TWI377065B - - Google Patents

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1377065 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於一種靈芝液，特別是指-種經由機械 式研磨製成之靈芝子實體懸浮液。 ' 機械 【先前技術】 奈米/次微米產品是近年來的熱門話題，近年來 研究學者、業者與一般大眾的注意，右 忍有鏗於奈米/次微米科 技的重要性及潛力’很多國家已將奈米/次微米科技之相關 研究列為優先考量，且-但將奈米/次微米科技應用於食品 材料上，將對全球的食品系統造成革命性的改變，雖献目 前奈米/次微米食品材料的研究尚屬於起步階段，_材粒 子細小後，應可提高吸收率，而有助於嬰兒、老人或消化 系統不良者攝取必須的營養物質，且可應用於中草藥，使 藥效更容易發揮，為達到這些長遠的目標，食品材料的奈 米/次微米化技術與產品性質的瞭解是一項重要的課題。 7中草藥中’靈芝子實體被公認為具有多項保健功能 ，如抗腫瘤、調節免疫機能、降血脂、降血壓、降血糖、 抗病毒、抗過敏、抗氧化、抗輻射、抑制血小板凝集與止 痛等，無論是以完整子實體或萃取物食用，靈芝確實是相 田女全的中草藥，甚至給予高劑量，例如：每日30 g之乾 燥子實體萃取物，經證實亦無顯著的毒性反應，且利用動 物實驗評估靈芝的營養價值和毒性，結果顯示靈芝並無基 因毒性（genotoxicity)。 據估計，2001年全世界靈芝的產量為4800噸，中國大 3 1377065 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 陸是最大生產國（3500噸），約有200萬人食用靈芝，即每 人每年約消耗2.5公斤，消費者健康意識的增加，使靈芝產 品市場將逐年成長。但市面上的靈芝產品很多種，常見的 為：整株靈芝、靈芝切片、膠囊、顆粒、錠丸與液狀飲品 (靈芝茶、靈芝酒、靈芝糖漿及靈芝飲料）等，依其有效 成份含量而言，品質優劣參差不齊。雖然靈芝保健食品是 目前食品市場的熱門商品’然而，其有效成分（例如幾丁 質、春醣、β-葡聚糖）萃取不易、溶解度低，於人體内的吸 收亦不甚理想，且萃取後之靈芝渣（多為膳食纖維之成分 )又常被視為廢棄物，而造成資源的浪費。 經申請人研究，若能將完整之靈芝子實體粒徑奈米/次 微米化處理，製成奈米/次微米級靈芝子實體懸浮液，不但 有助於靈芝多醣等活性成分的釋出，而獲得完整的活性成 分，及增加活性成分的吸收與利用外，還可從中獲得奈米/ 次微米化之膳食纖維，而同時減少廢棄物的產生。 【發明内容】 因此’本發明之目❾，即在提供一種經由機械式研磨 製成，且具有細小靈芝微粒的靈芝子實體懸浮液。 於是，本發明靈芝子實體懸浮液，為靈芝子實體盥可 食性乳化劑-起經由機械式研磨後所得到含有靈芝微粒之 靈芝子實體懸浮液，並含有纖維質、幾丁質，& 葡聚糖 ，且靈芝微粒之體積平均粒經小於1〇 μιη，該可食性乳化劑 是啊80,且該可食性乳化劑含量是$芝子實體重量的 4 申請索號第98111670號替換本 101.6.19 一本發月之功效·透過機械式研磨來製造靈芝子實體懸 汗液的方式，除了無須萃取即可獲得完整的活性成分外， 還可大幅提高纖維質比表面積，且纖維質之後續利用無須 再粉碎’可作為-良好的膳食纖維添加物。 【實施方式】 有關本發明之前述及其他技術内容、特點與功效，在 以下配合參考圖式之一個較佳實施例的詳細說明中將可 清楚的呈現》 # j發明靈芝子實體懸浮液的較佳實施例，係由整株靈 芝子實體經過機械式研磨處理製成，該靈芝子實體懸浮液 包：經：機械式研磨靈芝子實體所得到之靈芝微粒，及與 靈芝子實體一起進行研磨之可食性乳化劑。 機械式奈米研磨乃是利用機械能量、研磨介質（研磨 珠）間的磁撞作用’以及漿料·流體與流體·研磨珠間的剪切 力，將大粒子破碎與分散，常用於塗料或奈米粉體製備。 機械式研磨機配有冷卻系統，可避免高溫的產生，有利於 對熱敏感之有機材料的處理，例如食品㈣與中草藥等。 以下即以傳統熱水萃取法獲得之萃取物，與本發明直 接將靈芝子實心機械切磨進行奈米/讀米化處理後之 致芝子貫體懸浮液進行比較說明。 照組：傳統埶皮萃南 將靈芝子實體清洗後置於70°C供箱中，以熱風乾燥至 水份殘餘約10%左右。利用粉碎機

Co.，Taiwan)細碎成粉末備用。取3〇〇 g靈芝子實體粉末加 1377065 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 入4500 mL蒸餾水，於1〇〇艺加熱2小時，趁熱以60 mesh 筛網先行粗濾’所得瀘、液再以Whatman No.4濾、紙（

