TWI352121B - Process for producing a crude oil - Google Patents

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1352121 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 發明領域 本發明係關於一種具有經降低之非可皂化物質含量及 5 /或酯型固醇含量且包含高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪 酸之未加工油，一種製造精煉油脂之方法，以及該油脂（未 加工油或精煉油脂）以及摻混油脂（未加工油或精煉油脂）之 食品及飲料、治療性營養食品、動物飼料及醫藥製劑。本 發明中「非可皂化物質」以及「酯型固醇」表示由微生物 10 萃取而得之物質。因此於本發明述及「非可皂化物質」及 「酯型固醇」排除任何於萃取後添加至未加工油之非可皂 化物質及酯型固醇。 L先前技術;1 發明背景 15 有關人類高度不飽和脂肪酸(後文稱作為「PUFA」）之 生物合成，有兩大系列包括ω3及ω6系列。ω(亞米茄）表示由 脂肪酸端末曱基至第一個雙鍵所在碳原子之碳原子數目。 例如以ω6系列為例，亞油酸（18:2 ω6)重複接受不飽和化以 及碳鏈長度延長，結果被轉成γ-亞麻酸(18:3 ω6)、二同-γ-20 亞麻酸(20:3 ω6)、花生四烯酸(2〇:4 ω6)及4,7，10，13，16-廿二 碳五烯酸(22:5 ω6)。 同理於ω3系列之情況下，亞麻酸（18:3 ω3)重複接受 不飽和化及碳鏈長度延長’結果被轉成廿碳五烯酸(20:5 ω3)、7,1〇，13,16，19-廿二碳五烯酸(22:5 ω3)及（VOW，16, 5 19-廿二碳六稀酸(22:6叫。作為W系列酿As之廿碳五婦 「（後文稱之為「EPA」）以及廿二碳六烯酸（後文稱之為 DHA」）為已知具有多項生理功能，特別為生活方式疾病 (甘&硬化及血栓)之預p；5r功效，癌症抑制功效及學習能力 ，升作用’多方面嘗試應用此等pUFAs至醫藥製劑以及特 定健康食品。但近年來的注意力也轉移到ω3以外之 PUFAs((〇6及ω9系列）之生理功能。 約10/。組成主要器官（如血液及肝臟）之脂肪酸為花生 四稀酸。例如人類血液之碟脂f之脂肪酸具有組成，包含 11%花生四烯酸，1%廿碳五烯酸及3%廿二碳六烯酸。花生 四烯酸作為細胞膜之主要組成分，花生四烯酸涉及膜的流 動調節’於身體代謝作用有各項功能，進一步作為前列腺 素之直接前驅物扮演重要角色。 特別，近年來注意到花生四烯酸作為嬰兒營養品以及 作為内生性類大麻酌· (2-花生四烯醯基一甘油、阿南達麥 (anandamide))之組成脂肪酸具有神經活化作用。通常告食 用亞油酸含量豐富食物時，亞油酸被轉成花生四晞酸。於 患有生活方式疾病以及屬於生活方式疾病風險族群病人、 嬰兒及老人，該項生物合成牽涉的酵素活性降低。因此， 花生四烯酸的濃度可能不足。因此理由故需要直接攝取花 生四烯酸作為油脂（三酸甘油酯之成分脂肪酸）。 對於EPA及DHA用作為ω3系列之PUFAs，魚油可作為 豐富供應源。另一方面，ω6系列之PUFAs例如γ-亞麻酸、二 同个亞麻酸、花生四烯酸及4,7，10,13,16-廿二碳五歸酸(225 ®6)幾乎無法由習知油脂供應源獲得；目前一般使用包含微 生物發酵製造之PUFAs作為成分脂肪酸之油脂（三酸甘油 輯）。例如曾經提出一種方法，其中包含花生四烯酸作為成 分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）係經由培養多種微生物而製 5 造，該等微生物可製造包含花生四烯酸作為成分脂肪酸之 油月旨（三酸甘油酯）。 其中經由使用屬於被孢霉屬（genus Mortierella)之特定 微生物製造含高花生四烯酸含量之油脂（三酸甘油酯）為已 知（曰本專利公開案第63(1988)44891及63(1988)-12290 10號）。基於多項試驗結果，據稱此等油脂為安全。但因此等 油脂係衍生自微生物，因此於食用上不滿意。目前該種油 月旨尚未滿意地為社會所普遍接受。另一方面，包含發酵製 造之花生四烯酸作為成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）開始 用於應使用花生四烯酸的領域，例如用於嬰兒營養領域且 15 特別用於嬰兒配方。 由天然產品（例如動物及植物）製造的油脂接受精煉處 理’例如脫膠、去氧化、脫臭、脫色、分子蒸餾及冬化， 隨後上市作為食用油脂。例如由產油植物壓梓所得之油脂 含有大量雜質，無法就此用作為食用油脂。只有芝麻油及 20撖欖油除外其可直接食用，否則此等油脂通常於用作為食 用油之前先經過精煉。 例如於脫膠處理，含於未經精煉油之磷脂質、碳水化 合物、樹脂類、蛋白質化合物、微量金屬及著色物質被去 除。於去氧化(驗精煉)處理，脂肪酸、著色物質、磷脂質、 7 微量金屬H合物、油不溶物及氧化產物被去除。於脫 色處理著色物f、膠狀物質、微量金屬、皂成分、氧化 產物及翻質被去除。於脫臭處理，脂肪酸類 酸甘油 S曰類-酸甘油^類、链類、醇類、酮類、烴類、著色物 質硫化口物、過氧化物、氧化分解產物及其它有氣味物 質皆被去除。 /由月a 3有可;谷於油且較不可能以鹼分解之有機化合 物’稱做「非可|化物質」。例如，已知高碳醇類、固醉類、 經類、生㈣類、及類胡蘿蔔素等化合物為非可皂化物質 10之組成成分。於油脂精煉過程，非可皂化物質含量if被降 低，但無法完全被去除。固醇已知存在於微生物製造之·/由 脂作為非可皂化物質之主要成分。 存在於油脂之固醇被分成自由態型及酯型◊於精姝過 程中，自由態型可被去除，但另一方面，酯型固醇幾f無 15法被去除。