TWI391491B

TWI391491B - 醣類結合模組及其應用

Info

Publication number: TWI391491B
Application number: TW098124661A
Authority: TW
Inventors: 張大慈; 李遠川; 黃榮淵; 林淑娟; 周維宜; 劉錫輝
Original assignee: 國立清華大學
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2009-07-22
Publication date: 2013-04-01
Also published as: EP2430045B1; TW201040280A; WO2010131114A3; US20100291540A1; US8293465B2; CN103097411B; JP2012529426A; CN103097411A; US20100291601A1; EP2430045A4; WO2010131114A2; JP5746149B2; EP2430045A2

Description

醣類結合模組及其應用

本發明係關於醣類結合模組及其應用。特別是醣類結合模組可結合HIV之醣蛋白，為新穎的抗體模擬物。

已知人類免疫缺乏病毒(HIV)係引起後天免疫缺乏症候群(AIDS)的主因。由於HIV具快速遺傳變異性致持續產生突變株病毒，因此偵測及治療不同品系之HIV感染相當困難且深具挑戰性。

一般最常偵測待測樣品中之抗HIV之抗體以診斷HIV感染。目前已開發多項HIV感染的實驗室診斷方法提供大量篩檢，以延長HIV病人之壽命並提昇其生活品質，其中已開發國家最常使用酵素免疫分析法(EIA)。此法包含一層塗鍍的病毒抗原，其可能由病毒溶解物、反轉錄濾過性病毒蛋白質、和天然或合成之多肽類組成，此病毒抗原會和可能含有HIV抗體之血液或血清反應。雖然酵素免疫分析法具有空窗期的問題(產生抗HIV抗體所需之時間限制)，由於其絕佳的靈敏度、專一性及相對較低的花費，此法仍是HIV診斷中最受歡迎的方法。

然而，在酵素免疫分析法中，使用分離的病毒蛋白作為抗原仍有一些缺點，例如：培養及處理大量感染性活病毒；活病毒併入測試原料之可能性；產生的病毒溶解物之多變性質；以及大量可能的偽陰性及偽陽性結果，需要額外的確認試驗。使用合成的多肽類可運用免疫學及生物資訊的原理設計模擬HIV之抗原決定位(epitope)，避免上述提到之缺點。然而由於抗原決定位之序列可能隨病毒突變而降低抗原性甚或不表現，將導致HIV感染血清的偵測失敗。

因此偵測HIV感染仍亟需開發可靠、兼具靈敏度及專一性的方法，且其花費較經濟並可大範圍實施。

發展一個有效的預防性疫苗和其他治療性策略以抑制HIV傳染為迫切的臨床需求。目前大部分成功的疫苗係使用減毒或去活性之病毒顆粒，然而HIV相關之後天免疫不全病毒的減毒作用仍無法只具保護性反應卻不造成致病性，因而引起諸多安全顧慮使得人體臨床試驗難以進行。另外，HIV已演化出許多複雜的機制有效地逃避套膜醣蛋白調控之抗體反應，包括利用多醣類外層防禦以遮蔽其保留且穩定的結構，以及利用立體結構的限制以掩飾其受器結合位置。因此，近期研究趨勢為以套膜醣蛋白為基礎的免疫原誘發抗體。然而使用得自醣蛋白120之高抗原性V3套環的單體醣蛋白120或胜肽，卻只能產生專一性的抗體，而非可廣泛使用的抗體。

因此發展一個有效的偵測法和預防性疫苗以對抗HIV並抑制現今流行病，仍舊是一個未實現的目標。

本發明提供一醣類結合模組之抗體模擬物，其可特異性結合HIV醣蛋白的一個抗原決定位。

本發明中提及之「醣類結合模組」係指具有醣結合活性之醣類活性酵素中，一個連續的胺基酸序列。在醣類水解酵素的初級結構分析中，醣類結合模組分為53個家族，其中包括7個類別例如纖維素、樹膠質、甲殼素以及澱粉結合。

