TWI363761B

TWI363761B - Modified peptide of human acidic fibroblast growth factor

Info

Publication number: TWI363761B
Application number: TW098119510A
Authority: TW
Inventors: Henrich Cheng; Wen Chun Kuo
Original assignee: Eu Sol Biotech Co Ltd
Priority date: 2008-06-10
Filing date: 2009-06-10
Publication date: 2012-05-11
Also published as: US20090305988A1; TW201006845A; US7956033B2

Description

1363761 苐098119510號發明專利申請案修正後無釗線之全份說明書替換本(1〇〇年 π月15曰）發明說明【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種酸性纖維母細胞生長因子之改質肽，其具有較佳的穩定性。【先前技術】酉文性纖維母細胞生長因子(acidic fjbroblast growth factor， aFGJ〇 ’其係為最初由活體組織中，包含腦及海馬迴，所分離之單鏈蛋白質，能夠在體外影響許多細胞種類之生長及分化。 aFGF係為肝素(heparin>依賴性之細胞分裂劑(mit〇gen)，且能與目前已知的四種生長因子受體及其剪接型態牢固地結合。此蛋白質可被定位在與運動及知覺功能相關之特定神經子集 &，且可自成人大起中分離。分離之係為一種神經母細胞之細胞分裂劑’並促使神經軸突自脊椎神經延長。人類aFGF之天然肽係自人類大腦中分離，包含有154個胺基酸。然而，天然之人類aFGF多肽胺基末端19個胺基酸已被鑑定為與人類介白質-l(Interlukin-l，IL-1)同源。人類aFGF 與IL-1相似之多肽區位可能會造成自發性免疫反應，包括巨嗤細胞的活化及造成細胞生長停滞(G. Venkataraman ei α/., 伙从96:3658-63, 1999)。此外，促發炎細胞激素IL-1及 FGF-l(aFGF)/FGF-2(bFGF)因具有相同的結構支架(scaff〇id)，將會相互競爭絡胺酸激酶(tyrosine kinase)區位上相同之受體結合區域(A. J. Minter et al.，J. Cell Physil., 167:229-37, 1996)。【發明内容】本發明係提供一種人類酸性纖維母細胞生長因子之改質肽，命名為aFGF135，包含一天然之人類aFGF，其係為自該天然之人類aFGF胺基末端(N-terminal)刪除20個胺基酸，並增加一個丙胺酸於縮短之人類aFGF之前。特定而言，aFGF 多肽包含如序列編號1之胺基酸序列，其具有相當高之穩定性 1363761 第098丨丨9510號發明專利申請案修正後無劃線之全份說明書替換本(100年11月丨5曰）且車父已知的aFGF多狀好。本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含本發明之 aFGF多肽以及醫藥上可接受之載體。【實施方式】本發明係提供一種人類酸性纖維母細胞生長因子之改質肽，命名為aFGF135，包含一天然之人類aFGF，其係為自該天然之人類aFGF胺基末端刪除20個胺基酸，並增加一個丙胺酸於縮短之人類aFGF之前。特定而言，aFGF多肽包含如序列編號1之胺基酸序列。出乎預期地，改質之aFGFi35多肽在體溫下具有相當高地穩定性，且具有於其它已知的aFGF 不同之立體結構。 >根據本發明，具有如序列編號1之aFGF135多肽有相當高地穩定性。與天然之人類aFGF相比，aFGF135多肽自天然之人類aFGF胺基末端刪除20個胺基酸（稱為「縮短之 aFGF」）’並在已刪除2〇個胺基酸之aFGF前增加一個丙胺酸。根據本發明，因為人類aFGF與人類辽^之前19個胺基酸已被鑑定為同源’為了避免藉由共同的路徑產生類辽^丨之反應，該20個胺基酸係由天然之人類aFGF中刪除。令人意外的是， aFGF夕肽在生理體溫下，較目前已知的，包括天然之 aFGF，有較佳的穩定度。如本發明之一具體實施例所示， aFGF135多肽在體溫下(例如約yc)培養至少48個小時後，仍保有正確的折疊而無任何降解的產生(如第二A圖所示）。在本發明之另一具體實施例中，aFGF135多肽在自我加速分解溫，了(例如約54。〇培養一小時後(如第二3圖所示），仍保有其凡整的結構。由此可證，aFGF135多肽相較於已知的aFGF，例如具有140個胺基酸及127個胺基酸之人類aFGF，有較佳的穩定度。，為了顯示aFGF 135多肽與已知的aFGF之差異性，利用核磁共振圖躇計算aFGF135多肽在三維空間中的正確結構，並 4 1363761 。 • * 第098119510號發明專利申請案修正後無劃線之全份說明書替換本(丨⑽年丨丨月丨5曰） ^ 將其與已知的aFGF做比較。在與 Bemett MJ ei α/，（尸⑺纪/财，57(3):626-34, 2004)所公開之具有140個胺基酸之人類aFGF(蛋白質資料庫(PDB)編碼為 1RG8)，及與 Lozano (Biochemistry, 2;39(17):4982-93 ·· 2000)所公開之具有127個胺基酸之人類aFGF(蛋白質資料庫 . (PDB)編碼為1DZD)相比下’ aFGF135多肽具有不同的結構特徵’包括碳基末端及胺基末端的裸露以及左下角一個顯著的結 ^ 合環(looP) ’如第五A圖所示。可推測因為aFGF135多肽具有改質的序列（包含刪除20個胺基酸及增加一個丙胺酸），造成與其它已知重組或天然aFGF相比有更穩定的結構。在本發明的一個具體實施例中，如第三圖所示，針對穩定性進行與降解有關之比較’商業上購得之重組aFGF(Pr〇rnega公司)在54。〇培養一小時後在西方墨點試驗中產生出降解的條帶，而 aFGF135則相對地穩定。本發明進一步提供一醫藥組合物，其包含本發明之aFGF 多肽以及醫藥上可接受之載體。本發明之醫藥組合物可由傳統上習知之方法與—種或— 種以上之醫藥上可接受之載體製備。術語「醫藥上可接受之载體」在本文中意指包含任何標準的醫藥上可接受之

