TWI381851B

TWI381851B - 蛋白質－聚合物綴合物

Info

Publication number: TWI381851B
Application number: TW097131134A
Authority: TW
Inventors: Ko Chung Lin
Original assignee: Pharmaessentia Corp
Priority date: 2007-08-16
Filing date: 2008-08-15
Publication date: 2013-01-11
Also published as: US20090053177A1; SI2205281T1; EA018111B1; NL301195I2; EA201070282A1; JP2010536788A; CN101367872A; HRP20220937T3; CY2022026I2; HUE059551T2; FR22C1045I2; CA2696478A1; MX2010001750A; JP5613050B2; DK2205281T3; EP2205281A1; LT2205281T; WO2009023826A1; LUC00277I2; UA103158C2

Description

蛋白質－聚合物綴合物

發明領域

本發明涉及蛋白質－聚合物綴合物，更具體而言涉及含有一個或多個聚合物部分、蛋白質部分以及連接子的綴合物。本發明還涉及用於製備所述蛋白質－聚合物綴合物的方法以及其在治療乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染中的用途。

發明背景

在細胞生物學和重組蛋白質技術方面的進展導致了蛋白質治療劑的開發。

然而，仍存在著較大障礙。大多數蛋白質易受蛋白水解降解的影響並因此在循環系統中的半衰期短。其他的缺點包括低水溶性和誘發中和抗體。

聚合物(例如聚乙二醇(PEG))與蛋白質的連接阻礙了蛋白水解酶與蛋白質骨架的接近，導致蛋白質穩定性的增加。此外，它還可以增加水溶性並使免疫原性減至最小。需要有將聚合物連接到蛋白質上的有效方法。

發明概要

本發明的一方面涉及包含一種或多種聚合物部分、蛋白質部分和連接子的基本上純的(純度80%)綴合物。在所述綴合物中，所述聚合物部分與所述連接子相連接，所述蛋白質部分N末端的氮原子與所述連接子相鍵合；所述連接子是共價鍵、C_1－10 亞烷基、C_2－10 亞烯基或C_2－10 亞炔基；所述蛋白質部分是α干擾素部分、人生長激素部分或促紅細胞生成素部分。優選地，所述綴合物純度為90%或更高。此綴合物具有出乎意料地長的體內半衰期。

本發明的另一個方面涉及式I的蛋白質－聚合物綴合物：其中R₁ 、R₂ 、R₃ 、R₄ 和R₅ 各自獨立地是H、C_1－5 烷基、C_2－5 烯基、C_2－5 炔基、芳基、雜芳基、C_3－8 環烷基或C_3－8 雜環烷基；A₁ 和A₂ 各自獨立地是聚合物部分；G₁ 、G₂ 和G₃ 各自獨立地是鍵或連接性官能團；P是蛋白質部分；m是0或1－10的整數；n是1－10的整數。

參照上式，所述蛋白質－聚合物綴合物可具有一個或多個以下特徵：G₃ 是鍵，P是蛋白質部分，其中N末端的氨基與G₃ 相連；A₁ 和A₂ 是分子量為2－100 kD(優選10－30 kD)的聚環氧烷部分，G₁ 和G₂ 各自是(其中O與A₁ 或A₂ 相連，NH與式I中所示的碳原子相連)，或者G₁ 和G₂ 各自為脲、磺醯胺或醯胺(其中N與式I中所示的碳原子相連)；m是4，n是2，R₁ 、R₂ 、R₃ 、R₄ 和R₅ 各自為H；P是包含1－4個其他氨基酸殘基的干擾素部分或被修飾的干擾素部分。

術語“烷基”指單價的直鏈或支鏈烴基。烷基的實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基和正戊基。相似地，術語“烯基”或“炔基”指包含一個或多個C＝C雙鍵或一個或多個C≡C三鍵的單價的直鏈或支鏈烴基。

術語“亞烷基”指二價的直鏈或支鏈烴基。相似地，術語“亞烯基”或“亞炔基”指包含一個或多個C＝C雙鍵或一個或多個C≡C三鍵的二價的直鏈或支鏈烴基。

術語“芳基”指具有至少一個芳環的烴環系(單環或雙環)。芳基部分的實例包括但不限於苯基、萘基和芘基。

術語“雜芳基”指具有至少一個芳環的烴環系(單環或雙環)，其中所述芳環包含至少一個作為環系部分的雜原子如O、N或S，並且其餘部分是碳。雜芳基部分的實例包括但不限於呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基和吲哚基。

