TWI386645B

TWI386645B - 可定量任何聚乙二醇分子與其修飾物之抗聚乙二醇表現細胞

Info

Publication number: TWI386645B
Application number: TW099123699A
Authority: TW
Inventors: Tian Lu Cheng; Steven R Roffler; Kuo Hsiang Chuang; Ssu Jung Lu
Original assignee: Univ Kaohsiung Medical
Priority date: 2010-07-19
Filing date: 2010-07-19
Publication date: 2013-02-21
Also published as: US20120015380A1; TW201205076A

Description

可定量任何聚乙二醇分子與其修飾物之抗聚乙二醇表現細胞

建構出多種細胞膜表現抗聚乙二醇骨架(anti-PEG(CH₂CH₂O))或抗甲氧基聚乙二醇(anti-methoxyl-PEG,anti-CH₃O-PEG)抗體之細胞株，並開發以此細胞為平台的三明治免疫酵素分析法(cell-based sandwich ELISA)或競爭性免疫酵素分析法(cell-based competition ELISA)。

聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一種水溶性、無毒性、低抗原性並且具有生物相容性的聚合物，已獲得美國食品藥物管理局(FDA)許可適用於人體靜脈、口服、皮下注射等方式。研究顯示：聚乙二醇分子具有化學預防大腸癌、治療神經性損傷等效果；此外，經過聚乙二醇修飾之巨分子(蛋白質、奈米藥物及脂質體)能夠降低其抗原性(immunogenicity)、增加半衰期、以及提升其生物相容性等之優點。然而，目前市面上並沒有簡便的方法能有效測量活體內外的聚乙二醇或是其修飾物的濃度。現有測量聚乙二醇分子濃度的方法，例如(a)利用傳統蛋白質專一性抗體三明治免疫酵素分析法直接辨認蛋白質，常會遇到修飾蛋白質的聚乙二醇遮掩掉抗體所辨認的部位 (epitope)，而造成偵測困難與不準確。此外，歐美政府已禁止使用腹水方式生產抗體，未來傳統抗體三明治免疫酵素分析法之商品價格將隨之提高。(b)以碘化鋇(barium-iodide)或氰化鐵(Fe(CN)3)與聚乙二醇修飾蛋白形成複合物的比色測定法，需要先將其他蛋白質去除才能測定，其敏感度低，僅到達1-5μg/ml。(c)以同位素標定聚乙二醇修飾分子進行追蹤，雖然此方法敏感度高，卻不是所有聚乙二醇修飾分子皆適用；此外，由於會有放射線廢棄物的產生，必須為特定的實驗室及操作人員才得以使用，造成其不方便及不普遍。因此開發出一套簡單、敏感且價格低廉的方法，即可測定任何聚乙二醇或聚乙二醇修飾分子在活體內的藥物動力學(pharmacokinetics)，將可以解決傳統方法的不方便、低敏感度且成本昂貴之問題，使一般實驗室皆可使用；幫助任何實驗室皆可方便評估聚乙二醇及其修飾物於活體內外的藥物動力學，對於未來臨床前與臨床上開發聚乙二醇修飾藥物將扮演很重要的角色。

本發明為一種聚乙二醇(PEG)檢測套組，包含具有膜表面抗體表現方向一致之聚乙二醇抗體呈現細胞，其中該細胞會在其細胞膜上呈現聚乙二醇抗體。本發明亦關於一種聚乙二醇(PEG)之檢測方法，第一種方式為先將細胞膜呈現聚乙二醇抗體之細胞固定於一載體，之後依序加入待測之聚乙二醇或聚乙二醇修飾之分子、化學物質修飾之抗聚乙二醇抗體，以及呈色劑，最後再清洗多餘之呈色劑並利用呈色深淺定量聚乙二醇之濃度。第二種方式為將細胞膜呈現聚乙二醇抗體之細胞固定於一載體，同時加入等體積之生物素修飾之聚乙二醇，與待測之聚乙二醇或聚乙二醇修飾之分子，最後加入呈色劑，清洗多餘之呈色劑並利用呈色深淺定量聚乙二醇之濃度。

