TWI354024B - Compositions of growth factors for enhancing the w - Google Patents

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九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於一種用以促進表皮細胞再生之人類成 長因子組成及其製備方法。 【先前技術】 皮膚不但具有調節人體之體溫、水分等功能，也是人 體免疫系、統的第-道防、線’一旦失去表皮的保護就極容易 遭受外來病原感染。而經歷燒傷、潰瘍、發炎、放射線治 療、手術以及糖尿病之患者，長時間處於皮膚缺損及異常 之情形下，容易造成感染而對身體產生莫大的傷害，故傷 口癒合以及表皮細胞再生機制是一項重要的醫學研究領 域。 目前用於治療傷口以促進癒合之藥物多為殺菌劑、抗 生素、皮質類固醇激素等’對於傷口癒合皆各有其缺點， 且傷口癒合率差。因而發展出人工皮膚或其它皮膚替代 物、細胞治療等方法》 相關研究指出，在皮膚的傷口癒合過程中，有多種生 長因子扮演了重要的角色。皮膚受傷後，血小板會釋放出 其中所含之多種生長因子及細胞激素，包括表皮生長因子 (epidermal growth factor ’ EGF )、鹼性纖維母細胞生長因 子（basic fibroblast growth factor，bFGF)、血小板衍化生 長因子（platelet-derived growth factor，PDGF)、人類胰島 素生長因子（insulin-like growth factor，IGF-1 )、血管内皮 生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉 1354024

化生長因子 α ( transforming growth factor-α，TGF-c〇、轉 化生長因子 ( transforming growth factor-jS ’ TGF-/3)、介 白素-1( interleukin-1 ’ IL-1 )、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF )、激活素（activin )、腫瘤壞死 因子 α ( tumour necrosis factor，TNF-c〇 等。這些生長因子 可吸引嗜中性白血球（neutrophil)和巨嗟細胞（macrophage ) 朝向傷口處聚集，以清除受傷組織、細胞並吞噬感染物， 亦可活化附近的纖維母細胞及角質細胞以及誘導周圍血管 進行血管新生作用。

另一方面，傷口部位的纖維母細胞會在某些生長因子 (特別是PDGF以及TGF-冷）的影響下，轉型為肌纖維母細 胞。這些肌纖維母細胞會大量表現α肌動蛋白（a -actin ) 以利收縮傷口，並合成膠原蛋白纖維。這些沈積於傷口處 之膠原蛋白纖維的排列方式受到肌纖維母細胞收縮之影響 而與原本正常組織之膠原蛋白纖維列方式不同，因而形成 疤痕組織。在受傷後第四星期開始一直到約六個月間，疤 痕組織中之膠原蛋白會重新排列，而使得疤痕組織之外形 及機能接近原先之正常組織。 近來有研究指出，TGF-/33於傷口癒合的調節上，不僅 對巨噬細胞與纖維細胞有趨化性，並可刺激第I型及第Π 型膠原蛋白之mRNA的轉錄作用，以促進傷口中膠原蛋白 的聚積，以提高傷口的癒合率。故TGF-/33經證實可產生無 症的上皮再生作用，並加速癒合因放射線照射所形成之皮 膚傷口。研究指出，在哺乳動物之胚胎時期可分泌大量 TGF-|33，然而，成體哺乳動物的表皮於受傷時，所分泌的 (S ) 6 1354024 TGF-/53的含量卻非常少，是以出生後之傷口，易有肌纖維 細胞收縮而造成之疤痕。 由於生長因子對於傷口之再生及修復機制扮演了重要 的角色，包括 EGF、bFGF、IGF-1、PDGF、及 VEGF 等，

