TWI353990B - A method for the preparation of a heat stable oxyg - Google Patents

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1353990 四、 指定代表圖： ()本案指定代表圖為：第（2)圖。 (一）本代表圖之元件符號簡單說明：無。 五、 本案若杨學式時，請揭綠賴神日㈣徵的化學式： 無0 ^、、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於-種含熱穩定氧載體之藥學組成物的製 備方法與由此程序所製造的組成物。本發明也關於此含哉 穩定氧載體之藥學組成物對於人類或其他動物之癌症治 療、缺氧失調與器官保存的用途。 【先前技術】 血紅素（hemoglobin)在大部分脊椎動物中扮演一重要 角色用於在血管系統與組織之間的氣體交換。复對經由血 液循環從呼吸系統搆帶氧氣至身體細胞及並且攜帶代謝廢 棄產物一氧化碳離開身體細胞至呼吸系統負責，其中二氧 化碳被呼出。由於血紅素具有此氧氣運送特徵1以# 可^ h叩被穩定化且“心>〇被使用，則其可作為一強 有力的氧氣供應者。 自然發生之血紅素為— 時，其通常為穩定的。然而， 四聚體，當存在於紅血球内 當將自然發生之血紅素從紅 1353990 血球移出時’其在血漿中變得不穩定且裂成兩個α—沒二 聚體（dimer)。這些二聚體的每一個在分子量中為約32 kDa。xi些二聚體可導致實質腎臟損傷，當其經由腎臟過濾 亚排泄時。四聚體連接的損壞也負面地衝擊在循環中之功 能性血紅素的持續性。 為了解決此問題，近來在血紅素處理的發展中已將各 種乂聯技術具體化以產生在四聚體内之分子内鍵結及在四 聚體之間的分子間鍵結以形成聚合之血紅素。先前技術教 為了卩加血紅素之循環半衰期，聚合之血紅素為較佳的 形式:然而，依照本發明發明人所測定，聚合之血紅素在 血液趣中更容易轉變為變性血紅素（met-hem〇glc)bin)。 變性，紅素無法結合氧氣且因此無法使組織充氧。因此， 引起聚合之血紅素形成之由先前技術所教示的交聯是個問 題。本技術領域中需要一技術，其允許分子内交聯以產I 穩定^聚體而沒有聚合之血紅素的同時形成。 ^者試圖穩定血紅素之先前技術的更進-步問題包括 包含不能接受之高百分比之二聚體單㈣四聚體血紅= 丄—聚體的存在使血紅素組成物不符合投予哺乳動物 重腎鮮二聚體形式可在哺乳動物身體中導致嚴 ^ Λ腎臟損傷可嚴重至足以導致死亡。因此， t = :要產生穩定的四聚體血紅素，其在終產物 中，、有偵測不到的二聚體形式。 壓方術血紅素產物的另一問題為在投藥後於血 反方面的突然增加。在過去，已記錄了由於較老一代之血 1353990 . 紅素氧氣載體的血管收縮（vasoconstriction)事件。例 如’如 Katz et al.，2010 所揭露，Hemopure®產品（Biopure Co.，USA)導致較高的平均動脈血壓（124 ±9 mmHg)，或當 相較於基線（96±10 mmHg)時高出30%。試圖解決此問題之 先前技術已依靠硫醇基（sul f hydry 1)基團試劑來與血紅素 硫醇基基團反應’據稱以避免内皮衍生血管舒張因子 (endothelium-derived relaxing factor)與硫醇基基團結 合。然而，硫醇基處理的使用增加了處理步驟，導致成本 籲與之後必須從血紅素組成物移除之雜質的增加。因此本技 .術領域中需要一程序，其用來製備出當提供給哺乳動物時 . 不會引起血管收縮與高血壓的血紅素。 隨著先前技術試圖產生穩定之血紅素的更進一步問題 包括蛋白質雜質，例如免疫球蛋白G的出現，其會在哺乳 動物中導致過敏反應。因此，本技術領域中需要一程序， 其可產生穩定的四聚體血紅素而無蛋白質雜質。 • ㊉了上述問豸’本技術領域中需要-經穩定化的四聚 體血紅素，其為沒有二聚體、沒有磷脂質，且可以工業規 模來生產。 ^ 【發明内容】 本發明提供用來處理一非聚合、熱穩定經純化之經交 聯之四聚體血紅素’此四聚體▲紅素適合用於哺乳動物中 而不導致嚴重腎臟損傷' 血管不利作用（—Γ demmentaleffect)與嚴重有害事件，包括死亡。本發明 1353990 移除血紅素的二聚體形式、未經交聯之四聚體血紅素、填 脂質與蛋白質雜質。此外，本發明使用（D用以準確且經控 制之低滲透壓裂解（hypotonic lysi s)的即刻細胞溶解設 備（instant cytolysis apparatus)，（2)流動管柱層析 (flowthrough column chromatography)，（3)用以在純化 程序中熱處理血紅素溶液的高溫短時間設備以移除不希望 獲得之非經穩定化的血紅素二聚體並移除蛋白質雜質，例 如免疫球蛋白G (immunoglobin-G)，以可避免腎臟損傷、 血官不利作用與其他毒性反應，及（4)一密閉輸液袋包裝以 避免氧氣侵入產物。 此方法包括哺乳動物全血的起始材料，其包括至少紅 血球與血漿。在哺乳動物全血中將紅血球從血漿分離，接 1藉由過濾以獲得一經過濾之紅血球部分組（fracti〇n)。 /月洗經過壚之紅血球部分組以移除血聚蛋白質雜質。在一 即刻細胞溶解設備以5Q]_ L/小時之流速，藉由一經控 制之低#透壓裂解達到足以裂解紅血球而不裂解白血球的 時間’來使經清洗的紅血球破裂。執行過濾以從溶解產物 (bat0移除無用阻留物的至少—部份。從上述溶解產物 萃取一第一血紅素溶液。 2用設置來移除扣較於四聚體血紅素具有較高分子量 過濾 灿士 atlQn fUter)來執 超過遽程序，以從第一血紅素溶液更進一步移除 任何病毒與殘餘之無用阻留物以獲得—第？ 對第二…溶液執行流動管柱層析⑴。二h 1353990 column chr〇mat〇graphy)以移除蛋白質雜質、二聚體血紅 素與磷脂質以形成無磷脂質血紅素溶液。使用設置來移除 雜貝一過遽器來對無磷脂質血紅素溶液執行一第二超過遽 程序產生一經濃縮純化之無磷脂質血紅素溶液。 藉由雙-3,5-二溴水楊基延胡索酸脂（匕丨5_3,5_ dibromosal icyl fumarate)來使至少經純化之血红素的 « - α次單元交聯以形成熱穩定之經交聯的血紅素而沒有 聚合之血紅素的形成，以使所產生之非聚合之經交聯的四 聚體血紅素的分子量為60 — 70 kDa。如在此使用之措辭“非 聚合”，意指四聚體血紅素，其不與其他血紅素分子或任 何其他非血紅素分子，例如PEG，分子内（intenn〇lecuiariy) 交聯。將一適合之生理緩衝溶液，例如磷酸鹽緩衝溶液 (phosphate buffered saline， PBS)、乳酸林格氏液 (lactated Ringer’s solution)、醋酸林格氏液（acetated Ringer’s solution)或Tris緩衝溶液，與經交聯之四聚體 血紅素進行交換（exchange)。使用切流式過遽 (tangent i a卜flow Π ltrat ion)來移除任何殘留之化學藥 劑。 在此程序之後’熱處理經交聯之血紅素以移除任何殘 餘之未經父聯之四聚體血紅素與任何未經穩定化的血紅 素，例如·一 I體形式之血紅素與任何其他蛋白質雜質。在 熱處理之前，視需要而定，以約〇. 2%之濃度將N_乙醯基半 胱氨酸（N-acetyl cysteine)添加至經交聯之四聚體血紅 素以避免變性血紅素的形成。立即在熱處理與冷卻之後， 1353990 以約0 · 2 %至〇 4 〇/，、曲a ，4/。之遍度添加N-乙醯基半胱氨酸以更進一 步避免變性血紅素的形成。熱處理較佳為執行於約7(TC至 95 C達3°和至3小時’伴隨隨後冷卻至25。。的-高溫短 時間的處理。错由一離心或一過渡裝置來移除在熱處理期 間所形成的任何沈殺以因此形成—乾淨的溶液。 然後將無二聚體、無磷脂質、無蛋 非聚合之經交聯的四聚體血紅素添加至一藥學上可、之 載體》 之後將此熱穩定、經交聯的四聚體血紅素配製並包裝 成-訂製且密封之聚乙稀、乙浠乙酸乙烯醋、乙烯_乙烯醇 (PE，EVA，EVGH)輸液袋。此包裝避免氧氣污染，氧氣污染 導致失效之變性血紅素的形成。 、 將由以上方法形成之熱穩定經交聯的四聚體企紅素被 用於各種癌症，例如白血病、大腸直腸癌、肺癌、乳癌、 肝癌、鼻咽癌與食道癌的治療。摧毀癌症細胞的機制為增 進在缺氧狀態中之艘瘤的充氧，因此增強對於放射與化學 療法試劑的敏感度。也將此熱穩定經交聯之四聚體聚合物 用於在移植期間之器官組織的保存，或用於在μ _缺 乏氧氣供應之情況中的心臟的保存，例如在缺氧心臟 (oxygen-deprived heart)中。 【實施方式】 血紅素為在哺乳動物與其他動物之血液之紅血球中的 含鐵氧氣運送蛋白質。血紅素顯示蛋白質三級與四級結構 8 1353990