本發明將各種抗聚乙二醇抗體(anti-PEG (CH₂CH₂O)n-backbone antibody：AGP3/IgM、E11/IgG1、3-3/IgG1、6-3/IgG1)或抗甲氧基聚乙二醇抗體(anti-methoxyl-PEG antibody：15-2/IgG2b)表現於哺乳動物細胞之細胞膜上，例如老鼠纖維母細胞(3T3)之細胞膜上，建構出可定量各種聚乙二醇及其修飾物的細胞株。首先將先前建立的AGP3及15-2融合瘤的Fab抗體序列之輕鏈(VL-CK)及重鏈(VH-CH1)，以口蹄疫病毒之2A胜肽(foot-and-mouth virus 2A peptide,FMDV 2A)連接，並且與B7穿膜受器結合，隨後將其接入反轉錄病毒載體pLNCX，分別製成pLNCX-AGP3 Fab-B7及pLNCX-15-2Fab-B7質體。將這些質體與pVSVG載體(能促進GP2-293產生複製能力缺陷之反轉錄病毒)，利用脂質體(Lipofectamine 2000)共同轉染入GP2-293細胞，經過48小時後，此GP2-293細胞的培養液即分別含有帶AGP3 Fab及15-2 Fab的反轉錄病毒顆粒，並以此反轉錄病毒顆粒感染3T3細胞，而後以抗生素G418 sulfate(1 mg/ml)進行藥物篩選作業，之後利用流式細胞儀收集具高度表現與功能的細胞，因而產生3T3/AGP3及3T3/15-2細胞株(圖2A及2B)。此類細胞株可搭配生物素修飾之抗聚乙二醇抗體(AGP4-Biotin)，建立一套三明治之酵素免疫分析法；例如：將3T3/AGP3細胞種植於96孔盤中，加入待測之聚乙二醇或聚乙二醇修飾巨分子後，再以生物素修飾之抗聚乙二醇抗體當偵測抗體，最後加入辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素(streptavidin-HRP)，適當清洗後，即可利用基質的呈色定量出聚乙二醇或聚乙二醇修飾巨分子的濃度；以3T3/AGP3細胞為平台所建立的三明治酵素免疫分析法可有效定量分子量兩萬的聚乙二醇自由分子(敏感度可達100ng/ml)(圖3A)、聚乙二醇修飾干擾素(PEG-Interferon 2α,Pegasy)(敏感度可達10 ng/ml)(圖3B)、聚乙二醇修飾微脂體藥物(Lipo-Dox)(敏感度可達10 ng/ml)(圖3C)以及聚乙二醇修飾螢光奈米微粒(PEG-Quantum dots,PEG-Q-dot)(敏感度可達0.1 nM)(圖3D)。更重要的，本發明發現：相較於3T3/AGP3，利用3T3/15-2為平台所建立的三明治酵素免疫分析法，能夠敏感地定量帶有甲氧基端的聚乙二醇自由分子；針對分子量五千之甲氧基聚乙二醇(CH₃O-PEG5K)偵測的敏感度高於3.7倍以上，針對分子量二千之甲氧基聚乙二醇(CH₃O-PEG2K)偵測的敏感度高於100倍以上(圖4)。此外，針對不具有甲氧基端的聚乙二醇自由分子之定量，本發明以辨認聚乙二醇骨架之 3T3/AGP3細胞為平台，搭配生物素修飾之聚乙二醇(PEG-Biotin)，開發出一套競爭性酵素免疫分析法；利用生物素修飾之聚乙二醇與不同分子量(MW：2K~20KDa)的待測聚乙二醇樣本，或聚乙二醇修飾之分子等體積均勻混合後，可進行競爭性酵素免疫分析法，可以敏感定量分子量2KDa、5KDa、10KDa及20KDa之聚乙二醇自由分子，敏感度可到達58.6、14.6、3.7及3.7 ng/ml(圖5A)，且不會受到血清的影響(圖5B)。本發明亦建構出其他膜表現抗聚乙二醇之細胞株，如：3T3/E11、3T3/3-3及3T3/6-3(圖6)，亦可以當作三明治之酵素免疫分析法及競爭性酵素免疫分析法之平台。