本發明中提及之「抗體模擬物」係指具有類似抗體結合標的結構之功能的物體，但其結構較抗體簡單。製造大量抗體需要以下步驟：(a)將單一抗體生產細胞與培養中之腫瘤細胞融合，生成一個融合瘤細胞，(b)每個融合瘤細胞生產大量之相同的抗體分子，(c)在細胞培養中增殖融合瘤細胞以產生一個細胞群，其中每個融合瘤細胞都可生產相同的抗體分子。製造抗體需耗費可觀的人力與費用。然而在本發明中，大範圍的宿主包括細菌、酵母菌、昆蟲及哺乳動物細胞皆可用來製造醣類結合模組之抗體模擬物，製程簡便且較為經濟。

本發明中醣類結合模組之較佳實施例係澱粉結合區域。本發明中提及之「澱粉結合區域」係指一可結合顆粒澱粉或可溶澱粉之功能性區域，其可增加酵素活性部位之受質局部濃度，並且可能瓦解澱粉表面結構以增進澱粉分解率。目前共有9個結合澱粉之醣類結合模組家族：醣類結合模組家族第20、21、25、26、34、41、45、48和53族。本發明之較佳實施例中，澱粉結合區域係醣類結合模組家族第20和21族，分別選自黑麴菌(Aspergillus niger )之葡糖澱粉酶(An SBD)和米根黴(Rhizopus oryzae )之葡糖澱粉酶(Ro SBD)。雖然醣類結合模組家族第20和21族之胺基酸序列相似度頗低(約13.5%)，二者卻具有非常相似之二級與三級結構，並在顆粒澱粉水解作用中扮演促進酵素活性之相似角色(Tung JY et al.,Biochem.(2008)416:27-36)。

本發明之抗體模擬物，其中米根黴葡糖澱粉酶之醣晶片分析顯示其具有能力結合一多醣Manα(1,2)Manα(1,2)Manα(1,3)Manα，此特殊多醣存在於HIV1醣蛋白120之高度醣化的抗原決定位。

人類單株抗體2G12在1996年首先分離出並進行特性分析，已證實其可中和HIV1分支A及B(Trkola A,et al.,J. Virol.(1996)70:1100-1108)。不同於大多數抗體辨識病毒組成之蛋白質骨架，丙胺酸定點突變掃描顯示2G12抗原決定位主要位於醣蛋白120上之高甘露醣類或複雜甘露醣殘基之天門冬胺酸295、天門冬胺酸332、天門冬胺酸339、天門冬胺酸386、天門冬胺酸392、天門冬胺酸448(Sanders RW,et al.,J. Virol.(2002)76:7293-7305 and Scanlan CN,et al.,J. Virol.(2002)76:7306-7321)。2G12的晶體結構(PBD ID:1ZLS)以及其與寡糖之複合物Man₉ GlcNAc₂ (PBD ID:1OP5)顯示兩個抗原結合片段形成一個重鏈變異區交換二聚物(Chalarese DA et al.,Science(2003)300:2065-2071)。本發明中，米根黴葡糖澱粉酶及黑麴菌葡糖澱粉酶也能夠辨識HIV之多醣部份。如圖2A及2B所示，2G12人類單株抗體重鏈變異區之晶體結構(PBD ID:1ZLS)模型及米根黴葡糖澱粉酶結晶與醣基配體(PBD ID:2V8M)之二級結構均由貝它褶板組成，二者之結構及其類似且根均方差(RMSD)甚低。更進一步根據CATH(蛋白質結構分類資料庫(http://www.cathdb.info/ )顯示，2G12人類單株抗體(PBD ID:1ZLS)與黑麴菌葡糖澱粉酶之顆粒蛋白結合區域屬於相同之同源超家族(ID# 2.60.40.10)，由類免疫球蛋白之蛋白質結構組成。米根黴葡糖澱粉酶、黑麴菌葡糖澱粉酶及2G12之結構相似性，或許顯示其中之功能相似性。

