TWI361695B - Pcv-2 vaccine - Google Patents

Description

1361695 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明關於對抗豬環狀病毒（PC V-2)之疫苗及製造這 類疫苗，以保護小豬對抗PCV感染之方法。 PCV-2被認爲與小豬中所觀察到之豬離乳後多系統消 耗症（PMWS)有關。 此疾病在199 1年第1次出現在加拿大。

其臨床徵象和病理學於1 997年發表（（：13|^^31· Proc. Am. Assoc. Swine. Pract > 1 997:499-5 0 1 > Harding et al., Proc. Am. Assoc. Swine. Pract，1 997:503 )，包括： 進行性消耗、呼吸困難、呼吸迫促及偶而出現之黃疸》

Nayar 等人，Can.Vet.J.Volume38，June 1997 在具有 PMWS之臨床症狀的豬隻中偵測到豬環狀病毒，而推斷有 種非爲該已知之被視爲PK-15細胞之天然居住者的PCV 外的PCV與PMWS有關。稍後之文獻（Hamel et al.，J. Virol., 72 (6) ，5262-5267 * 1 998； Meehan et al;，J. gen.

Virol·, 79，2171-2 179，1998 )確認這些這些發現，並提議 (Meehan等人，·如上述）將這些病原性PCV稱爲PCV-2, 而原始之PK-15細胞培養分離物（Tischer et al.，Nature 295，64-66，1 9 82 )應稱爲 PC V-1。 PCV-1和PCV-2爲含有環形單股DNA基因組之小（17 奈米）二十面體無外套膜病毒。PC V-2基因組之長度爲約 1768 bp。源自世界上不同區域之PCV-2分離物似乎彼此密 切相關，且顯示出具有95至99%之核苷酸序列一致性（ -4- ⑧ (2) (2)1361695 F enaux et al., J Clin. Micorbiol·，38 (7) ，2494-2503， 2 000 )。PCV之ORF-2編碼該推論之病毒的殼體蛋白質。 PCV-2之ORF-2編碼由233個胺基酸所組成的蛋白質。所 有卩(^-2分離物之01^-2分享91-100%之核苷酸序列一致 性及90-1 00%之推演出的胺基酸序列的一致性。PCV - 1 和PCV-2之0RF - 2基因間僅有65至67%之核苷酸一致 性及63至68%之胺基酸序列一致性（？611311\6131.，51^13

PDNS (豬皮膚炎及腎病症候群）爲養豬人之另一.主要問 題，其與PMWS約在相.同時間出現。PDNS之特徵爲帶有 出血之紅/棕色環形皮膚病灶，通常出現在耳朵、肋腹、 腿和股臀部。PCV-2相關症候群和疾病之評述見於 Chae. C (2005) Vet. J. 169 3 26-3 3 6 中。 【先前技術】 吾人對於可保護小豬對抗PCV-2相關疾病（如：PMWS 和PMWS)的疫苗存在著需求。然而，目前仍無可購得之對 抗PCV-2相關疾病的疫苗。 傳統上，個人會考慮以去活化之全PC V-2病毒爲底之 用於豬隻的傳統疫苗。然而，PCV-2的情況較爲複雜，這 是因爲PCV-2不會在細胞培養中複製出高滴定度。 —種替換之疫苗可以衍生自PCV-2之重組抗原爲底質 。PCV-2蛋白質已表現在不同表現系統中。