術語“環烷基”指僅具有碳環原子的部分飽和或完全飽和的單環或雙環環系。實例包括但不限於環丙基、環戊基和環己基。

術語“雜環烷基”指除碳原子外還具有一個或多個雜原子(例如O、N或S)作為環原子的部分飽和或完全飽和的單環或雙環環系。實例包括但不限於哌啶、哌嗪、嗎啉、硫代嗎啉和1,4－氧氮雜環庚烷(1,4－oxazepane)。

本文中提及的烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環烷基和雜環烷基包括取代的和未取代的部分。取代基的實例包括C_1－ C₁₀ 烷基、C_2－ C₁₀ 烯基、C_2－ C₁₀ 炔基、C_3－ C₈ 環烷基、C_5－ C₈ 環烯基、C_1－ C₁₀ 烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳基氧基、氨基、C_1－ C₁₀ 烷基氨基、C_1－ C₂₀ 二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、羥基氨基、烷氧基氨基、C_1－ C₁₀ 烷基磺醯胺基、芳基磺醯胺基、羥基、鹵素、硫代、C_1－ C₁₀ 烷硫基、芳硫基、氰基、硝基、醯基、醯氧基、羧基和羧酸酯。

術語“聚環氧烷部分”指源自線形、分枝或星形聚環氧烷的單價基團。聚環氧烷部分的分子量可以是2－100 kD。聚環氧烷部分是飽和或不飽和的。聚環氧烷部分的實例包括但不限於聚氧乙烯、聚乙二醇、聚氧異丙烯、聚氧丁烯及其共聚物。其他的聚合物比如葡聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯醯胺或基於碳水化合物的聚合物也可用於替代所述聚環氧烷部分，只要它們不是抗原性的、毒性的或誘發免疫應答的。所述聚環氧烷部分是取代的或未取代的。例如，其可以是甲氧基封端的聚乙二醇(mPEG)。

術語“蛋白質部分”指源自天然存在的蛋白質或被修飾的蛋白質的單價基團。所述天然存在的蛋白質可以是α－干擾素、β－干擾素、人生長激素、促紅細胞生成素和粒細胞集落刺激因數或抗體。所述被修飾的蛋白質可以是例如含有α－干擾素和位於所述干擾素N末端的1－4個其他氨基酸殘基的蛋白質。如此被修飾的干擾素的實例是，IFN表示干擾素α_2b 部分，其N末端的氨基與所述羰基鍵合。

術語“α－干擾素”指抑制病毒複製和細胞增殖並調節免疫應答的一個高度同源的物種特異性蛋白質家族。參見 Bonnem等J.Biol.Response Mod.,1984,3(6)：580-598和Finter,J.Hepatol.,1986,3 Suppl 2：S157-160。

很多類型的α干擾素蛋白質是可商購的，包括由Schering Corporation,Kenilworth,N.J.提供的Intron-A干擾素、Hoffmann-La Roche,Nutley,N.J.提供的Roferon干擾素、Boehringer Ingelheim Pharmaceutical,Inc.,Ridgefield,Conn.提供的Berofor α₂ -干擾素、Sumitomo,Japan提供的Sumiferon和Glaxo-Wellcome Ltd.,London,Great Britain提供的Wellferon α-n1干擾素(INS)。

以下列出五種示例性的人α干擾素蛋白質的氨基酸序列，其為前體形式或成熟形式：

maltfallva llvlsckssc svgcdlpqth slgsrrtlml laqmrrislf sclkdrhdfg fpqeefgnqf qkaetipvlh emiqqifnlf stkdssaawd etlldkfyte lyqqlndlea cviqgvgvte tplmkedsil avrkyfqrit lylkekkysp cawevvraei mrsfslstnl qeslrske(序列辨識編號：1)(參見Krasagakis等，Cancer Invest.26(6),562-568,2008)

cdlpqthslg srrtlmllaq mrkislfscl kdrhdfgfpq eefgnqfqka etipvlhemi qqifnlfstk dssaawdetl ldkfytelyq qlndleacvi qgvgvtetpl mkedsilavr kyfqritlyl kekkyspcaw evvraeimrs fslstnlqes lrske(序列辨識編號：2)(參見Klaus，等，J.Mol.Biol.274(4),661-675,1997)

mcdlpqthsl gsrrtlmlla qmrrislfsc lkdrhdfgfp qeefgnqfqk aetipvlhem iqqifnlfst kdssaawdet lldkfytely qqlndleacv iqgvgvtetp lmkedsilav rkyfqritly lkekkyspca wevvraeimr sfslstnlqe slrske(序列辨識編號：3)(參見GenBank錄入號AAP20099,2003年4月30日版本)