Whatman，Springfield Mill，UK)過濾以除去細微殘渣，可 得黃色滤液，即為萃取液。殘渣再加入4500 mL蒸餾水， 且如上進行萃取。每一樣品進行三次熱水萃取，將所得濾 液混合，於真空下濃縮至適量體積，計算濃縮率並紀錄之 〇 實驗組：機械式研磨整铁雷芏子實體，包含以下步麻 丄 步驟（一）研磨前處理。 秤取靈芝子實體，洗淨切丁後加入250 mL 4乞去離子 水，以攪碎器（Blender 7012S，Waring Commercial, USA) 攪打5分鐘後倒入600 mL的高型燒杯中，以去離子水（ 150 mL、4°C )將殘留在攪碎器中的子實體粗碎物洗出，於 4°C下靜置隔夜，使纖維組織鬆弛，再以高速均質機（ Polytron PT 3000，Kinematica AG，Switzerland)於 20,000 rpm下攪打10分鐘（全程冰浴以避免溫度上升），使子實體 顆粒小於300 μιη，再進行機械式研磨。 步驟（二）機械式研磨。 使用奈米細磨機（MiniPur，NETZCH- Feinmahltechnik GmbH，German)研磨上述步驟（一）所得之子實體顆粒， 研磨需分為二個階段。第一階段使用粒徑0.8 mm之釔錯珠 為研磨介質，第二階段則改用粒徑0.3 mm之釔锆珠為研磨 介質，進料速度360 mL/min ^為探討操作條件對產品之影 6 1377065 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 響，選擇不同的固形物濃度、研磨介質填充量及攪拌軸轉 速進行實驗，於研磨過程中，每30分鐘取樣進行粒徑分析 〇 完成上述靈芝子實體懸浮液之製備後，將針對對照組 與實驗組所得之靈芝液進行化性與物性分析比較，分別如 下所述： (一）化性分析 Α. β-葡聚糖（β-D-glucans)含量測定 利用螢光染劑Aniline blue定量β-葡聚糖。取研磨後之 靈芝子實體懸浮液離心（ 2000xg，10 min)後，以Whatman Νο·4濾紙過濾，取適量樣品溶液，加入0.3 N NaOH使總體 積為3 mL，攪拌30分鐘，以1 N HC1調整pH至11.5，加 入 50 mM 之 pH 11.5 的 Na2HP04-Na0H buffer (含 0.5 Μ NaCl)，並定容至10 mL。取上述溶液2 mL，力口入0.2 mL aniline blue ( 1 mg/mL)，以Vortex震盪混合均勻後，靜置 2小時，以螢光檢測器檢測（激發波長395 nm，放射波長 495 nm )。以不同濃度之Lentinan製備標準曲線，計算樣品 中之β-葡聚糖含量。 Β.總膳食纖維測定 採用 AOAC 991.43 (enzymatic-gravimetric method)和 AOAC 993.21 (nonenzymatic-gravimetric method)兩種方法 。AOAC 991.43是目前廣為學者所接受之測定方法，AOAC 993.21則是一種不使用酵素的簡便方法（此法只適用於總 膳食纖維> 10%，澱粉< 2%之樣品，包括靈芝之部分中草 7 1377065 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 藥均符合此規範）。 C.幾丁質（Chitin)含量測定 取400 mg靈芝子實體懸浮液，以6 N HC1於100°C下 迴流水解5小時，冷卻至室溫後以Whatman Νο·4濾紙過濾 ，取1 mL濾液於45〜50°C下減壓乾燥後備用。將乾燥之水 解產物回溶於蒸餾水中。取1 mL上述水解產物之稀釋溶液 加入 0.25 mL 4% acetylacetone，於 90°C 下加熱 1 小時，冷 卻後加入2 mL ethanol並震盪使沉澱物溶解，隨後加入0.25 mL Ehrlich reagent，呈色後，於波長530 nm下測定其吸光 值。利用不同濃度之 glucosamine hydrochloride ( 5〜50 pg/mL)製作標準曲線，並以 l，4-anhydro-N-acetyl-2-deoxy-D-glucopyranose equivalent 計算幾丁質含量。 (二）物性分析 A.粒徑分佈測定 使用動態光散射粒徑分析儀（dynamic light scattering particle size analyzer) (Nanotrac 150，Microtrac Inc” USA) ，測定所得之靈芝微粒的粒徑分佈，該儀器的測定範圍0.8 nm至6500 nm。如超出該範圍，貝ij改用 Beckman Coulter (CA, USA)生產之LS 230粒徑分析儀進行量測，其粒徑 量測範圍0.4 μηι至2000 μηι，光源經濾光處理後，偵測下 限可達40 nm »以去離子水作為空白測試，並於25°C下進行 測定。將研磨後之靈芝子實體懸浮液經適當稀釋後，直接 以儀器測定之。利用分析軟體（FLEX Software，Microtrac Inc.，USA)分析散射訊號，計算粒子之Doppler shifts以求 8 1377065 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 得粒徑分佈百分比、平均粒徑（mean particle size )、中間 粒徑（median particle size)等粒徑分佈參數。 B.顯微觀察 使用光學顯微鏡（Optiphot-Pol，Nikon，Japan)觀察靈 芝粗碎後之組織結構，以及研磨初期靈芝顆粒之變化情形 。以掃描式電子顯微鏡（SEM)觀察所得靈芝微粒的顯微結 構。樣品經稀釋後，塗抹於載玻片上，置於室溫下乾燥， 用銀膠將樣品黏著於鋁台上，於真空狀態下以離子覆膜器 將樣品表面鍍上金膜後，以SEM觀察樣品之顯微結構。另 亦使用穿透式電子顯微鏡（TEM ) ( JEM-1230，JEOL Co. Ltd, Japan)觀察所得靈芝微粒之顯微結構，確認粒徑分佈 之測量結果。樣品經適當稀釋後，以TEM專用之200 mesh 鍍碳銅網（ 01800-F，Ted Pella，Inc.，U.S.A.)