例如：Liu等 人（Protein Expression and Purification，2 1 ， 1 1 5-120 -5- 1361695 *- (3) (200 1 )將由PCV-2之0RF-2(其連接MBP His標籤）所編 碼之整個蛋白質的融合蛋白質表現在大腸桿菌中。Kim等 人（J. Vet. Sci，3 (1) ，19-23，2002 )將 PCV-2 之 ORF 1 和2表現在桿狀病毒表現系統中。Blanchard(Vaccine，21 .，4565-45 75，2003 )等人將ORF 1和〇RF 2表現在昆蟲 細胞中之以桿狀病毒爲基礎的系統中。將已產製PC V-2蛋 白質之昆蟲細胞溶解並將其調製成用來免疫接種不含特殊 ^ 病原（SPF)之小豬的疫苗。在首次-追加攝生法中，小豬 係接種二種蛋白質中之任一種，其中在接種次單位疫苗後 再接種DNA疫苗，或者，在另一組小豬中，小豬在二次 ' 注射中接受0RF1和ORF2蛋白質。然而，所有實驗均以 不含病原之SPF豬隻進行，因此，不具有任何自母體衍生 之對抗PCV-2的抗體。 由PCV-2弓|起之PMWS和PDNS可在四週大至約15 週大之小豬中觀察到。似乎直到斷奶前小豬均可安全地免 ® 於PCV-2之相關疾病，小豬僅在斷奶後才有出現臨床症狀 的機會。因此，爲了以疫苗保護小豬，理想上，必須從斷 奶後開始保護小豬，因爲何時會出現PCV-2相關疾病是無 法預測的》 爲了以二次疫苗注射攝生法達到此目的，小豬需要在 第一週大時即進行首次接種，如此，其.可在約斷奶時接種 追加疫苗，而就在斷奶後即取得對抗PC V-2感染的完全保 護。 小豬似乎具有自母體衍生的對抗PC V-2的抗體（MDA) -6- ⑧ 1361695 *- (4) 。（本發明疫苗之實驗中所使用之小豬的MDA滴定度的分 佈情形列於實例中）。然而，本技藝熟知：當有自母體衍 生的抗體存在時將會干擾疫苗接種。 小豬可具有不同滴定度之MDA。非常高之被動性 _ MDA滴定度可保護小豬對抗PCV-2感染（Merial:'PCV-2 Diseases:From research back to the field strain" 1 18,h IPVS > Hamburg Germany，June 2004，page 99-101 )。 ® 然而，具較低MDA滴定度之小豬在達到相關年齡（即 ，斷奶後）時並無法保護小豬對抗PCV-2感染。 對那些似乎爲該區中主要遇到的小豬而言，MDA之 滴定度可能太低而無法提供對抗PC V-2感染之保護效果， 但仍高至足夠干擾疫苗（例如：傳統之去活化PCV-2疫苗） 接種。尤其是，由於病毒無法在細胞培養中增殖至高滴定 度，因此，去活化疫苗可能含有較少之抗原（或者應將複 雜及消耗時間之濃縮程序引入疫苗製造方法中）。本發明 • 之疫苗可特別對此群體之小豬提供適當之對抗PCV-2感染 的保護作用。 【發明內容】 藉由本發明可提供用於保護小豬之方法中的疫苗，甚 至可對那些抗PCV-2 MDA陽性、抗PCV-2之感染及藉由 此對抗PCV-2相關疾病（最令人注意的爲PMWS和PDNS) 的小豬提供保護。 本發明提供包含至少20微克/劑量之第二型豬環狀病 1361695 •· (5) 毒（PCV-2)的0RF-2蛋白質的抗PCV-2疫苗。 現已發現每一劑量包含至少20微克（/zg)PCV-2之 ORF-2蛋白質的疫苗即使在有MDA存在時亦可引出對抗 PCV-2感染之保護性免疫反應（以藉此對抗與PCV-2相關 之疾病，像PMWS和PDNS)。