本發明也提供一偵測HIV醣蛋白之方法，其包含：(a)採用一固體表面，其上結合能與HIV醣蛋白結合的定量之醣類結合模組；(b)將樣本與上述表面接觸，以培養形成醣類結合模組-HIV醣蛋白複合體；以及(c)培養此複合體，加入標誌HIV抗原以產生可量化測量之訊號，以判讀樣本為HIV感染陽性或陰性。在一較佳實施例中，醣類結合模組包含但不限於澱粉結合區域。本發明之方法，其中步驟c所述之抗原，標記一個酵素，該酵素在接觸一個酵素基質時能夠產生上述可量化測量之訊號。其中之酵素包含但不限於辣根過氧化氫酶、鹼性磷酸酶、葡糖澱粉酶、尿素酶以及氯黴素乙醯轉換酶。在一較佳實施例中，該酵素為辣根過氧化氫酶。對於所屬技術領域中具有通常知識者而言，適當之實施例以及使用必要基質進行偵測之手段是眾所皆知的，另外，在一較佳實施例中，該基質包括但不限於3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)。

所屬技術領域中具有通常知識者能夠理解上述大綱，及一個酵素免疫分析法之步驟的描述。他們也能夠理解一般大綱中省略的特定步驟，例如序列稀釋和使用適當之緩衝液清洗等，均為酵素免疫分析法之標準步驟。雖然以下將描述緩衝液及其他試劑，並使用特殊之稀釋說明本發明，然而所屬技術領域中具有通常知識者能夠理解，這些都只是例證性的描述，其他相等物在此大綱中皆有可能。

在本發明中，抗體模擬物之主要標的物為HIV之醣蛋白外膜、及穿膜醣蛋白120。這些醣蛋白質為高度醣化的前驅蛋白質醣蛋白160合成後經高基氏體傳輸時產生醣基化而得。當外套膜醣蛋白120結合宿主細胞的主要受器，即嵌入可能的標的細胞之細胞膜表面抗原分化簇4受體(CD4)，開啟一個新的感染週期。在本發明中，醣類結合模組之抗體模擬物不僅可以結合HIV套膜醣蛋白之多醣結構，成為可偵測和阻斷HIV和標的細胞交互作用之可能的治療劑，此抗體模擬物也可作為一個預防性疫苗，以對抗HIV套膜醣蛋白之保留且穩定的抗原決定位，並抑制新的HIV感染。

於上所述，醣類結合模組可作用為抗體模擬物，可應用於偵測HIV，且可應用於HIV的預防或治療。

下述的實施例僅作為本發明代表性的不同面向及特徵，而非用於限制本發明。

實施例一利用直鏈澱粉親和層析純化米根黴葡糖澱粉酶及黑麴菌葡糖澱粉酶

分別利用大腸桿菌系統表現載體pET23a及pET15Bb製造米根黴葡糖澱粉酶及黑麴菌葡糖澱粉酶。以結合緩衝液(50mM醋酸鈉，酸鹼值5.5)回溶含有重組蛋白質之大腸桿菌菌體，並進行均質處理(EmulsiFlex-C5，均質機)。在4℃、重力16,000g 之重力加速度離心20分鐘以除去細胞碎片，利用直鏈澱粉樹脂(新英格蘭生物實驗室公司，Ipswich,MA)以親和層析純化上清液。利用5倍管柱體積之結合緩衝液清洗樹脂後，以1毫升/分鐘之流速將上清液注入管柱。再以5倍管柱體積之結合緩衝液清洗樹脂，之後利用洗提緩衝液(10mM甘氨酸/氫氧化鈉，酸鹼值11.0)將重組蛋白質洗提出來。在進行30kDa分離後，以AmiconUltra-15蛋白質濃縮過濾器(Millipore)PL-10進行分離(10kDa分離)，以醋酸鈉緩衝液(50mM，酸鹼值5.5)洗提純化之米根黴葡糖澱粉酶/黑麴菌葡糖澱粉酶。