mallfpllaa lvmtsyspvg slgcdlpqnh gllsrntlvl lhqmrrispf lclkdrrdfr fpqemvkgsq lqkahvmsvl hemlqqifsl fhterssaaw nmtlldqlht elhqqlqhle tcllqvvgeg esagaisspa ltlrryfqgi rvylkekkys dcawevvrme imkslflstn mqerlrskdr dlgss(序列辨識編號：4)(參見Capon等，J.Mol.Cell.Biol.5(4)：768-779,1985)

lsyksicslg cdlpqthslg nrralillaq mgrispfscl kdrhdfglpq eefdgnqfqk tqaisvlhem iqqtfnlfst edssaaweqs llekfstely qqlnnleacv iqevgmeetp lmnedsilav rkyfqritly ltekkyspca wevvraeimr slsfstnlqk rlrrkd(序列辨識編號：5)(參見Lund等，J.Interferon Res.5(2),229-238,1985)

在一個實例中，用於製備本發明綴合物的α干擾素蛋白質具有與以上列出的氨基酸序列之一或其相當於成熟的α-干擾素的片段至少80%(例如85%、90%、95%或99%)相同的氨基酸序列。

術語“人生長激素”指天然存在的人生長激素(其為前體形式或成熟形式)及其功能性變體，即具有與天然存在的人生長激素至少80%(例如85%、90%、95%或99%)相同的氨基酸序列並具有與人生長激素相同的的生理活性。天然存在的人生長激素(前體形式和成熟形式)的氨基酸序列顯示如下：

matgsrtsll lafgllclpw lqegsafpti plsrlfdnam lrahrlhqla fdtyqefeea yipkeqkysf lqnpqtslcf sesiptpsnr eetqqksnle llrisllliq swlepvqflr svfanslvyg asdsnvydll kdleegiqtl mgrledgspr tgqifkqtys kfdtnshndd allknyglly cfrkdmdkve tflrivqcrs vegscgf(前體)(序列辨識編號：6)

fptiplsrlf dnamlrahrl hqlafdtyqe feeayipkeq kysflqnpqt slcfsesipt psnreetqqk snlellrisl lliqswlepv qflrsvfans lvygasdsnv ydllkdleeg iqtlmgrled gsprtgqifk qtyskfdtns hnddallkny gllycfrkdm dkvetflriv qcrsvegscg f(成熟形式)(序列辨識編號：7)

由肝臟或腎臟產生的促紅細胞生成素(EPO)是一種調節紅細胞生成或血液紅細胞產生的糖蛋白激素。參見美國專利5,621,080。人EPO的氨基酸序列(前體形式和成熟形式)顯示如下：

mgvhecpawl wlllsllslp lglpvlgapp rlicdsrvle rylleakeae nittgcaehc slnenitvpd tkvnfyawkr mevgqqavev wqglallsea vlrgqallvn ssqpweplql hvdkavsglr slttllralg aqkeaisppd aasaaplrti tadtfrklfr vysnflrgkl klytgeacrt gdr(前體)(序列辨識編號：8)

apprlicdsr vlerylleak eaekittgca ehcslnekit vpdtkvnfya wkrmevgqqa vevwqglall seavlrgqal lvkssqpwep lqlhvdkavs glrslttllr algaqkeais ppdaasaapl rtitadtfrk lfrvysnflr gklklytgea crtgdr(成熟形式)(序列辨識編號：9)

用於製備本發明綴合物的促紅細胞生成素蛋白質可以是由合適的物種(例如人、鼠、豬和牛)產生的EPO蛋白質，其或為前體形式或為成熟形式。在一個實例中，所述促紅細胞生成素蛋白質具有與上述氨基酸序列之一至少80%(例如85%、90%、95%或99%)相同的氨基酸序列。

兩個氨基酸序列的“相同性百分數”可利用Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87：2264-68,1990)的演算法確定，其修正方法如Karlin和Altschul的Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：5873-77,1993。將這樣的演算法引入Altschul等的NBLAST和XBLAST程式(2.0版本)中(J.Mol.Biol. 215：403-10,1990)。可利用XBLAST程式(得分=50，字元寬度=3)進行BLAST蛋白質搜索以獲取與本發明的蛋白質分子同源的氨基酸序列。在兩個序列間存在缺口的情況下，可利用Altschul等Nucleic Acids Res. 25(17)：3389-3402,1997中描述的缺口化BLAST(Gapped BLAST)。當利用BLAST和Gapped BLAST程式時，可使用各自程式的默認參數(例如XBLAST和NBLAST)。

術語“連接性官能團”指二價官能團，其一端與聚合物部分連接而另一端與蛋白質部分連接。實例包括但不限於-O-、-S-、羧酸酯、羰基、碳酸酯、醯胺、氨基甲酸酯、脲、磺醯基、亞硫醯基、氨基、亞氨基、羥基氨基、膦酸酯、或磷酸酯基團。