例如經脫膠、去氧化、脫色及脫臭處理後，Λ 豆油之固醇含量（毫克/克)對自由態型而言分別為3.4、 2.0及1.6 ’而對酯型而言分別為〇 6、〇.6、0.6及0.6(「食用 油脂科學」，20-21頁，幸書房）。 因無法去除之固醇類等被包含作為非可皂化物質I 20部分，故通常非可皂化物質含量廣泛被用作為精煉油腊I 品質指標、或作為精煉過程之品管指標。舉例言之，根據 曰本農業標準，例如於食用紅花籽油、食用大豆油及食用 棕橺油之非可皂化物質含量不可高於丨.0%(日本農柊漁牧 部第523號公告（1969年3月31日））。嬰兒需要膽固醇，膽固 8 醇含量增高的婴兒配方已經問世。植物衍生之固醇類含於 植物性食用油脂。植物衍生之固醇的存在會不利地抑制嬰 兒對膽固醇的吸收（「食品加工及成分」，第33卷，第2期， 42_45頁（I"8年)）。因此，當考慮食用油脂掺混於嬰兒配方 用途時，強力需要含低固醇含量，換言之，具有低非可皂 化物質含量之食用油脂。 經由培養屬於被孢霉屬之微生物製造的油脂之主要部 分為三酸甘油酯（不低於約7〇%重量比）及磷脂質，含有非可 皂化物質作為其它成分。非可|化物質包含固醇類(如鍵固 醇)及固醇醋類作為主要成分。食用油脂係呈三酸甘油醋形 式。其中已經去除磷脂質之精煉油脂可如下提供，將經由 培養微生物製造之原先油脂（經由細胞萃取所得之油脂，稱 作為未加工油」)接受食用油脂之精煉處理(脫膠、去氧化、 脫臭及脫色）。但難以藉精煉處理完全去除非可皂化物質。 由於完全去除非可息化物質困難，以及廣泛需要有含 有低非可4化物質之食用油脂，從事研究如何去除非可息 化物質。絲舰㈣錄朴_煉之料（日本專利公 開案第10(；1998)_191886號）。但此種技術未對非可皂化物質 之組成成分做詳細研究。精煉後之非可皂化物質成分與精 練前之成錢化’射之，藉輯絲之成分資訊仍然未 知。 經由培養被抱霉屬微生物製造之油脂係積聚於菌絲 體。因此由製造含高度不麵脂肪_脂之成本效益改進 觀點視之，因培養而獲得較高細胞濃度。為了提供高細胞 1352121 濃度，培養基中可轉成細胞成分之氮源濃度係提高。根據 先前報告（日本專利公開案第10(1998)-191886及 10(1998)-70992號），雖然報告非可皂化物質含量或總固醇 含量，但微生物培養使用之培養基之氮源濃度至多約為 5 1.5%。 此外’曾經報告含固醇含量不超過1〇/〇之含高度不飽和 脂肪酸之油脂（PCT公告案第2000-510513號之日文公告譯 本）。但此種情況下’用於此種製造之培養基之氮源濃度 低’於使用尚山莫拉氏菌（Mortierella alpina)製造含花生四 10稀酸之油脂時’培養係於1%(=酵母萃取物〇.5%+硝酸鈉 0.5%)之低氣源濃度進行(PCT公告案第2〇〇〇 5〇8888號之公 告曰文譯本）。如此由於極端需要具有低非可皂化物質含量 及固醇含量之食用油脂，從事降低非可息化物質及/或固醇 之相關研究 但未曾敘述有關由高濃度微生物培養製造之 微生物油脂所含非可皂化物質或固醇。

20 L银^明内容】 發明概要 10 1352121 如此本發明提供-種具有經降低之非可息化物質含量 及/或醋型固醇含量且包含高度不飽和脂肪酸作為組 肪酸之未加工油。此外，本發明提供一種由未加工' = 精煉油之方法。 4 ^ 5 此外，本發明提供一種未加工油，其具有經降低之非 可息化物質含量及/或醋型固醇含量，且包含如前述方法製 造之高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸，以及提供由此 油脂製造的精煉油脂。 此外，本發明提供前述油脂之多項用途。 10 已經報告具有經降低之非可皂化物質含量及固醇含 量，且包含高度不飽和脂肪酸之油脂（日本專利公開案第 10(1998)-191886 及 10(1998)-70992號，以及PCT公告案第 2000-51〇513號之曰文譯本）。但此等製法因培養基之氮源濃 度低，故不適合用於成本效益生產油脂。因此為了提升成 15本效益，必需經由於培養基之升高氮源濃度進行培養，來 改良每次培養時含高度不飽和脂肪酸之油脂之回收量。作 於此種情況下，發現油脂之非可皂化物質含量及固醇含量 也提高。如此本發明之目的係發展一種製造方法，其可滿 足藉尚濃度培養改良成本效益，且可經由降低非可皂化物 20 質含量及固醇含量而改善品質。 發明人對於含高氮源濃度之培養基之培養條件以及製 造的油脂之化學組成進行廣泛徹底研究，意圖提供一種藉 高濃度培養製造的油脂（未加工油），其具有較低非可皂化物 質含量及/或酯型固醇含量’且包含高度不飽和脂肪酸作為 11 1352121 成分脂肪酸。結果出乎意外地，就培養槽攪動葉輪形式的 改良，以及培養基氮源滅菌時之pH條件，結果導致確立一 種油脂（未加工油）之製造方法，該油脂具有非可皂化物質含 量不大於2.2%重量比，及/或酯型固醇含量不大於1.0%重量 5 比’且包含高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸。

已知供給滿意數量之氧氣對於藉液體培養方法使用微 生物製造高度不飽和脂肪酸相當重要（曰本專利公開案第 6(1994)-153970號）。容積氧移轉係數(kLa)廣為人接受用作 為微生物液態培養之氧供應指標^ Richard報告kLa與每單位 10液體量之攪動功率消耗(Pg/V)、通氣線性速度(Vs)以及攪動 速度(N)具有式（1)表示之關係式(j w. Richard ;工業微生物 學之進展’第3期，141頁（1961年)）。 kLacx(Pg/V)0-4Vs°-5N0·5 (1)

基於容積為0.2至60立方米之培養測量值，Fukuda等人 15報告式(2)可獲得優於式⑴之關係式(Fukuda等人，所藏和雜 誌，第46期，829頁（1968年)）。 kLa〇c {(Pg/V)°.4VS05N°.5}1 4 (2)