實施例二　米根黴葡糖澱粉酶之醣晶片分析

同先前所述，利用大腸桿菌系統表現載體pET23a製造米根黴葡糖澱粉酶重組蛋白，再以直鏈澱粉樹脂進行純化。由功能性醣質體學協會，核心H設施進行醣晶片分析。此晶片包含總共377種不同之自然及合成多醣，並使用版本3.1來進行分析。簡而言之，以醋酸鈉結合緩衝液(50mM醋酸鈉，酸鹼值5.5，1%牛血清蛋白，0.05%聚山梨醇酯20)將米根黴葡糖澱粉酶重組蛋白稀釋至200毫克/毫升。將70微升之稀釋液鋪在晶片表面，蓋上玻片，在室溫避光的情況下於溼潤器中培養一小時。培養過後，移除蓋玻片，並以TSM緩衝液(50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，酸鹼值7.5，50mM氯化鎂以及0.5M蔗糖)清洗4次。以1:200之倍數以磷酸鹽緩衝液結合緩衝液稀釋70微升的抗米根黴葡糖澱粉酶之單株抗體，並將稀釋液鋪在晶片表面，在溼潤器中培養一小時。清洗方法如先前所述。為偵測結合程度，使用以磷酸鹽緩衝液結合緩衝液稀釋至5毫克/毫升之Alexa₄₈₈ -標記山羊抗小鼠免疫球蛋白G進行二級抗體培養，將晶片置於溼潤器中一小時，再以先前所述之方法輕洗。利用Perkin-Elmer微陣列XL4000掃描器讀取結合影像，並使用Imagene(V.6)影像分析軟體進行分析。

圖一A顯示米根黴葡糖澱粉酶之醣晶片分析結果。在377種多醣中，只有Manα(1,2)Manα(1,2)Manα(1,3)Manα(No. 187)產生明顯的交互作用訊號峰。圖一B顯示具有最強信號之特殊的Manα(1,2)Manα(1,2)Manα(1,3)Manα之分子結構。根據由功能性醣質體學協會核心H設施提供之分析數據，大部分具有Manα(1,2)Manα(1,2)Manα(1,3)Manα結構之人類(Homo Sapiens )相關蛋白質屬於人類C型凝集素家族，例如朗格素(Langerin)(PDB ID:3BC7)、甘露糖結合蛋白/凝集素(PDB ID:1HUP)以及肺泡表面蛋白質(surfactant proteins)D(PDB ID:1PWB)。另外，一個特殊的HIV1中和抗體2G12也被發現具有辨認HIV1醣蛋白120之Manα(1,2)Manα(1,2)Manα(1,3)Manα結構的特徵(Wang JS,et al.,Org. Biomol. Chem. (2007)5:1529-1540 and Pashov A,et al.,Glycobiology(2005)15:994-1001)。因此，本發明利用三明治酵素免疫分析法，測試米根黴葡糖澱粉酶結合在HIV抗原&抗體陽性組中之HIV自然抗原之能力。

實施例三　2G12重鏈變異區與米根黴葡糖澱粉酶之結構模擬及序列排比

圖二A顯示2G12人類單株抗體重鏈變異區(PDB ID:1ZLS，左)及米根黴葡糖澱粉酶(PBD ID:2V8M，右)之結構模擬結果。重鏈變異區位於2G12之重鏈，並與N鍵結醣基結合。2G12及米根黴葡糖澱粉酶結構之重疊(圖二B)，顯示兩蛋白質之二級結構貝它褶板相似，並且大多數醣基配體結合殘基位於相似之方向(結構對照之均方根位移值為2.43)。米根黴葡糖澱粉酶也同樣被證實與一般抗體具有結構相似性。儘管米根黴葡糖澱粉酶和2G12之胺基酸序列只擁有8.9%之相似度，但結構排比(如圖三所示，SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示)卻顯示其關鍵二級結構組件(以框線表示)和配體結合殘基(以雙底線表示)擁有高度關聯性。