兩者的特性。在血紅素中的大部分胺基酸形成α螺熒，复 由短的非螺旋片段所連接。氫鍵穩定在血紅素中的螺旋部 分引起在分子内對其之吸引折疊各多胜肽成一特定形狀15 從四個球狀蛋白質次單元來裝配血紅素分子。各單元為 一多胜肽鏈所組成，多胜肽鏈被排成一組之α螺旋結構片 段其連接成一具有嵌入之血色素（heme)基團的‘‘肌紅蛋 白折疊（myoglobin fold)” 配置。

血色素基團係由包含於雜環中之鐵原子所組成，已知 為卟啉（porphyr iη)。鐵原子在環中心平均地與四個氮原子 結合，而環呈一個平面的狀態。之後氧可垂直於卟啉環 平面與鐵中心結合。因此，一單一的血紅素分子具有與 的 四 個氧之分子結合的能力。 在成年人類中，最通常形式的血紅素為一被稱為血紅 素A的四聚體，其係由稱為α2/?2之兩個α與兩個万非 共價結合次單元所組成，各分別由141與146個胺基酸殘 ® 基所形成。α與冷的大小與結構為彼此非常相似。各次 單元具有約65 kDa之四聚體總分子量的約丨6 kDa分子量。 四條多胜肽鏈藉由鹽橋、氫鍵與疏水交互作用 (hydrophobic interact ion)彼此結合。牛之血紅素的結構 相似於人類血紅素（在α鏈中9〇 14%相同；在冷鏈中 84. 35%相同）。差異為在牛之血紅素中位於沒Cys 93的兩 個硫醇基（sulfhydryl)基團，而在人類之血紅素中之硫醇 基為为別位於a Cys 104、/3 Cys 93與/3 Cys 112。第 1圖顯不牛、人類、狗、豬與馬的血紅素的胺基酸序列排

丄 J J 丄 J J >!>與£。第1圖指出當將它們的 人類血紅素與牛、狗、豬與馬的 比，分別標示為B、h、 胺基酸序列進行比較時 血紅素共有高的相似度 在紅血球内自然發生的血紅素中 Ο ^ ^ A …鏈與其對應d 冷鏈的結合為非常牢固的， 在生理上正常的狀態下5 離然而，一個α泠二聚體血2 ., 、 體’、另—個二聚體的結^ 在、工血球外為相當地弱。 沾 # '、。具有分裂成各約32 kDa - 兩個〇: /5二聚體的傾向。 > & 二不希望得到之二聚體夠小ί 被腎臟過慮並被排泄，伴隨 ^ 斤丨現潜在腎臟損傷與實質上下降二 血管内保留時間的結果。 因此，為了功效與安全性， 何血紅素穩定。於下方概述產 程；將本發明製程的概要呈現在

最初’選擇一全血為來自 擇哺乳動物全血，包括，但不 的全血。將紅血球細胞從血漿 除血漿蛋白質雜質。 需要使用在紅血球外的任 生經穩定化之血紅素的製 第2圖的流程圖中。 紅血球之血紅素的來源。選 限於人類、牛、豬、馬與狗 分離、進行過濾與清洗以移 為了從紅血球細胞釋放血紅素，將細胞膜裂解。雖 可使用各種技術來裂解红血球，本發明使用在低滲透壓 態下的裂解，以適合工業規模生產之在體積方面可被準 :控制的方式。為此目的，使用如第3圖所見之即刻⑷ 溶解設備來裂解紅血球。低滲透壓裂解產生溶解產物的〉 液，其包括血紅素與無用之阻留物。為了使工業規模生乂 可能，裂解被小心地控制以便只裂解紅血球而不裂解白』 10 1353990 -.球或其他細胞。在—實施例中，選擇即刻細胞溶解設備的 尺寸以使紅血球細胞在此設備來回移動2至秒或其他足 夠以裂解紅血球的_時間的期間’且較佳為加秒。即刻細 胞溶解設備包括一靜態授拌器（static mixer)。將經去離 =與条鶴的水使用為—低渗透m溶液。當然可以瞭解的 疋八有不同鹽類濃度之低滲透壓溶液的使用會導致不同 的紅金球裂解時間期間。由於經控制之裂解程序只裂解紅 ·=球而不裂解白▲球或細胞物f ’其將毒性蛋白質、鱗脂 質或來自白血球之DNA與其他細胞物質的釋放最小化。在 • 30秒後立即添加高滲透㈣啊㈣⑷溶液，其為在含紅 ，‘血球之溶液已於即刻裂解裝置之靜態搜摔器部分來回移動 之後。所產生之血紅素相較於產生自使用其他裂解技術的 血紅素，具有較高的純度及較低程度的污染物，例如不希 望得到的DNA與鱗脂質。分別藉由聚合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reacti〇n)(偵測極限=64 即）與高效 籲能液相層析（high perf〇rmance nquid chr〇mat〇graphy， HPLC)方法（偵測極限=】# g/ml )，並未在血紅素溶液中偵 測到來自白血球之不希望得到的核酸與磷脂質雜質。 執行兩個超過濾程序：一個，其在流動管柱層析前， 移除具有大於血红素之分子量的雜質，而另一個其在流 動管柱層析後，移除具有小於血紅素之分子量的雜質。後 面的超過攄程序濃縮了此血紅素。在一些實施例中，一 1 〇 〇 kDa過濾器被使用為此第一超過濾，而一 3〇 k])a過濾器被 使用為此第二超過渡。 11 1353990 使用流動官柱層析來移除在經純化之血紅素溶液中的 蛋白質雜質’例如免疫球蛋白G、白蛋白（albumin)與碳酸 酐酶（carbonic anhydrase)。在一些實施例中，藉由使用 市售可得之離子交換管柱’例如DEAE管柱、CM管柱 '經 填灰石管柱（hydroxyapatite column)等的一個或一組合 來執行管柱層析。管柱層析的pH —般從6至8.5。在—實 施例中’使用流動CM管柱管柱層析步驟，以在PH 8. 〇移 除蛋白質雜質。在從管柱層析洗提之後，執行酵素連結免 疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 以偵測殘留在樣本中的蛋白質雜質與磷脂質。此獨特的流 動管柱層析分離使工業規模生產之連續分離系統為可能。 酵素連結免疫吸附分析結果顯示這些雜質的量在經洗提的 血紅素中是相當低的（免疫球蛋白G: 44. 3 ng/ml ;白蛋白： 20. 37 ng/ml ;碳酸酐酶：81. 2 // g/ml)。以不同之pH值 使用不同之管柱的蛋白質雜質移除結果顯示於下方表1 中。 表1