載體包含，但不限於：食鹽水、緩衝食鹽水、葡油、乙醇或上述之組合物。 P甘。較佳本發明之醫藥組合物可以選擇任何適合的形式為直接塗覆在手術部位。一、

本發明進一步由下列實施例說明，但豆非限制。目的僅作為例示而只％例1 . aFGF135多肽之克隆(ci〇ning) ratories, Inc. 一性引子序人類全長aFGF多肽係為購自於Cbntech Lab〇之快速克隆eDNA之產^。在建獅，設計兩個列如下： 5 1363761 第098119510號發明專利申請案修正後無劃線之全份說明書替換本(丨00年丨丨月丨5曰）序列編號2: 55 - ACTGL^ATTC ATGGCTG AAGGGG AA ATCA-3，序列編號3: 5 j-aaga!agcttcaatcagaagagactggcagg-3 5 在序列編號2中具有一個EcoR I限制酶切割位置(其標示為）’而在序列編號3中具有一個HindIII限制酶切割位置(其標示為τ)。將全長序列之產品利用上述引子進行聚合酶連鎖反應(PCR)可得到485個鹼基對之PCR產物。將cDNA產物以 EcoRI及Hind III限制酶切割之後’其切割片段插入具有相同切割位之pUC18載體令，經DNA定序分析後，得到含正確序列的重組質體pUC-haFGF。根據pUC-haFGF之模版’兩段專一性引子設計如下：序列編號4: 5 ’ -GGCAtTAT GGCTAATTACAAGAAGCCC-3，序列編號5: 5 ’-AAGAtGATCTCTTTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3，在序列編號4中具有一個Ned I限制酶切割位置(其標示為）’而在序列編號5中具有一個Bglll限制酶切割位置(其標示為v)。由序列編號4及序列編號5放大之cdNA長度係為較全長縮短57個鹼基對。aFGF135多肽僅有135個胺基酸，並保留了 aFGF主要功能區域。此外，在胺基末端之第二個胺基酸-甘胺酸(G)係被變更為丙胺酸。如序列編號1所示： △NYKKPKLLY。自 pUC-haFGF 放大之 cDNA 片段與 Ned I 及邮11限制酶反應後’另外利用Nde I與BamH I限制酶作用一表達空載體pET3c(購自Novagen)，最後將cDNA切割片段插入具有相同切割位之pET3c載體中。pET3c-haFGF因此而被建構。 6 1363761第 0981195丨0號發明專利申請案修正後無劃線之全份說明書替換本(丨〇〇年丨丨月丨5日）實施例2 :表現並純化aFGF135多肽在放大pET3c-haFGF之後，利用勝任細胞(competent cell)BL21(DE3)(Novagen,德國)將載體轉化為DNA。在加入最終濃度為lmMIPTG(異丙基β-D-卜硫代半乳糖苷)培養前’培養抗胺苄青黴素(ampicillin)之E. coli菌落並在LB培養液中放大至OD6()()到達0.3。在培養16個小時(土兩個小時)後，蒐集細菌並以27,000xg離心以去除上清液。蒐集到的細菌以 PBS沖洗兩次’接著以高壓均質機(Niro Soavi型號NS2006L， Daken Stainless Products Ltd” UK)打破。打破之樣本以 0.22 μπι