皆已廣泛運用於醫藥及美容保養產#。然而，目前係利用 基因工程以大量製備上述生長因子，需將表現上述人類生 長因子之基因個別插入載體内以大量繁殖，並進一步純化 其表現之人類生長因子。雖然此種方法可降低成本，但其 缺點在於純化後之蛋白質的純度不一，且可能含有内毒素 或其他不良之蛋白質，而影響療效或併發過敏反應；此外， 一個質體要同時插入三種以上的生長因子基因，且皆有活 性表現，難度非常高，若欲同時操作多個選殖質體既費時 又費工，再者，以原核生物或真菌類來表現人類生長因子 蛋白質時，大部分所產生之蛋白質的活性會降低。 另一方面，幹細胞治療則是利用人類成體幹細胞，例 如位於骨髓、表皮、腸道等部位之幹細胞來治療各種疾病。 由人類骨趙分離的間葉幹細胞（human mesenchymal stem cell ’ hMSC )是一種成體幹細胞，其具有多種分化潛能， 在不同的培養環境下可分化成骨骼、軟骨、肌肉、皮膚等 組織，又有易於分離 '培養與體外增生速度快之特性，已 有多項研究證實其可強化皮膚傷口癒合機制。然而，以幹 細胞注射或手術移植入人體，需要長期的臨床試驗以評估 異體幹細胞移植是否產生免疫排斥反應。再者，幹細胞治 療耗費之醫療資源以及金錢亦尚於一般療法。 因此’需要提出一種方法，可以結合基因工程以及幹 1354024 ’需要一種方法可同 長因子，同時可透過 子，以促進表皮細胞 細胞療法之優點並改進其缺點。亦即 時提供三種以上由人類細胞表現之生 一般外用或内服之途徑施用該生長因 再生。 【發明内容】 有鑑於上述問題，本發明提出_種於體外培養人體骨 賴葉幹細胞和/或製備人類生長因子的方法。首先，在初 # A培養液中進行人體骨髓間葉幹細胞之初代培養。接著， 絲初代培養液中之懸浮型細胞並選擇黏貼型細胞，並以 繼代培養液進行繼代培養。其後，選擇黏貼型細胞並以末 . 代培養液進行末代培養，上述末代培養液是一種無血清培 養液，且含有人類騰島素生長因子。末代培養可使得黏貼 型細胞能夠分泌多種生長因子至末代培養液中，以形成人 類生長因子溶液。亦即，上述人類生長因子溶液至少包含 人類骨髓幹細胞所分泌之複數種人類生長因子的組合，即 # &本發明所稱之人類生長因子組成。上述之人類生長因子 組成包含至少三種選自下列群組之生長因子：EGF、bFGF、 IGIM、PDGF、VEGF、TGF必、幹細胞生長因子（咖爪_ faCt〇r ’ SCF)、干擾素（interferon，IFN-γ)、趨化因子 (RANTES )、血小板生長因子（thr〇mb〇p〇ietin，Tp〇 )、金 屬蛋白酶組織抑制因子（tissue池油沉〇f metalloproteinase，TIMP )、痩體素（leptin ) ' 介白素·6 (interleukin-6 ’ IL-6 )、以及介白素 _8( interleukin_8，IL-8 )。 根據本發明一實施例，可在上述末代培養液中選擇性 1354024 地加入一營養液。此一營養液可包含至少一種胺基酸和/或 至少一種維生素。 根據本發明一實施例，可將上述之人類生長因子溶液 取出並進行透析’以純化上述人類生長因子溶液。

根據本發明之又另一種態樣，提出一種用以促進表皮 細胞再生的組合物，上述組合物至少包含本發明實施例之 人類生長因子組成、營養成分、乳化劑溶液、以及油相液 體。上述營養成分包含根據本發明實施例製備人類生長因 子組成時，所用之營養液的一部份。上述乳化劑溶液以及 油相液體可將人類生長因子組成及營養成分以油包水_水 包油（water in oil in water，w/o/w)之方式包埋成一種微 脂體包埋物。 根據本發明之一實施例，更可在上述用以促進表皮細 胞再生的組合物中加入一水溶性膠體，以增加上述微脂體 包埋物之安定性。