移除百分比（％) 碳酸酐酶_白蛋白_免疫球蛋白G 管柱(pH狀態） 2 5 8 0 2 . . 6 6 3 3 3 5 2 DEAE(於 pH 7. 5) --- 呢紐(於邱7.8) — CM(於 pH 6.2) — CM(於 pH 8.0) 5.6 连^石（於 pH 7.5) 4.5 在管柱層析程序之後’藉由雙-3，5-二漠水楊基延胡索 酸脂（bis-3, 5-dibromosalicyl fumarate，DBSF)使血红 IJ53990 .'、^父乂聯為了避免聚合之企紅素的形成，於周遭溫度 (15 25c)’較佳為在約8-9的pH，以介於1:2.5至1: 4. 0之血紅素比DBSF的莫耳比將反應小心地控制在一無 氧％境中（較佳為小於〇丨ppm溶氧程度），計自3至16小 4的一 間期間’以使所產生之經交聯的血紅素為四聚體 血紅素，其具有6〇_7〇 kDa的分子量顯示聚合之血紅素 不存在DBSF反應的產量為高的，> 99%，且二聚體濃度 眷在終產物中是低的。視需要而定，此程序不需要如在各種 先引技術中所使用之在交聯前與血紅素反應的硫醇基處理 ，試劑，例如碘乙醯胺（i〇d〇acetaraide)。 在此觀點，將磷酸緩衝溶液，一生理緩衝溶液與此經 ”聯的洛液父換（exchange)，且藉由切流式過濾 (tangential fl〇w fiitrati〇n)來移除任何殘留之化學藥 劑。 、 在無氧狀態下藉由DBSF之血紅素的交聯程序之後，本 •發明對於在一無氧環境中經交聯的四聚體血紅素溶液提供 =熱處理步驟。在熱處理之前，視需要而定添加n_乙酿基 半胱氨酸（N-acetyl cysteine)以避免變性血紅素（失效的 血紅素）的形成。在熱處理之#，將溶液冷卻纟立即添加 N-乙醯基半胱氨酸以保持低程度的變性血紅素。若在熱處 理之前與之後添加1乙醯基半胱氨酸，在熱處理之前的添 加里為約0· 2%，而在熱處理之後的添加量為約〇 2至 0.4¾。然而，若僅在熱處理後添加N—乙醯基半胱氨酸的話， 則添加量為0. 4%。 13 1353990 在一些實施例中，在從50°C至95°C的溫度範圍，在一 ·-無氧環境中（小於0.1 ppm溶氧程度）將經交聯之四聚體血 -紅素溶液加熱，持續0 · 5分鐘至1 0小時。在一些實施例中， 在攸7 0 C至9 5 °C的溫度範圍’將經交聯之四聚體血紅素溶 液加熱’持續3 0秒至3小時。在一些較佳實施例中，在 8〇°C，將經交聯之四聚體血紅素溶液加熱3〇分鐘。且在 又其他實施例中’將經交聯之血紅素溶液加熱至9 〇。〇計3 〇 移至3分鐘’之後在約1 5至3 0秒内快迷冷卻至約2 5 °C， 且如前述添加N-乙醯基半胱氨酸。產生一非常低量的變性 φ 血紅素，例如小於3%。沒有N-乙醯基半胱氨酸的使用，則 . 所形成之變性血紅素的量為約16%，對於藥學應用而言為 · 不能接受的高百分比。 · 之後使用南效能液相層析分析、電喷灑離子化質譜 (electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)、環兩色相性光譜（circuUr dichr〇isffl spectr〇sc叩〇 與用於P50測量之血氧分析儀（Hem〇x八⑽丨口“）來分析並 描繪此熱穩定經交聯之四聚體血紅素的特性。關於來自牛 血液來源之α紅素的方面，帛4圖顯示對於遭受於達 45秒至2分鐘或8G°C達30分鐘之熱處理之血紅素而言， 二聚體形式的血紅素在高效能液相層析系統中（偵測極 限：2.6域或〇 〇43%)為偵測不到的。發現經交聯之 非聚合四聚體血紅素在H9(TC為熱敎的達一段時 間°此熱處理（高溫短時間，HTST)步驟為使自然未經反應 之四伞體形式與—聚體形式之血紅素變性的強效步驟。 4 ^ C) 14 1353990 .. 為了分析此高溫短時間步驟的結果，使用高效能液相 層析的分析方法來偵測在此熱處理後之二聚體的量。高效 月匕液相層析分析的移動相包含氯化鎂（〇. π m)，其可分離 一聚體（非經穩定化之四聚體）與熱穩定經交聯的四聚體。 對於促進血紅素分解成二聚體而言，在相同之離子強度， 氯化鎂比氯化納更有效約3。倍。熱處理步驟也扮演一變性 步、引人注目地移除在經交聯之四聚體血紅素中的不需 籲要的蛋白質雜質（在免疫球蛋白G方面侦測不到；在白蛋白 方面讀測不到；在破酸祿t Π η ^針起方面99.99%降低）。執行酵素 .連結免疫吸附分析(_以在樣本中偵測蛋白質雜質。因 •，此丄、屯化、熱穩定之經交聯的四聚體血紅素溶液具有 無法谓測出之程度的二聚體（ 、低於偵測極限：0. 043%)，盥 免疫球蛋白G，及非常低量的白 醢 贪白（0. 〇2 //g/ml)與碳酸 酐酶（〇· 014 # g/ml)。表2顯示 理井越s Φ款认 ；稭由尚溫短時間熱處 理^驟來移除蛋白質雜質盥_ 砵門赦考饰止 —聚體的實驗結果。此高溫短 體血-聚fm x聯的四聚體從非穩定之四聚 骽興一汆體的選擇性分離為可能。

樣本 狀態 無熱處理 80°C，10 分鐘 8〇°C ’ 15 分鐘 8〇°C，30 分鐘 無熱處理 9〇°C，1. 〇 分鐘 90°C，1. 5 分鐘 90°C，2. 0 分鐘 蛋白質雜質

0.36 無法偵測出 無法偵測出 _ 無法偵測屮 0.29 無法偵測出 無法偵測出 ^法偵測出 在對於經交聯之血紅素在 無氧狀態下的熱處理步 驟 15 1353990 之後’此熱穩定經交聯的四 裝而言為具備適合的條件。 熱穩定經交聯之四聚體血紅 明中之熱穩定經交聯的四聚 態下是穩定的。 聚體血紅素對⑨藥學配製與包 本發明描述在一無氧環境中之 素的—密封包裝步驟。在本發 體血紅素’大於兩年在無氧狀 '八％工文疋馬了靜脈 内注射應用而準備。傳統上，先前之產品使用—般PVC血 袋或Sten⑽血袋’其具有高的氧氣渗透性，高的氧氣渗 透性最終會縮短產品的壽命，由於其在充氧狀態下快速轉 變成失效之變性血紅素（在幾天内）。 於本發明中使用的包裝導致鈦籍 u衣命双热穩夂經父聯之四聚體血 紅素大於兩年是穩定的。使用EVA/EV〇H材料之一多層包裝 來將氣體滲透性最小化並避免失效血紅素的形成。設計用 來包含本發明經純化與熱穩定之經交聯的四聚體血紅素的 100ml輸液袋，為由一具有〇4mm厚度之五層的eva/ev〇h 疊層材料（laminated material)所製成，其具有在室溫每 大氣壓每24小時每10〇平方英吋〇 〇〇6_〇132㈣3的氧氣 滲透度。此材料為一第VI類塑膠（ciass VI plastic)(如 //7-κ/κο生物反應測試 USP<88>中所定義），其符合