沾取樣品懸浮 液，置於乾燥箱中乾燥，乾燥後之樣品直接以TEM觀察， 並以 CCD 照相系統（DualVision CCD，Gatan Inc.，US A )结 取所需之數位影像。TEM所用之電子源為熱陰極電子搶（ LaB6燈絲），最大加速電壓為120KV。 (三）靈芝子實體懸浮液之穩定性處理與分析 A.界面活性劑之添加 選擇適當的研磨操作條件（轉速：3600 rpm，介質直 徑：0.2 mm ;時間：90分鐘），於研磨前加入不同種類、濃 度和HLB值之可食性乳化劑。選用之乳化劑有：1.離子型 界面活性劑（ionic surfactant )，例如脂肪酸鹽類（屬陰離 子型界面活性劑）。2.非離子型界面活性劑（nonionic 9 1377065 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 surfactant)，例如（1)蔗糖龍（sugar ester)(選擇 hlb 值 分別為3、7、11和15之蔗糖酯）;⑴聚山梨醇酐脂肪酸 醋（_ 85、80、60、20 和 Tween 65、20，HLB 值分別為 1·8 4·3 6·7、8.6、10.6、16.7 )。上述所選用之乳化劑濃 度，是以研磨之固形物含量為基礎，加入5%、1〇%、2〇% 和 50%。 Β·儲存性試驗 將研磨後及經穩定處理之靈芝子實體懸浮液分別放置 在4°C和室溫下，於儲存期間（〇、〇 5、丨、2、6、12 ' 24 48 72 96小時）’取樣進行濁度分析和粒徑分析。於此 試驗中，將添加少許防腐劑，以避免微生物的生長。 C.濁度測定 濁度的高低與溶液中粒子之數量有關，若樣品中之奈 米/次微米粒子聚集成大粒子，甚至沉澱，則懸浮粒子總數 下降致使上層溶液濁度下降。可由濁度初步判斷靈芝子 實體懸洋液之穩定性，進而淘汰不適用的乳化劑。使用攜

帶 ^濁度 at ( portable turbidimeter, model 21 OOP，HACH company，U，S·Α·)測定儲存期間濁度的變化，檢測前先以標 準品（Gelex Secondary Standards)(濁度分別為 〇_10 Ντυ 、〇·1〇0 NTU和〇_1〇00 NTU)校正，取研磨及穩定處理後 之靈芝子實體懸浮液，經適當稀釋，取15 mL·置入水樣檢 測瓶中，直接以濁度計測定之，單位為NTU。 D·界面電位（Zetapotentia丨）測定 界面電位是敕子間吸引力或排斥力的指標，該值的增 10 1377065 申請案號第98111670號替換本 丨〇丨.<U9 加，顯示粒子越穩定，是測量粒子表面性質的有效工具。 將稀溶液置於谓測儀上，賦予粒子固定值的電I，觀察粒 子的移動速率，由移動速率與時間的相關性可導出粒子 表面的相關性質。界面電位分析儀（加potent )可即時分析界面電位對應#值、乳化劑添加濃度及時間 的變化曲線圖及結果，由於界面電位 粒子穩定性的重要指標，藉由該數據的分析/;=奈卡 求/次微核靈芝微粒再聚集的可能原因，進而探討其基 理論。配合現有之濁度計及雷射粒徑分析儀等，將可使產 品穩定性之解析更加完備且具時效性，同時瞭解奈米 米級靈芝微粒的表面特性，是將來進一步修飾粒子表面性 質的重要依據。 E.顯微觀察 使用光學顯微鏡（〇ptiph()t_PQl，Nik(m，hpan)觀察奈 米/次微米級靈芝微粒再聚集之變化情形。此外，以穿透式 電子顯微鏡（讓）（脑_123G，卿L c。ud，—η)觀察 儲存期間奈米/次微米級靈芝微粒的顯微結構，以確認挪 分佈的測量及再聚集之結構，並以掃描式電子顯微鏡；

Sc_ing e丨ectron microsc〇pe，随）觀察所得樣品的顯微結 構0 (四）28天亞急毒性試驗 「依衛生署公告的「藥品非臨床試驗優良操作規範」，和 健康食品安全性評估方法」中的毒性試驗方法進行28天 亞急毒性試驗。在試驗物質給予期_量㈣H重及食物 11 1377065 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 消耗量之變化。剖檢前收集血液樣品，進行血液及血清生 化分析。試驗物質給予期間結束，進行剖檢，以肉眼觀察 及記錄動物的器官與組織之變化，並測量主要臟器重量。 最高劑量組與對照組進行組織病理檢驗。 A. 動物處理 動物則採用自台大醫學院動物中心的5_6週ICR小鼠 ，每劑量組使用雄、雌各12隻動物。在進行毒性測試前， 動物首先在具溫度、溼度及光照之動物房適應一週，並自 由攝取正常飼料及水。一週後開始餵食實驗，連續28天後 ，犧牲小鼠。 B. 靈芝劑量 在本試驗中，低劑量及中劑量組則分別採0.02及0.2 g/kg/day，高劑量組採用 2 g/kg/day。此低劑量（0.02 g/kg/day)、中劑量（0.2 g/kg/day)、高劑量（2 g/kg/day) 分別為成人每曰建議攝取量之同劑量、10倍及100倍。 C. 血清生化值之測定 動物的血液樣本取自頸動脈血放入血清分離管，經 3000 xg 15分鐘離心後取的血清樣本。