利用本發明實施例之體外培養人體骨髓間葉幹細胞的 方法，可輕易得到一種人類生長因子組成，其中所含之人 類生長因子的種類、活性、安全性皆高於利用基因工程所 產生者。且根據本發明實施例之方法所得到之生長因子組 成至少包含多種和表皮細胞再生相關之生長因子，可有效 提升表皮細胞再生之能力。 此外，根據本發明實施例之營養液，不但可在人類生 長因子組成製備過程中提供額外的養分給人體骨髓間葉幹 細胞’亦有助於提升本發明實施例之用以促進表皮細胞再 生的組合物中所含之人類生長因子組成促進表皮細胞再生 9 1354024 之能力。 【實施方式】 為讓本發明之上述目的、特徵、 下文特舉較佳具體實施例，詳細說明如優下以更明顯易僅， 實施例（一）

於趙外培養人想骨趙間葉幹細胞和/或製備人類生 组成之方法 卞 本發明之-實施例提出-種於體外培養人體骨趙間葉 幹細胞的方法，該方法包含下列步驟： ” (a) 在初代培養液中進行人體骨髓間葉幹細胞之初代 培養； (b) 去除初代培養液中之懸浮型細胞並選擇黏貼型細 胞，並以繼代培養液進行繼代培養；

(c) 選擇繼代培養液中之黏貼型細胞，並以末代培養 液進行末代培養。上述末代培養液為無血清培養 液且含有人類騰島素生長因子，以使得黏貼型細 胞能夠分泌多種生長因子至末代培養液中，以形 成人類生長因子溶液 在本發明之具體實施例中，係將健康人體骨髓間葉幹 細胞（購自 The National Disease Research Interchange, NDRI， USA)以含10%胎牛血清之dMEM培養液（Dulbecco，s modified eagle medium，購自 Gibico，Cat· Νο·12100-061 ) 作為初代培養液，進行初代培養3日。接著去除初代培養 1354024 液中之懸浮型細胞並選擇黏貼型細胞，再以含1〇%胎牛血 /月之DMEM培養液作為繼代培養液，進行繼代培養3日。 •. 繼代培養之後，以末代培養液進行末代培養3日，上述末 • 代培養液為一種無血清培養液，且含有約5〜25 ng/ml人類 騰島素生長因子。 在末代培養步驟中，末代培養液中之黏貼型細胞可分 泌複數種人類生長因子至末代培養液中，以形成一種人類 生長因子溶液。這些人類生長因子至少包含三種下列生長 ^ 因子.EGF、bFGF、IGF-1、PDGF、VEGF、TGF-/33、SCF、 IFN-γ、RANTES、TP〇、TIMP、瘦體素 ' IL-6、以及 IL-8。 這些人類生長因子的組合，即為本發明實施例所稱之「人 類生長因子組成」。此外，根據本發明實施例，人類生長因 子組成中所含的生長因子濃度為可偵測的，其偵測方式以 及偵測極限將於下文詳述。 根據本舂明之具體實施例，繼代培養步驟可視需求重 複至多20次。根據本發明之具體實施例，可在繼代培養步 φ 驟後將經培養之人體骨髓間葉幹細胞冷凍保存，且此一冷 凍保存之人體骨髓間葉幹細胞經解凍後可再度進行繼代培 養，但解凍後之人體骨髓間葉幹細胞的繼代培養次數最多 可重複3次。 在本發明之一具體實施例中，可於末代培養液中加入 營養液，上述營養液包含至少一種胺基酸和/或至少一種維 生素。上述之胺基酸例如可為丙胺酸、精胺酸、天門冬醯 胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、 組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸 '子硫胺酸、苯丙胺 11 jr/p 脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸， 所選之母種胺基酸的濃度約為5〜100 mg/L。上述之維生 素例如可為維生素A、維生素B卜維生素B2、維生素B3、 維生素B5、維生素B6、維生素B12、維生素c、維生素 D2、維生素E、維生素H、維生素K3、氣化膽鹼葉酸、 或肌醇，且所選之每種維生素的濃度約為0.1〜10 mg/L。 在本發明一實施例中，將利用本發明實施例製備之人 類生長因子溶液進行透析，以進一步純化該人類生長因子 命液。根據本發明之一具體實施例，利用一 3·5 kd之透析 膜（購自 Pierce，SnakeSkinTM Pleated Dialysis Tubing，3 5〇〇 MWCO)來進行上述人類生長因子溶液之透析，透析可持 續進仃約3〜5日。藉由透析步驟’可實質上移除人類生長 因子溶液中分子量小於3,5〇〇道爾吞（Dalt〇n，D)之物質， 因而達到純化人類生長因子溶液之目的。 由於根據本發明實施例欲製備之人類生長因子組成中 所含之人類生長因子的分子量皆遠大於3 5 KD，例如egf 之分子量約為6KD而TGF-阳之分子量更高達25〇KD，故 而根據本發明實施例之方法所產生之人類生長因子大部分 會留存於透析膜之中。最後，收集透析膜中留存之溶液， 其至少包含二種人類生長因子。此種利用本發明實施例之 方法所製備之人類生長因子組成的特徵在於包含至少三種 可偵測之生長因子（偵測方法將於下文詳述），上述生長因 子可以是 EGF、bFGF、IGF-1、PDGF、VEGF、TGF必、 SCF、IFN-γ、RANTES、Τρο、TIMP、瘦體素、IL-6、或 IL_8。 < S ) 12 1354024 實施例（二） 人類生長因子组成之定性分析