實施例四　HIV-米根黴葡糖澱粉酶結合分析

製備塗鍍米根黴葡糖澱粉酶/黑麴菌葡糖澱粉酶之培養皿以進行酵素免疫分析法

首先在96孔培養皿(Greiner-Bio One GmbH,Frickenhausen，德國)之個別孔中，加入100微升碳酸氫鈉緩衝液(酸鹼值9.5)/三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(酸鹼值8.0)之米根黴葡糖澱粉酶/黑麴菌葡糖澱粉酶，並於4℃培養16小時，使之鍍於各孔盤內。以磷酸鹽緩衝液(10mM磷酸鹽緩衝液(酸鹼值7.0)加上0.05%聚山梨醇酯20)清洗培養皿，在每個孔中加入200微升之阻隔緩衝液(0.01M磷酸鹽緩衝液(酸鹼值7.0)加上5%牛血清蛋白)，並於37℃培養2小時。移除阻隔緩衝液，並在25℃乾燥培養皿1小時。每個孔分別加入100微升之HIV抗原＆抗體陽性組(編號9144532，SeraCare生命科學，Milford，MA)或抗HCV混合濃度表現組(編號PHV205-24，SeraCare生命科學，Milford，MA)，並於37℃反應1小時。HIV抗原＆抗體陽性組經由Perkin Elmer之酵素免疫偵測試劑確認為HIV抗原陽性，並經由Abbott之酵素免疫偵測試劑確認為抗HIV抗體陽性。接下來，加入辣根過氧化氫酶結合大腸桿菌重組蛋白之HIV1醣蛋白120抗原(0.05微克/毫升)，於37℃反應30分鐘。此結合物可直接辨識HIV抗原＆抗體陽性組中之人類抗HIV抗體。為測試葡糖澱粉酶結合HIV之專一性，以相似方式分析HCV試驗檢體及辣根過氧化氫酶結合HCV之重組抗原(核心蛋白+非結構性蛋白3+非結構性蛋白5)(0.33微克/毫升)。最後，加入100微升之3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)至培養皿中，並於37℃培養30分鐘。在每個孔加入100微升之2N硫酸以終止反應，並利用酵素免疫分析儀在450nm測量吸光值。將這些吸光質轉換為一個統計值(閥值，cut off value，COV)，並以截止指數(cut off index，COI)表示。閥值的計算係將負控制(正常人類血清)之吸光值加0.1(閥值=負控制＋0.1)；截止指數的計算則是將待測檢體之吸光值除以閥值。若一個檢體的吸光質高於閥值，舉例而言，其截止指數大於1，則此檢驗結果即視為陽性。

圖四A顯示，米根黴葡糖澱粉酶結合之最大截止指數為2.298(HIV)。另外，圖四B使用抗HCV混合濃度表現組以顯示米根黴葡糖澱粉酶之專一性。其差異具有統計顯著性(P＜0.0001)。這些結果指出米根黴葡糖澱粉酶對HIV抗原＆抗體陽性組具有專一性結合，可能是與HIV之抗原醣蛋白120反應。

再者，利用HIV1發生率/流行率表現組PRB601(SeraCare生命科學，Milford，MA)為待測檢體，比較其在塗鍍米根黴葡糖澱粉酶之酵素免疫分析法和Coulter HIV-1 p24抗原試驗中之表現，或比較其在黑麴菌葡糖澱粉酶之酵素免疫分析和Coulter HIV-1 p24抗原試驗中之表現。相關檢體係取自美國HIV陽性捐血者之未稀釋單位血漿，但捐血者之感染及血清轉換日期未知。這些檢體都經過Calypte抗HIV1西方墨點法檢測，結果顯示15個檢體皆為抗HIV1 p24和抗醣蛋白160抗體陽性。圖五A和圖五B顯示，傳統HIV1 p24抗原試驗之偵測率僅有20.0%，相較之下，塗鍍米根黴葡糖澱粉酶之酵素免疫分析法(93.3%)及塗鍍黑麴菌葡糖澱粉酶之酵素免疫分析法(86.7%)之偵測率高出許多。