分析項目如下：高密 度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白 (low density lipoprotein, LDL )、麵氨酸氨基轉化酶（ glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)、麵氨酸丙酮酸氨 基轉化酶（glutamic pyruvic transaminase, GPT)、血液尿素 氮（blood urea nitrogen, BUN)、肌氨酸針（creatinine, CRE )、總膽固醇 （cholesterol，CHO )、三酸甘油脂 （ 12 1377065 申請案號第98111670號替換本 10丨.6.19 triglyceride, TG )、鈉離子（Na+ )、鉀離子（K+ )、氣離子 (C1-)、葡萄糖（Glucose)等。 D.血液分析 動物的血液樣本取自頸動脈血放入含EDTA抗凝劑試 管採集1 mL全血，分析項目如下：白血球（white blood cell，WBC)、紅血球（red blood cell，RBC )、血紅素（ hemoglobin, Hb)、血球容積比（hematocrit，Hct)、平均紅 血球容積（mean corpuscular, MCV)、平均紅血球血紅素（ mean corpuscular hemoglobin, MCH)、平均红血球血紅球濃 度(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)、 血小板（platelets, PLT )、淋巴球數目（lymphocytes, LYMPH )、紅血球平均寬度（red cell distribution width-coefficient of variation, RDW-CV)、 血小板紅 jk 球 （platelet distribution width，PDW)、平均血小板容積（mean platelet volume, MPV )、血小板大細胞範圍（platelet-large cell range，P-LCR)等。 Ε·組織病理切片 ' 將所有動物之組織，肝臟、腎臟、心臟、脾臟、肺臟 、睪丸、副睪及子宮卵巢等標的器官取下後，放入10% formal’in固定一星期。切片後以hematoxylin and eosin染色 後，以顯微鏡觀察。組織病理切片判讀委託台灣動物科技 研究所進行。 以下即針對本發明靈芝子實體懸浮液之製程與分析進 行說明： 13 1377065 申請案號第98111670號替換本 HH.6.19 (一）、研磨製程與粒徑之關係 如表1所示研磨條件，於相同研磨時間（90 min)下， 探討轉速（2310〜3570 rpm)、進料濃度（0.5〜2.0 g/mL) 和研磨珠填充量（80〜140 mL)對靈芝奈米/次微米化製程 之影響。 表1 編號 離心轉速 (rpm ) 靈芝進料濃度 (g/mL ) 研磨珠填充量 (mL) 1 3570 0.5 140 2 3570 0.5 110 3 3570 0.5 80 4 3570 1.0 140 5 3570 2.0 140 6 2940 0.5 140 7 2310 0.5 140 如圖1所示，轉速提高會增加研磨珠間的碰撞次數和 強度，致使溫度快速上升並促使粒子再聚集，造成平均粒 徑的增加。提高進料濃度可降低粒子間的平均距離並使研 磨珠碰撞範圍内存在較多的粒子而增加研磨效率。填充量 過高則可能會限制研磨珠於研磨過程中的運動，降低碰撞 速度，致使研磨效率降低。由上述實驗結果可知，在奈米/ 次微米級靈芝子實體懸浮液的研磨製程中，使用較高的固 形物濃度，並降低研磨轉速及研磨珠的填充量，應可降低 產品的體積平均粒徑。 將刖述刖處理所得之靈芝細碎懸浮液於36〇〇卬爪之固 定轉速、360 mL/min之固定進料速率和14〇 之固定填充 量，以及不同固形物濃度與兩種研磨珠大+ (0.8 mm、0.3 mm 釔锆珠）下研磨 30、6〇、9〇、12〇、15〇、18〇 和 27〇 分 鐘發見’’二剷處理後之靈芝細碎懸浮液，其粒徑雖可小於 14 1377065 101.6.19 申請案號第98111670號替換本 300 μπι，但絕大部分仍大於15〇 μιη，因此，欲將靈芝子實 體奈米/次微米化需採用階段性研磨，亦即先以0.8 mm纪錯 珠細磨，待粒徑降至約5〇 μιη以下，再改以〇 3 mm釔锆珠 繼續研磨。 如圖2所示，研磨時間亦影響粒徑，隨著研磨時間的 增加，體積平均粒徑減少，於研磨6〇分鐘，體積平均粒徑 之減少速率較高，隨後趨缓，研磨9〇分鐘後，靈芝微粒之 體積平均粒徑約為1.2 μπι。繼之改以〇3 mm锆珠研磨9〇 分鐘後’則體積平均粒徑小力i 〇㈣。因所得懸浮液之粒 徑分佈範圍較寬，故粒子間易再聚集而沉澱，雖然數目平 均粒徑比體積平均粒徑小很多，但為求更佳的品質，本發 明是以體積平均粒徑為指標。 由圖3、4所示之粒徑分析結果可知，將上述以〇3爪爪 釔鍅珠研磨180分鐘所得靈芝子實體懸浮液以i〇〇〇〇g離心 1〇分鐘，除去較大之顆粒後，離心上清液之粒徑分佈範圍 為28〜578 nm (圖3)，體積平均粒徑約1〇5nm，其中67% 的粒子小於100 nm，就食品而言，小於i _應足可增加其 於禮内的吸收’離心上清液之粒子皆小於i μπι，其固形物 含量雖較低，但因研磨而被萃提出之活性成分則皆仍存留 下來。而離心沉降物之顆粒尺寸小於1〇 μιη (圖4)，質地 細緻，可作為保養品（如面膜）或敷料、人工皮膚之基材 ’且因富含幾Τ質及纖維素’所以可作為_良好的腾食纖 維添加物。 如圖5所示’顯微觀察研磨後之靈芝微粒，新鮮靈芝 15 1377065 申請案號第98111670號替換本 丨01619 子實體經blender授打後，以掃描式電子顯微鏡（se⑷觀 察’由圖5B中清楚可見靈芝子實體之樹狀分枝骨骼菌絲。 