Matsushima等人證實式⑴及式(2)之通用性，且報告式 (1)及式（2)藉通式表示為式（3)可獲得更寬廣應用 20 (Matsushima等人，守藏和雜誌、，第50期，1〇5頁（1972年)）。 kLax{(Pg/V)0-4Vs0-5N°-5}a ⑶ 由此等關係式，討論於相同功率消耗(Pg/v)以及相同 通氣線性速度(Vs)條件下，較高攪動速度(N)將獲得較高容 積氧移轉係數(kLa)。 12 1352121 每單位液體量之攪動功率需求可以式(4)表示。 Pg/V=pNpN3d5/V (4) 其中P表示液體密度，Np表示功率值’以及4表示授動 葉輪直徑》 5 為了於指定工作，換言之，攪動功率需求相同，提供 較尚授動速度(N) ’考慮以使用具有較小功率值(Np)及較小 攪動葉輪直徑(d)之培養槽為佳。

Taguchi等人（「微生物學介紹7_微生物發酵工程」， Hisaharu Taguchi及Shiro Nagai編輯，共立出版公司，175 10頁（1985年))敘述有關通氣-攪動培養槽之標準條件，d/D比 於1/4至1/3之範圍作為標準範圍，典型為1/3。 但此條件僅於水或有低細胞濃度之培養溶液建立。為 了改進製造之成本效益，須提供培養基之氮源濃度來獲得 較南細胞濃度。因此發明人認為於具有高細胞濃度之培養 15溶液，不僅因考慮容積氧移轉係數(kLa)，同時也需將全體 培養液之混合列入考慮。 此外發現當培養係於有較高氮源濃度之培養基進行 時，換言之，於較高細胞濃度進行時，由微生物萃取所得 包含向度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂（未加工油） 20之非可皂化物質含量及酯型固醇含量增高，結果導致因培 養含有較1¾氣源濃度’導致製造含有非期望化學組成之油 脂。Iwamoto報告總脂質之非可皂化物質含量隨著細胞油脂 含$的下降而降低（「油脂之微生物製造」，Hir〇aki Iwamoto’（來源未知)）。發明人進行研究也顯示於較高濃度 13 培養可降低每細胞的㈣含量。發明人考慮每個㈣之油 脂含量降低’造成非可4化物質含量及執行固醇含量的增 高。 如此，發明人考慮於高濃度培養，其中培養基之氣源 濃度高，要緊解僅改良容魏__(kLa)，同時也改 良全體培養液的齡，因而提升每個細胞的油脂含量。發 明人針對改良授動葉輪形狀(形式），作為達成此項目的之手 段並進行歧徹底研究。絲，發明人經域用培養槽具 有d/D[攪動葉輪直徑(=d)對培養槽内部直徑(=d)] = 〇 %至 0.6 ’經由培養微生物’成功地提升每個細胞的油脂含量， 且改良尚度不飽和知肪酸的產能。此外出乎意外地發現， 此種情況下，由微生物萃取所得包含高度不飽和脂肪酸作 為成分脂肪酸之油脂具有較低酯型固醇含量。 此外’發現即使於具有d/D=小於0.34之培養槽的情況 下，經由於pH值不大於5.0滅菌培養基的氮源，可達成微生 物製造高度不飽和脂肪酸產能的改進，以及酯型固醇含量 的降低。 如此，發明人進行全面性徹底研究，結果成功地製造 一種油脂（未加工油）其具有較低非可皂化物質含量及/或酯 型固醇含量，其方式係採用一種方法，其中培養係使用裝 配有d/D=不小於0.34之攪動葉輪之培養槽進行；或採用一 種方法其中當培養槽具有d/D=小於0.34時，培養係於含有 已經於pH不大於5滅菌之氮源的培養基進行。結果導致完成 本發明。 【實施冷式】 較佳實施例之詳細說明 本發明係有關一種製造油脂（未加工油）之方法，該油脂 具有較低非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量，且包含高 度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸，該油脂（未加工油），以及 帶有經由精煉油脂（未加工油）所得精煉油脂（三酸甘油酯） 摻混於其中之食品及飲料、治療性營養食品、動物飼料及 醫藥製劑。 根據本發明之油脂（未加工油）為經由於含氮源濃度2% 至15%之培養基，培養可製造包含高度$飽和脂肪酸作為 成分脂肪酸之_之微生物，製叙料產輯得之微生 物油知該'由脂（未加工油）係經由於裝配有授動葉輪 d/D=0.34至〇·6之培養槽培養，或當培養槽d/D=j 、於 0.34 時，經由於pH值不大於5滅菌之含氮源培養基培養 ，而具有 較低非可皂化物質含量及/或執行固醇含量。 特別，油脂（未加工油）具有非可息化物質含量不大於 2.2/〇重量比’較佳不大於2 〇%重量比及更佳不大壯8〇/❶重 量比及/或㈣固醇含量不大於1G%重量比，較佳不大於 〇·8/〇重量比及更佳不大於〇 6%重量比；以及以油脂（未加工 油）之總贿料基準1度傾和脂肪酸含f不低於薦 重量比’較佳不低於20%重量比，更佳不低於·重量比， 最佳不低於40%重量比。因此因進行可製造包含高度不飽 和脂肪酸作為成分m㈣旨（謂甘㈣）之微生物培 1352121 此處所述微生物較佳為可製造一種選自含18個或以上 碳原子以及3個或以上雙鍵之ω6高度不飽和脂肪酸、含18 個或以上碳原子以及2或以上雙鍵之ω9高度不飽和脂肪 酸、以及含18個或以上碳原子及3個或以上雙鍵之(〇3高度不 5 飽和脂肪酸之高度不飽和脂肪酸，主要係作為三酸甘油酯 之成分脂肪酸。 含18個或以上碳原子及3個或以上雙鍵之ω6高度不飽 和脂肪酸包括γ-亞麻酸(6,9，12-十八碳三烯酸）、二同-γ-亞麻 酸(8，11，14-廿碳三烯酸）、花生四稀酸（5,8，11，14·廿碳四烯 10 酸）、7，10，13，16-廿二碳四烯酸(22:4 ω6)以及DPA ω6(4,7,10, 13,16-廿二碳五烯酸）。