較合適的爲，該疫苗含有至 少50微克/劑量，最合適的爲含有至少80微克/劑量。本 技藝之疫苗甚至還可製備成每一劑量帶有至多275微克抗 • 原量之疫苗，而這類疫苗仍不會在注射部位引起局部反應 。當然，甚至可在本發明疫苗之疫苗劑量中加入更多微克 之抗原，但若具較高劑量之疫苗未能改良所取得之保護效 果，則所增加之抗原負載僅是昂貴的花費而非必要。另外 • ，需避免增加抗原劑量最終可能在注射部位產生不可接受 的局部反應。本申請案之實驗部分中記述用來測量抗原量 的方法。 本發明之疫苗可含有重組之ORF-2蛋白質，其中該重 ® 組蛋白質宜藉由從昆蟲細胞中之桿狀病毒表現載體表現的 方式製造，該桿狀病毒表現載體含有該受合適之啓動子控 制的PCV-2 ORF-2基因序列。 雖然亦可在製備本發明疫苗之方法中使用其它本技藝 已知之合適的表現系統，但現已發現：使用桿狀病毒表現 系統可產生高產量之病毒抗原，且其可顯示良好之抗原性 。當無法產生高濃度之抗原時（例如：在受病毒感染之細 胞培養中），使用桿狀病毒表現系統可排除對於將抗原濃 縮至合適水準之複雜且耗時之程序的需求。 -8 - 1361695 V (6) 最常使用之桿狀病毒表現載體爲苜蓿夜蛾’其通常與 SF-9、SF-21或High five昆蟲細胞一起使用。SF-9和SF-21爲來自草地夜蛾之卵巢細胞株’ High five細胞係衍生 自擬尺蠖之卵細胞。PC V-0RF-2基因應受合適啓動子的控 制。桿狀病毒表現系統中最常用之啓動子爲用於多面體基 因之啓動子及用於 pl〇基因之啓動子’意指該 0RF-2 PCV-2基因序列係插入桿狀病毒基因組中之多面體基因位 • 或pl〇基因位中的插入部位。亦可使用本技藝所已知之其 它合適的啓動子（同源或異源）。桿狀病毒表現系統各方面 之詳細說明列於 D.R. O'Reilly，L.K.Miller 和 V.A.Luckow 所著之”88。111〇乂11：115£\卩1655;011'\^(^015"( 1992，\^.1'1·

Freeman & Co，New York )。再者，從桿狀病毒衍生之表 現載體和完整之表現系統可從許多不同公司購得。 根據本發明之疫苗可進一步包含合適之佐劑。本技藝 已知多種佐劑系統，例如：常用的水包油佐劑系統。任何 ® 合適的油均可使用，例如：本技藝中已知之用於輔助的礦 物油。油相亦可含有不同油（礦物油或非礦物油）之合適的 混合物。合適之佐劑亦可包含隨意地與一或多種油混合之 維他命E。以水包油爲佐劑之疫苗的水相將含有該抗原物 質。合適之調和物通常包含約25-60%油相（40- 75%水相）。 合適之調和物的實例可包含3 0 %水相及7 0 %油相或各5 0 % 〇 本發明之疫苗可經由本技藝所已知之任何合適途徑投 服’例如：肌肉內、皮內或皮下，宜經由肌肉內途徑投服 -9- ⑧ (7) 1361695 本發明還提供用於製造欲用來保護幼豬之PCV-2 MDA陽性，對抗PCV-2感染之疫苗的方法，其中該疫苗 具有至少20微克/劑量之第二型豬環狀病毒（PCV-2)的 ORF-2蛋白質。 本發明之疫苗（藉由本發明之方法製備者）可用於保護 幼豬對抗PCV-2感染的方法中。 • 本發明之疫苗甚至可用於保護幼豬的方法中，其中該 幼豬爲自母體衍生之抗PCV-2抗體（MDA)陽性、抗PCV-2 感染。 現已發現：本發明之疫苗即使在小豬具有非常高滴定 度之抗PCV-2的MDA時仍可保護小豬。表1中反映出歐 洲各地之不同農場區中所遇到之幼豬中的MDA滴定度的 分佈情形， 而本發明疫苗所提供之保護作用反映在表2中。