"（申請號99109673.8，公開號CN1283621A）。而在專利"芹菜甲素作為製備預防和治療腦缺血引起的疾病的藥物"中未涉及左旋丁基苯酞的作用。

為了克服現有技術的不足，本發明提供了如通式(I)所示

的左旋正丁基苯酞（以下簡稱L－NBP）作為預防或治療腦梗塞的藥物的應用。

本發明所用的左旋正丁基苯酞是經化學合成，先得到消旋正丁基苯酞，後經化學拆分成為左旋光學異構體正丁基苯酞，通過核磁、質譜和紅外等光譜分析，特別是用Hp 5890氣相色譜儀，手性氣相色譜柱(Chiraldex G－TA)進行分析，證明本品的光學純度和化學純度為單一光學立體異構體－左旋正丁基苯酞（比旋光度>－66.49⁰ ，光學純度>98%，化學純度>98%），拆分方法參見中國專利"製備光學活性3－正丁基苯酞的方法"，申請號99109673.8，公開號CN1283621。本品的化學結構式是和食用芹菜及其籽中所含的芹菜甲素結構相同。

本發明研究發現，光學異構體1－NBP對大鼠腦缺血的治療作用比d－NBP強，並強於含有同樣1－NBP劑量的d1－NBP。

本研究用大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)2h後再灌注24h造成缺血性腦卒中模型，觀察光學活性NBP的抗腦缺血作用。小鼠暫時性局部腦缺血模型分為8組，每組10只，分別為：1)溶劑對照組，植物油1 ml/kg；2)和3)為d1－NBP40和80 mg/kg組；4)和5)為d－NBP20和40 mg/kg組；6)和7)為1－NBP20和40 mg/kg組；8)為MK801 0.1 mg/kg組。1－7組為口服給藥；8組為腹腔注射給藥。小鼠暫時性局部腦缺血模型缺血後15分鐘給予丁基苯酞溶劑對照組、陽性對照藥。用單因素方差分析法檢驗各組間存在顯著性差異表明，1－NBP組（20 mg/kg和40 mg/kg）縮小梗塞體積非常顯著，而且有劑量效應關係。其中40 mg/kg組作用最強，縮小梗塞體積達80.4%（與溶劑組比較P<0.001），治療效果接近於MK801組（梗塞體積縮小81.8%，P<0.001）。而d－NBP和d1－NBP組均無明顯作用（見圖1，2）。以上結果表明，1－NBP縮小梗塞體積的作用明顯比d－NBP強。d1－NBP(80 mg/kg)和d－NBP(40 mg/kg)的梗塞體積雖比溶劑組縮小，但均無統計學意義，而d1－NBP(80 mg/kg)中含有1－NBP(40 mg/kg)。這說明d1－NBP中d－NBP的存在可能拮抗了1－NBP的作用。

通過行為學評分，溶劑對照組大多數動物神經學評分為2分，表現為對側前肢內旋，側向擠壓對側伸肌力量減弱。少數動物出現對側轉圈症狀，評為3分。個別動物行為評分較輕，僅表現為對側前肢內旋，為1分或症狀很重，缺乏自主活動，評為4分。溶劑對照組的神經評分均值為2.6±0.3。缺血15分鐘後口服給1－NBP 20，40 mg/kg均能明顯改善其神經症狀（1.4分P<0.01和1.1分P<0.001），MK801作用最顯著（0.8分P<0.001），而d－NBP和d1－NBP各組對神經症狀無顯著改善作用。MK801治療組的動物，雖然腦缺血後的症狀明顯減輕，但動物四肢軟弱無力，爬行時呈蹣跚狀，出現共濟失調，且常向一側繞圈。對行為學評分表明，藥物對行為的改善程度與藥物縮小梗塞體積的作用呈平行相關。

總而言之，本發明從生化、分子生物學和整體動物水平進行了研究，均得到了一致結果，即1－NBP的腦保護作用比d－NBP和d1－NBP強，而且d1－NBP中d－NBP的存在拮抗了1－NBP的作用發揮，以致使d1－NBP抗腦缺血的作用下降。