Cm-Wfo Bi〇l〇gicai Reactivity Tests)與物理化學測試 (Physico-Chemical Test)，且適合製造為用來靜脈内注射 目的之輸液袋。此主要的袋子對於保護熱穩定經交聯的四 聚體血紅素溶液免於導致其不穩定性並最终影響其治療特 性的長期氧氣暴露為有效的。 16 1353990 對於血液產品的第·一級保s蔓而言，其已知為使用銘外 包裝（overwrap)以免於潛在的氣體洩漏且維持產品於一無 氧狀態。然而’在銘外包裝中具有針孔（pin hole)的可能 性’此可能性危及其密封並使產品不穩定。因此，本發明 使用銘外包裝小袋（aluminum overwrap pouch)為第二級包 裝’其避免充氧且也避免光暴露。外包裝小袋的組成包括 〇_〇12 _之聚對苯二甲酸乙二酯（polyethylene φ terephthalate’ ΡΕΤ)、0· 007 的鋁（A1)、〇. 〇15 mm 的 尼龍（nylon, NY)與 〇_lmm 的聚乙烯（p〇lyethylene，pE)。 •外包裝薄膜具有〇· 14 mm的厚度與在室溫每大氣壓每24小 •時每1〇〇平方英吋0.006 cm3的氧氣穿透率。此第二級包 裝延長血紅素的穩定時間，延長產品的貯藏期限 (shelf-life)。 精由各種技術來分析本發明的血紅素，包括電喷灑離 ^化質譜（ESI -MS)。電錢離子化f譜使非f大之分子的 刀析為可旎。其為一離子化技術’其藉由將蛋白質離子化 ::後,據質量/電荷比分離此經離子化的蛋白質來分析 量化合物。因此，可準確測定分子量與蛋白質交互 _ 5圖巾’電噴;麗離子化質譜分析結果#出熱穩 定經交聯之四聚鲈a,主 素四聚體卜 小為65心（非聚合之血紅 CDsp t《19〇纟24〇1^的遠紫外光環二色光譜(farUV 顯示血紅素之血球蛋白咖)的二級結 四聚體血&純化之血紅素溶液與熱穩定經交聯之 &體血紅素之光譜的—致 双f玍..肩不血紅素鏈正確地被折 17 1353990 疊’甚至是在90°C熱處理之後。環二色結果顯示此熱穩定 經交聯之四聚體血紅素具有約42%的α螺旋（alpha_ 1^11叉）、38%的5摺疊（1；)43 — 31^61:)、2.5%的；5彎曲（56七3-turn)與16%的無規線圈（rand〇in c〇il)。其更進一步破認 此經交聯之四聚體血紅素是熱穩定的。 於本發明中的製程為可適用於此熱穩定經交聯之四聚 體血紅素的大規模工業生產。此外，與藥學上可接受之載 體（例如’水' 生理緩衝溶液、以膠囊形式）結合之此熱穩 定經父聯的四聚體血紅素為適合哺乳動物使用。 本發明更揭露含氧載體之藥學組成物在增進組織充氧 中、在癌症治療中、在氧氣缺乏失調，例如缺血性休克的 /。療中與在低氧氣含量環境下（例如心臟移植）之心臟保存 中的用途。選擇劑量以具有約〇2_13 g/kg之濃度範圍， 伴隨小於10 ml/小時/kg體重的注射速率。 對於在癌症治療中的用途而言，本發明之含氧載體的 藥學組成物作為組織充氧試劑以增進在腫瘤組織中的充 氧’因此促進化學敏感性（Chem〇SenSitiVity)與放射線敏 感性（radiation sensitivity)。 此外’於本發明中證明此熱穩定經交聯的四聚體血紅 素增進在正常組織中（第7圖）與極度缺氧之腫瘤中（第8圖） 之充氧、人類鼻咽癌（使用CNE2細胞株）的能力。於第8 圖中顯示循著人類CNE2異體移植（xenograft)之組織路徑 (tissue track)的代表性氧氣輪廓。藉由與一微定位系統 (micro-positioning system) (DTI Limited)結合之光纖 1353990 氧氣感應器（fibreoptic oxygen sensor)來直接監測在腫 瘤塊中的氧氣分壓（p〇2)。在此熱穩定交聯之四聚體血紅素 之〇· 2 g/kg的靜脈内注射後，在15分鐘内’中位數（median) P〇2值從基線（base 1 ine)提高至約兩倍的相對平均氧氣分 麼且延續至6小時。此外，在注射後24至48小時，氧氣 程度平均仍然維持高於基線值25%至30%的程度。當與在本 發明中所製備之含氧載體的藥學組成物比較時，沒有市售 產σσ或現存之技術顯示如此高的功效。 對於腫瘤組織充氧而言，於第8圖中顯示人類頭頸鱗 狀細胞癌（head and neck squamous cel 1 carcinoma, HNSCC) 異體移植（FaDu)的代表性氧氣輪廓。在此熱穩定交聯之四 聚體血紅素之〇· 2 g/kg的靜脈内注射後，在3小時與6小 時分別觀察到在大於6.5倍與5倍之在平均p〇2方面的顯 著增加（第8圖）。

在對於癌症治療方面中的應用而言，本發明之含氧載 體的藥學組成物作為一組織充氧試劑以增進在腫瘤組織中 的充氧，因此增強化學與放射線敏感度…—光放射線與 此熱穩定經交聯之四聚體血红素結合的方面，延遲了腫瘤 在第/A圖中，代表性曲線顯示在鼻咽癌之鼠科動 I顯者的腫瘤縮小。以單獨X—光放射線（2Gy)或與 交聯之四聚體血紅素結合(2Gy爾處理帶有 ”體移植之裸小鼠。在[光放射線之前約3至6小 之此熱穩定經交聯的四聚體血紅素靜脈内 /射進小…導致鼻咽癌異體移植的—部分縮小。 19 t35399〇 在一實施例中，在注射此組成物並與化學治療試劑結 · · 合之後’觀察到顯著之肝臟腫瘤縮小。在第9B圖中，代表 -性圖顯示在大鼠原位（orthotopic)肝癌模式中的顯著腫戶 縮小。以單獨3mg/kg順氯氨鉑（cisplatin)或與〇.4g/kg 之此熱穩定經交聯的四聚體血紅素結合（順氯氨鉑+Hb)來 處理帶有肝腫瘤移植（orthograf t)(CRLl 601細胞株）的布 法羅大鼠（Buffalo rat)。在順氯氨鉑注射前之此熱穩定經 交聯的四聚體血紅素的投予導致肝腫瘤的一部份縮小。 對於在缺氡失調的治療中的用途而言與對於心臟保存 鲁 而言’本發明含氧載體之藥學組成物作為提供氧氣至目標 器官的血液代替物。 於第10圖中顯示以0.5 g/kg之熱穩定經交聯的四聚 體血紅素處理後，在嚴重缺血性休克之大鼠模型中的主要 動脈壓力的改變。在嚴重缺血性休克的大鼠模型中，以熱 穩疋經交聯的四聚體血紅素處理後’主要動脈壓力回復至 一安全且穩定的程度且維持於或約基線。以熱穩定經交聯 的四聚體血紅素處理之後，主要動脈壓力回復至正常所需 ® 的時間甚至比投予作為正控制組之自體（aut〇1〇g〇us)大氧 血液來得更短。結果指出在此熱穩定經交聯之四聚體血紅 素的輸液（transfusion)後，沒有發生血管收縮事件。 【實施例】 藉由描述本發明特定實施例的方式來提供下列例子， 而不傾向以任何方式來限制本發明的範圍。 實施例1 20 1353990 製程概觀 於第2圖中圖解說明本發明之製程的概要流程圖。將 牛的全血收集進含有3. 8%(w/v)三檸檬酸鈉（tri —s〇diura citrate)溶液為抗凝血劑（an1;i_c〇agulant)之一封住無菌 的容器/袋子中。之後立即將血液與三檸檬酸鈉溶液混合均 勾以抑制血液凝固。藉由一機採機制（apheresis mechanism)從血漿與其他較小之血液細胞將紅血球細胞 φ (re(1 blo〇d cel ls，RBC)分離出並收集。伴隨7無菌可拋 棄式離心砵（gamma steriiized disp〇sable centrifuge bowl)，一 細胞洗條器”被使用於此程序。以等體積之 • 〇. 9%(w/v氣化鈉）鹽水來清洗紅血球。 藉由操作對紅血球細胞膜的低滲透壓休克，將經清洗 之紅血球裂解以釋放出血紅素内容物。為此目的使用顯 不於第3圖中一專門之用於紅血球裂解裝置的即刻細胞溶 解設備。在紅血球裂解後，藉由使用一丨〇〇 kDa膜的切流 籲式超過遽來伙其他蛋白質分離出血紅素分子。為了流動管 住層析’收集在遽出液中的血紅素且藉由一 3〇 kDa膜更進 一步將其？辰細至12-14 g/dL。執行管住層析以移除蛋白質 雜質。 首先將經漠縮之血紅素溶液與DBSF反應以形成在無 氧狀態下熱穩疋經父聯之四聚體紅素分子。之後在最後 配製與包裝之則’在無氧狀態下於90 °C執行熱處理步驟3〇 秒至三分鐘。 實施例2 21 1353990 時間&經控制之低滲透壓裂解與過濾 -: 新鮮地收集牛的全血並將其在一適冷的狀態（2至. C )下運送。經由細胞洗滌器且隨後以一 〇. 6 5 μ m過據來 將红血球從血漿分離出。在以〇. 9%鹽水清洗红血球濾出液 後’藉由低滲透壓裂解來使此濾出液破裂。藉由使用顯示 於第3圖中之即刻細胞溶解設備來執行低滲透壓裂解。即 刻細胞溶解設備包括一靜態攪拌器以協助細胞裂解。將具 有經控制血紅素濃度（12-14g/dL)之紅血球懸浮液與4體 積之經純化的水混合以產生對紅血球細胞膜之一低滲透壓 _ 休克。控制低滲透壓休克的期間以避免不需要之白血球與 血小板的裂解。低滲透壓溶液通過即刻細胞溶解設備之靜 . 態攪拌器部分達2至30秒或一足夠裂解紅血球的時間，且 較佳為3 0秒。在3 0秒後’藉由將溶解產物與1 /1 〇體積之 高滲透壓緩衝溶液混合來终止休克，隨著其退出靜態檀掉 器。所使用之高滲透壓溶液為0. 1 Μ磷酸緩衝溶液、7. 4%