其顯 # 示出本發明之疫苗甚至可對其MDA滴定度爲實例中所定 義之"第2組"的幼豬提供對抗PCV-2感染之適當保護（表 2)。歸類於此組之小豬所具有之MDA滴定度介於8和12 l〇g2間（此高MDA滴定度）。 因此，根據本發明之疫苗甚至可用於保護幼豬的方法 中，其具有至多101〇g2，或甚至121og2(以實例中所指出 之方法測量）之對抗PCV-2的MDA滴定度。 從表1中可發現從歐洲各地之不同農場所收集到的小 豬約有5 5 %屬於第2組（當然，屬於第1組，具有較低 -10- ⑧ 1361695 *- (8) MDA滴定度且包含32 %之族群的小豬亦可受本發明疫苗 的保護）。因此，所得之結論爲：本發明之疫苗可對在農 場中所遇到之絕大多數小豬（包括那些具高MDA滴定度者 )提供保護。 爲了提供適當之保護，宜以二次注射之疫苗攝生法投 服疫苗，藉以在小豬第一週至第四週大時（宜在斷奶前， 例如：在第一週時）給予小豬第一次注射（首次疫苗）。第二 ® 次注射（追加疫苗）可在約三週後給予。以此方式，小豬可 在斷奶後即取得對抗PCV-2感染的完全保護，而斷奶時爲 小豬對PCV-2感染最敏感的時候，因而此時會對PMWS 和PDNS變得敏感。 【實施方式】 實例1:(母體衍生）之PCV-2特異性抗體滴定度的測定 方法 抗PCV_2感染之抗體滴定度可以下列方式測定： 在96-槽組織培養盤中形成單層PK1 5細胞。在80% 融合度時，以PCV-2現場分離物感染細胞，並在37°C之 C〇2保溫箱中繼續培養2天。經過這段時間之後，將細胞 在乙醇中固定，並貯存在2-8°C中，直到使用時。當培養 盤中約20%細胞受感染時，使用此培養盤進行測試。爲了 測定特定血清之PCV_2特異性抗體，製作系列稀釋液，並 在經乙醇固定之細胞上温育。在3 7 °C中温育1小時後，以 自來水清洗培養盤，並與經FITC標示之兔子抗-豬IgG — 1361695 ·- (9) 起温育以偵測已結合的抗體。特定血清之滴定度係以其中 仍可觀察到PCV-2特異性抗體反應之最高稀釋度的倒數表 示0 表1中所列爲斷奶前之小豬體內自母體衍生之抗 PCV-2抗體滴定度的典型分佈情況。 血清係從歐洲各地之不同國家的23 2隻小豬收集得來

(10) 1361695 表1在包含232隻幼豬之群體中，自母體衍生之抗體滴 定度的分佈情形 族群中具有自母體衍生之 PCV-2特異性抗體滴定度 (l〇g2)的小豬類別 每一類別之小豬 的百分比 每一組小豬 之百分比 ^ 4 1 . 3 5 9.9 32 6 9. 1 7 12.1 8 9.5 9 19.4 10 11.2 55 11 9.9 12 4.7 13 5.2 14 3.0 15 2.6 13 16 1.3 ^ 1 7 0.8

表1中可區分出三組：第I組；具有小於8之滴定度 的小豬，第2組；具有從8至1 2之滴定度的小豬及第3 組；具有1 3及較高滴定度的小豬。第3組中，自母體衍 -13 - -- (11) 1361695 生的抗體滴定度如此高，因此，預料小豬在關鍵年齡可受 到其保護（Merial:’PCV-2 Diseases:From research back to the field strain" > 18'b IPVS * Hamburg Germany * June 2004 ，page 99-101 )。而第1組中，自母體衍生的抗體滴定度 如此低，因此’這些小豬大部分都可很容易地接受疫苗接 種。