孔徑之篩過濾並用於蛋白質之純化。

人類aFGF135多肽以色層分析法分離，如以下之步驟： (1)陽離子交換層析法(CMFF管柱，RM197，購自GE Healthcare Bio-Sciences USA Corp.); (2)親和層析法，其係對肝素(heparin)專一(Heparin FF 管柱，RM 244,購自 GE Healthcare Bio-Sciences USA Corp.); (3)大小排阻層析法(Superdex 75 pre-grade 管柱 ’ RM245 ’ 講自 GE Healthcare Bio-Sciences USA Corp.)。上述管柱的緩衝液為墙酸鹽溶液(Na2P〇4:NaHP〇4 = 51:49 ’ 0.1 % EDTA-Na ’ pH6.8-7.2)。最後所得之產物即為本發明之aFGF135多肽。aFGF135多肽的分子量由LC-MSMS方法鑑定為15281 Da。實施例3 : aFGF135多肽之穩定性試驗 (1)西方墨點法純化之多肽加入4-20或10-20%之斜率凝膠(gradientgel) 中進行聚丙烯酿胺膠體電泳’接著以電泳轉印機(p〇lybl〇t Transfer System, Model SBD-1000； American Bionetics, Emeryville, CA)轉印至硝纖維膜上(0.05 Am; Schldcto & Schuell，Inc.，Keene，NH)。為了檢測aFGF多肽之穩定性，製備 Laemmli 緩衝液(2.4 ml 1 M Tris PH 6.8，0.8 g SDS:基液， 100%甘油，0.01%溴酚藍’ 0.02%丨ml p·巯乙醇(電泳等級）， 7 、0981丨9510號發明專利申請案修正後無劃線之全份說明書替換本(丨〇〇年丨丨月丨5曰）以及2.8 ml水)含有或不含8Μ尿素(用於打開潛在之聚結體）作為焦集膠體(stacking gel)緩衝液’其中包含0.0625 μ三經曱基氨基曱烧(Tris-base)，1%SDS基液以及15福二硫蘇糖醇 (dithiothreitol)。樣本置於室溫1小時後，再置於4。〇隔夜。進行聚丙烯醯胺膠體電泳前將樣本煮沸。

在以含有3°/〇奶粉之TBS轉移及阻斷非專一性蛋白質結合位置後’硝纖維膜與以沖洗緩衝液(lOmjytTris-HCl，pH 8.0 ’ 0·15 M NaCn’ 0.05% Tween-20)適當稀釋之不同抗體(aFQF 抗體以1:500稀釋’講自R&D System, Inc.)在4°C下反應隔夜。使用適當之二級抗體來與抗原-抗體組合物反應使其顯影，並將其培養於 ProtoBlot Western Blot AP 系統中(promega, Madison, WI)。 (2)降解測試完整之aFGF多肽分別培養於37°C及54〇C下，其中54t：為自我加速分解溫度。接著，將樣本進行西方墨點法分析。培養於37 C下之樣本之結果如第二A圖所示，其中道1至道3 分別為培養6小時、24小時及48小時後之結果，道4為生物標誌且每個條帶上之數字為其所代表之分子量。aFGF135多肽在54 C下培養120分鐘(2小時)間之結果如第二B圖所示;其中道1至道3分別為培養1〇分鐘、6〇分鐘及12〇分鐘之結果，道4為生物標誌且每個條帶上之數字為其所代表之分子量。如第二A圖所示，aFGF135多肽在體溫下(約37。〇能保持完整之結構至少48小時。這表示aFGF135多肽提供較長時間之神經保護效果，以及較佳之穩定性。如第二B圖所示，aFGF135多肽在54t：下能保持完整之結，至少1小時。當培養於54它下2小時後，aFGF135多肽會完全降解而不會轉化為其他結構，該結構可能造成具有不可預期之副作用。因此，aFGF多肽提供安全的儲存及運輸。 f相同的實驗條件下，同時使用一商業上購得之重組 aFGF( PromegaaFGp，購自 pr〇megaC〇rp〇rati〇n)進行穩定性 1363761 • · 第0981丨9510號發明專利申請案修正後無薊線之全份說明書替換本(丨〇〇年11月丨5曰） « 測試:如第三圖所示，promegaaFGF條帶中具有黑色箭頭所指之第二條帶;相反地，aFGF135多肽則維持原來結構而無任何降解。同時，當加入樣本於微盤中時，Pr〇megaaFGF產生白色>儿殿物而aFGF135多肽則保持澄清。此結果證明aFGFl35 ·· 多肽比起商業上之aFGF有較佳之穩定性。 • ·- 貫施例4 : 15N-核磁共振結構特徵 " 核磁共振光譜是最近用來確定生物上大分子，如蚕白暂或核酸’絲子贿度下之結構的如工委 U 核磁共振核心（中央研究院，台灣)針對aFGF135多肽鑑定苴έ士 W 構特徵。八'° 簡而言之’光譜係在298 K下以BrukerAVANCE 600紀錄。碳基末端及胺基末端之化學位移係以TALOS軟體得到骨架扭轉角(torsion angles)。骨架之循序共振判定