以人類細胞介素抗體微陣晶片（RayBio™ Human Cytokine Antibody Arrays )檢測該透析液中之生長因子組 成，檢測結果如第1圖之人類細胞介素抗體微陣圖所示。 由第1圖可以發現，根據本發明實施例製備之人類生長因 子組成所含之人類生長因子種類及其彳貞測極限（limit of detection，LoD)如下：EGF (偵測極限 1 pg/ml )、bFGF (4貞測極限 10000 pg/ml )、IGF-1 (偵測極限 10 pg/ml )、 PDGF (偵測極限1000 pg/ml )、VEGF (偵測極限100 pg/ml )、TGF-/33 (偵測極限 100 pg/ml )、SCF (偵測極限 10 pg/ml)、IFN-γ (偵測極限 100 pg/ml)、RANTES (偵測 極限 2000 pg/ml )、Τρο (偵測極限 100 pg/ml)、TIMP (偵 測極限1 pg/ml)、痩體素（偵測極限100 pg/ml)、IL-6 (偵 測極限1 pg/ml)、以及IL-8 (债測極限1 pg/ml)。

在本說明書中，「偵測極限」一詞係指利用本發明實施 例之方法進行人類生長因子定性分析時，所採用之檢測方 法的最低偵測濃度。換句話說，待測樣本中所含之特定人 類生長因子的濃度，必須至少等同於或大於檢測方法所用 之偵測極限，才可能被檢測出來，在此種情形下，亦可將 該特定人類生長因子稱為「可偵測的」人類生長因子。

此外，分別利用SCF RayBioTM ELISA Kit套組以及 VEGF RayBio™ ELISA Kit 套組，針對 SCF 與 VEGF 二種 生長因子進行定量分析，其結果如第2A及2B圖所示。由 第2Α及2Β圖可以發現，以各套組内所附的SCF與VEGF (S ) 13 1354024 標準品做迴歸直線，可求得本發明實施例製備之人類生長 因子組成中’ SCF之濃度約1380 pg/mi，且VEGF之濃度 約 25130 pg/ml。 相較於先前技藝所用之幹細胞培養方法，培養液中則 不含可偵測的TGF-/?3(偵測極限1〇〇pg/ml)以及sCF (偵 測極限10 pg/ml)，亦即利用先前技藝幹細胞培養方法’培 養液中TGF-尽3含量小於丨〇〇 pg/mi，且sCF含量小於！ 〇 pg/m卜此外’利用先前技藝幹細胞培養方法培養液中 VEGF的濃度僅為約200-500 pg/m卜然而，本發明實施例 之人類生長因子溶液中，則含有可偵測的TGF_妇，亦即 TGF-/33的含量大於等於1〇〇 pg/ml，且所含之SCF濃度 ( 1380 pg/ml)以及 VEGF 濃度（2513〇 pg/ml)皆遠高於 先前技藝。 實施例（三） 促進表皮細胞再生的组合物 在本發明之另一具體實施例中，提出一種用以促進表 皮細胞再生的組合物，其至少包含根據本發明實施例之人 類生長因子組成、一營養成分、一乳化劑溶液、以及一油 相液體《上述營養成分包含根據本發明實施例製備人類生 長因子組成時所用之營養液的一部份，在較佳的情形中， 營養成分至少包含一或更多種胺基酸和/或維生素。上述之 乳化劑溶液及油相液體可將人類生長因子組成及營養成分 以油包水·水包油（w/0/w)之方式包埋成一微脂體包埋物。 1354024 在本發明實施例中，上述乳化劑溶液包含約0.5-1%之