實施例一：

以抗聚乙二醇之細胞為平台，建立三明治酵素免疫分析法以定量聚乙二醇自由分子及聚乙二醇修飾分子。實例：將3T3/AGP3細胞接種(seeding)於96孔盤上，加入待測之聚乙二醇或聚乙二醇修飾物後，再以生物素修飾之抗聚乙二醇抗體(AGP4-Biotin)當偵測抗體，最後加入呈色劑，例如辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素並適當清洗後，即可利用基質的呈色定量出聚乙二醇或聚乙二醇修飾巨分子的濃度，此法可於血清存在的狀況下，分別定量分子量兩萬的聚乙二醇分子及聚乙二醇修飾巨分子(蛋白質、螢光奈米、脂質體)，其敏感度可分別達到100 ng/ml(5nM)，10 ng/ml，0.1 nM，10ng/ml；因此利用此法可敏感定量各種聚乙二醇修飾物，顯示此平台未來廣泛的應用性。

實施例二：

以抗甲氧基聚乙二醇之細胞為平台，建立三明治酵素免疫分析法以定量各種甲氧基聚乙二醇自由分子。實例：將3T3/15-2細胞接種於96孔盤上，加入待測之甲氧基聚乙二醇，再以生物素修飾之抗聚乙二醇抗體(AGP4-Biotin)當偵測抗體，最後加入辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素並適當清洗後，即可利用基質的呈色定量出甲氧基聚乙二醇的濃度，此法可於血清存在的狀況下，分別定量各種帶有甲氧基之聚乙二醇自由分子(CH₃O-PEG2K及CH₃O-PEG5K)，其偵測敏感度優於3T3/AGP3之平台；因此利用3T3/15-2細胞為平台之三明治酵素免疫分析法，可敏感定量各種甲氧基聚乙二醇自由分子，顯示此平台未來廣泛的應用性。

實施例三：

以抗聚乙二醇之細胞為平台，建立競爭性酵素免疫分析法定量聚乙二醇自由分子。實例：將3T3/AGP3細胞接種於96孔盤上，並將固定濃度的生物素修飾聚乙二醇分子(PEG-Biotin)與待測之聚乙二醇自由分子，依相等體積(一比一)均勻混合後，加入96孔盤中，最後加入辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素並適當清洗後，即可利用基質的呈色定量出聚乙二醇自由分子的濃度，此法即使在40%血清存在的狀況下，仍可分別定量分子量兩萬到兩千的聚乙二醇分子(PEG20K、PEG10K、PEG5K及PEG2K)，且敏感度可達到3.7、3.7、14.6及58.6ng/ml；因此利用此法可敏感定量多種聚乙二醇自由分子，顯示此平台對於未來聚乙二醇在活體內的藥物動力學的了解以及臨床開發上將有很大的幫助。

圖一. 3T3/AGP3、3T3/E11、3T3/3-3及3T3/6-3細胞可辨認聚乙二醇之重複序列(-O-CH₂-CH₂-)n，而3T3/15-2細胞可辨認具有甲氧基端之聚乙二醇(CH₃O-PEG)，因此任何聚乙二醇自由分子及聚乙二醇修飾之巨分子(如脂質體、蛋白質、奈米粒子、藥物…)均可被此類細胞辨認。