然而，第2組中，這類幅度之抗體滴定度使得傳統之 疫苗接種方式可能無法成功地將大部分小豬免疫化。由於 • 超過半數之小豬似乎均屬於此組，因此，若想將P M W S排 出此農場，則保護這組小豬爲最重要的。 本技藝中熟知：當有自母體衍生的抗體存在時，可藉 ' 由佐劑或高抗原含量來輔助疫苗接種。何種佐劑或抗原含 量可破壞針對特定病原之自母體衍生的抗體目前仍未知。 因此，本實驗中描述吾人試圖定義保護第2組小豬對抗 PCV-2感染的最低抗原量的方法。 ® 實例2.表現PCV-2 0RF-2之重組桿狀病毒的構造方法 利用不含PCV之豬睾九（ST)細胞從顯示PMWS之臨 床及組織病理徵兆的生長豬（Feeder pig)的肺組織分離出 PCV-2病毒。將病毒在不含PCV之PK-15細胞上經由轉 種5代來增殖。

從受感染之PK-15細胞上清液中純化出PC V-2病毒的 製品，再從此製品中分離出DNA。根據已發表之序列，例 用含有BamHl限制位之引物（前向引物：CGG GAT CCG TTT TCA GCT ATG ACG TAT，逆向弓| 物：CGG GAT CCT -14- ·- (12) 1361695 TTA TCA CTT CGT AAT GGT T )進行 PCR，以將 ORF-2 基因擴增。所產生之擴增子包含完整之〇RF-2基因加上鄰 接之BamHl限制位。 凝膠電泳之後，將擴增子切出並純化。然後，以 BamHl分解純化之PC V-2 0RF-2片段，並將其接合入經 BamHl 分解之 p A c A S 3 中（V1 ak e t · a 1 · ( 1 9 9 0) V i r ο 1 o g y 179 312-320 )。此質體含有插入位置之pl〇啓動子上游， • 以使外來基因可在pl〇啓動子之控制下表現出。 以接合混合物將TOP 10F'細菌（Invitrogen，Carlsbad ，USA )轉形，並根據選殖株之序列選出含有正確構造物 ' 之選殖株。將陽性選殖株擴增，並利用定序法重新測試該 • 轉移質體之DNA。 轉染前，以Bsu361分解苜蓿夜蛾核型多角體病毒 (AcNPV，描述於 Martens et. al. (1 995) J. Virol. Methods 52 15-19中）。此病毒中之Bsu361位置爲plO基因位中 ® 之獨特的限制位。 然後，利用CellFectine(生命技術公司，美國蓋茲堡 市），以轉移質體和經Bsu361分解之 AcNPV桿狀病毒 DNA轉染草地夜蛾（Sf9)細胞。轉染後第3天收成轉染上 清液並在Sf9細胞上進行斑塊純化。 將斑塊擴增並藉由分析分離出之病毒DNA的序列， 及利用抗-PC V-2兔子之和豬血清在Sf9細胞上進行免疫螢 光分析來篩選所產生之病毒中是否有PC V-2 ORF-2基因插 入。 -15- 1361695 • (13) 製備稱爲"主要籽（Masterseed)"之重組桿狀病毒 BacPCV-2-ORF-2的籽。藉由分析分離出之DNA的序列， 及在Sf9細胞上進行免疫螢光分析來測試在主要籽及Sf9 細胞上之主要籽的轉種第5代中之PCV-2 0RF-2插入子的 _ 穩定性。 進行滴定以測量在病毒製品中之感染性病毒的量。在 Sf9細胞上進行滴定，並藉由觀察桿狀病毒特異性CPE及/ ® 或利用多株兔子抗-PCV-2免疫血清來進行PCV-2 0RF-2 特異性免疫螢光分析讀取結果。 結果顯示本方法產生重組AcNPV桿狀病毒BacPCV-2 0RF-2之由斑塊純化的主要籽。