含18個或以上碳原子及兩個或以上 雙鍵之ω9高度不飽和脂肪酸包括6,9-十八碳二烯酸、8,11-廿碳二烯酸以及梅德酸(Mead acid)(5,8,ll-廿碳三烯酸）；以 及含18個或以上碳原子及3個或以上雙鍵之ω3高度不飽和 15 脂肪酸包括α-亞麻酸(9,12,15-十八碳三烯酸）、6,9，12，15-十 八碳四烯酸（18:4 ω3)、8，11，14，17-廿碳四烯酸(20:4〇〇3)、 £?八(5,8，11，14，17-廿碳五烯酸）、0卩八〇)3(7，10,13,16，19-廿二 碳五烯酸)及DHA (4,7，10，13，16，19-廿二碳六烯酸）。 如此於本發明，任一種微生物皆可使用，只要該微生 20 物可製造包含高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂 (三酸甘油酯）即可。可製造包含花生四烯酸作為成分脂肪酸 之油脂（三酸甘油酯）之微生物包括屬於下列菌屬之微生 物：被抱霉、耳霉（Conidiobolus)、腐霉（Pythium)、疫霉 (Phytophthora)、青霉（Penicillium)、枝孢（Cladosporium)、 17 1352121 毛霉(Mucor)、鐮抱(Fusarium)、曲霉(Aspergillus)、紅酵母 (Rhodotorula)、蟲霉（Entomopht;hora)、次抱囊霉 (Echinosporangium)、及水霉（Saprolegnia) 〇

屬於被孢霉屬被孢霉亞屬之微生物包括例如亞屬長形 5 被孢霉（Mortierella elongata)、微小被抱霉（Mortierella exigua)、喜濕被抱霉(Mortierella hygrophila)、及高山被孢 霉。其特例包括長形被孢霉(IFO 8570)、微小被孢霉(IFO 8571)、喜濕被孢霉（IFO 5941)、高山被孢霉（IFO 8568)、 ATCC 16266、ATCC 3222卜 ATCC 42430、CBS 219.35、 10 CBS 224.37、CBS 250.53、CBS 343.66、CBS 527.72、CBS 529.72、CBS 608.70及CBS 754.68菌株。 例如屬於種屬克席科德菌（Crypthecodenium)、破囊壺 菌（Thrautochytrium)、分裂壺菌（Schizochytrium)、烏奇尼亞 菌（Ulkenia)、日本壺菌（Japonochytrium)或海壺菌 15 (Haliphthoros)之微生物也值得一提作為製造DHA之微生 物。 全部菌株皆可使用而非僅限於得自大阪發酵研究所 (IFO)、美國種型培養收集會(ATCC)及微生物培養局(CBS) 之菌株。此外，本發明研究小組由土壤分離的菌株亦即長 20 形被孢霉SAM 0219(FERM P-8703)(PERM BP-1239)也可使 用。 為了培養本發明可使用之菌株，經由事先培養所得的 孢子、菌絲體或種子培養液、或由種子培養收集所得細胞 接種於液態培養基，接著進行主培養。於液態培養基，此 18 5 :有::碳源包括(但非限制性)業界常用之碳源例如 油 庶糖、麥芽糖、可溶性澱粉、糖蜜 油、甘露糖醇及醣化殿粉。 取物氮括天錢源例如蛋㈣、酵母萃取物、麥芽萃 冷分*萃取物、卡斯胺基酸(casamino acids)、玉米穗軸 ^液、大豆 及盏—变曰、脫脂大豆及棉籽粉；有機氮源如尿素； …、機氮源如石肖酸納、確酸錄、及硫酸銨 10 ::特別大豆、脫脂大豆、一用= —/ 豆漿及豆粉為值得一提之氮源，特別熱變性脫脂 五，更佳為於約70°C至90。(：加熱處理脫脂大豆以及去除 醇可溶性成分而製備之產物可單獨使用或組合兩種或兩 種以上或組合前述其它氮源使用。 15 此外’若有所需，磷酸根離子、鉀離子、鈉離子、鎂 飼離子，此外，金屬離子如鐵、銅、鋅、猛、鎳及 姑離子以及維生素也可用作小量營養素。 20 葡萄 、甘 此等培養基成分濃度並無特殊限制’只要微生物之生 長不觉抑制即可。實際上，碳源之總添加量通常為〇. 1至4 〇 % 重畺比且較佳為1至25%重量比，氮源總添加量較佳為2至 15%重量比，且較佳為2至1〇%重量比。更佳碳源添加初量 為1至5%重量比，氮源添加初量為3至8%重量比，於培養過 程鎖進礙源及氮源且更佳只饋進碳源。 為了提高不飽和脂肪酸之產率，例如可使用烴類如十 六烷或十八烷；脂肪酸或其鹽類如油酸或亞油酸或脂肪酸 酯類如油酸酯、甘油脂肪酸酯或聚山梨糖醇脂肪酸酯；或 19 油脂如撖欖油、大豆油、油菜籽油、棉籽油、或棕櫚油單 獨或組合使用作為不飽和脂肪酸之前驅物。添加之基質量 係占培養基之0.001至10% ,且較佳05至10%。培養也可使 5用此等基質作為唯-碳源進行。可製造高度不飽和脂肪酸 之微生物之培養溫度係依據使用的微生物種類而改變。但 培養溫度可為5至40。(：且較佳為20至3〇°C。也可使用一種方 法其中培養係於20至3(TC來進行來生長細胞，然後繼續於5 至2〇C培養來製造不飽和脂肪酸。製得之脂肪酸中之高度 1〇不飽和脂肪酸比例也可藉此種溫度控制而升高。種子培養 而經由通氣-攪動培養、振搖培養、固態培養或靜態液體培 養進行；而主培養係藉通氣-攪動培養進行。主培養開始時 (接種種子培養液時）培養基調整至pH 5至7且較佳55至 •s°主培養通常進行2至3〇日，且較佳5至20日，更佳5至 15日。 15 根據本發明之油脂（未加工油）為經由培養可製造包含 馮度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）之 該種微生物製備之培養產物所得之微生物油脂，本發明之 最大特色在於未加工油之非可皂化物質含量及/或酯型固 醇含量可藉下述方式降低，經由於裝配有d/D=0.34至0.6之 20搜動葉輪之培養槽進行主培養；或當使用培養槽d/D=小於 〇·34時，經由於PH值不大於5滅菌之含氮源培養基進行主培 養。如此本發明發展出一種經由使用可製造包含高度不飽 和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）之微生物，而 降低未加工油之非可皂化物質含量及/或酯韶固醇含量。 20 1352121 5 本發明之培養方法中，最大特色為未加工油之非可皂 化物質含量及_旨型固醇含量係經由於培養槽培養而降 低，該培養具有_(齡錄聽㈣料養槽内部餘 ㈣之比HUO至0.6,較佳_,至〇 55，更佳d/D=()37 至0.55 ’及最佳d/D=〇.42至〇,55。為了藉_比達成更佳效 果’需要使用容積不小於丨立方米，較佳不小於5立方米， 及更佳科於敝方米之培養槽。有_轉輪，可使用 包括渴輪“之_葉輪可•單_階段❹個階段 無特殊限制。