上述蛋白質-聚合物綴合物可以為遊離形式或鹽的形式(如果適用的話)。例如鹽可以在陰離子和本發明蛋白質-聚合物綴合物上的帶正電荷的基團(例如氨基)之間形成。合適的陰離子包括氯化物、溴化物、碘化物、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、三氟乙酸鹽和乙酸鹽。同樣，鹽也可以在陽離子和本發明蛋白質-聚合物綴合物上的帶負電荷的基團(例如羧酸鹽)之間形成。合適的陽離子包括鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子和銨離子如四甲基銨離子。

此外，所述蛋白質－聚合物綴合物可具有一個或多個雙鍵或者一個或多個不對稱中心。這樣的綴合物可作為外消旋體、外消旋混合物、單一對映體、單個非對映體、非對映體混合物、以及順式或反式或者E式或Z式的雙鍵異構形式而存在。

本發明的蛋白質－聚合物綴合物的實例顯示如下：

其中mPEG的分子量是20 kD，IFN是干擾素α _2b 部分。

本發明的另一方面涉及可用於製備蛋白質－聚合物綴合物的化合物。所述化合物具有式II：其中X是反應基團；A₁ 和A₂ 各自獨立地是聚合物部分，或者A₁ 和A₂ 中的一個是聚合物部分，另一個是反應基團；G₁ 、G₂ 和G₃ 各自獨立地是鍵或連接性官能團；R₁ 、R₂ 、R₃ 、R₄ 和R₅ 各自獨立地是H、C_1－5 烷基、C_2－5 烯基、C_2－5 炔基、芳基、雜芳基、C_3－8 環烷基、C_3－8 雜環烷基或－G₄ －X’，G₄ 是鍵或連接性官能團，X’是反應基團；m和n各自獨立地是0或1－10的整數；前提條件是如果－G₃ －X是－CO(O)－N－琥珀醯亞胺基，則n是1－10的整數。

在一個實施方案中，X、X’、A₁ 、A₂ 、G₁ 、G₂ 、G₃ 、G₄ 、R₁ 、R₂ 、R₃ 、R₄ 、R₅ 和m如上所定義，n是1－10的整數。

某些式II化合物具有一項或多項以下特徵：聚合物部分可具有一個或多個反應基團；G₃ 是鍵並且P是蛋白質部分，其中N末端的氨基與G₃ 相連；A₁ 和A₂ 是分子量為2－100 kD(優選12－30 kD)的聚環氧烷部分，G₁ 和G₂ 各自是，其中O與A₁ 或A₂ 相連，NH與式I中所示的碳原子相連；m是4；n是1；R₁ 、R₂ 、R₃ 、R₄ 和R₅ 是H；X是CH(＝O)或者X是離去基團(例如琥珀醯亞胺基或對硝基苯氧基)。

術語“反應基團”指能與另一個官能團反應使得其被所述另一個官能團取代或者與所述另一個官能團相連的官能團。反應基團可以是離去基團、親核基團、醛或Michael受體。

術語“離去基團”指當直接取代或離子化時能帶著電子對從其共價鍵中之一離去的官能團(參見例如F.A.Carey和R.J.Sunberg,Advanced Organic Chemistry,3rd Ed.Plenum Press,1990)。離去基團的實例包括但不限於甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯、對甲苯磺酸酯、碘、溴化物、氯化物、三氟乙酸酯、琥珀醯亞胺基(“Su”)、對硝基苯氧基和吡啶－2－基氧基。

術語“親核基團”指通過給出電子對而與接受電子的基團(比如親核試劑)反應的富電子官能團。

術語“親電基團”指通過接受電子對而與給電子基團 (比如親核試劑)反應的缺電子官能團。Michael受體是親電性基團的亞類。當接觸親核試劑時，其經歷Michael反應。典型的Michael受體包含α,β－不飽和酮部分。

式II的示例性化合物顯示如下：

在另一方面，本發明涉及製備式I的蛋白質－聚合物綴合物的方法，其中蛋白質部分P的N末端的氨基與連接性官能團G₃ 相連。所述方法包括使N末端遊離的蛋白質H－P與具有和上述式II相同(只是X為離去基團)的式的二聚合物分支分子偶聯。所述N末端遊離的蛋白質H－P指其中蛋白質部分P的末端氨基的氮原子與氫原子H鍵合的蛋白質。換言之，H－P具有末端伯氨基或仲氨基。作為替代，所述方法包括(1)使上述N末端遊離蛋白質H－P與具有和上述式II相同(只是G₃ 是鍵，n是0或1－9的整數並且X是CHO)的式的二聚合物分支分子偶聯；和(2)還原所述偶聯產物以形成蛋白質－聚合物綴合物。