NaCl，pH 7· 4。第3圖之即刻細胞溶解設備可以每小時處 理50至1〇〇公升的溶解產物，且較佳為以一連續方式每小 # 時至少300公升。 在紅血球裂解之後，藉由〇· 22過濾器來過濾紅血 球溶解產物以獲得一血紅素溶液。分別以聚合酶鏈鎖反應 (读測極限：64 pg)與高效能液相層析（偵測極限：丨# g/ml ) 方法並未在此血紅素溶液中偵測到來自白血球的核酸與磷 脂質。執行第一 1〇〇 kDa超過濾以移除相較於血紅素具有 較高分子量的雜質。採用流動管柱層析以更進一步純化此

22 1353990 -. 血紅素溶液。之後執行第二30 kDa超過濾以移除相較於血 紅素具有較低分子量的雜質並濃縮。 實施例3 對無基質（stroma-free)血紅素溶液方面的病毒清除研究 為了證明來自本發明之產物的安全性，藉由病毒確認 研究（virus validation study)來證明（1) 0.65 /zm 濾洗 (diafiltration)步驟與（2) 100 kDa超過濾步驟的病毒移 φ 除能力。其為以不同之模型病毒（腦心肌炎病毒 (encephalomyocarditis virus)、假性狂犬病病毒 • (Pseud〇rabies virus)、牛病毒性下痢病毒（b〇vine viral diarrhea virus)與牛小病毒（bovine parvovirus))，藉由 這兩個程序的低規模版本（down-scaled version)的謹慎 穿刺（deliberate spiking)來完成。在此研究中，使用四 種开>式的病毒（參見表3)。這些病毒在它們的生物生理學 與結構特徵方面呈多樣化’且它們在對於生理與化學試劑 # 或處理的抗性方面表現差異。 表3 目標病毒 模型病毒 分類學 基因體 結構 大小 [nm] 穩定度* c型肝炎病 毒（HCV) 牛病毒性下 痢病毒 (BVDV) 黃熱病毒科 (Flaviviridae) ssRNA 套膜 40-60 低 秦 腦心肌炎病 毒⑽CV) 小核糖核酸病毒 (Picornavirus) ssRNA 無套膜 25-30 中 小病毒B19 牛小病毒 (BPV) 小病毒科 (Parvoviridae) ssDNA 無套骐 18-26 非常高 B型肝炎病 毒（HBV) 假性狂犬病 病毒 (PRV) 范療病毒科 (Herpesviridae) dsDNA 套膜 120-200 低至中 23 於下方表4中簡單地顯示確認方案

遽洗 細胞清洗 超過濾 病毒穿刺 I 超過濾 I 病毒測試 ψ 病毒穿刺(virus spiking) 遽洗 病毒測試 ---- 在⑴0.65 /zm遽洗與（2) 100 kDa超過遽令之四種 病毒的對數減少結果的概要顯示於下方表5中。所有四種 病毒’牛病毒性下痢病毒（BW)、牛小病毒（猶）、腦心肌 炎病毒⑽CV)與假性狂犬病病毒(pRV)，被以〇·65"濾 洗與I 00 kDa超過濾有效地移除。

表5 註解： 2未測定出殘餘之傳染性 實施例4 流動管柱層析 吏用 CM f柱（市售可從GEhealthcare獲得）來更進 24 S、 1353990 一步移除任何蛋白質雜質。起 (H 芍。緩衝浴液為20 mM醋酸鈉 8. 0)，而洗提緩衝溶液為

r η、 ★、 ^ mM 醋酸鈉、2Μ NaClCpH 巷入p “ “柱之後，將蛋白質樣本 載入此s柱中。以至少5管桎體 貝 < 思始緩衝〉谷液來清洗 未結合之蛋自質雜f 管㈣積❹⑽洗提 液(。-。爲C1)來執行洗提。於第u圖中顯示洗提輪摩; CM管柱之前 血紅素浴液為在流出之部分組中。藉由酵素連結免疫吸附 分析來分析流出之部分組的純度。於下列表6中顯示結果。 表6

Ά th #/ (Flowthrough) (含血紅素） 由於血紅素是在來自pH 8之^析的流7^7 (不在洗出液中）’因此其為連續工業規模操作的良好方 式。對於卫業規模操作而言，第—超喊裝備被直接連接 至流動CM管柱層析系統，且此流出管柱可被直接連接至第 二超過濾裝備。於第12圖中顯示概要的工業製程設置。 實施例5 熱穩定經交聯之四聚體血紅素的製備 (5a)與DBSF之交聯反應 於一無氧狀態中執行交聯反應。將DBSF添加至血紅素 溶液’以形成經父聯之四聚體血紅素而沒有聚合之血紅素 的形成° DBSF穩定化程序穩定了四聚體形式之血紅素（65 kDa)且避免其分離成經由腎臟被排泄的二聚體（32 kDa)。 25 1353990 在此實施例中，使用〗.9 , 用1 . 2. 5之也紅素比DBSF的莫耳比且 pH為8.6。在氮氣的—惰戌 h性大虱中在周遭溫度（15_25<t ) 執行此程序達3-6小時的地„ 、， 崎的期間，以避免血紅素的氧化而形 成二價鐵變性血紅素，1在斗 八為生理上失效的（溶氧程度維持小 於〇. 1 ppm) 〇藉由使用古μ Λ切

用间效月b液相層析測量殘餘之j)BSF 來監測DBSF反應的完成。nRQTr G Λ 成DBSF反應的產量是高的，> 99%。 (5b)高溫短時間熱處理步驟 一於第13圖中顯示-高溫短時間(HTST)處理設備。使用

此高溫短時間處理設備夾 > 爾不對經父聯之四聚體血紅素執行一 加熱處理。在此例子Φ&你 牡此例千中，熱處理的條件為9〇。。，3〇秒至3 分鐘’且較佳為45至Rn灿姑· = , & b〇私，然而如前所討論也可選擇其 他條件且設備因此而修籂 ’、 叩U飾。以母分鐘丨.〇公升的流速將視 需要而定以〇 2%$ Μ·»，π*# p • ''乙醯基半胱氨酸添加於其之含經交 聯之血紅素的溶液抽 次進同，皿短時間處理設備（高溫短 時間處理熱父換器的第—部份為被預熱且維持力)，

設備之第一部份的滯留時間為介於45至60秒之間，之後 錢以相同之流速通過進人維持於饥之此熱交換器的另 口P伤。冷钟所需時間為介於J 5至3〇秒之間。在冷卻至 :眈之後’以〇.2%至0·4%，較佳為〇 4%的濃度立即添加 -乙醯基丰胱氨酸。在高溫短時間減理之後的此化學添 :、對於維持變性血紅素(失效血紅素)在一低程度而言是十 刀重要的。對於工業操作而言，處理設備的裝備為容易被 控制的。於第14圖中顧千抖庙-取谢^人曰 .4不對應一聚體含I的溫度輪廓。若 血紅素為非經交聯的，1 场非熟穩疋的且在加熱步驟後形

26 成沈殺。之後藉由—離、、七_ .. ^ t或一過濾設備來移除沈澱以因此 形成一乾淨的溶液。 ％ 在90C之南溫短時間熱處理期間，變性血紅素（失效 血紅素）被增加（如於第15 甘+ 第15圖中所不）。在立即添加乙醯 暴半胱氨酸之後，可·給彡主μ & + h ，·持低知度的篗性血紅素，約小於3%。 下列表7顯示在熱處理步驟之後移除了蛋白質雜質， 例如免疫球蛋白G、ώ疋A a, ^ 白蛋白、奴酸酐酶與不希望得到之未 經穩定化之四聚體哇-爷骑 „ 賵次一聚體。使用一酵素連結免疫吸附分 析方法來測量免疫球蛋白G、白蛋白與碳酸肝酶的量而 猎由一高效能液相層析方法來測定二聚體的量。在高溫短 時，熱處理步驟後’此熱穩定經交聯之四聚體血紅素的純 度是非常高的’在98.0至99 9的範圍中。藉由一血氧分 析儀（He議Analyzer)所測量之p5〇值，氧氣分廢（於其血 紅素溶液為—半（5W飽和的），經由高溫短時間熱處理步 驟被維持於約30至40 _g，且因此此熱處理經交聯之四 聚體血红素在90t是穩定的。