以往研究表明，1－NBP抗血小板聚集和抗血栓作用強度接近阿司匹林和塞氯匹啶，除此以外1－NBP還具有腦保護和改善腦微循環作用（d－NBP無作用），而這些作用正是阿司匹林和塞氯匹啶所不具備的。因此1－NBP具有很寬的治療範圍，不僅能治療急性缺血性腦卒中，而且可用於腦卒中的二級預防，預防心肌梗塞以及治療外周血管疾病等。

本發明順應當今國際上新藥開發的要求，為加強療效，減少毒副作用，將消旋體藥物拆分成光學異構體的單體，弄清楚其各自性質，將作用強或毒副作用低的光學異構體開發成手性新藥。據此，消旋丁基苯酞中1－NBP抗腦缺血作用較強，d－NBP不僅作用弱，而且又拮抗1－NBP的抗腦缺血作用，因此有理由開發左旋丁基苯酞成為一個新的治療急性缺血性腦卒中的手性藥物。

本發明因此還涉及含有作為活性成份的本發明化合物和常規藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發明藥物組合物含有0.1－95重量%的本發明化合物。

本發明化合物的藥物組合物可根據本領域公知的方法製備。用於此目的時，如果需要，可將本發明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，製成可作為人藥或獸藥使用的適當的施用形式或劑量形式。

本發明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。

本發明化合物或含有它的藥物組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內注射和穴位注射等。

給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍乾粉針劑等。

本發明化合物可以製成普通製劑、也可以是緩釋製劑、控釋製劑、靶向製劑及各種微粒給藥系統。

為了將單位給藥劑型製成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關於載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如澱粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、矽酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、澱粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如乾燥澱粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻澱粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化矽、玉米澱粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步製成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。

例如為了將給藥單元製成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關於載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、澱粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或麵糊等；崩解劑，如瓊脂粉、乾燥澱粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。

例如為了將給藥單元製成膠囊，將有效成分本發明化合物與上述的各種載體混合，並將由此得到的混合物置於硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發明化合物製成微囊劑，混懸於水性介質中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或製成注射劑應用。

例如，將本發明化合物製成注射用製劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍乾粉針劑，這種製劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3－丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了製備等滲注射液，可以向注射用製劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規的助溶劑、緩衝劑、pH調節劑等。這些輔料是本領域常用的此外，如需要，也可以向藥物製劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其他材料。

為達到用藥目的，增強治療效果，本發明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。

本發明化合物藥物組合物的給藥劑量取決於許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應，給藥途徑、給藥次數、治療目的，因此本發明的治療劑量可以有大範圍的變化。一般來講，本發明中藥學成分的使用劑量是本領域技術人員公知的。可以根據本發明化合物組合物中最後的製劑中所含有的實際藥物數量，加以適當的調整，以達到其治療有效量的要求，完成本發明的預防或治療目的。本發明化合物的每天的合適劑量範圍優選為0.1－100 mg/kg體重，更優選為0.1－100 mg/天/人。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥這受限於給藥醫生的臨床經驗以及包括運用其他治療手段的給藥方案。

每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發明的化合物或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或對症藥物合併使用並調整劑量。

術語：d1－NBP：消旋丁基苯酞d－NBP：右旋丁基苯酞1－NBP：左旋正丁基苯酞tMCAO：暫時性局部腦缺血模型

實施例1光學活性丁基苯酞對tMCAO大鼠腦梗塞體積的影響

實驗材料和方法試劑和藥品1－,d－，d1－NBP由本所合成室提供，光學和化學純度均>99%，其旋光度依次為－66.49，＋66.88和0度。用植物油配製。MK801為Sigma產品，用生理鹽水配製。氯代三苯基四氮唑(TTC)：用蒸餾水配成4%溶液備用，由北京化工廠生產。