10 15 +於培養基滅菌後當進行培養基之PH調整時，可小心以 無菌方式進行調整，俾不致於造成非㈣的微生物污染。 因此PH的通常係於培養基滅菌之前進行。例如滅菌時 不會造成任何PH變化之培養基，於培養開料調整至阳 6.〇,於培«培養絲㈣方式㈣师⑼，可免除於滅 菌後需要做無_調整^ 口卩使於培養槽d/D=小於_ 也可降低S旨型固醇含量，發明人針對此點進行研究，研究 滅菌步驟之PH條件對鱗生產力以及錄組成的影塑。^ 果發明人發現，於被調整至购大於5之培養基類前，再 度調整阳至適合滅菌後開始培養需要的pH值為佳。

20 S。脅丞虱脉〉谷液於滅菌後被調整至至5 較佳PH 4.2至4.7。滅菌後之培養基就此使用，或選擇性 加另-種有待滅菌的培養基後用來製備開始培養之培 基，然後調整至PH 5至7且較佳pH 5.5至6 5。種子培倾 入培養基而開始主培養。滅菌前可用於調整含氮源溶液 21 1352121 pH之pH調節劑包括（但非特別限制）硫酸、鹽酸、磷酸硝 酸及碳酸或其鹽，可單獨使用或組合兩種成兩種以亡使 用。滅菌後培養基pH之再度調節劑包括（但补限制性/氫氧 化物如氫氧化鈉及氩氧化鉀、以及氨及銨鹽，其讦單獨使 5用或組合兩種或兩種以上使用。 屬於被孢霉屬被孢霉亞屬之微生物已知町製造包含花 生四烯酸作為主要成分脂肪酸之油脂(三酸甘油酯）。發明人 經由讓前述菌株接受突變處理，獲得可製造包含二同-γ-亞 麻酸作為主要成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）之微生物（日 10本專利公開案第5(1993)-91887號）、以及可製造包含®9尚度 不飽和脂肪酸作為主要成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）之 微生物（日本專利公開案第5(1993)-91888號）。 此外，發明人也取得對高度濃縮碳源有抗性的微生物 (WO 98/39468)。前述微生物係屬於被孢霉屬被孢霉亞屬之 15微生物，藉本發明方法培養容易降低未加工油之#玎皂化 物質含量及/或酯型固醇含量，培養方法特別係經由於裝配 有攪動葉輪d/D=0.34至0.6之培養槽進行主培養；或當培養 槽d/D=小於0.34時，於pH值不大於5經滅菌且具有中等氮源 濃度為2%至15%之含氮源培養基進行主培養，可降低未加 20工油之非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量。 但本發明使用之微生物非僅限於屬於被孢霉屬被孢霉 亞屬之微生物，經由應用本發明之培養方法至可製造含咼 度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂（三酸甘油酯）之微 生物，可製造期望之具有較低非可皂化物質含量及/或酯型 22 1352121 固醇含量之未加工油，特別該方法係經由於裝配有授動葉 輪d/D=〇.34至0.6之培養槽進行主培養；或當培養槽d/D^、 於0.34時，於PH值不大於5經滅菌且具有中等氮源濃度為 2%至15%之含氮源培養基進行主培養，可降低未加工油之 5 非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量。 經由於裝配有授動葉輪¢1/0==0.34至0.6之培養槽進行主 培養，或當培養槽d/D=小於0.34時’於pH值不大於5經滅菌 且具有中等氮源濃度為2%至15%之含氮源培養基進行主培 養，可降低未加工油之非可皂化物質含量及/或酯型固醇含 · 10直，製造包含向度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之油脂且 具有較低非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量之微生 物，由該種微生物獲得未加工油之方法包括一種方法，其 中於培養完成後，培養溶液就此、或培養溶液於滅菌、濃 縮或酸化等處理後接受習知固_液分離(例如澱積、離心及/ 15 或過濾）來收集培養細胞。 由輔助固-液分離之觀點’可添加凝結劑或過滤劑來辅 助。凝結劑包括例如氯化紹、氯化約、藻蛋白及幾丁聚糖。_ 過滤助齊!包括例如石夕藻土。培養細胞較佳以水洗務、乾碎 及乾燥。乾燥例如可經由凍乾、風乾或流化床乾燥進行。 20由乾燥後細胞獲得未加工油之手段可為以有機溶劑萃取戈 擠壓》但以於氮氣流下以有機溶劑萃取為較佳。 有機溶劑包括乙醇、已烷、甲醇、乙醇、氣仿、二氯 f烷、石油醚及丙酮。也可使用以甲醇及石油醚萃取與以 氯仿-甲醇·水之單相溶鮮取交替進行。但獲得未加工油之 23 1352121 萃取方法非僅限於前述方法，任何可有效萃取積聚於細胞 内部之油脂之方法皆可使用。例如超臨界萃取可用作為有 效萃取方法。 目標未加工油之獲得方式，係經由使用有機溶劑或超 5臨界流體於減壓或其它條件下萃取，由所得萃取物去除有 機溶劍成分或超臨界流體成分來獲得目標未加工油。