(sequence-specific resonance assignments)係藉由 HNCO、 HN(CA)C0、HACNCB、CBCA(CO)NH、HNCA 及 HN(CO)CA 試驗’側鏈判定(side-chain assignments)係藉由 l5N-TOCSY-HSQC 及]3C-NOESY-HSQC 合併 N-NOESY-HSQC及13C-NOESY-HSQC而完成。骨架圖如第 ^ 四圖所示。為了結構計昇，利用TAL0S軟體計算出平面二面角的訊息(dihedralangle) ’ 15N-NOESY-HSQC 及 13C-NOESY-HSQC 決 * 定出距離限制，配合1)20交換的實驗結果列出26個可能的氫 i 鍵。^GF135多肽的核磁共振數據及結構計算統計皆詳列於表表一 aFGF135多肽的核磁共振數據及結構計算統計 9 1363761^ 098Π9510號發明專利申請案修正後無劃線之全份說明書替換本(100年11月丨5曰） NOE距離數據總值（Total) 1639 短距(Short range),丨 i-j 丨 S1 869 中距(Medium range), 1 < | i-j | < 5 206 長距(Long range), 5 < I i-j 丨 538 固定氫鍵(Restrained hydrogen bonds) 26 扭轉角數據(Torsion angle constraints) φ 70 ψ 76 CYANA 目標功能值(target fiinction value) (A2) 1.26±0.31

Ramachandran plot 統計值（％) 在主要區位之殘基(Residues in most favored regions) 65.9 在其它許可區域之殘基(Residues in additional allowed regions) 33.6 在通常許可區域之殘基(Residues in generously allowed regions) 〇.5 在不被允許區域之殘基(Residues in disallowed regions) 〇均方根離差(RMSD)來自於平均書(averaged coordinates)(A) 全長之骨架RMSD 1.12±0·36 全長之重原子RMSD 1.56±0.28 次級結構之骨架RMSDb 0.43±0.08 次級結構之重原子RMSDb 0.93±0.11 殘基 7-12, 16-30, 36-53, 58-85, 89-108, 111-131 0.54士0.07 之骨架RMSD ^ 殘基 7-12,16-30, 36-53, 58-85, 89-108, 111-131 1.05±0.06 之重原子RMSDe a. 提供之數據係根據CYANA檢測之超過平均20個代表溶解結構之構造 b. 次級結構區域係根據MOLMOL選擇：7-11，16-21, 25-29, 39-43, 48-53, 59-62, 68-71, 80-85, 89-94, 127-131 c. 選擇之區域係根據文獻(Lozano RM. 〇/·,所oc/ie/whiT'y， 2:39(17):4982-93, 2000)所揭露之區域而決定 aFGF135多肽之三維立體結構及兩個已知的人類aF〇F 多肽結構之比較如第五A圖及第五B圖所示。具有140個胺基酸如序列編號6所示之aFGF多肽(PDB編碼1RG8)，其、妹構顯示於第五A圖；具有127個胺基酸如序列編號7所示^ 10 第098119510號發明專利申請案修正後無劃線之全份說明書替換本(丨〇〇年丨丨月丨5曰） aFGF多肽(PDB編碼1DZD)，其結構顯示於第五b圖。上述 iii，皆不同於aFGFi35多肽之結構，因其碳基末端及田土末端献結構之中且左τ角缺少—繼合環(1鄉）。此結不證明具有改質胺基酸序列及特殊結構之aFGF135多肽，在結構上新穎且與已知之aFGF多肽不同。技藝者將可赚，謂上狀频實规行變化而 - 黃泛之發明概念。因此，應明瞭本發明並不限於所揭 =由附呈之申請專鄕圍所定義之【圖式簡單說明】將可下有關本發明之詳細敛述’結合附加之圖式限於是’無論如何，本發縣不受 37 A/, it為西方墨點法之圖像，其展示咖多肽在時 = 3 小上^數字為其所代表之分子量。 ”，、刀子^-t ’母個條帶圖2西!墨點法之圖像，其展示瞻多肽在培養道1至道3分別是每個條帶上之數字為細代表^分子量㈣’道4為分子觀’ 第一圖係為西方墨點法之圖像，盆 aFGF多肽(道之標示為上ϋ C下1小時間，人類aFGF(道之標示為”二具有刚個胺基酸之誌，在道P之商業上購得 ^車父;其中道，’M”為分子標黑色箭頭標示。’、犬、有降解情形，其降解處以第四圖為-圖譜，其展示由液態蛋白質核磁共振光譜分析 1363761 第098119510號發明專利申請案修正後無釗線之全份說明書替換本(丨〇〇年11月丨5日）儀檢測aFGF多肽之iH/N-HSQC光譜。第五A圖係為具有140個胺基酸之人類aFGF多肽(PDB編碼1RG8)之結構圖。第五B圖係為具有127個胺基酸之人類aFGF多肽(PDB編碼1DZD)之結構圖。【主要元件符號說明】益 12 1363761 第098119510號發明專利申請案修正後無劃線之全份說明書替換本(100年1丨月丨5曰） g ，’ 序列表 <110>雅祥生技醫藥股份有限公司 <120>人類酸性纖維母細胞生長因子改質肽 <140> 098119510 <141> 2009-06-11 «* * <150> US 61/060,262 <151> 2008-06-10 4 <160> 7 <170> Patentln 3.3 版