Tween 80、以及約ι_ι〇%之山梨糖醇半油酸脂（sorbitan sesquioleate，Arlacel 83 )。在本發明之實施例中，上述乳 化劑溶液可更包含約80-90%之純水、約1-1〇%之玻尿酸和/ 或約1-10%之葡萄糖。

在本發明實施例中，上述油相液體包含約1-10%之卵 璘脂、約1-10%之膽固醇以及約80-90%之磷脂質。在本發 明之實施例中’能夠以其它油脂成分取代上述之磷脂質， 例如上述油相液體可包含窥麻油和/或礦物油。 根據本發明實施例，更可在上述用以促進表皮細胞再 生的組合物中加入水溶性膠體，以增加微脂體包埋物之安 定性。水溶性膠體包含約1-10%之Tween 20、約1-10%之 丙二醇（propylene glycol，PG)、約 1-10%之 PEG-600、以 及約1-5%之膠體物質，其中上述膠體物質可以是三仙膠、 透明膠、或其組合物。在本發明一實施例中，水溶性膠體 可更包含約1 -10%之玻尿酸。

根據本發明之一具體實施例，於約4°C下在約l〇ml純 水中加入約2-5公克Tween 80、約2-5公克Arlacel 83、約 3-5公克玻尿酸和約2-5公克葡萄糖加以溶解’以製備成總 體積約20 ml之乳化劑溶液。另一方面，將約5-10公克卵 磷脂、以及約2-5公克膽固醇加入約20-30ml篦麻油和約 10-20 ml礦物油中，以製備成總體積約40 ml之油相液體。 此外，在約60-80ml之純水中，加入約10-20公克Tween 20、 約10-20公克PG、約2-5公克PEG-600、約5-10公克三仙 膠、以及約10-20公克玻尿酸，以製備成總體積約120 ml 15 1354024 之水溶性膠體。 於約4它下取約20 ml乳化劑溶液以及等體積（即’約 2〇 mi)之經3.5 KD透析膜透析之人類生長因子溶液混合。 接著，緩慢加入約的如油相液體，以8，_·1〇，_Γριη的 高壓均質機於約4。(：下攪拌均勻，攪拌持續約1〇_2〇分鐘。 以形成微脂體奈米顆粒（w/0/w)<>最後，加入約12〇〇1丨水 溶性膠體，以2,500-3,000 rpm的均質機於約4〇c下攪拌均 勻，攪拌持續約20分鐘，最終所得之乳糜狀組合物，即為 本發明實施例之用以促進表皮細胞再生的组合物。 在本實施例中，加入水溶性膠體之目的在於增加微脂 體奈米顆粒之安定性，T使微脂體奈米顆㈣的水溶性蛋 白質於室溫保持活性達2〜3年之久。 實施例（四） 小鼠皮膚傷口療合/表皮細胞再生試驗 在本發明具體實施例中，以小鼠皮膚傷口癒合試驗測 0 #本發明實施例之用以促進表皮細胞再生的組合物對傷口 癒合率之影響。本試驗共進行了二組試驗組（微脂體A、 以及微脂體B)及一組對照組（微脂體c)，每組各利用四 隻八週齡大之Balb C鼠，將每隻小鼠以滅菌處理之解剖刀 於小鼠剃毛後之背部剪下〇.5 χ 〇·5 cm2之傷口，隨即以顯 微鏡觀察小軋皮膚傷口，並擷取及記錄第〇日傷口影像， 並以軟體計算第〇日傷口面積；小鼠皮膚傷口癒合試驗之 試驗設計如下： 微脂體A :以微脂體包埋本發明實施例所述之人類生 1354024 長因子溶液（即，實施例（三）之用以促進表皮細胞再生 的組合物） 微脂體B :以微脂體包埋本發明實施例所述之營養液 微脂體C :以微脂體包埋生理食鹽水