此外 可使用濕細胞進行萃取。此種情況下，使用與水相容之溶 劑如甲醇、乙醇及丙酮，或與水相容且由前述溶劑與水及/ 或其它浴劑組成之混合溶劑。其它程序係如前文說明。 10 根據本發明製造之具有較低非可皂化物質含量及/或 酯型固醇含量且包含高度不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之 未加工油，可摻混動物飼料直接使用。但應用至食物前， 較佳於使用前將未加工油接受習知的精煉油脂處理。此處 可使用之油脂精煉處理包括例如脫膠、去氧化、脫臭、脫 15色、管柱處理、分子蒸餾及冬化等習知處理。因此將本發 明之未加工油（其具有習知油脂精煉處理所無法達成之低 酯型固醇含量）接受油脂精煉處理，可獲得含有空前降低之 非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量之精煉油脂。 經由將本發明之具有較低酯型固醇含量之未加工油接 20受油脂精煉處理，也可降低精煉處理的處理負擔。特別例 如即使縮短精煉處理時間以及降低能量成本，仍然可獲得 具有非可皂化物質含量及/或酯型固醇含量等於先前技術 之精煉油脂。此外，使用與先前技術相等處理時間及能量 成本，可獲得比先前技術更低的非可皂化物質含量及/或酯 24 1352121 型固醇含量之精煉油脂。 根據本發明之精煉油脂(三酸甘油S旨）可用於I限廡用 範圍，例如用於食物、飲料、化妝品及醫藥製劑之原：及 添加劑’而其使用目的及用量並無特殊限制。 5 例如其t可使用精煉油脂之食品組成物包括_般食 品’以及额外包括機能性食品、營養補充物、早產嬰兒配 方、足月嬰兒配方、嬰兒配方、嬰兒食品、孕婦及哺乳婦 食品或老人食品。 10 15 含有油月旨之食品例如包括：本質上含有油脂之天缺食 品如肉、魚或核果；烹煮時添加油脂之食品例如湯;：用 油脂作為加熱媒介之食品如圈餅；油脂食品例如乳油；加 工時添加油脂之加工食品如小點心或餅乾；或加工完成時 喷麗或塗覆油脂之食品例如硬餅。此外精煉油脂添加至不 含油脂之農產品、發酵食品、牲口飼料、漁產飼料或飲料。 精煉油脂可以機能性食品及醫藥製咖式使用，例如以加 工後形式使用，例如口服營養品、散劑、粒劑、片劑、内 服液劑、懸浮液劑、乳液劑及糖漿劑。 實施例 20 將參照下列實施例說明本發明之進一步細節。但須了 解本發明非僅囿限於此等實施例。 粉於培養基 濃度=6% 提供高山被孢霉(CBS 754.68)作為花生四缔酸的生產 性真菌。高山被抱霉之標準菌株接種於培養基(1%酵母萃取 25 1352121 物，2%葡萄糖，pH 6.3)。於1〇〇 _之往復式振搖及耽 溫度開始種子培養（第—階段），種子培養連續3日。其次， 於5〇升容積之通氣·擾動培養槽内準備3〇升培養基(1%酵母 萃取物’ 2〇/〇葡萄糖’ 〇.1%大豆油，pH 6 3)。種子培養(第 5 -階段)溶液接種於培養基。於授動速度啊，溫度28 °C，以及槽内壓150 kPa之條件下開始種子培養（第二階 段），該種子培養連續2日。 其-人準備4500升培養基（培養基A :大豆粉336千克， ΚΗ2Ρ04 16.8千克 ’ MgCl2.6H2〇 2 8千克，CaCl2 2H2〇 2 8 % 1〇千克，大丑油5.6千克）。用於條件（1-1)培養基調整至pH 6.3 ’對條件（ι_2)調整至ρΗ 4_5。條件（Μ)及條件（1_2)之培 養基皆係於121 C及20分鐘條件下滅菌。於14〇〇C4〇秒條件 下滅菌1000升培養基（培養基B:葡萄糖 一水合物112千 克）’添加該滅菌後之培養基之前述培養基A而準備培養基c 15作為另一培養基。培養基C就此用於條件（ι·υ，培養基C調 整至pH 6.3用於條件（1_2)。然後種子培養（第二階段)溶液接 鲁 種於如此製備之培養基，容積調整為培養液初量共5600升 (培養槽容積·· 10千升）。 培養係於溫度26°C，空氣流速49牛頓立方米/小時及内 20壓20〇kPa之條件下開始培養。 培養槽之形式為於三個階段裝配六葉片渦輪，攪動葉 輪直徑（一d)對槽内部直徑(=D)之比為d/D=〇 34。當饋進表1 所示之培養基時，進行主培養3〇6小時。培養結束時，受到 饋進培養基而使溶液量增加、以及溶液蒸發而使溶液量減 26 1352121 少等影響，培養液總量為775〇升。培養結束時，每升培養 溶液製造的花生四烯酸濃度對條件（Μ^18·2克/升及對條 件（1-2)為18.4克/升。 表1 :實施例1進給之培養基 主培養時間 進給之培養基 19小時後 葡萄糖一水合物280千克/460升 43小時後 fe萄糖一水合物280千克/450升 67小時後 葡萄糖一水合物252千克/390升 91小時後 葡萄糖一水合物252千克/410升 120小時後 140小時後 163 /丨、B# 接 葡萄糖一水合物224千克/370升 葡萄糖一水合物168千克/280升 培養完成後，培養液於UOUO分鐘條件下滅菌。藉連 續脫水器收集濕細胞。收集所得濕細胞於擺動流化床乾燥 器乾燥至水含量為1%重量比。錢後之細胞藉空氣運送機 運送至填裝處所，連氣-起填裝入容 ίο 帶容器内。袋口部經熱熔封，然後帶狀容器儲存於10 以下之冰箱。 ' 取 乾燥後細胞由容器袋中取出，接受已燒萃取。 由己烧溶液去除固體物質。然後渡液於減壓下加熱去^ 烷，獲得含花生四烯酸作為成分脂肪酸之未加工「示 工 量 油經分析。結果如表2所示，未加工油 未加 具有低酯型固醇含 27 15 1352121 表2 .含化生四烯酸之未加工油之實測值 實施例 實施例1 條件1-1 實施例1 條件1-2 $養槽形式，d/D 0.34 0.34 培養基A經調整後之pH值(滅菌前） 6.3 6.3 4.5 6.3 培養基C之pH值(滅菌後而於接種種子培養液之前） 各分量之wt% 三酸甘油S旨 94.0% 非可皂化物質 94.2% 酯型固醇 2.0% 1.8% — 0.8% 0.6% 未加工油之花生四烯酸於總脂肪酸，％ 42.0% 42.1% 复鱼例2 :花生四烯酸之製造，dm豆粉於培基其 濃廑=6% 5 種子培養係以實施例1之相同方式進行。