經適當均質處理後’該骨絡菌絲變的更為細碎、鬆散（如 圖5C所示），且其大小約在數十至數百微米，而此一狀態 將有利於後續之研磨處理。圖5D為經兩段式研磨後，利用 穿透式電子顯微鏡（TEM)㈣之結果，圖中圓形顆粒為 靈芝子實體懸浮液中的奈米粒子，由seale ^可明顯的看 到’單-顆粒確可達（M _以下之奈米級尺度，但因顆粒 間的再聚集使整體之粒徑範圍變大，可達數百奈米，即為 次微米級尺度。此-結果亦驗證了上餘好析儀所測得 之結果’並再次確認本發明使用之介質研磨製程，確實可 使靈芝子實體研磨後之靈芝微粒降至奈米/次微米尺产。 由於靈芝子實體富含纖維素及幾丁質，質地粗糙且堅 勒’將這些纖維物質的粒徑下降，除提高比表面積外，亦 可改善產品進食之口感。齡纖維之生理功效肖其 吸附作用有關，因此，提高膳食纖維之比表面積，;增進 其生理活性。將膳食纖維之粒徑由〇1 mm下降至丨pm，曰比 表面積可提高⑽#，膳食纖維之建議攝取量則可減為原 ，議量的百分之一，若粒徑下降至1〇〇⑽以下，建議攝取 量則可減至原建議量的千分之_。換言之，於5⑼扯之飲 用水中加入50〜500 ppm之奈米/次微米級腾食纖維，即可 達到腊食纖维之每日建議攝取量（25g)。基於這個觀點， 靈芝子實體懸浮液之離心上清液不但保有靈芝特有的生理 /舌f生成为，更額外提供高表面積之膳食纖维。 16 1377065 * 申請案號第981Π670號替換本 101.6.19 * (二）研磨製程與有效成分之關係 如表2所示，經介質研磨後，β-葡聚糖的含量明顯増加 ，以較大研磨介質（粒徑0.8 mm)進行研磨，產品中的β-. 葡聚糖含量與熱水萃取產品（約0.01 mg/mL)相近，隨著 介質粒徑的降低及研磨時間的增加，β-葡聚糖含量增加為熱 水萃取產品的4倍’且高於市面上所收集到的商品（〇,〇〇23 ~ 0.0202 mg/mL )。 表2 測試樣品 β-葡聚糖含量（mg/mL) (β-l ,3-D-gIucan ) 熱水萃取 0.010 + 0.0 ' 0.8 mm記錯味研磨 0.0096±0.0004 ~ 0.3 mm纪錯珠研磨 0.0398+0.0003 Green (Amazon Biotechnolosy Co.，Ltd) 0.0023 土 0.0001 Ex (Syngen Biotech Co·，Ltd) 0.01+0.0001 Gene (Genefrem Biotechnology Co., Ltd) 0.02±0.0001 Natsuki (Hill-Top Food Co., Ltd) 0.0079+0.0001 Join-Yes (Join-Yes International Co., Ltd) 0.0025+0.0 ~~~~ 各樣品皆進行三次取樣測試’：=次平均值+SD " ~~ 一般的市售商品’其聲稱之有效成分多以熱水或有機 溶劑來提取’雖可取得該有效成分，但提取量有限，且尚 有加工後之廢水、有機溶劑及殘渣處理問題。以機械式研 磨的製程方式，不但可使靈芝子實體懸浮液中具有纖維素 、幾丁質等腾食纖維，亦可藉由細磨過程中靈芝子實體細 胞壁的破碎，促使有效成份的釋出。 如表3 .所示，幾丁質含量亦有類似的現象，以ο」爪以 介質研磨所得之產品中幾丁質含量高☆ 〇8 mm介質研磨所 獲得的產品，但若以離心方式將所得產品中之較大的顆粒 移除後，上清液之幾丁質含量則大幅下降，但仍約為一般 17 1377065 101.6.19 申請案號苐98111670號替換本 熱水卒取所得產品的5肖，可見該被移除之顆粒含有豐富 的幾丁質。由於熱水提取幾乎只可抽得水溶性物質，故其 提取液中之幾丁質含量甚低，絕大部分都殘存在藥潰中。 樂凌約含有35〜4G%幾丁質’ 4G〜5G%p_葡聚糖，其餘為以 黑色素（_anines)為主之含氮物’為良好的膳食纖維來 源’如將子實體粉碎並細磨至奈米/次微米尺寸，不僅可取 代萃取，產品令亦將保存子實體的所有成分（富含幾丁質 有助於人體的吸收， 、纖維素等膳食纖維），且因粒子小 所以此奈求/次微求級靈芝子實體懸浮液或其濃縮產品將適 於作為保健食品之添加物。 表3 測試樣品 熱水萃取 機械式研磨 4 丁質濃度（mg/mL) 0 05+0.0018 〇 · 8紀錯珠研磨 1.14+0.0116 一 0.3記錯珠研磨 1 -98+0.01 43 _〇.3釔锆珠研磨德之離心上清& 0-25 + 0.001 8 離心上清液··丨〇〇〇〇g，1 〇分鐘 各樣*皆進行=次取樣測試，=次平珀佶+SD 1 (三）靈芝子實體懸浮液之穩定性 如圖6〜8所示，靈芝子實體經研磨後，高濃度的靈芝 微粒及寬廣的粒徑分佈，促使靈芝微粒間相互碰撞並迅速 聚集成較大之微粒團簇，粒徑的增加致使重力效應遠大於 布朗運動效應，進而產生明顯的沉降現象。於下靜置 24小時後分析其粒徑，微粒已聚集並形成數十微米之團簇 ，體積平均粒徑增至9·35 μηι (如圖6所示），考量研磨產品於 後續加工，如冷凍貯藏、冷凍乾燥或高溫滅菌加工等之安 定性，針對冷凍（-2(TC，24小時）及高壓蒸汽滅菌（ 18 1377065 ' 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 . 121°C，15分鐘）後之子實體懸浮液進行粒徑分析，以探討 加工前後之粒徑分佈差異》 靈芝子實體懸浮液之靈芝微粒於冷凍過程中會再聚集 ，解凍後似有離水之相分離現象，聚集形成的微粒團簇呈 棉絮狀並難以物理或機械力（如震盪、均質、超音波震盪 處理）將之分散，冷凍後子實體懸浮液之粒徑分佈如圖7 ，體積平均粒徑為1〇9 pm。