實施例五　醣蛋白對米根黴葡糖澱粉酶/黑麴菌葡糖澱粉酶結合HIV之影響

將10mM麥芽七糖(G7 glycan)和環糊精(β-CD)(Sigma-Aldrich，聖路易，MO)溶解在含有5%牛血清蛋白之磷酸鹽緩衝液，並將其與同樣體積之HIV抗原＆抗體陽性組混合，於37℃反應1小時。將混合液加入塗鍍米根黴葡糖澱粉酶之培養皿(在0.05M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸中為100nM，酸鹼值8.0)或加入塗鍍黑麴菌葡糖澱粉酶之之培養皿(在0.05M碳酸氫鈉緩衝液中為100nM，酸鹼值9.5)後，經37℃反應1小時，加入辣根過氧化氫酶結合大腸桿菌重組蛋白之HIV1醣蛋白120抗原(0.05微克/毫升)100微升以進行偵測。

圖六A顯示HIV抗原＆抗體陽性組之截止指數在麥芽七糖和環糊精存在的情況會減少。將10mM麥芽七糖或環糊精加入塗鍍米根黴葡糖澱粉酶之培養皿，會出現競爭現象，強烈指出麥芽七糖和環糊精為米根黴葡糖澱粉酶和HIV抗原＆抗體陽性組的結合作用之競爭者，其中10mM麥芽七糖和環糊精之競爭抑制率分別為24.4%和23.1%。

相同地，競爭現象發生在將10mM麥芽七糖或環糊精加入塗鍍黑麴菌葡糖澱粉酶之培養皿(圖六B)，顯示麥芽七糖和環糊精在黑麴菌葡糖澱粉酶和HIV抗原＆抗體陽性組的結合作用亦為競爭者。10mM麥芽七糖對黑麴菌葡糖澱粉酶之競爭抑制率為45.9%，較其對米根黴葡糖澱粉酶之競爭抑制率為高。然而10mM環糊精對黑麴菌葡糖澱粉酶之競爭抑制率(14.3%)，則較其對米根黴葡糖澱粉酶之競爭抑制率為低。

實施例六　2G12和醣蛋白140對HIV-米根黴葡糖澱粉酶和HIV-黑麴菌葡糖澱粉酶結合之競爭作用

將HIV抗原＆抗體陽性組分別混合與相同體積之500nM人類免疫球蛋白G₁ 二級抗體、500nM 2G12單株抗體或250nM HIV1醣蛋白140抗原，於37℃作用1小時。將混合液加入塗鍍米根黴葡糖澱粉酶之培養皿(在0.05M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸中為100nM，酸鹼值8.0)或加入塗鍍黑麴菌葡糖澱粉酶之之培養皿(在0.05M碳酸氫鈉緩衝液中為100nM，酸鹼值9.5)後，經37℃反應1小時，加入100微升之辣根過氧化氫酶結合大腸桿菌重組蛋白之HIV1醣蛋白120抗原(0.05微克/毫升)以進行偵測。

圖七A和圖七B顯示HIV抗原＆抗體陽性組之截止指數在2G12單株抗體存在的情況會減少現象。將500nM 2G12單株抗體精加入塗鍍米根黴葡糖澱粉酶之培養皿(圖七A)和塗鍍黑麴菌葡糖澱粉酶之培養皿(圖七B)，會出現競爭現象。這些結果指出，相較於人類免疫球蛋白G₁ ，2G12出現專一性的競爭現象。其中500nM 2G12對米根黴葡糖澱粉酶之競爭抑制率為28.9%，對黑麴菌葡糖澱粉酶之競爭抑制率則為28.4%。相反地，500nM人類免疫球蛋白G₁ 並不造成任何競爭現象。另外，250nM HIV1醣蛋白140的存在之競爭作用更為明顯，其抑制率分別為對米根黴葡糖澱粉酶為42.9%和對黑麴菌葡糖澱粉酶為40.1%。這些結果強烈顯示澱粉結合區域和HIV醣蛋白120之間的專一性相互作用。