主培養係於實 施例1條件（1-1)之相同條件下進行，但培養槽形式為 d/D=0.42之六葉片渦輪裝配於三個階段，培養基準備時之 pH條件各異。供於條件(叫培養，培養基八(滅菌前)調整至 PH 6.1，未對培養基C(接種種子培養液前）進行pH調整。供 H)於條件(2-2)培養，培養基a調整至pH 4 5，培養紅調整至 PH 6.1。培養結果，培養結束時每升料液製造的花生四稀 酸濃度，條件(2-1)為19,0克/升及條件升。培 養完成後，以實施例1之相同方式獲得包含花生四歸酸作: 成分脂肪酸之未加工油。未加工油經分析。結果如表3所 15 示，未加工油具有低酯型固醇含量。 28 1352121 表3 :含花生四婦酸之未加工油之實測值 實施例 實施例2 條件2-1 實施例2 條件2-2 培養槽形式，d/D 0.42 0.42 培養基A經調整後之pH值(滅菌前） 6.1 4.5 培養基C之pH值(滅菌後而於接種種子培養液之前） 6.1 6.1 各分量之wt% 三酸甘油酯 94.2% 93.5% 非可皂化物質 1.8% 1.6% 酯型固醇 0.6% 0.5% 未加工油之花生四烯酸於總脂肪酸，％ 42.2% 41.3% fAMl:花生四烯醢之製造，d/D=0.3、0.25及0.2，夫吞 養基澧唐=6% 5 種子培養係以實施例1之相同方式進行。主培養係與實 施例1條件(1-1)之相同條件下進行，但有關培養槽形式，二 階段使用裝配有六葉片渦輪d/D = 0.3之培養槽，二階段使 用裝配有六葉片渦輪d/D=0.25之培養槽，以及二階段使用 裝配有六葉片渦輪d/D=0.2之培養槽。培養結果，培養結束 10 時每升培養液產生的花生四烯酸濃度，d/D=0.3之槽為17.0 克/升’ d/D=〇.25之槽為16.5克/升，及d/D=0.2之槽為13.5克 7升。培養完成後，以實施例1之相同方式獲得包含花生四 稀酸作為成分脂肪酸之未加工油。未加工油經分析。結果 如表4所示，各種情況之酯型固醇含量皆超過1%。經由實 15 施例3結果與實施例1及2結果比較，酯型固醇含量高考慮係 歸咎於培養槽具有低d/D比。 29 1352121 表4 :含花生四烯酸之未加工油之實測值 實施例或對照例 實施例3 對照例 實施例3 對照例 實施例3 對照例 培養槽形式，d/D 0.30 0.25 0.20 培養基A經調整後之pH值(滅菌前） 6.3 6.3 6.3 6.3 培養基C之pH值(滅菌後而於接種種子培養液 之前） 6,3 6.3 各分量之wt% 三酸甘油醋 93.8% 93.1% 93.0% 非可皂化物質 2.9% 2.9% 2.9% 酯型固醇 1.2% 1.2% 1.2% 未加工油之花生四烯酸於總脂肪酸，°/〇 42.0% 41.6% 41.5%

宜羞L例4 :花生四烯酸之製造，d/D=0.3、〇_25及0.2，大豆 数於培養某澧膚=6%，低dH滅菌 5 種子培養係以實施例1之相同方式進行。主培養之培養 基pH調整係以實施例1條件（1_2)之相同方式進行（培養基 A(pH 4.5)4滅菌—培養基C(pH 6.3)。隨後共於三種條件下 進行主培養，換言之，條件4-1，其中於二階段槽中配有六 葉片渦輪d/D=0.3;條件4-2,其中於二階段槽中配有六葉片 10 滿輪d/D=0.25 ;以及條件4-3，其中於二階段槽中配有六葉 片渦輪d/D=0.2，主培養係以實施例1之相同方式進行。除 前述實驗之外，使用槽d/D=0.3於另二條件下進行培養，條 件4-4培養基A調整至pH 4.0，以及條件4-5為pH 4.9。 主培養結果，培養結束時每升培養液製造的花生四烯 15 酸濃度，條件(4-1)[於pH 4.5滅菌，d/D=0.30]為17.2克升， 條件（4-2)[於pH 4.5滅菌，d/D=0.25]為16.8克升，條件 (4-3)[於ΡΗ4·5滅菌，d/D=〇.2〇]為 14.0克升，條件(4-4)[於pH 4.〇滅菌，〜0=0.30]為17.1克升，以及條件(4-5)[於卩114.9滅 30 菌’ d/D=0.30]為Π.2克升。培養完成後，重複實施例1之程 序獲得含花生四烯酸作為成分脂肪酸之未加工油。 未加工油分析結果顯示於表5。比較實施例3與實施例4 結果顯示，於d/D=0.30之培養槽，於pH 4.5滅菌培養基氮 源’可降低酯型固醇含量至不超過1%。但於d/D=0.25之槽 及d/D=0.20之槽培養，儘管氮源係於ρΗ4·5滅菌，酯型固醇 含量無法降至不超過1%。此外，比較條件(4-1)、（4-4)及(4-5) 結果，顯示於4.0至4.9之pH範圍滅菌氮源，被考慮為可獲得 同等酯型固醇降低效果。 表5 :含花生四烯酸之未加工油之實測值 實施例或對照例 實施例4 條 #4*1 實施例4 條科2 (對照例） 實施例4 條私3 (對照例) 實施例4 條 #4*4 實施例4 條料5 $養槽形式’ d/D 0.30 0.25 0.20 0.30 0.30 $養基A經調整後之pH值(滅菌前） 4.5 4.5 4.5 4.9 養基C之pH值(滅菌後而於接種種子 4.0 培養液之前） 6.3 63 6.3 6.3 6.3 各分量之wt% 三酸甘油酯 93.8% 93.1% 93.0% 93.5% 93.4% 非可皂化物質 2.2% 2.5% 2.7% 2.1% 2.1% 酯型固醇 1.0% 1.1% 1.1% 1.0% 1.0% 未加工油之花生四烯醆於總脂肪酸，％ 42.0% 40.8% 40.8% 41.5% 41.7% 實施例5 :經由精煉未加工油所得精煉油脂分析結果 實施例1條件（1 -1)及實施例2條件(2-1)製備之含花生四 烯酸之未加工油藉習知去氧化及脫膠方法精煉，獲得精煉 15 油脂5-A及5-B。