高壓蒸汽滅菌處理亦會造成微 粒間嚴重的再聚集作用，形成呈團塊狀之微粒團簇，並如 同冷凍處理般難以物理或機械力將之分散，其粒徑分佈範 圍5.9〜824.5 μιη，體積平均粒徑為132 μηι (如圖8所示機 . 械式研磨所得之靈芝子實體懸浮液，粒徑分佈範圍寬廣， 易再聚集沉澱，但固形物含量高，富含幾丁質、纖維素， 此靈芝子實體懸浮液或其濃縮產品將適於作為保健食品之 添加物。 (四）靈芝子實髅懸浮液之離心上清液的穩定性 如表4所示，研磨時間的改變，除了會影響靈芝微粒 平均粒徑外，也間接影響儲存安定性，研磨時間越長者， 產。。的穩定性越高。研磨3〇分鐘之靈芝子實體懸浮液的離 心上清液產品（1000〇g離心10分鐘），經21天的儲存體積 平均粒徑由〇. 195增加為丨丨99 μηι，但研磨180分鐘之靈芝 子實體懸浮液的上清液產品（1〇〇〇〇g離心1〇分鐘），體積 平均粒杈由〇. 126增為〇〖37 μηΊ，增加率低於丨〇%，顯示增 加研磨時間有助於粒子的穩定性。 19 1377065 申請案號第98111670珑替換本 101.6.19 表4___ 餘存時間（天） —趙積平均粒徑（“m) It量平均粒5徑（/^)2丨· Λ ^ ^ )__( volume mean diameter) ( nnmK〇. a：____ ， 30 0.195 0.610 1.199 v uum〇( 0.103 ϊγ mean aia 0.127 meter ) 0 131 60 0.158 0.236 0.341 0.079 0.107 0 090 90 0.151 0.173 0.202 0.078 0.070 0 092 120 0.149 0.149 0.153 0.090 0.073 0 078 150 0.139 0.143 0.138 0.071 0.056 0 070 180 CXL 0 Λ η/ 0.126 0.133 0.137 0.066 0.068 0.064 研磨30〜90分鐘：以0.8 mm記錯珠進行之第一階段研磨結果。 ，研磨120~18〇分鐘：以0.3 mm釔锆珠進行之笛二階段研磨結罢。 接著，就凍乾、高壓蒸汽滅菌及濃縮處理對靈芝子實 體懸浮液之離心上清液的影響做一探討。 如圖9所示’先將靈芝上清液經凍乾後，再分散於水 溶液中’並以Nanotrac 150粒徑分析儀測定粒徑分佈（粒 禮1測上限為6.54 μιη )，由結果可知，康乾處理會促使靈 芝微粒間再聚集。凍乾後，粒徑分佈範圍寬廣，有相當比 例微粒之粒徑大於6.54 μηι (礙於儀器量測上限而無法測得 )，其體積平均粒徑為1.177 μιη。 如圖10a所示，離心上清液經高壓蒸汽滅菌處理後仍保 有相當好的安定性，滅菌處理後，待溫度下降至室溫即量 測其粒徑’所有粒子皆小於1 μηι，粒徑分佈範圍36〜8〇〇 nm’體積平均粒徑為140 nm’且仍有56%的微粒維持在 100 nrn以下。觀察其於室溫下貯存28天（如圖i〇b所示） 及1年（如圖10c所示）之粒徑變化，粒徑分佈雖有往大粒 徑偏移，但偏移幅度甚小，而其體積平均粒徑亦只分別辦 至165 nm和373 nm，顯示離心上清液經高溫作用後仍十分 20 1377065 101.6.19 申請案號第98111670號替換本 穩定’粒子於貯存期間之再聚集現象並不顯著。 藉由離心雖可將離心上清液之粒徑分佈降至1 μηι以下 ’並使其具有較佳之穩定性，但相對的，離心上清液之固 形物含量及靈芝微粒數則大幅減少。為提高固形物濃度， 以減壓濃缩方式降低離心上清液之水分含量，並於不同濃 縮倍率（concentration ratio)下取樣，量測其粒徑變化。濃 縮倍率之計算是以原液體積除上最終濃縮液體積。圖u與 表5為離心上清液經2、4 ' 8、12及2〇倍濃縮後之粒徑分 析結果，低於4倍濃縮之離心上清液，其粒徑變化不大， 體積平均粒徑只增加33%，且微粒皆小於i μηι。濃縮8倍 以上時，粒子間開始有聚集現象產生，並使粒徑分佈往大 粒徑偏移’粒徑分佈大於i μιηβ就本實施例而言，為提高 產品固形物濃度並兼顧安定性，將離心上清液濃縮“倍 應可符合所需。 上清液濃縮倍率 (濃度） 0 [3.4 mg/mL) 2 (6,8 mg/mL) 4 (13.6 mg/mL) 體積平均粒徑 (U m)

0.140 表5 粒徑分布範圍 (// m) 0.03-0.578 0.036 〜0.750 0.030 〜0.972 粒徑小於 m之微粒含晉（％、 100

100 100 (27.2 mg/mL) 12 (40.8 mg/mL) 20 (68.0 mg/mL) 0.351 0-033-2.120 95 1.922 1.880 〇· 111 〜6.54 〇_ 8 5 9〜6 · 5 4 61 ~ 1~ -----__ 0 1(五）乳化劑對靈芝子實體懸浮液穩定性之影響 濁度是-量測簡易之物理參數，對穩定分散之懸浮溶 液而言，其濁度不應隨時間而呈現顯著差異。因此 21 1377065 101.6.19 申請案號第98111670號替換本 Μ篩選較佳 明針對所欲探討的各種變因，進行濁度分析， 的乳化劑。 如表6所示，未添加乳化劑之靈芝子實體經研磨後， 靈芝子實體懸浮液濁度高於職麵，稀釋Η磨麦 5〇倍後之試樣的濁度均隨時間而逐漸下降，稀釋 ，濁度之變化率愈小。低濃度（高稀釋倍率）懸浮液之濁= 定性較U度（⑽釋倍率）佳，⑽餘濃度是料縣^液 穩定性的重要參數，濃度愈高微粒間碰撞機率愈高 現^也相5明顯。整體而言，微粒間的聚集相當明顯，致 使靈之子實體懸浮液的聚集沉降行為明顯。