藉由定序法及免疫螢光分 析來測試主要籽及在Sf9細胞上之主要柱的轉種第5代時 可判斷此構造物在plO啓動子之控制下可在Sf9細胞上穩 定表現出PCV-ORF-2蛋白質》 • 實例3. PCV-2抗原之產製方法 爲了取得最大量之表現產物，進行初步實驗以將取得 重組PCV-2 0RF-2蛋白質之條件最優化。所有實驗均在 28°C下，利用在懸浮液中培養之草地夜蛾21(Sf2 1)細胞進 行。使用來自主要籽之轉種第4代層級的BacPCV-2-ORF· 2病毒進行感染。爲了將產製條件最優化，感染時之細胞 密度爲1.4xl06細胞/毫升，感染複數（MOI)爲〇.〇1，並在 感染後持續培養6天。所產生之混合物稱爲表現產物收成 品。在一年期間內於個別實驗中，在最優化之條件下進行 -16- ⑧ (14) 1361695 5次表現。 由於抗原係位於細胞內，將含細胞及上清液二者之全 部收成品進行超音波處理直到至少有90%之細胞被破壞。 •之後，將各批經超音波處理之收成品與33mM雙乙醯亞胺 (BEI)在37°C，PH7.5下持續攪拌72小時，以將該存活之 重組病毒去活化。去活化後，加入1.6倍莫耳過量之硫代 硫酸鈉以中和BEI。 • 中和後，在600g下低速離心1 〇分鐘以去除細胞碎片 和多面體。所產生之上清液稱爲去活化之病毒懸浮液。 檢査收成品是否爲不育性，以檢査去活化是否完全。 經由將去活化之病毒懸浮液轉種在Sf9細胞上2週，並目 視檢查是否無桿狀病毒特異性CPE存在，以測試去活化是 否完全。 結果顯示本方法所取得之桿狀病毒滴定度爲 8.5 l〇g1GTCID5()/毫升，其經BEI處理後被完全去活化。 實例4. PCV-2抗原量之測定方法 將低速離心前和後之去活化懸浮液及母轉移病毒之細 胞培養懸浮液樣本根據Laemmli( Laemmli，U. K. (1970) Nature 227，680-685 )的方法進行變性SDS-聚丙烯醯胺·凝 膠電泳。使用以庫馬西亮藍（Coomassie Brilliant Blue)染 色之4-12%梯度凝膠。 當完成西方點墨分析時，以電穿孔方式將來自凝膠之 蛋白質轉移至尼龍膜上，以在PBS中之脫脂牛奶阻斷之， -17- ⑧ ·- (15) 1361695 並將其與抗PC V-2之現場分離物的多株豬血清稀釋液反應 〇 將1微升（# 1)此懸浮液以類似方法在凝膠上泳行，以 測量所產生之去活化病毒懸浮液中的抗原含量，而將牛血 清白蛋白（美國聖路易士史格馬公司，目錄編號A-2 15 3)之 系列稀釋液同時在同樣凝膠上泳行以作爲參考。藉由照相 機捕捉造影和使用 GeneTools(英國劍橋賽基因公司 • (SynGene )，第3版）進行電腦分析將BSA參考物之密度 與含PCV-2之樣本的密度相比較，以定量去活化之病毒 懸浮液中的0RF-2基因產物。 當將低速離心前和後之去活化收成品在SDS-PAGE凝 ， 膠上對精確外加標記（Precision Plus markers)(美國海格力 斯市Bio-Rad公司）進行電泳分離以相互比較時，離心前 之物質可產生二個約相等密度之30和26.8kDa表面分子 量（MW)的主帶，而離心後之物質僅含有較低的帶子。當 ® 將母轉移病毒在重組病毒旁泳行時，母轉移病毒僅含二個 帶子中之較高者，這顯示出該較低的帶子爲PCV的ORF-2 ，而較高的帶子爲離心後移除之多面體。 經由西方點墨分析進一步確認較低的26.8kDa帶子之 特性，其中顯示出此帶可與對抗PCV-2現場病毒的多株豬 血清反應，30 kDa的帶子則不。 