干擾素是一種用於治療乙型肝炎病毒(HBV)感染或丙型肝炎病毒(HCV)感染的免疫調節藥物。此外，干擾素(例如α干擾素)可用於治療非霍奇金淋巴瘤、毛細胞白血病、慢性髓性白血病、AIDS相關的卡波西肉瘤、濾泡性淋巴瘤、惡性黑素瘤和尖銳濕疣。因此，本發明的另一方面涉及利用本文中所述的干擾素－聚合物綴合物治療任何上述病症的方法。

本發明還涉及包含用於任何上述病症的干擾素－聚合物綴合物的組合物、以及此治療用途和所述綴合物在製備用於治療這些病症中之一的藥物中的用途。

本發明的一個或多個實施方案的詳細描述在以下的說明書中進行闡明。基於本申請的說明書和申請專利範圍，本發明的其他特徵、目的和優點將顯而易見。

較佳實施例之詳細說明

可通過化學領域中眾所周知的合成方法製備本發明的蛋白質－聚合物綴合物。例如，可使連接子分子同時或分別與兩個聚合物分子鍵合併隨後使蛋白質分子與所述連接子分子鍵合以形成本發明的蛋白質－聚合物綴合物。

本發明還涉及式(II)的化合物。這些化合物可用於製備上述蛋白質－聚合物綴合物。它們可通過化學領域內眾所周知的合成方法製備。以下給出了示例性的合成方案和實際實施例。

方案1表明了製備本發明的蛋白質－聚合物綴合物的實施例。使包含縮醛基團的二胺化合物1與碳酸N－羥基琥珀醯亞胺酯mPEG(即化合物2)反應而形成二PEG化的化合物3，然後將化合物3轉化為醛4。使此醛化合物與具有遊離氨基的化合物反應通過還原性烷基化而得到本發明的蛋白質－聚合物綴合物。

由此合成的蛋白質－聚合物綴合物可通過諸如離子交換色譜、凝膠過濾色譜、電泳、透析、超濾或超離心的方法而進一步純化。

上述化學反應包括使用溶劑、試劑、催化劑、保護基團和脫保護基團的試劑、以及某些反應條件。它們還可包括在本文中所具體描述的步驟之前或之後添加或除去合適保護基團的步驟，以最終實現蛋白質－聚合物綴合物的合成。另外，可以以可選的順序或次序進行各種合成步驟以得到所期望的蛋白質－聚合物綴合物。可用於合成可適用的蛋白質－聚合物綴合物的合成化學轉化和保護基團方法(保護和脫保護)是本領域中已知的，包括例如R.Larock,Comprehensive Organic Transformations ,VCH Publishers(1989)、T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis ,2d.Ed.,John Wiley和Sons(1991)、L.Fieser和M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis ,John Wiley and Sons(1994)、以及L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis ,John Wiley and Sons(1995)及其後來的版本中所述的那些。

本發明的綴合物具有非常高的純度。即在80%或更多的綴合物分子中，聚合物部分與同一蛋白質部分N末端的同一氮原子相連。換言之，在至少80%的綴合物分子中，所述蛋白質部分在所有方面都是相同的，包括其序列和其與所述聚合物部分的鍵合位置。

本發明的綴合物在綴合物的形式中可以是藥物活性的。或者，其可通過酶促裂解所述蛋白質部分和所述聚合物部分間的連鍵而在體內釋放藥物活性的蛋白質(例如通過水解)。體內裂解連鍵所涉及的酶的實例包括氧化酶(例如過氧化物酶、胺氧化酶或脫氫酶)、還原酶(例如酮還原酶)和水解酶(例如蛋白酶、酯酶、硫酸酯酶或磷酸酯酶)。

因此，本發明的一個方面涉及施用有效量的一種或多種上述蛋白質－聚合物綴合物用於治療疾病(例如HBV或HCV感染)的方法。具體地說，可通過給物件以有效量施用一種或多種所述蛋白質－聚合物綴合物而治療疾病。這樣的物件可通過醫護人員基於來自任何合適的診斷方法的結果而確認。

本文所用的術語“治療”被定義為出於治癒、緩解、減輕、治療或改善病症、所述病症的症狀、所述病症的繼發疾病或病症、或所述病症的易患病體質的目的而給具有所述病症、所述病症的症狀、所述病症的繼發疾病或病症、或所述病症的易患病體質的物件(人或動物)應用或施用包含蛋白質－聚合物綴合物的組合物。“有效量”指對所治療物件發揮治療作用的蛋白質－聚合物綴合物的量。所述治療作用可以是客觀的(即可通過某些試驗或指標衡量的)或主觀的(即物件表現出來的效果的指征或感覺到效果)。