表6 於本發明令，選擇以不同HLB(hydr〇phileiip〇phiie bal e親水親脂均衡）之嚴糖醋（叫肛ester，HLB分別 為3、7、il和15)、聚山梨醇酐脂肪酸酯（Span 85、8〇、 6〇、2〇 和 Tween 65、20，HLB 分別為 1>8、4.3、6 7、8 6 寿16·7 )及脂肪酸甘油脂（HLB為3.8)作為初步篩 22 1377065 ' 申請索號苐兕〗丨1670號替換本 1〇ι.6.19 選的乳化劍， 添加量先固定為相對於靈芝子實體重量之5 % ^ 2 M所7^ ’分别為$芝子實體懸浮液稀釋倍率5 210倍和5G倍下，濁度變化率隨時間之_。濁度變化 李為負值表示濁度下降’正值則表示上升。除了少數的正 值外，幾乎所有試驗的濁度變化趨勢均為下降。 整體而S，稀釋倍率愈高，微粒間碰撞機率降低，聚 集作用減緩，濁度隨時間的變化率趨緩，各稀釋倍率的濁 度均隨時間的增加而下降。 在最高稀釋倍率50的情況下(靈芝微粒濃度約議卿 (0.001 mg/mL))，濁度變化率最小，且以聚山梨醇針脂肪 酸醋類乳化劑的穩定性較佳，於96小時後濁度變化率絕對 值均小於3G %。於低稀釋倍率（5倍及1()倍）下，濁度變 化率與乳化劑種類、HLB值似無關聯性，％小時後濁度： 化率絕對值均大於80 % ’即無顯著穩定效果。 >因此，如以濁度作為判斷基準’就靈芝子實體懸浮液 而呂，以5 %添加量之聚山梨醇酐脂肪酸酯作為分散劑，對 濃度100 PPm (最高稀釋倍率50倍）之靈芝子實體懸浮液 有較佳的穩定性。 由表7之粒徑（靈芝微粒濃度為1〇〇 ppm)分析結果可 知’未添加乳化劑之靈芝子實體懸浮液經靜置存放96小時 後，靈芝微粒再聚集後的體積平均粒徑（MV)為3 24 pm ’其中’粒徑小於1 的微粒（奈米/次微米級）佔靈芝子 實體總質量的24.9%，粒徑屬奈米尺度（小於10〇 nm)者 23 13/7065 101.6.19 申請索號第98111670號替換本 二佔靈芝子貫體總質量的2〇4%。於研磨時 時’添加脂肪竣甘油脂—及…者之趙積千: 粒，幅度較小，分別變為一.9。、— = 提同界面電位值將有助於微粒之穩定性，靈芝子實體懸 浮液未添加乳化劑之界面電位值約_117 _，本實施例所^ 用乳化劑中，^Span 85、Span 8〇及—2〇對於微粒界面_ 電位的增加較為顯著，界面電位值分別為-16_7、_13.8及 13.7 mV。 综合上述濁度分析 '粒徑分析和介面電位分析結果， 於乳化劑添加量5%的情況下，HLB值小的乳化劑有助於穩 定靈芝子實體懸浮液系統，因此，選擇蔗糖酯（HLb 3 )、 脂肪酸甘油脂（HLB 3.8)、Span 85 (HLB ι8)及 span 80 (HLB 4 _ 3 )等，進行乳化劑添加量對靈芝子實體懸浮液系 統穩定性影響之測試。 24 1377065 申請索號第98111670號替換本 101.6.19 ---1 測試樣品 ~ 7 pH 介面電位 (mV、 體積平均粒徑 (Um) 數量平均粒徑 無添加乳化剤 靈芝子實體懸浮液 5.69 (JW m) -11.7 3.24 0 124 靈芝子實體上清液 5.47 -20.0 0.100 〇 有添加乳化剤 蔗糖酯（HLB 3) 5.64 -U.5 10.1 0 107 蔗糖酯（HLB 7) 5.66 -12.1 20.7 Λ 1 rn 蔗糖酯（HLB 11) 5.65 -10.4 21.9 0.101 蔗糖酯（HLB 15) 5.63 --二_ •10.3 14.8 Π 1 ΓΠ 脂肪酸甘油脂（HLB 3.8) 5.70 -10.7 3.86 ν . 1 V ^ 0.107 Span 85 (HLB 1.8) 5.67 -1 6.7 2.90 0 119 Span 80 (HLB 4.3) 5.63 -13.8 3.68 Π 1 ΠΟ Span 60 (HLB 6.7) 5.68 -10.9 6.52 0 114 Span 20 (HLB 8.6) 5.65 Γ -13.7 8.41 Π 1 1 1 Tween 65(HLB 10.6) 5.62 -8.8 23.3 〇 ι Λ? Tween 20(HLB 16.7) 5.64 -11.3 55.4 Λ 1 Λ 1 ν · 1 V/ 1 如表8、9所示，靈芝子實體懸浮液於不同乳化劑添加 量（相對於靈芝子實體重量之5%、1〇% 、2〇%和5〇%)時 之粒徑分析、界面電位量測結杲。由粒徑分佈結果可知， 四種乳化劑中以Span 80之穩定效果較佳，其添加量1〇%時 ，可將微粒之體積平均粒徑降至2·29 μηι，並提高奈米和次 微米粒子所佔的比例。觀察界面電位之變化情形可發現， 提高四種乳化劑的添加量皆可增加靈芝子實體懸浮液之界 面電位值，但高於20%則穩定效果有限β 25 1377065 申請案號第981U670號替換本 101.6.19 表8 乳化劑種類 乳化劑 添加量（％) 體積平均 粒徑（μπι) 數量平均 粒徑（μπι) 奈米粒子 含量（wt%) 奈米/次微 米粒子含量 (wt%) 無乳化劑 0 3.43±0·23 0.121 2.04 24.9 蔗糖酯（HLB 3) 5 10·5±0·16 0.106 1.99 12.6 脂肪酸甘油脂 (HLB 3.8) 5 3·91±0·05 0.107 2.73 17.2 10 5.94±0.36 0.116 2.85 26.3 20 9.06±0.56 0.102 2.91 15.6 Span 85 (HLB 1.8) _5 2.95±0·06 0.111 2.61 20.1 !