在傷口造成一小時候，於試驗用小鼠的傷口上均勻塗 抹約100 μΐ之微脂體A、B、或C。其後，每隔24小時， 分別以同樣之方式塗抹約100 μΐ之微脂體A、B、或C，一 共塗抹三次。第三次塗抹後24小時，即傷口產生後之第3 曰’以顯微鏡觀察小鼠皮膚傷口，並擷取及記錄第3日傷 口影像，並以軟體計算第3日傷口面積。 本實施例所用之顯微鏡係連接電荷耦合元件（Charge Coupled Device ’ CCD)以擷取小鼠皮膚傷口之影像，並於 擷取影像後，將該影像傳輸至電腦進行影像處理及傷α面 積計算、統計；影像處理及傷口面積計算所使用之軟體為 Northern Eclipse image system ;而數據統計則以軟體

SigmaStat program (2002)進行分析，係以單項變方分析 (One-way Analysis of Variance ’ ANOVA)的鄧肯氏多變域測 驗（Duncan’s New Multiple Range Test, DMRT)進行叶算。 小鼠皮膚傷口影響如第3圖所示。第3A圖為小鼠第〇 曰之傷口影像；第3B圖為經微脂體A處理之小鼠第3日 之傷口影像；第3C圖為經微脂體B處理之小鼠第3日之傷 口影像；以及第3D圖為經微脂體C處理之小鼠第3日之 傷口影像。比較第3A-D圖可以發現，經過本發明實施例之 用以促進表皮細胞再生的組合物（微脂體A)處理=天後 的小鼠皮膚傷口面積（如第3B圖所示），明顯小於另—組處 (S ) 17 1354024 理的小鼠皮膚傷口面積（如第3C及3D圖所示）。 以影像處理軟體計算各組小鼠第0天及第3天之皮膚 傷口面積，以換算傷口癒合率’其計算方式如下： 傷口癒合率（％) =(第0日皮膚傷口面積·第3天之皮 膚傷口面積）/第〇曰皮膚傷口面積x 100% 取各組小鼠傷口癒合率平均值，結果如第4圖，其中微脂 體A組小鼠的傷口癒合率約為70%，而微脂體B小鼠的傷 口癒合率約為61%，微脂體C組小鼠的傷口癒合率約為52 〆傷口癒合率之統計分析結果如表一所示。由表一可以 發現，相對於對照組微脂體c ,試驗組微脂體A以及微脂 體B中，小鼠傷口癒合率皆具有顯著差異（p<〇 〇5)。 --；_：- ·" '心w似口卞观ST力不/Γ 傷口癒合率（％) I II III IV 微脂體A 69 68 73 71 微脂體B 61 60 62 60 微脂體C 52 51 49 54 60.75 0.96 51.50 2.10

實施例（五） 人類皮膚試驗 、述實施例—所製得微脂體A :以微脂體包埋本發明實 施例所述之人類生 長因子溶液（用以促進表皮細胞再生的 18 1354024

組合物）進行人類皮膚試驗，試驗對象之資料如表二所示，於試驗前 拍照記錄各試驗對象之試驗部位，如第5A ' 5C、5E、及5G圖所示。 表二人類皮膚試驗試驗對象之資料 試驗者 性別 年齡 試驗部位 試驗前 試驗後 試驗者1 男 44 眼尾皺紋處 第5A圖 第5B圖 試驗者2 男 29 額頭青春痘 第5C圖 第5D圖 試驗者3 女 20 臉部青春痘 第5E圖 第5F圖 試驗者4 女 25 臉部青春疫 第5G圖 第5H圖