本發明還涉及一種藥物組合物，其包含有效量的至少一種上述蛋白質－聚合物綴合物和可藥用載體。另外，本發明包括給患有一種或多種疾病的患者施用有效量的一種或多種所述蛋白質－聚合物綴合物的方法。本領域技術人員公認，根據例如蛋白質－聚合物綴合物的水解速率、待治療疾病的類型、施用途徑、賦形劑的使用以及與其他治療劑聯用的可能性，有效劑量可以變化。

為實施本發明的方法，可以胃腸外、口服、經鼻、直腸、局部或口含施用具有一種或多種上述化合物的組合物。本文中使用的術語“胃腸外”指皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病竈內、腹膜內、氣管內或顱內注射，以及任何合適的輸注技術。

無菌注射組合物可以是在無毒的胃腸外可接受稀釋劑或溶劑中的溶液或懸浮液，如在1,3－丁二醇中的溶液。在可接受的載體和溶劑中，可應用的有甘露醇、水、林格氏液(Ringer’s solution)和氯化鈉等滲溶液。此外，不揮發油是作為溶劑或混懸介質(例如合成的甘油單酯或甘油二酯)而常規施用的。脂肪酸(比如油酸及其甘油酯衍生物)可用於製備注射劑，天然的可藥用油，比如橄欖油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙基化的形式同樣地可以。這些油溶液或懸浮液還可包含長鏈醇稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素或類似的分散劑。其他常用的表面活性劑(比如吐溫類或司盤類)或其他類似的乳化劑或常用於製備藥學上可接受的固體、液體或其他劑型的生物利用度增強劑也可用於製劑的目的。

口服施用的組合物可以是任何口服可接受的劑型，包括膠囊、片劑、乳劑和含水的懸浮液、分散劑和溶液。在片劑的情況下，常用的載體包括乳糖和玉米澱粉。通常還可以加入潤滑劑，比如硬脂酸鎂。對於膠囊形式的口服施用而言，可用的稀釋劑包括乳糖和乾玉米澱粉。當口服施用含水懸浮液或乳液時，活性成分可被混懸在或溶解在與乳化劑或助懸劑相合併的油相中。如果需要，可加入某些甜味劑、調味劑或著色劑。

可根據藥物製劑領域中眾所周知的技術製備鼻氣霧劑或吸入劑組合物。例如，利用苄醇或其他合適的防腐劑、用於增加生物利用度的吸收促進劑、碳氟化合物和/或本領域中公知的其他增溶劑或分散劑，將這樣的組合物製備成在鹽水中的溶液。也可以以用於直腸施用的栓劑的形式施用含有一種或多種上述化合物的組合物。

可藥用載體通常與一種或多種上述活性化合物使用。藥物組合物中的載體必須是“可接受的”，其意為它與所述組合物的活性成分相相容(並且優選地能穩定所述活性成分)並且對所待治療的對象無害。一種或多種增溶劑可用作藥物賦形劑用於遞送上述化合物。其他載體的實例包括膠體二氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素、月桂基硫酸鈉和D&C黃# 10。

可使用合適的體外方法來初步評價上述綴合物在抑制乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒中的效力。還可通過體內方法檢驗所述綴合物在治療乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染中的效力。例如，可將其施用給患有乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染的動物(例如小鼠模型)或人，然後評價其療效。基於這些結果，還可以確定劑量範圍和施用途徑。

以下實施例僅被解釋為舉例說明的，無論如何都不以任何方式限制本公開內容的其餘部分。相信本領域技術人員在本文說明書的基礎上，不需要進一步的努力即可最大程度地利用本發明。本文中引用的全部公開文獻以整體通過引用併入本文中。

二PEG醛的製備

根據Bioconjugate Chem.1993,4,568－569中描述的方法，由購自SunBio Inc.,CA,USA的20 kD mPEGOH製備20 kD的PEGO(C＝O)OSu。

向含有20 kD PEGO(C＝O)OSu(1.72 g,86.0 μmol)的燒瓶中加入6－(1,3－二氧戊環－2－基)己烷－1,5－二胺在二氯甲烷中的溶液(11.97 g溶液含有9.03 mg二胺，47.8 μmol)。在PEGO(C＝O)OSu完全溶解後，加入N,N－二異丙基乙胺(79 μL,478 μmol)。在室溫下攪拌反應混合物24小時，然後在攪拌下滴加甲基叔丁基醚(200 mL)。收集所得的沈澱物並在真空下乾燥而得到白色固體的二PEG縮醛(1.69 g,98%)。