〇_ 2·55±0·07 0.139 1.66 33.7 20 2.48±0·07 0.172 0.67 29.4 Span 80 (HLB 4.3) _5 3.78 + 0.14 0.108 3.11 21.8 10 2.29±(Μ4 0.126 3.03 40.6 20 3.51±0·11 0.138 1.93 34.3 表9 乳化劑種類 界面電位（zeta potential) 5% 10% 20% 50% 蔗糖酯（HLB 3) 11.5±1·0 -12.9±0.2 -14.2±0.8 脂肪酸甘油脂 (HLB 3.8) -10·7±0·4 -13·8±0.3 16·6±1.1 • Span 85(HLB 1,8、 -15·7±0.9 -1 6.3±0·6 -21.2+0.8 -2 5.3 + 1 7 Span 80(HLB 4.3> -13·8±0·5 -14.1+0.4 -24.2±1·0 -24.7±Γ(Γ 在28天亞急毒性試驗期間，雄、雌性小鼠對照組及處 理組之平均每日體重變化、平均每曰食物消耗量與平均每 ’雄、雌性小鼠處理組和對照組 其檢測值皆在正常值範圍内，主 曰水消耗量皆無顯著差異 血液分析亦無明顯差異， 要器官之組織切片檢查亦正常，所以在試驗期間並未造成 死亡現象以及引發不良臨床徵兆。 ’不觀上述’靈之子實體含有大量粗纖维及木質素成分 ，且-般真菌細胞壁的成分除了纖維素外尚有幾丁二 =多黯等活性成分亦多存在於細胞壁中，本發明透過機 械式研磨來製造靈芝子實體懸浮液的方式，除了無須萃取 26 1377065 申請索號第98111670號替換本 丨01.6.19 即可獲得完整的活性成分外，還可大幅提高纖維質比表面 積，且纖維質之後續利用無須再粉碎，可作為一良好的腾 食纖維添加物。其中，研磨所得之靈芝子實體懸浮液雜 後續離心處理後，離心沉降物中富含幾丁質及纖維素，其 顆粒尺寸小於Η) μιη，質地細緻，可作為保養品（如面膜） 或敷料、人工皮膚之基材，而離心上清液中，靈芝微粒粒 徑皆屬奈米/次微米級，並保有完整之活性成份其幾丁質 等有效成分為傳統熱水萃取之5倍以上，且含有部分粒徑 較小之纖維素，同樣可用以作為保健食品之添加物，故媒 實能達成本發明之目的。 惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不 能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利 範圍及發明說明内容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍 屬本發明專利涵蓋之範圍内。 【圖式簡單說明】 圖1是體積平均粒徑相對研磨轉速與進料濃度之曲線 圖； 圖2是研磨時間相對粒徑之曲線圖； 圖3是靈芝子實體懸浮液之離心上清液的粒徑分布圖 圖4是靈芝子實體懸浮液之離心沉澱物的粒徑分布圖 圖5是靈芝子實體之影像圖；說明靈芝子實體自尚未 研磨至經過機械式研磨後之粒徑變化； 27 1377065 t 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 圖6是靈芝子實體懸浮液經4。(：儲存後之粒徑分布圖； 圖7是靈芝子實體懸浮液經過冷凍乾燥後之粒徑分布 圖， 圖8是靈芝子實體懸浮液經過高壓蒸氣滅菌後之粒經 分布圖； 圖9疋靈芝子實體懸浮液之離心上清液經冷陳處理後 的粒徑分布圖； 圖10是靈芝子實體懸浮液之離心上清液經高壓蒸氣滅 鹵後之不同儲存時間的粒徑分布圖； 圖11疋靈芝子實體懸浮液之離心上清液經不同倍數之 濃縮後的粒徑分布圖； 圖12是靈芝子實體與乳化劑一起機械式研磨製成之靈 芝子實體懸浮液的濁度變化曲線圖； 圖13是靈芝子實體與乳化劑一起機械式研磨製成之靈 芝子實體懸浮液的濁度變化曲線圖；及 圖14是靈芝子實體與乳化劑一起機械式研磨製成之靈 芝子實體懸浮液的濁度變化曲線圖。 28 1377065 • 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 • 【主要元件符號說明】 無 29

Claims (1)

1377065 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 七、申請專利範圍： pv月1%修正替換頁公告本 1. 一種靈芝子實體懸浮液，為靈芝子實體與可食性乳化劑 一起經由機械式研磨後所得到含有靈芝微粒之靈芝子實 體懸浮液，並含有纖維質、幾丁質，及β-葡聚糖，且靈 芝微粒之體積平均粒徑小於1 〇 μπι，該可食性乳化劑是 span 80，且該可食性乳化劑含量是靈芝子實體重量的 10%。 30 1377065 申請案號第98111670號替換本 101.6.19 四、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：圖（3)。 (二） 本代表圖之元件符號簡單說明： 無 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：