將上述實施例三所製得微脂體A局部塗抹於各試驗者之試驗部 位’每曰塗抹2次’一次塗抹2ml，連續塗抹3〇曰後，拍照記錄各試 驗對象之試驗部位’如第5B、5D、5F、及5H圖所示。由第5A及5B 圖可以看出，連續使用本發明所提供之促進傷口癒合之組合物3〇曰 後’可以使臉部皺紋淡化。此外，由第5D、5F、5H圖也可看出，本 發明所提供之促進傷口癒合之組合物亦可使臉部皮膚之疤痕(如：青春 癌淡化。 由上述本發明較佳實施例可知，應用本發明具有下列 優點。 首先’藉由本發明實施例之體外培養人體骨髓間葉幹 細胞的方法’使得人體骨髓間葉幹細胞可產生人類生長因 19 1354024 子組成，上述人類生長因子組成至少包含複數種與傷口癒 合/表皮細胞再生相關之生長因子。此外，由於這些生長因 子是由人體骨髓間葉幹細胞所表現，其成分和人體自身表 現之生長因子相同且不含原核内毒素。另一方面，這些生 長因子之活性及種類亦優於人類成體細胞和/或基因重組 之異種細胞所表現者。

再者，根據本發明實施例之培養方法，可於末代培養 液中加入一營養液’其含有一或更多種胺基酸和/或維生 素’可在培養過程中提供額外的養分給人體骨髓間葉幹細 胞。此外’根據本發明製備用以促進表皮細胞再生的組合 物時，不需移除末代培養時額外加入之營養液，因而最終 用以促進表皮細胞再生的組合物中所含的營養液可額外提 供表皮、真皮組織再生、以及膠原纖維重整所需之養份， 而和本發明實施例之人類生長因子組成產生一種加乘效 果，進一步提升表皮及真皮組織之傷口癒合和/或膠原纖維 重整能力。 最後’上述用以促進表皮細胞再生的組合物不僅可透 過微脂體包埋法以形成一種可内用或外服之生長因子微脂 體，更可加入一人工皮膚或一皮膚替代物中，以促進表皮 細胞再生。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以 限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神 和範圍内，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護 範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 20 1354024 【圖式簡單說明】 為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例 能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下： 第1圖為一人類生長因子抗體微陣圖； 第2A圖闡明本發明之生長因子組成中幹細胞生長因 子（SCF)之濃度； 第2B圖闡明本發明之生長因子組成中血管内皮生長 因子（VEGF)之濃度；

第3 A-D為顯微照相圖，闡明依照本發明一具體實施 例，小鼠皮膚傷口癒合情形；以及 第4圖為長條圖，闡明依照本發明一具體實施例，以 各種微脂體成分處理小鼠皮膚傷口對於皮膚傷口癒合率之 影響。 第5 A-Η為顯微照相圖，闡明依照本發明一具體實施 例’人體皮膚傷口癒合與淡化細紋情形。

【主要元件符號說明】 21

Claims (1)