¹ H NMR(400 MHz,d₆ －DMSO)δ7.16(t,J ＝5.2 Hz,1 H),7.06(d,J ＝8.8 Hz,1 H),4.76(t,J ＝4.8 Hz,1 H),4.10－3.95(m,4 H),1.80－1.65(m,1 H),1.65－1.50(m,1 H),1.48－1.10(m,6 H)。

將二PEG縮醛(4.0 g,0.2 mmol)混懸於pH 2.0的緩衝液(檸檬酸，40 mL)中。在35℃攪拌反應混合物24小時，然後以二氯甲烷萃取(3×50 mL)。將合併的有機層通過硫酸鎂乾燥、濃縮，然後重新溶解在二氯甲烷(20 mL)中。在攪拌下將所述溶液滴加至甲基叔丁基醚(400 mL)中。收集所得的沈澱物並減壓乾燥而得到白色固體的二PEG醛(3.8 g,95%)。

¹ H NMR(400 MHz,d₆ －DMSO)δ9.60(s,1 H),7.24(d,J ＝8.4 Hz,1 H),7.16(t,J ＝5.2 Hz,1 H),4.10－3.95(m,4 H),3.95－3.80(m,1 H),3.00－2.85(m,2 H),2.58－2.36(m,2 H),1.46－1.15(m,6 H)。

被修飾的干擾素的製備

通過PCR方法，利用人基因組DNA作為範本克隆被修飾的重組人α _2b 干擾素。基於人α _2b 干擾素(GenBank Accession # J00207,2008年1月8號)的側翼序列合成寡核苷酸。將得到的PCR產物亞克隆進pGEM－T載體(Promega)中。通過pGEM－T克隆而再次PCR擴增IFN變體，隨後利用NdeI/BamHI作為克隆位點，將其亞克隆進蛋白質表達載體pET－24a(Novagen)中，所述pET－24a為一種T7 RNA聚合酶啟動子驅動的載體。然後將載體pET－24a轉化到大腸桿菌(E .coli )BL21－CodonPlus(DE 3)－RIL(Stratagene)菌株中。通過在卡那黴素(50 μg/mL)和氯黴素(50 μg/mL)存在下維持所述轉化的大腸桿菌BL21－CodonPlus(DE 3)－RIL而選擇高表達的克隆。

利用Terrific肉湯培養基(BD,200 mL)在1000 mL燒瓶中增殖具有Pro－IFN基因的BL21－CodonPlus(DE 3)－RIL。在37℃下230 rpm搖動燒瓶16小時。在5升的發酵罐(Bioflo 3000；New Brunswick Scientific Co.,Edison,NJ)中進行分批發酵和補料分批發酵。分批發酵使用150 mL過夜預培養接種物和3 L添加有以下物質的Terrific肉湯培養基：卡那黴素(50 μg/mL)、氯黴素(50 μg/mL)、0.4%甘油、和0.5%(v/v)的痕量元素(10 g/L的FeSO₄ ．7H₂ O、2.25 g/L的ZnSO₄ ．7H₂ O、1 g/L的CuSO₄ ．5H₂ O、0.5 g/L的MnSO₄ ．H₂ O、0.3 g/L of H₃ BO₃ 、2 g/L的CaCl₂ ．2H₂ O、0.1 g/L的(NH₄ )₆ Mo₇ O₂₄ 、0.84 g/L EDTA、50 ml/L HCl)。溶解氧的濃度控制在35%，通過加入5 N NaOH水溶液將pH保持在7.2。製備含有600 g/L葡萄糖和20 g/L MgSO₄ ．7H₂ O的補加溶液。當pH上升到大於所述設定點的值時，加入合適體積的補加溶液以增加培養基肉湯中的葡萄糖濃度。通過加入IPTG至1 mM的最終濃度而誘導Pro－IFN基因的表達，孵育3小時後收穫所述培養基肉湯。

用TEN緩衝液(50 mM Tris－HCl(pH 8.0)、1 mM EDTA、100 mM NaCl)以合適的1：10(濕重g/mL)的比例重新混懸所收集到的細胞團塊並通過微射流均質機(microfluidizer)將其破壞，然後在10,000 rpm下離心20分鐘。用TEN緩衝液洗滌所述含有包涵體(IB)的團塊兩次並如上所述進行離心。然後將所述含有IB的團塊混懸於150 mL 4 M的鹽酸胍(GuHCl)水溶液中並在20,000 rpm下離心15分鐘。然後使IB溶解在50 mL 6 M的GuHCl溶液中。將GuHCl溶解的物質在20,000 rpm下離心20分鐘。通過將變性的IB在1.5 L新鮮製備的重折疊緩衝液(refolding buffer)(100 mM Tris－HCl(pH 8.0)、0.5 M L－精氨酸、2 mM EDTA)中稀釋而啟動重折疊，所述重折疊緩衝液僅在添加期間攪拌。然後在不攪拌的條件下孵育所述重折疊反應混合物48小時。被重折疊的重組人α _2b 干擾素(即Pro－IFN)通過20 mM Tris緩衝液(含有2 mM EDTA和0.1M脲，pH 7.0)進行透析以通過Q－瓊脂糖凝膠柱色譜而進一步純化。