在5個個別實驗中測定PCV-2 ORF-2之表現水準，且 在各情況中，該量遠高於試驗之偵側限制，具體地說，該 量係在40至550微克（//g) /毫升（ml)去活化病毒懸浮液 (16) 1361695 之範圍內。 實例5. PCV-2 0RF-2之量對MDA陽性幼豬採納疫苗的影 響 調配具不同PCV-2 0RF-2抗原含量之疫苗並用來爲具 不同水準之自母體衍生之抗PC V-2抗體（MDA)的幼豬進行 疫苗接種。給予二次疫苗接種，且彼此間隔3週。在第一 ® 次疫苗接種後5-6週測量對抗該抗原之血清反應。從這些 數據可計算出當有MD A存在時，抗原含量對採納疫苗的 影響。 製作多種不同之抗原稀釋液，並將其與水包油佐劑（ 如本技藝所常用者）以1 : 1(體積/體積）混合。 然後，在幼豬第1和第4週大之間，將一窩豬分成數 組，並以含有不同量之PCV-2 0RF-2蛋白質的疫苗經由肌 肉內途徑處理或者是不接種疫苗。3週後重複進行疫苗接 ® 種。製作下列各組：以1-14微克PCV-2 0RF-2蛋白質/劑 量接種1 14隻小豬（第1組），以20和80微克PCV-2 ORF-2蛋白質/劑量接種85隻小豬（第2組）。 在第1次疫苗接種時及5-6週後採取血液。製備血清 ，並藉由免疫螢光分析檢査PCV-2抗體。爲了進行此項檢 査，以PCV-2之現場分離物感染在96-槽組織培養盤中之 PK1 5細胞單層。培養2天後，當約20-3 0%之細胞受感染 後，將單層在乙醇中固定，並貯存在2-8 °C中，直到使用 時。爲了測定滴定度，將測試血清之系列稀釋液在細胞上 -19- .- (17) 1361695 ，於37°C温育1小時，清洗培養盤後，將其與經FITC標 示之兔子抗-豬IgG(荷蘭提堡，諾迪克（Nordic)公司）一起 温育以偵測已結合的抗體。所測得之滴定度爲其中仍可觀 察到PCV-2特異性螢光之最高稀釋度的倒數。測定所有動 _ 物在第一和第二次採血間之抗體滴定度的衰退情形。若此 期間抗體滴定度未下降或增加，則認爲該相關動物已採納 該疫苗。然而，當該PCV-2特異性抗體滴定度降低時，則 ® 認爲疫苗接種並未成功而小豬未採納該疫苗。 經由將採納之不同疫苗劑量與接種疫苗時自母體衍生 之抗體的滴定度做相關比較可測定出用來將足夠量之小豬 進行疫苗接種時所需的最低抗原量。此分析結果列於表2 中 〇 •20· ⑧ (18) 1361695 表2.在不同MDA滴定度和抗原濃度下採納疫苗之百分比

接種疫苗時具有 自母體衍生之 PCV-2特異性抗 體滴定度(l〇g2)的 小豬實例 第1 ;組；1-丨4微克/劑量 第2組；20-80微克/劑量 每一類別之小豬 數量/採納疫苗之 小豬數量 每組採納疫苗之 百分比 每一類別之小豬 數量/採納疫苗之 小猪數量 每組採納疫苗之 百分比 S 4 3/3 1/1 5 0/0 90% 3/3 100% 6 15/13 5/5 7 .2/2 3/3 8 12/8 4/4 9 12/5 17% 11/10 10 6/0 13/10 76% 11 21/0 15/10 12 26/0 7/4 13 15/0 6/1 14 2/0 11/0 15 0/0 0% 4/0 4% 16 0/0 1/0 ^ 17 0/0 1/0 總數 Π4/31 27% 85/51 60% 受保護之總數* 114/48 42% 85/73 86% *受保護之小豬的總數爲其中滴定度小於13而採納疫苗之小豬的數量加上已具有13或更 高滴定度之小豬的數量。 ·- (19) 1361695 此表中，"採納疫苗”意指小豬在追加疫苗後1週所產 生之PCV-2特異性抗體的滴定度等於或高於首次疫苗接種 所產生之PC V-2特異性抗體的滴定度的疫苗接種。在所有 這類情況中均顯示出疫苗發動對抗PCV-2之主動血清反應 ，且在該情況中，可認爲小豬受到對抗PCV-2感染之保護 。然而，在其中追加疫苗後1週所產生之滴定度小於首次 接種疫苗後所產生之滴定度的小豬體內並無法引起免疫反 • 應，而所觀察到之自母體衍生的抗體自然下降的情況使得 這些動物易受PCV-2感染。 此表.中顯示當使用等於或小於Μ微克之疫苗劑量時 ，第1組（MDA滴定度S7)中有90%之動物將因接種疫苗 而發生血清轉化，因此可被視爲受到保護。然而，第2組 (MDA滴定度>7而<13)中，以小於或等於14微克之疫苗 劑量接種時，僅17 %之動物發生血清轉化而受到保護。此 群體中有17隻動物具有13或更高滴定度，因此，其已受 ® 自母體衍生的天然取得之PCV-2特異性抗體的保護。因此 ，個人獲得之結論爲：此組中全部114隻小豬僅有48 (42%)隻受保護；17隻已具有自母體衍生之抗體滴定度的 小豬，加上第1和2組中之3 1隻發生血清轉化的小豬。 在以20微克/劑量或更高劑量接種之群體中有明顯較 多之動物受到保護；第1組之全部動物及第2組之76%的 動物發生對抗PC V-2之血清轉化而受到保護，再加上具有 1 3或更高之MDA滴定度的小豬後可發現此群體中有88% 之小豬受到保護。 -22- ⑧ (20) 1361695 由於當約80%或更多動物受保護時即取得畜群保護， 因此可結論：針對PC V-2之疫苗的抗原量必須至少含有 20微克或更多之抗原以有效保護畜群對抗PCV-2感染所 造成之結果。

Claims (1)

1361695 匕為日修正本I ^ in»··· ιι. ——I _ I· · · 附件3A :第094131364號申請專利範圍修正本 民國100年8月9日修正 十、申請專利範圍 1. 一種第二型豬環狀病毒（PCV-2)的ORF-2蛋白質於 製造供保護呈源自母體的抗體（MDA)陽性之小豬免於PCV-2感染的疫苗之用途，該疫苗包含至少20微克/劑量之該 ORF-2蛋白質。 2. —種PCV-2的ORF-2蛋白質於製造供保護呈MDA 陽性之小豬免於PC V-2感染的疫苗之用途，該疫苗包含至 少50微克/劑量之該ORF-2蛋白質。 3. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該ORF-2 蛋白質已藉由於昆蟲細胞中經桿狀病毒表現載體表現之方 式製造，且其中該桿狀病毒表現載體包含受合適啓動子控 制的PCV-2 ORF-2基因序列。 4. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該啓動子爲 p 1 0啓動子。 5. —種作爲供保護呈MDA陽性之小豬免於PCV-2感 染的疫苗之醫藥組成物，其包含至少20微克/劑量之 PCV-2的ORF-2蛋白質和藥學上可接受之載體。 6. —種作爲供保護呈MDA陽性之小豬免於PCV-2感 染的疫苗之醫藥組成物，其包含至少50微克/劑量之 PCV-2的ORF-2蛋白質和藥學上可接受之載體。 7. 如申請專利範圍第5或6項之醫藥組成物，其中該 組成物包含合適之佐劑。 1361695 8. 如申請專利範圍第7項之醫藥組成物，其中該佐劑 爲水包油乳化劑。 9. 如申請專利範圍第7項之醫藥組成物，其中該佐劑 包含維生素E。