圖二. (A)以抗HA抗體測試3T3/AGP3細胞上膜抗體蛋白表現量，並以聚乙二醇修飾螢光奈米微粒(PEG-Q-dot)測試AGP3膜抗體辨認聚乙二醇之功能。(B)以抗HA抗體測試3T3/15-2細胞上膜抗體蛋白表現量，並以聚乙二醇修飾螢光奈米微粒及以螢光素標記之牛血清白蛋白修飾之含甲氧基端聚乙二醇(CH₃O-PEG-BSA-FITC)測試15-2膜抗體辨認CH₃O-PEG之功能。結果顯示3T3/AGP3以及3T3/15-2細胞的膜抗體皆有高度表現；3T3/AGP3細胞能辨認聚乙二醇之骨架，而3T3/15-2僅能辨認帶有甲氧基端之聚乙二醇(CH₃O-PEG)而無法辨認PEG-Q-dot(其聚乙二醇不具有甲氧基末端)。

圖三. 以3T3/AGP為平台之三明治酵素免疫分析法以3T3/AGP3細胞所建立的細胞級三明治酵素免疫分析法敏感偵測(A)聚乙二醇自由分子到達100 ng/ml，(B)偵測聚乙二醇-干擾素2 α(Pegasys)到達10 ng/ml，(C)偵測Lipo-Dox到達10 ng/ml及(D)PEG-Q-dot到達0.1nM；3T3/DNS為負對照組。

圖四. 以3T3/15-2為平台之三明治酵素免疫分析法以3T3/15-2細胞所建立的細胞級三明治酵素免疫分析法偵測帶有甲氧基端(CH₃O end)之聚乙二醇自由分子(A)5KDa，(B)2KDa，比3T3/AGP3更加敏感；3T3/DNS為negative control。

圖五. 以3T3/AGP3細胞為平台之競爭性酵素免疫分析法(A)以不同濃度以及不同分子量大小(MW：2,5,10及20KDa)的聚乙二醇自由分子與修飾上生物素的聚乙二醇(PEG-Biotin,125ng/ml)作競爭，可以發現當聚乙二醇自由分子(2,5,10及20KDa)的濃度分別到達58.6,14.6,3.7及3.7 ng/ml時，吸光值開始隨著聚乙二醇自由分子濃度梯度上升而呈現線性下降，證明以競爭性酵素免疫分析法能夠有效定量聚乙二醇自由分子，其敏感度可達奈克(ng/ml)。(B)將聚乙二醇-生物素與聚乙二醇自由分子(MW：5KDa)配置於內含不同濃度血清的溶液中(2.5%~40%)，並進行競爭性酵素免疫分析法。結果証實，即使血清比例高達40%，亦不會影響競爭性酵素免疫分析法定量聚乙二醇自由分子的能力。

圖六. 探討細胞膜表現E11、3-3及6-3之表現與功能以抗HA抗體(虛線)測試3T3細胞上抗聚乙二醇膜抗體之蛋白表現量，並以PEG-Q-dot(實線)測試膜抗體辨認聚乙二醇之功能；(A)3T3/E11，(B)3T3/3-3，(C)3T3/6-3。結果顯示，此三種細胞株皆具有效與聚乙二醇結合之能力，顯示細胞級三明治酵素免疫分析法及競爭性酵素免疫分析法可使用此三種細胞株當做平台，偵測聚乙二醇自由分子與聚乙二醇修飾之巨分子。