將所述被重折疊的重組人蛋白質Pro－IFN上樣到Q－瓊脂糖凝膠柱(GE Amersham Pharmacia,Pittsburgh,PA)上。所述柱被預先平衡並用20 mM的Tris－HCl緩衝液(pH 7.0)洗滌。用20 mM的Tris－HCl緩衝液(pH 7.0)和200 mM NaCl的混合物洗脫產物。基於其在280 nm的吸光度，收集含有Pro－IFN的級分。利用Bradford方法(Pierce,Rockford,IL)，通過蛋白質測定試劑盒測定Pro－IFN的濃度。

蛋白質－聚合物綴合物的製備

向上述製備的二PEG醛(1.2 g,0.03 mmol)在水(72 mL)中的溶液中加入2 M磷酸鈉緩衝液(pH 4.0,5 mL)和Pro－IFN(200 mg，在22.2 mL pH 7.0的含有20 mM Tris－HCl和0.2M NaCl的緩衝液中，0.01 mmol)。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘，然後加入氰基硼氫化鈉的水溶液(400 mM,1.25 mL,0.5 mmol)。在黑暗處攪拌反應混合物16小時並通過SP XL瓊脂糖凝膠色譜純化。基於保留時間和在280 nm的吸光度收集含有所期望的聚合物－蛋白質綴合物的級分。利用Bradford方法(Pierce,Rockford,IL)，通過蛋白質測定試劑盒測定所述綴合物的濃度。所述綴合物的分離產率是約40%或更高。

其他實施方案

本說明書中公開的所有特徵均可以任何組合進行結合。本說明書中公開的每個特徵均可被實現同樣、等價或相似目的的可替代特徵所替換。因此，除非另外明確說明，所公開的每個特徵僅是等價或相似特徵的一般系列中的實例。

基於以上說明書，本領域技術人員可容易地確定本發明的必要特徵，而不脫離其精神和範圍，可以作出本發明的各種變化和改變以使其適應各種應用和條件。因此，其他的實施方案也在以下申請專利範圍的範圍內。

<110> 藥華醫藥股份有限公司

<120> 蛋白質-聚合物綴合物

<140> TW 097131134

<141> 2008-08-15

<150> US 60/956,273

<151> 2007-08-16

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 188

<212> PRT

<213> 人類

<400> 1

<210> 2

<211> 165

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<400> 2

<210> 3

<211> 166

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Claims

一種式I的蛋白質-聚合物綴合物：其中R₁ 、R₂ 、R₃ 、R₄ 和R₅ 中每一個各自獨立地是H、C_1-5 烷基、C_2-5 烯基、C_2-5 炔基、芳基、雜芳基、C_3-8 環烷基或C_3-8 雜環烷基；A₁ 和A₂ 各自獨立地是聚合物；G₁ 、G₂ 和G₃ 各自獨立地是鍵或連接性官能團；P是α干擾素、人生長激素或促紅細胞生成素；m是0或1-10的整數；和n是1-10的整數。
如申請專利範圍第1項的綴合物，其中G₃ 是鍵，P是蛋白質，其中N末端的氨基與G₃ 鍵合。
如申請專利範圍第2項的綴合物，其中A₁ 和A₂ 各自是分子量為10-30 kD的mPEG。
如申請專利範圍第3項的綴合物，其中G₁ 和G₂ 各自是其中O與A₁ 或A₂ 相連，NH與式I中所示的碳原子相連。
如申請專利範圍第4項的綴合物，其中P是在N末端包含1-4個其他氨基酸殘基的被修飾的干擾素。
如申請專利範圍第5項的綴合物，其中n是2。
如申請專利範圍第6項的綴合物，其中所述綴合物是其中mPEG的分子量為20 kD，IFN為干擾素α_2b 。
如申請專利範圍第1項的綴合物，其中P是在N末端具有1-4個其他氨基酸殘基的α干擾素。
如申請專利範圍第1項的綴合物，其中P是序列辨識編號：1、2、3、4或5。
如申請專利範圍第1項的綴合物，其中P是序列辨識編號：6或7。
如申請專利範圍第1項的綴合物，其中P是序列辨識編號：8或9。
一種用於治療丙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒感染的藥學組成物，其包括如申請專利範圍第1項的蛋白質-聚合物綴合物。