暫時性局部腦缺血模型(tMCAO)製備雄性Wistar大鼠，體重280－320克，每5只放置1籠中，室溫保持在23'C，自由進食和飲水。大鼠用戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg)。在手術顯微鏡下，頸正中切口暴露右側頸總動脈，仔細分離頸內、外動脈(1CA，ECA)，並結紮吻合枝。將ECA結紮並剪斷，拉直與ICA成直線，將一根直徑為0.28 mm的圓頭尼龍線（用多聚賴氨酸包被）由ECA插入ICA約20 mm，進顱至大腦中動脈起始處。缺血2小時後小心將尼龍線拔出，結紮ECA開口處，縫合切口後放回籠中，再灌注24小時。全部過程室溫保持24－25℃。整個手術中，大鼠置於37℃的加熱板上保持體溫。缺血後15分鐘給藥。

分組與給藥分為8組，每組10只，分別為：1)溶劑對照組，植物油1 ml/kg；2)和3)為d1－NBP40和80 mg/kg組；4)和5)為d－NBP20和40 mg/kg組；6)和7)為1－NBP20和40 mg/kg組；8)為MK8010.1 mg/kg組。1－7組為口服給藥；8組為腹腔注射給藥。

神經行為評分待其缺血24小時後進行行為學觀察。提鼠尾離開地面約1尺，觀察兩前肢情況；推動大鼠雙肩，觀察兩側抵抗力有無差異；將大鼠置於地面，觀察其行走情況。按以下標準進行打分：0分：兩前肢有力，對稱地伸向地面，：雙肩抵抗力一致，行走正常。

1分：手術對側肩內旋，前肢內收；雙肩抵抗力一致，行走正常。

2分：手術對側肩內旋，前肢內收；推動雙肩時，手術對側抵抗力下降；行走正常。

3分：手術對側肩內旋，前肢內收；推動雙肩時，手術對側抵抗力下降；行走繞圈。

4分：手術對側肩內旋，前肢內收；無自發活動。

分數越高，說明動物的行為障礙越嚴重。

腦梗塞體積的測定大鼠經戊巴比妥鈉麻醉(100 mg/kg)，在術後24小時快速斷頭取腦。冠狀切成6片（第一至第五片厚2 mm，第六片厚4 mm），然後迅速將腦片置5 ml含有1.5 ml 4% TTC及0.1 ml 1M K₂ HP0₄ 的溶液中，避光，37℃溫孵30分鐘，其間每隔7－8分鐘翻動一次，經TTC染色後，正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗塞組織呈白色，且界限清楚。溫孵完畢後，將每組腦片排列整齊後，數碼相機拍攝保存。每張腦片採用電腦圖像分析系統處理（SPOT3.5軟體），梗塞面積疊加計算梗塞體積。梗塞體積以所占大腦半球的百分率來表達，以消除腦水腫的影響。具體計算公式為：腦梗塞體積(%)＝（未手術側半球的體積－手術側未梗塞部分的體積）/未手術側半球的體積。

統計分析所有結果採用均數±標準誤表達。行為學評分，腦梗塞體積實驗採用單因素方差分析(One－wayAVONA)，組間差異採用pοsthoc LSD檢驗。P<O.05為有顯著性差異。

結果光學活性丁基苯酞對tMCAO大鼠腦梗塞體積的影響用單因素方差分析法檢驗各組間存在顯著性差異表明，1－NBP組（20 mg/kg和40 mg/kg）縮小梗塞體積非常顯著，而且有劑量效應關係。其中40 mg/kg組作用最強，縮小梗塞體積達80.4%（與溶劑組比較P<0.001），治療效果接近於MK801組（梗塞體積縮小81.8%，P<0.001）。而d－NBP和d1－NBP組均無明顯作用（見圖1，2）。以上結果表明，1－NBP縮小梗塞體積的作用明顯比d－NBP強。d1－NBP(80 mg/kg)和d－NBP(40/kg)的梗塞體積雖比溶劑組縮小，但均無統計學意義。說明d1－NBP中d－NBP的存在可能拮抗了1－NBP的作用。