實施例七　HIV1分離株之2G12抗原決定位之胺基酸序列排比

圖八A和圖八B顯示21個HIV1分離株(SEQ ID NO:4 to SEQ ID NO:23)之2G12人類單株抗體抗原決定位之多重胺基酸序列排比(SEQ ID NO:3)。2G12抗原決定位主要包含在HIV1 IIIB醣蛋白120和JR-FL分離株上之多量甘露醣或兩種混合醣殘基天門冬胺酸295，天門冬胺酸332，天門冬胺酸339，天門冬胺酸386，天門冬胺酸392及天門冬胺酸448(Sanders RW,et al.,J. Virol.(2002)76:7293-7305 and Scanlan CN,et al.,J. Virol.(2002)76:7306-7321)。這些天門冬胺酸殘基在21個HIV1分離株之醣蛋白120序列中，皆明顯地高度保留。圖七A和圖七B中之6個N連結醣基化位置，位於底線標示之天門冬胺酸1，天門冬胺酸38，天門冬胺酸92，天門冬胺酸98，天門冬胺酸103及天門冬胺酸154，符合2G12辨識位。另外，天門冬胺酸38和天門冬胺酸98被HIV模組辨認為高度甘露醣辨識位(Calarese DA,et al.,Science(2003)300:2065-2071)。這些結果指出，雖然HIV具有快速遺傳漂變之特性，隨時間推移，其N連結醣基化位置卻是穩定不變，使得連接這些位置之特殊醣類成為極具潛力的專一性辨識標的。醣類結合模組調控之醣類辨識區域可作為一個抗體模擬物以偵測HIV，並針對廣泛變異的HIV品系感染，發展預防及治療試劑。

圖一A及圖一B係醣晶片分析決定米根黴(Rhizopus oryzae )葡糖澱粉酶(Ro SBD)之多醣辨識。

圖二A係2G12人類單株抗體重鏈變異區(PDB ID:1ZLS，左)及米根黴葡糖澱粉酶(PBD ID:2V8M，右)之模擬結果。圖二B係2G12及米根黴葡糖澱粉酶結構之重疊。

圖三係2G12人類單株抗體(PBD ID:1ZLS)重鏈變異區和米根黴葡糖澱粉酶(Ro SBD)(PBD ID:2V8M)之胺基酸序列排比，僅有8.9%的相似度。

圖四A、圖四B及圖四C係利用HIV抗原＆抗體編號9144532陽性組和米根黴葡糖澱粉酶的結合。

圖五A係利用HIV1發生率/流行率表現組PRB601和米根黴葡糖澱粉酶的結合；圖五B係利用HIV1發生率/流行率表現組PRB601和黑麴菌(Aspergillus niger )之葡糖澱粉酶(An SBD)的結合。

圖六A係米根黴葡糖澱粉酶與麥芽七糖(G7)和環糊精(β-CD)結合HIV之間的競爭；圖六B係黑麴菌葡糖澱粉酶與麥芽七糖(G7)和環糊精(β-CD)結合上HIV之間的競爭。

圖七A係米根黴葡糖澱粉酶與HIV1醣蛋白140抗原和2G12單株抗體結合HIV之間的競爭；圖七B係黑麴菌葡糖澱粉酶與HIV1醣蛋白140抗原和2G12單株抗體結合HIV之間的競爭。

圖八A及圖八B係21個HIV1分離株之2G12抗原決定位之胺基酸序列排比。

Claims

一種醣類結合模組之抗體模擬物，包含米根黴(Rhizopus oryzae )之葡糖澱粉酶(Ro SBD)或黑麴菌(Aspergillus niger )之葡糖澱粉酶(An SBD)，其可特異性結合HIV醣蛋白的一個抗原決定位。
根據申請專利範圍第1項的抗體模擬物，其中醣類結合模組可特異性結合HIV醣蛋白之抗原決定位的一個多醣結構。
根據申請專利範圍第1項的抗體模擬物，其中醣類結合模組含有類似標準抗體之類免疫球蛋白(Ig-like)區域。
一種偵測HIV醣蛋白的方法，包含：a、採用固體表面，其上結合如申請專利範圍第1項之抗體模擬物；b、將樣本與上述表面接觸，以培養形成抗體模擬物-HIV醣蛋白複合體；以及c、培養此複合體，並加入一個能產生可量化測量之訊號的標記HIV抗原結合體，以評判樣本為HIV感染陽性或陰性。
根據申請專利範圍第4項的方法，其中步驟c所述之抗原，標記一個酵素，該酵素在接觸一個酵素基質時能夠產生上述之訊號。