<110> 高雄醫學大學

<120> 可定量任何聚乙二醇分子與其修飾物之抗聚乙二醇表現細胞

<130> 1236-KMU-US

<160> 10

<170> PatentIn version 3.4

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Claims

一種聚乙二醇(PEG)檢測套組，其包含：一具有膜表面抗體表現方向一致之聚乙二醇抗體呈現細胞，其中該細胞會在其細胞膜上呈現聚乙二醇抗體，其中該抗體係選自由AGP3、E11、3-3、6-3、15-2組成之群組，其中AGP3抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈及SEQ ID NO：2之輕鏈；E11抗體包含SEQ ID NO：3之重鏈及SEQ ID NO：4之輕鏈；3-3抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈及SEQ ID NO：6之輕鏈；6-3抗體包含SEQ ID NO：7之重鏈及SEQ ID NO：8之輕鏈；15-2抗體包含SEQ ID NO：9之重鏈及SEQ ID NO：10之輕鏈。
如申請專利範圍第1項之檢測套組，其中該細胞為哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第2項之檢測套組，其中該哺乳動物細胞為3T3細胞。
如申請專利範圍第1項之檢測套組，其中抗體為可偵測聚乙二醇碳骨架之抗體。
如申請專利範圍第1項之檢測套組，其進一步包含一生物素修飾之聚乙二醇抗體。
如申請專利範圍第5項之檢測套組，其中生物素修飾之聚乙二醇抗體係為AGP4-生物素。
如申請專利範圍第1項之檢測套組，其中15-2抗體為可偵測聚乙二醇上之甲氧基的抗體。
如申請專利範圍第1項之檢測套組，其進一步包含一生物素修飾之聚乙二醇。
如申請專利範圍第8項之檢測套組，其中生物素修飾之聚乙二醇係為PEG-生物素。
如申請專利範圍第1項之檢測套組，其進一步包含一呈色劑。
如申請專利範圍第10項之檢測套組，其中呈色劑係為辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素。
一種聚乙二醇(PEG)之檢測方法，其包括：將細胞膜呈現聚乙二醇抗體之細胞固定於一載體，其中該抗體係選自由AGP3、E11、3-3、6-3、15-2組成之群組，其中AGP3抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈及SEQ ID NO：2之輕鏈；E11抗體包含SEQ ID NO：3之重鏈及SEQ ID NO：4之輕鏈；3-3抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈及SEQ ID NO：6之輕鏈；6-3抗體包含SEQ ID NO：7之重鏈及SEQ ID NO：8之輕鏈；15-2抗體包含SEQ ID NO：9之重鏈及SEQ ID NO：10之輕鏈；加入待測之聚乙二醇或聚乙二醇修飾之分子；加入生物素修飾之抗聚乙二醇抗體；加入呈色劑，以及清洗多餘之呈色劑並利用呈色深淺定量聚乙二醇之濃度。
如申請專利範圍第12項之檢測方法，其中該細胞為3T3細胞。
如申請專利範圍第12項之檢測方法，其中15-2抗體用來專一性偵測帶有甲氧基之聚乙二醇分子。
如申請專利範圍第12項之檢測方法，其中該生物素修飾之抗聚乙二醇抗體為AGP4-生物素。
如申請專利範圍第12項之檢測方法，其中呈色劑為辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素。
一種聚乙二醇(PEG)之檢測方法，其包括：將細胞膜呈現聚乙二醇抗體之細胞固定於一載體，其中該抗體係選自由AGP3、E11、3-3、6-3組成之群組，其中AGP3抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈及SEQ ID NO：2之輕鏈；E11抗體包含SEQ ID NO：3之重鏈及SEQ ID NO：4之輕鏈；3-3抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈及SEQ ID NO：6之輕鏈；6-3抗體包含SEQ ID NO：7之重鏈及SEQ ID NO：8之輕鏈；同時加入等體積之生物素修飾之聚乙二醇，與待測之聚乙二醇或聚乙二醇修飾之分子；加入呈色劑，以及清洗多餘之呈色劑並利用呈色深淺定量聚乙二醇之濃度。
如申請專利範圍第17項之檢測方法，其中該細胞為3T3細胞。
如申請專利範圍第17項之檢測方法，其中生物素修飾之聚乙二醇為PEG-生物素。
如申請專利範圍第17項之檢測方法，其中呈色劑為辣根過氧化物酶標記鏈黴親和素。