由於本發明產物在無氧狀態下為穩定的，所以產物的 27 1353990 包裝重要的是將氣體滲透率最小化。對於靜脈内應用而· · 言，一訂製設計之100 rol輸液袋係由一具有〇.4 mm厚度. 之五層的EVA/EVOH疊層材料所製成，其具有在室溫每大氣 壓每24小時每1〇〇平方英吋〇 〇〇6 —〇 132 cm3的氧氣滲透 度。此材料為一第vi類塑膠（ciass VI plastic)(如 USP<88>中所定義），其符合生物反應測試與物理 化學測試，且適合製造為用來靜脈内注射目的之輸液袋（需 注意的是，同樣依照所需應用，其他形式的包裝可由此材 料所製成 > 也可將第二級包裝鋁外包裝袋應用至第一級包籲 裝輸液袋，其提供額外的屏障，將光暴露與氧氣擴散最小 化。袋的層包括：0.012 _之聚對苯二甲酸乙二酯 · (polyethylene terephthalate， PET) 、 0.007 mm 的鋁 (八1)、〇.〇15 111111的尼龍（叩1〇11，心）與〇.1_的聚乙烯 (polyethylene，PE)。外包裝薄膜具有〇· 14 _的厚度與 在室溫每大氣壓每24小時每1〇〇平方英吋0 006 cm3的氧 氣穿透率。於第16圖中顯示輸液袋的概要顯示。根據本發 _ 明各輸液袋的全部氧氣滲透度為在室溫每大氣壓每24小 時 〇. 0025 cm3。 實施例7 充氧的増進 (7a)在正常組織中之充氧的增進 藉由熱穩定經交聯之四聚體血紅素來執行對於正常組 織充氧的一些研究（如於第7圖中所示）。於布法羅大鼠中 執行比較藥物動力學（pharmacokinetic)與藥效學 3 28 1353990 - (Pharmacodynamic)研究。藉由彈丸式注射（b〇ius injection)經由大鼠之陰莖靜脈（penile vein)，以〇 2 g/kg熱穩定經交聯之四聚體血紅素溶液或林格氏醋酸緩衝 溶液（控制組）分別地投予雄性近親繁殖之布法羅大鼠。藉 由Hemocue光度計在1、6、24、48小時測定血漿血紅素 之濃度-時間輪廓並與基線讀數比較。此方法為根據血紅素 之光度測量法，其中血紅素的濃度直接讀出為g/dL。在布 φ 法羅大鼠之後腿肌肉中藉由〇xy 1 abT!*組織充氧與溫度監 測器（Oxford Optronix Limited)來直接測量氧氣分壓 ；(p〇2)。藉由腹腔内注射 Untra-peritoneal injecti〇n) 30-50 mg/kg戊巴比妥（pent〇barbit〇ne)溶液來麻醉大 鼠，接著將氧氣感測器插入肌肉中。藉由Datatrax2資料 獲付系統（World Precision Instrument)以一即時方式記 錄所有p〇2讀數。結果顯示，在〇 2 g/kg之熱穩定經交聯 之四聚體血紅素的靜脈内注射後，在丨5分鐘内平均p〇2值 # 從基線提升至約兩倍之相對平均氧氣分壓且延長至6小 時。此外，在注射後24至48小時，平均氧氣程度仍維持 高於在基線值25%至30%(第7B圖）。 (7b)在極度缺氧腫瘤區域中之充氧的顯著增進 藉由一頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC)異體移植模型來評估 在極度缺氧腫瘤區域中之充氧的增進。從美國菌種保存中

心（American Type Culture Collection)獲得咽下部 (hypopharyngeal )鱗狀細胞癌（FaDu細胞株）。將約1χΐ 〇6 個癌細胞皮下注入四至六週大近親繁殖的BALB/c AnN-nU 29 1353990 (裸（nude))小鼠。當腫瘤異體移植達到g_i〇mm的直徑時， 藉由Oxylab”組織充氧與溫度監測器（0xfor(10ptronix L i m i t ed)來直接測量在腫瘤塊内的氧氣分壓（p〇2)。藉由 DatatraX2 資料獲得系統（World Precisi〇ri instrument) 以一即時方式記錄所有p〇2讀數。當pi讀數為穩定時，經 由小鼠之尾靜脈靜脈内注射〇. 2 g/kg之熱穩定經交聯的四 聚體血紅素溶液並測量組織充氧。結果顯示，在靜脈内注 射〇. 2 g/kg之此熱穩定經交聯的四聚體血紅素後分別在 3與6小時中觀察到在大於6.5倍與5倍之平均p〇2方面的 顯著增加（第8圖）。 實施例8 癌症治療研究：鼻咽癌中顯著的腫瘤縮小 在投予熱穩定經交聯的四聚體血紅素溶液並結合χ光 :射後觀察到顯著之腫瘤縮小(第9Α圖)。使用人類鼻咽癌 “體移植楔型。將約lxl〇6個癌細胞(CNE2細胞株)皮下注 週大近親繁殖的BALB/c AnN-nu(裸）小鼠。當腫 瘤異體移植遠$|丨 _的直徑時，帶有腫瘤之小鼠被隨 機分成如下三個群組： Γ二1林格氏醋酸緩衝溶液⑻咖，S aCetated buf f er) (控制組） j ’林格氏醋酸緩衝溶液光照射（) :穩疋經乂聯的四聚體血紅素+χ光照射（2Gy+Hb) 2)m⑽2異體移植之裸小鼠被以單獨χ光照射(群組 2)或結合熱穩定經交聯的四聚體血紅素（群組3)。為了 χ 1353990 光照射（群組2與3) ’藉由腹腔内注射50 mg/kg之戊巴比 妥溶液來麻醉小鼠。藉由一光加速系統（linear a c c e 1 e r a t 〇 r s y s t e m) ( V a r i a η M e d i c a 1 S y s t e m s )將 2 戈雷 (Gray)之X光傳送至帶有腫瘤之小鼠的此異體移植。對於 群組3在X光處理之前，將丨.2 g/kg熱穩定經交聯之四 聚體血紅素經由尾靜脈靜脈内注射進小鼠。以治療的第一 天開始每一隔天記錄腫瘤尺寸與體重。使用方程式1/2LW2 _ 來計算腫瘤重量’其中L與W代表腫瘤塊的長度與寬度， 藉由一數位卡尺（digital caliper) (MitutoyoCo，Tokyo, Japan)在每次測量時測量。群組1為未處理控制組。結果 -(顯示於第9圖中）顯示在以熱穩定經交聯之四聚體血紅素 溶液結合X光照射處理之小鼠中觀察到CNE2異體移植的顯 著縮小（群組3，第9A圖）。 實施例9 癌症治療研究：肝腫瘤中顯著的腫瘤縮小 • 此外’在投予熱穩定經交聯的四聚體血紅素溶液並結 合順氯氨始後觀察到顯著之腫瘤縮小（第9B圖）。使用大鼠 原位肝癌模型。將以螢光酵素（luciferase)基因 (CRL1601-Luc)標示之約2χΐ〇6個大鼠肝腫瘤細胞注入布法 羅大乳中之肝的左葉中。藉由一 Xen〇gen 成像系 統來監測腫瘤生長。在注射後2至3週將腫瘤組織收穫、 切成小片且原位地（or1:hotopically)植入一第二群組之大 鼠的左肝葉中。帶有肝腫瘤之大鼠被隨機分成如下三個群 31 1353990 群組1 :林格氏醋酸緩衝溶液（控制組） 群組2 :林格氏醋酸緩衝溶液+順氯氨鉑（順氣氨鉑）（2Gy ) 群組3 :熱穩定經交聯的四聚體血紅素+順氯氨鉑（順氣氨 鉑 +Hb) ▼有肝腫瘤組織之大鼠被以單獨3 mg/kg之順氯氨始 (群組2)或結合熱穩定經交聯的四聚體血紅素（群組3)處 理。對於群組2與3而言，藉由腹腔内注射50 mg/kg之 戍巴比妥溶液來麻醉大鼠且經由左門靜脈（left p〇rtal vein)來投予順氣氨鉑。對於群組3而言，在順氣氨鉑處理 前，經由大鼠之陰莖靜脈靜脈内注射〇4 g/kg之熱穩定經 交聯的四聚體血紅素。群組丨為未處理控制組。重要地， 在治療3週後觀察到肝腫瘤的顯著縮小（第9B圖）。 實施例10 於大鼠中之急性嚴重缺血性休克的治療 在大鼠中之急性嚴重缺血性休克的模型中，熱穩定經 交聯之四聚體血紅素也被使用為復甦（resuscitati〇n)試 劑。依照復甦試劑將5〇隻斯普拉_道來（Sprague_Dawiey) 大鼠隨機分成3個群組，每個群組中16至18隻大鼠。 群組1 :林格氏醋酸缓衝溶液（負控制組，丨6隻大鼠） 群組2 :動物自體的血液（正控制組，16隻大鼠） 群組3:熱穩定經交聯的四聚體血紅素處理組（〇5gHb/ 體重之kg ’ 18隻大鼠） 藉由抽取的50%之動物全血來建立急性缺血性休克， 其估計為7. 4%之體重。在建立缺血性休克1()分鐘後，將 1353990 醋酸林格氏溶液、動物自體的血液或0.5 g Hb/kg之熱穩 定經父聯的四聚體血紅素注入動物中。將熱穩定經交聯之 四聚體血紅素的注入速率設定為5 ml/小時，之後觀察所 有實驗動物24小時。在研究期間，觀察並分析一組參數， 包括存活、血液動力學（hemodynamics)、心肌力學 (myocardial mechanics)、心輸出血量（cardiac output)、 心臟功能（cardiac function)、血中氣體（blood gas)、組 織氧氣傳送&消耗、組織灌注（tissue perfusi〇n)&氧張力 (oxygen tension)(肝' 腎與腦）' 肝與腎功能、血液流變 學（hemorheology)(血液黏度）' 與粒腺體呼吸控制率 (mitochondrial respiratory control rate)(肝、腎與 腦）。尤其是，存活率為主要目的。在24小時的觀察後， 與醋酸林格氏溶液或負控制組及自體血液組比較，熱穩定 經交聯的四聚體血紅素處理組具有高得多的存活率（如下 列表8中所示）。