<211> 135 <212> PRT <213〉人工合成 <220> <223> 來自於人類酸性纖維母細胞生長因子（a-FGF)之多肽 <400> 1

Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His 15 10 15

Phe Leu Arg lie Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg 20 25 30

Ser Asp Gin His lie Gin Leu Gin Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu 35 40 45

Val Tyr lie Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp Thr 50 55 60

Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe 65 70 75 80

Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr lie Ser Lys Lys 85 90 95

His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys 100 105 110

Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys Ala lie Leu Phe Leu 115 120 125

Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 1363761 第098119510號發明專利申請案修正後無劃線之全份說明書替換本(1〇〇年1〗月15曰） <210> 2 <2Ii> 28 <212> DNA <213> 人工合成 <220> <223> 引子 <400> 2 actgaattca tggctgaagg ggaaatca 28 <210> 3 <211〉 30 <212> DNA <213> 人工合成 <220> <223> 引子 <400> 3 30 26 aagaagcttc aatcagaaga gactggcagg <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> 人工合成 <220> <223> 引子 <400> 4 ggcatatggc taattacaag aagccc <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> 人工合成 <220> <223> 引子 2 33 1363761 .· 第098119510號發明專利申請案修正後無釗線之全份說明書替換本(100年11月丨5曰） » * * <400> 5 aagagatctc tttaatcaga agagactggc agg <210> 6 <211> 140 <2i2> PRT <213〉人工合成 <220> 4 <223>來自於人類酸性纖維母細胞生長因子（a-FGH之多肽 <400> 6

Phe Asn.Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys 15 10 15

Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg lie Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp 20 25 30

Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His lie Gin Leu Gin Leu Ser Ala 35 40 45

Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr lie Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gin Tyr 50 55 60

Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin Thr Pro Asn 65 70 75 80

Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr 85 90 95

Tyr lie Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys 100 105 110

Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gin Lys 115 120 125

Ala He Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 140

<211> 127 <212> PRT <213〉人工合成 <220> <223>來自於人類酸性纖維母細胞生長因子（a_FGF)之多肽 <400> 1 1363761 第0981丨9510號發明專利申請案修正後無劃線之全份說明書替換本(100年11月15曰）

Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg lie Leu Pro Asp Gly 1 5 10 15

Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gin His lie Gin Leu Gin 20 25 30

Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr lie Lys Ser Thr Glu Thr 35 40 45

Gly Gin Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gin 50 55 60

Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His 65 70 7 5 80

Tyr Asn Thr Tyr lie Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val 85 90 95

Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr 100 105 110

Gly Gin Lys Ala lie Leu Phe .Leu 115 120

Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 125

Claims

七第098119510號發明專利申請案修正後無割線之申請專利範圍^換頁⑽年1月曰）申請專利範圍日修正q 1公告本 1 L 一種人類酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)之改質肽，其係由如序列編號1之胺基酸序列所組成。 2.如申請專利範圍第1項之改質肽，其具有相當高之穩定性。 3· —種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第丨項之經分離之多肤以及一醫藥上可接受之載體。 4. -種祕組合物，其包含如中請專利範圍第2項之經分離之多肽以及一醫藥上可接受之載體。