行為學評分溶劑對照組大多數動物神經學評分為2分，表現為對側前肢內旋，側向擠壓對側伸肌力量減弱。少數動物出現對側轉圈症狀，評為3分。個別動物行為評分較輕，僅表現為對側前肢內旋，為1分或症狀很重，缺乏自主活動，評為4分。溶劑對照組的神經評分均值為2.6±0.3。缺血15分鐘後口服給1－NBP 20，40 mg/kg均能明顯改善其神經症狀（1.4分P<0.01和1.1分P<0.001），MK801作用最顯著（0.8分P<0.001），而d－NBP和d1－NBP各組對神經症狀無顯著改善作用。MK801治療組的動物，雖然腦缺血後的症狀明顯減輕，但動物四肢軟弱無力，爬行時呈蹣跚狀，出現共濟失調，且常向一側繞圈。對行為學評分表明，藥物對行為的改善程度與藥物縮小梗塞體積的作用呈平行相關（見圖3）。

討論以往我們所用的模型為永久性局部腦缺血（燒灼大腦中動脈），本研究採用暫時性局部腦缺血模型（2小時缺血＋24時再灌），後者模型組的腦梗塞體積比前者大。本研究選用d1－NBP的劑量雖與以前的相同，但在所用劑量(40 mg/kg，80 mg/kg)下，d1－NBP無縮小腦梗塞體積的作用，這一結果的差別是由於模型不同所致。

我們從生化、分子生物學和整體動物水平進行了研究，均得到了一致結果，即1－NBP的腦保護作用比d－NBP和d1－NBP強，而且d1－NBP中d－NBP的存在拮抗了1－NBP的作用發揮，以致使d1－NBP抗腦缺血的作用下降。文獻報道以及按新藥開發的要求，為加強療效，減少毒副作用，主張應將消旋體藥物拆分成光學異構體的單體，弄清楚其各自性質，將作用強或毒副作用低的光學異構體開發成手性新藥。據此，消旋丁基苯酞中1－NBP抗腦缺血作用較強，d－NBP不僅作用弱，而且又拮抗1－NBP的抗腦缺血作用，因此有理由開發左旋成為一個新的治療急性缺血性腦卒中的手性藥物。

以往研究表明，1－NBP抗血小板聚集和抗血栓作用強度接近阿司匹林和塞氯匹啶，而它又具有腦保護和改善腦微循環作用（d－NBP無作用），而這些作用正是阿司匹林和塞氯匹啶所不具備的。因此1－NBP具有很寬的治療範圍，不僅能治療急性缺血性腦卒中，而且可用於腦卒中的二級預防，預防心肌梗塞以及治療外周血管疾病等。預計有著重大的社會效益和經濟效益，因此對它開發成為治療腦卒中的藥物的前景看好。左旋丁基苯酞治療局部腦缺血的這一作用在國內外文獻中尚未見報導。

圖1.暫時性大腦中動脈阻斷後15分鐘灌服NBP對大鼠腦梗塞體積的影響的數碼相片。

圖2.暫時性大腦中動脈阻斷後15分鐘灌服NBP對大鼠腦梗塞體積的影響。資料以梗塞部分占對側（正常）半球的體積百分比表達，用均數±標準誤表示。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和溶劑組(vehicle)組比較

圖3.暫時性大腦中動脈阻斷後15分鐘灌服NBP對大鼠行為學評分的影響。資料用均數±標準誤表示。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和溶劑組(vehicle)組比較。

Claims (5)

1. 一種如通式(I)所示左旋正丁基苯酞於製備治療急性缺血性腦損傷的藥物的用途
2. 根據請求項1的用途，其特徵在於所述的腦損傷是局部腦缺血導致的。
3. 根據請求項1的用途，其特徵在於該化合物的有效治療劑量為：0.1~100 mg/kg/天。
4. 一種用於治療急性缺血性腦損傷之醫藥組合物，其特徵在於含有治療有效劑量的如通式(I)所示左旋正丁基苯酞及藥用載體
5. 根據請求項4的醫藥組合物，其特徵在於所述的醫藥組合物包括片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋製劑、控釋製劑及各種微粒給藥系統。