負控制组 大鼠自體血液0. 5 g Hb/kg 24小時後之 熱穩定經交聯的四聚體血紅素 16隻大鼠中3隻 16隻大鼠中1〇隻 18隻大鼠中13隻 24小時存活逛 18.8

關於各種實施例已描述前述發明，而這此容 〜二貝她例並非 限制。熟悉此技藝人士可瞭解為數眾多的變化與修飾。將 這些變化與修飾考慮為包含於下 a甲。月專利乾圍的範圍 内。 33 1353990 【圖式簡單說明】 第1圖顯示不同之血紅素的胺基酸序列排比。 第2圖為一流程圖，其顯示本發明製程的概觀。 第3圖綱要性地顯示用於本發明製程中的一即刻細胞 溶解設備。 第4圖顯不（a)非經熱處理之經交聯的四聚體血紅 素，與（b)遭受9(TC達45秒至2分鐘或8(^達3〇分鐘之 熱處理之熱穩定經交聯之四聚體血紅素的高效能液相層析 分析。 第5圖顯示熱穩定經交聯之四聚體血紅素的電噴灑離 子化質譜（electrospray i〇nization mass spectr〇metry， ESI-MS)分析。 第6圖顯示（a)經純化之血紅素溶液與（b)熱穩定經 交聯之四聚體血紅素的環兩色相性光譜（circuiar dichroism spectroscopy)分析。 第7圖顯示在正常組織中之充氧的增進。〇·2 g/kg之 熱穩定經交聯的四聚體血紅素溶液的注射導致在（A)血漿 血紅素濃度與（B)傳送至肌肉之氧氣方面的顯著增加。相 較於血漿血紅素程度，觀察到在充氧方面的顯著增加達到 一較長的時間期間。 第8圖顯示在缺氧腫瘤組織中之充氧的增進。〇2g/kg 之熱穩定經交聯的四聚體血紅素溶液的注射導致在傳送至 頭頸鱗狀細胞癌（head and neck squamous cel 1 carcinoma, HNSCC)異體移植（xenograft)之氧氣方面的顯著增加。 1353990 第 9 圖顯示在（A)鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC)與（B)肝腫瘤之齧齒目動物模式中的部分腫瘤縮小 (tumor shrinkage) 〇 第10圖顯示在以熱穩定經交聯之四聚體血红素處理 後於嚴重缺血性休克（hemorrhagic shock)之大鼠模式中 的平均動脈血壓變化。 第11圖為流動管柱層析之洗提輪廓；血紅素為在流出 部分組中。 第1 2圖綱要性地顯示用於工業規模操作之伴隨超過 遽的流動CM管柱層析系統。 第13圖為用於尚溫短時間熱處理程序步驟之設備的 概要顯示。 第14圖顯示在高溫短時間處理設備中的溫度輪廓與 本發明在85t肖9(TC之此系統中移除未穩定化之四聚體 (二聚體）所花費的時間。 第15圖顯示在第13圖之高溫短時間處料備中，在 85°C與90°C之系統中之變性血紅素形成的速率。 第1 6圖為用於本發明献籍定經^^ +货/3…穩疋經父聯之四聚體血紅素 之輸液袋的概要顯示D 【主要元件符號說明】 益 〇 35

Claims (1)