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降告本I 十、申請專利範圍： 1 · 一種於體外培養人體骨髓間葉幹細胞以製備人類生 長因子之方法，該方法至少包含： 進行初代培養，其係在一含10%胎牛血清之DMEM培 養液的初代培養液中培養人體骨髓間葉幹細胞； 取出該初代培養液中之黏貼型細胞，以一含10〇/〇胎牛 血清之DMEM培養液的繼代培養液進行繼代培養； 取出該繼代培養液中之該黏貼型細胞，以一末代培養 液進行末代培養，讓該末代培養液中之該黏貼型細胞分泌 多種生長因子至該末代培養液中以形成一人類生長因子溶 液其中该末代培養液為一無血清培養液且至少包含含量 約為5〜25 ng/ml的人類胰島素生長因子；以及 取出”玄生長因子溶液，利用一 35〇〇 kD之透析膜進行 透析3至5日’以純化該人類生長因子溶液。 1項所述之方法，其中該初代培 1項所述之方法，其中該繼代培 2.如申請專利範圍第 養之步驟係進行3曰。 •如申請專利範圍第 養之步驟係進行3曰。 ,4.如申請專利範圍第 行該繼代培養之步驟，主 若1項所述之方法，更包含重複進 其中該重複次數最多20次。 22 1354024 100年5月26日修正替換頁 5. 如申請專利範圍第丨項所述之方法，其中該末代培 養之步驟係進行3日。 6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該末代培 養液更包含一營養液，其中該營養液至少包含： ‘ 至少一胺基酸，其係選自由丙胺酸、精胺酸、天門冬 醯胺酸、天冬胺酸、半脱胺酸、胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、 組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺 ^ &、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、及纈胺 酸所組成之群組；和/或 至 >、維生素，其係選自由維生素A、維生素b 1、維 生素B2、維生素B3、維生素^、維生素郎、維生素Bn T生素C、維生素D2、維生㈣、維生素H、維生素κ3、 氣化膽鹼、葉酸、及肌醇所組成之群組。 7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該至少一 •=酸之含量各約為5〜⑽mg/L，以及該至少—維生素之 含量各約為〇. 1〜10 mg/L。 8. -種人類生長因子組成，其係利用如申請專利範圍 第1至7項中任—項所述之方法所製備，其包含至少三種 可谓測之生長因子，該生長因子係選自由表皮生長因子、 鹼性纖維母細胞生長因子、人類胰島素生長因子、血小板 衍化生長因子、金管内皮生長因子、轉化生長因子、及幹 細胞生長因子所組成之群組。 23 1354024 100年5月26日修正替換頁 9·—種用以促進表皮細胞再生的組合物，包含： —如申請專利範圍第8項所述之人類生長因子組成； —營養成分，其包含至少一胺基酸和/或至少一維生 素，其中該胺基酸係選自由丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺 酸、天冬胺酸、半胱胺酸、胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組 ‘ 胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、 脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、及纈胺酸所 組成之群組，該維生素係選自由維生素A、維生素B1、維 ^ 生素B2、維生素B3、維生素B5、維生素B6、維生素B12、 維生素C、維生素D2、維生素E、維生素H、維生素K3、 氣化膽鹼、葉酸、及肌醇所組成之群組； 一乳化劑溶液；以及 一油相液體，其中該乳化劑溶液及該油相液體將該人 類生長因子組成及該營養成分以油包水-水包油之方式包 埋成一微脂體包埋物D # 1〇.如申請專利範圍第9項所述之用以促進表皮細胞 再生的組合物，其中該乳化劑溶液包含TWeen 80、以及山 梨糖醇半油酸脂。 11. 如申請專利範圍第9項所述之用以促進表皮細胞 #生的組合物’其中該乳化劑溶液更包含純水、玻尿酸、 以及葡萄糖。 12. 如申印專利範圍第9項所述之用以促進表皮細胞 24 1354024 100年5月26日修正替換頁 再生的組合物’其中該油相液體包含卵磷脂、膽固醇以及 鱗脂質。 13.如申請專利範圍第9項所述之用以促進表皮細胞 再生的組合物，其中該油相液體更包含篦麻油、或礦物油》 14'如申請專利範圍第9項所述之用以促進表皮細胞 再生的組合物，更包含一水溶性膠體，其中該水溶性膠體 包含Tween 20、丙二醇、PEG_6〇〇、以及一膠體物質，其 中該膠體物質為三仙膠、透明膠、或其組合物。 15.如申請專利範圍第14項所述之用以促進表皮細 胞再生的組合物’其中該水溶性膠體更包含玻尿酸。

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幹細胞生長因子 10 - y=0.4373x+0.0039 OSKIO 0· 〇 v.yjyji

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第5C圖 第5D圖

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第5G圖 第5H圖