1353990 七、申請專利範圍： 1. 一種高度純化且熱穩定之含氧載體之藥學組成物的 製備方法’該含氧載體之藥學組成物包括血紅素，該血紅 素實質上係由非聚合之經交聯的四聚體血紅素所組成，該 方法包括： a) 提供哺乳動物全企，其包括至少紅血球與血漿； b) 在該哺乳動物全血中從該血漿分離該紅血球； c) 過濾從該血漿分離之該紅血球以獲得一經過濾之紅 血球部分組； d) 清洗該經過濾之红血球部分組以移除血漿蛋白質雜 質’產生經清洗的紅血球； e) 在一即刻細胞溶解設備中以5〇_丨〇〇〇L/小時的低流 速，藉由一準確且經控制的低滲透壓裂解達2至秒或其 他足夠以裂解該紅血球的-時間來使該經清洗的紅血球破 μ’其包括經破裂之紅血球的—溶解產物； 〇執行過滤以移除至少央^ ^^. 禾自3玄，合解產物的無用阻留物 的一部份； g)從該溶解產物萃取 不/分欣， h)使用設置來移除相較於 '瓦并百季父尚分子量之亲 質的一超過濾過濾器來執行—第一 ’、丨 ❿’愿程序，以從該身 -血紅素溶液更進一步移除任 以獲得-第二企紅素溶液； ”殘餘之無用阻留彩 。對該第二血紅素溶液執行流 f Μ ^ α ^ „ 位禮析以移除蛋白 頁雜貝以獲付一經純化之血紅素溶液； j) 使用設置來移除雜質並濃縮該經純化之血紅素溶液 的一第二超過濾過濾器來執行一第二超過濾程序；办 k) 藉由雙-3’ 5-二溴水楊基延胡索酸脂來使至少該血 紅素之α-α :大單元交聯以在一無氧環境中形成經交聯之 血紅素中該經交聯之灰紅素為非聚合之經交聯的四聚 體血紅素； 換； in)藉由切流式過濾來移除任何殘留之化學藥劑； η)在一無氧環境中熱處理該經交聯之血紅素以使任何 殘餘之未經反應的血紅素、未穩定化之血紅素（二聚體）與 任何其他蛋白質雜質變性及沈殿，以便所產生之熱穩定: =乂聯的四聚體血紅素具有一偵測不到的二聚體濃度，且 實質上係由非聚合之經交聯的四聚體血紅素所組成； 〇)在熱處理該經交聯之四聚體血紅素之後立即添加Ν— 乙醯基半胱氨酸以維持一低程度的變性血紅素； Ρ)糟由一離心或一過濾設備來移除沈澱以形成一乾淨 的溶液；以及 Q )將該，，星純化與熱穩定之經交聯的四聚體血紅素加至 一藥學上可接受之載體。 片2·如中請專利範圍第i項所述之高度純化且熱穩定之 .氧載體之藥學組成物的製備方法’其中該熱處理為一高 溫短時，程序，其被執行於約耽至95°C，30秒至3小 時接著立即冷卻，且在該冷卻之後立即添加0. 2至0. 4% 37 S 13^3990 之量的該N_乙醯基半胱氨酸。 申明專利範圍第1項所述之高度純化且熱穩定之 含氧載體之藥學組成物的製備方法，#中該全血為人類、 牛、豬、狗、馬的全血。 人/·如中請專利_帛i項所述之高度純化且熱穩定之 載體之藥學組成物的製備方法纟中該管柱層析包括 或更夕之陽離子交換管柱或陰離子交換管柱。 人—5:如中請專利範圍第4項所述之高度純化且熱穩定之 3氧載體之藥學組成物的製備方法#中該陽離子交換管 柱或陰離子交換管柱為一或更多之刪E管柱、CM管柱及， 或羥磷灰石管柱。 人6:如申請專利範圍第i項所述之高度純化且熱穩定之 S氧載體之藥學組成物的製備方法，纟中該藥學上可接受 之载體為—生理緩衝溶液或水。 7.種两度純化且熱穩定之含氧載體的藥學组成物， ’ ’工素該·02•紅素實質上係由非聚合之經交聯的四聚 體血紅素所組成，該非聚合之經交聯的四聚體血紅素係由 申請專利範圍第1項之程序所形成。 ,8_ 一種南度純化且熱穩定之含氧載體之藥學組成物的 製備方法’該含氧載體之藥學組成物包括血紅素，該血紅 素實質上係由非聚合之經交聯的四聚體血紅素所組成該 方法包括： a) 提供哺乳動物全血，其包括至少紅血球與血漿； b) 在該喝乳動物全血中從該血漿分離該红血球； 1353990 c )過遽從該血漿分離之該紅血球以寐组 水乂獲侍—經過濾之紅 血球部分組； 清洗該經過遽之紅血球部分組以移除血聚蛋白質雜 質，產生經清洗的紅血球； e)在-即刻細胞溶解設備中以5〇_1〇〇〇L/小時的低流 速’藉由-準4且經控制的低滲透壓裂解達2至30秒以 他足夠以裂解該紅血球的-時間來使該經清洗的紅血球破 裂以產生-溶液’ |包括經破裂之紅血球的一溶解產物； f )執行過濾以移除至少來自嗜、玄醢 7木目这，合解產物的無用阻留物 的一部份； g) 從該溶解產物萃取一第一血紅素溶液； h) 使用設置來移除相較於血紅素具有較高分子量之雜 質的一超㈣料器來執行—第—超過濾程序，以從該第 一血紅素溶液更進-步移除任何病毒與殘餘之無用阻留物 以獲得一第二血紅素溶液； ϋ對該第二轰紅素溶液執行流動管柱層析以移除蛋白 質雜質以獲得—經純化之血紅素溶液； j) 使用設置來移除雜暂廿、曲_ 雜質並 >辰縮該經純化之血紅素溶液 的一第二超過濾過濾器夾 〜裔木執仃一第二超過濾程序； k) 藉由雙-3 5--冷 , ’ 一'臭水揚基延胡索酸脂來使至少該血 紅素之α - 〇：次單元交胪 乂知以在一無氧環境中形成經 血紅素，其中該血紅素 又聯之 兩非聚合之經交聯的四聚體血红 l) 使該經交聯之血 ' 、素與一適合之生理緩衝溶液交 換， 39 ^53990 m)藉由切流式過濾來移除任何殘留之化學藥巧 、η)以、約9〇η抓的溫度熱處理該經交聯片之血紅素 乂使任何殘餘之未經反應的血紅素、未穩定化之血紅素（二 聚體）與任何其他蛋白質雜質變性及沈澱，以便所產生之埶 穩定之經交聯的四聚體血紅素具有一偵測不到的二聚 度且μ質上係由非聚合之經交聯的四聚體血紅素所組成， 並且立即冷卻至約2 5 °C ; 〇)在熱處理該經交聯之四聚體血紅素之後立即添加N — 乙酿基半胱氨酸以維持一低程度的變性血紅素； P)藉由一離心或一過濾設備來移除沈澱以形成一乾淨 的溶液；以及 q)將該經純化與熱穩定之經交聯的四聚體血紅素加至 一藥學上可接受之載體。 9 ·如申5月專利範圍第8項所述之高度純化且熱穩定之 a氧載體之藥學組成物的製備方法，纟中該熱處理係執行 於一無氧環境中。 1 〇 ·如申請專利範圍第8項所述之高度純化且熱穩定 之3氧載體之藥學組成物的製備方法，其中執行該熱處理 3 0衫至3小蚪，接著立即冷卻，且在該冷卻之後立即添加 〇·2至0.4%之量的該N_乙醯基半胱氨酸。 11. 如申請專利範圍第8項所述之高度純化且熱穩定 之含氧載體之藥學組成物的製備方法，其中該全血為人 類、牛 '豬、狗、馬的全血。 12. 如申叫專利範圍第8項所述之高度純化且熱穩定 40 1353990

之含氧載體之藥學組成物的製 』^ 幻表備方法，其中該管柱層析包 括一或更多之陽離子交換管柱或陰離子交換管柱。 13.如申請專利範圍第a 哨所迷之阿度純化且熱穩定 之3氧載體之藥學組成物的製 π衣備方法，其中該陽離子交換 管柱或陰離子交換；^ 十父換^柱為一或更多之DEAE管柱、cM管柱 及/或羥磷灰石管柱。 14'種呵度純化且熱穩定之含氧載體的藥學組成 物，包括血紅素，該血紅素實質上係由非聚合之經交聯的 四聚體血紅素所組成’該非聚合之經交聯的四聚體血紅素 係由申請專利範圍第8項之程序所形成。 15_ 一種高度純化且熱穩定之含氧載體之藥學組成物 的製備方法’該含氧載體之藥學組成物包括血紅素，該血 紅素實質上係由非聚合之經交聯的四聚體血紅素所組成， 該方法包括： a )提供哺乳動物全血’其包括至少紅血球與血漿； b)在該哺乳動物全血中從該血漿分離該紅血球； Ο過濾從該血漿分離之該紅血球以獲得一經過濾之紅 血球部分組； d) 清洗該經過濾之紅血球部分組以移除血漿蛋白質雜 貝’產生經清洗的紅血球； e) 在一即刻細胞溶解設備中以5〇-1 〇〇〇L/小時的低流 速’藉由_準確且經控制的低滲透壓裂解達2至30秒或其 他足夠以裂解該紅血球的一時間來使該經清洗的紅血球破 裂以產生一溶液，其包括經破裂之紅血球的一溶解產物； 41 1353990 f)執行過濾以移除至少來自 的一部份； 該溶解產物 的無用阻留物 g)從該溶解產物萃取 W使用設置來移除相較於血紅素具有較高分子 質的-超過遽過遽器來執行一第一超過遽程序： 一血紅素溶液更進一步移除主 〜第 艾移除任何病毋與殘餘之無 以獲得一第二血紅素溶液； …、 υ對該第二血紅素溶液執行流動管柱層析以移 質雜質以獲得一經純化之血紅素溶液丨 ^ =使用設置來移除雜質並濃縮該經純化之血紅素溶液 的-第一超過濾過濾器來執行一第二超過濾程序； k)藉由又3’5-二溴水揚基延胡索酸脂來使至少該血 紅素之α α次早凡交聯以在一無氧環境中形成經交聯之 血紅素，其中該經交聯之血紅素為非聚合之經交聯的四聚 體血紅素； )使該、.&又聯之血紅素與一適合之生理緩衝溶液 換； m)藉由切流式過濾來移除任何殘留之化學藥劑； η)將Ν 基半胱氨酸加至該經交聯之四聚體血紅素 在無氧％境下卩,約7〇°ci 95°C的Si熱處理該經交 聯之血紅素以使任何殘餘之未經反應的血紅素、未穩定化 之血紅素（二聚體）與任何其他蛋白質雜質變性及沈澱，以 便所產生之熱穩定之經交聯#四聚體血紅素具有—偵測不 J的+體/辰度且實質上係由非聚合之經交聯的四聚體血 ⑶州9〇 紅素所組成； H熱處理該經交聯之四聚體血紅素之後立即添加卜 醯基夺胱氨酸以維持一低程度的變性血紅素； p)藉由-離心或—過遽設備來移除沈澱以 的溶液；以及 Q)將該經純化與熱穩定之經交聯的四聚體企 璺μ άτ社企1 ' 一藥學上可接受之载體

16.如申請專利範圍第15項所述之 之含氧載體之藥學組成物的势備^ Qn 驭物的裝備方法，其中執行該熱處理 30秒至3小時’接著立即冷卻至饥，且在該冷卻之後立 %、加0. 2至〇· 4%之量的該N_乙醯基半胱氨酸。 如申μ專㈣圍第15項所述之高度純化且熱穩定 之3乳載體之藥學組成物的製備方法，其中在熱處理前之 Ν一乙醯基半胱氨酸的添加係以約〇. 2%之量。 入如申請專利範圍第15項所述之高度純化且熱穩定 之含乳載體之藥學組成物的製備方法’其中該全血為人 類、牛、豬、狗、馬的全血。 .種阿度純化且熱穩定之含氧載體的藥學組成 物γ包括血紅素’該血紅素實質上係由非聚合之經交聯的 四聚體血紅素所組成，該非聚合之經交聯的四聚體血紅素 係由申請專利範圍第15項之程序所形成。 43