於實施例3條件d/D=0.25製備之含花生四稀 酸之未加工油係以前述相同方式精煉獲得精煉油脂5_(>含 花生四烯酸之精煉油脂之實測值顯示於表6。 31 1352121 表6 :實施例5分析結果 (含花生四烯酸之精煉油脂A、B及C之實測值) 實施例或對照例 實施例1 (條件1-1) 實施例2 (條件2-1) 實施例3 (d/D=0.25) (對照例） 精練油脂· 5-A 5-B 5-C 各分量之wt% 三酸甘油酯 96.0% 96.4% 95.0% 非可皂化物質 1.4% 1.2% 2.0% 酯型固醇 0.8% 0.6% 1.2% 花生四烯酸於精煉油脂之總脂肪酸，％ 42.4% 42.8% 41.7% 宜座例6 :於1.5%大豆粉條件下製造花峰四埤醅 5 提供雨山被抱霉(CBS 754.68) ’種子培養（第一階段及 第一階段)係以實施例1之相同方式進行。其次，於121 °c及 2〇分鐘條件下滅菌4500升培養基（培養基A :大豆粉84千 克 ’ KH2P04 16.8千克 ’ MgCl2.6H20 2.8千克，CaCl2.2H2〇 2.8 千克，大豆油5.6千克）。經由將1000升培養基(培養基b :葡 10萄糖一水合物112千克)於140°C40秒條件下滅菌，添加減菌 後培養基至前述培養基A ’製備培養基C作為另一培養基。 培養基C調整至pH 6.1。然後種子培養（第二階段)溶液 接種於如此製備的培養基，容積調整為培養液初量56〇〇升 (培養槽容積：10千升）。主培養始於溫度26°C，空氣流速49 15 牛頓立方米/小時及内壓200 kPa之條件。主培養係於主培養 槽進行，換言之，於二階段培養槽裝配有d/D(攪動葉輪直 徑（=d)對槽内部直徑(=D)之比）= 0.34之六葉片渦輪，以及 二階段培養槽裝配d/D=0.25之六葉片渦輪。當饋進表7所示 培養基時，進行主培養162小時。培養結束時，每升培養液 20製造的花生四烯酸濃度對d/D=0.34之槽為5.0克/升，對 32 1352121 d/D=〇.25之槽為4.7克/升。 表7 :實施例6之培養基進料 主培養時間 培養基進料 _ 19小時後 葡萄糖一水合物84千克/200升 _43小時後 葡萄糖一水合物84千克/200升 67小時後 葡萄糖一水合物56千克/12〇升 _91小時後 葡蜀糖一水合物56千香/125升

培養完成後’以實施例1之相同方式，收集乾燥細胞， 接著使用己烷萃取獲得含花生四烯酸作為成分脂肪酸之未 加工油。未加工油之實測值顯示於表8。當培養基氮源濃度 為1.5%時’對d/D=0.25及d/D=0.34二者，未加工油皆具有酯 型固醇含量不超過1%。 表8 :實施例6結果(含花生四烯酸之未加工油實測值) #養槽形式，d/D 0.25 0.34 各分量之wt% 1酸甘油酯 94.1〇/〇 93.0% 非可皂化物質 1.2% 1.2% 酯型固醇 0.4% 0.4% 花生四烯酸於未加工油之總脂肪酸，％ 40.8% 41.5% 施例7 :二同-γ-亞麻酸之製造；d/D=〇.3〇、0.34及0.25之 嚴響，大豆粉於培養基濃度4%，氤淑滅菌dH 4.5

發明人確立一種包含二同-γ·亞麻酸作為成分脂肪酸之 油脂（三酸甘油酯）之製法。油脂之製法係根據日本專利公開 15 案第5(1993)-91887號所述製法，培養具有花生四烯酸生產 能力以及較低Δ5不飽和活性之微生物，例如高山被孢霉 SAM 1860突變株(FERMP-3589)而製造油脂。 33 1352121 高山被孢霉（SAM 1860)提供為二同-γ-亞麻酸生產性真 菌。高山被孢霉之標準菌株接種於500毫升錐形瓶内之1〇〇 毫升培養基（1%酵母萃取物，2%葡萄糖，pH 6.3)。種子培 養（第一階段)係始於1〇〇 ι·ριη往復振搖及溫度28°c之條件， 種子培養連續3曰。其次，於50升容積之通氣·授動培養槽 内準備30升培養基（1%酵母萃取物，2%葡萄糖，〇1%大豆 油，pH 6.3)。種子培養（第一階段）溶液接種於培養基。種 子培養（第二階段)始於攪動速度2〇〇 rpm，溫度28。〇及槽内 邛壓力150 kPa之條件；種子培養持續2日。主培養係於條 件（7-1)至（7-4)之四個階段進行。 至於條件（7-1) ’ 4500升培養基（培養基a :大豆粉224 千克，KH2P〇4 16.8千克，MgC12.6H2〇 2 8千克，CaCi2 2H2〇 15 20 千克大豆油5.6千克)藉添加氫氧化納水溶液調整至 6.卜培養基於121t及2〇分鐘條件下滅菌。培養基c準備作 為另一培養基，係經由於140°C4〇秒條件下滅菌1〇〇〇升培養基 |培養基B :葡萄糖—水合物112千克），將滅菌後之培養基 ϋ至W述培養基A。測定培養基c之pH，發現為㈣1。 然後種子培養（第二階段)溶液接種於培養基c，容積調整至 培養液初”测升(鱗積千朴培養始於溫度 1氣机速49牛頓立方米/小時及内壓2〇〇 kpa之條件。 培養槽形式為二階段裝設六葉片渴輪，義葉輪直徑 〜句對槽内部直徑(=D)之比為d/D=〇 34。谇養期f， 使用消泡偵測_，自動添加二 泡而由培她物„==== 34 主培養2叫時。培養結㈣，受叫魏進祕成溶液量 ::及培養液蒸散造成溶液量減少的影響，培養液量 至於條件(7·2)，主培養仙條件(7娘相同方式進 打’但培養基續、_㈣添加硫_整维4 5，培養基 c係藉無菌添加氫氧化鈉水溶液調整至阳61，使麟㈣3 之培養槽。至於條件(7·3)，培養係叫件㈣之相同方式 10 進二料用d/㈣欺培養槽。至於條件(Μ)，培養係 以條件㈤)之相同方式進行，但使編韻之培養槽。 η及铬=母升培養液生產之二同个亞麻酸濃度，條件 (-)條件(7-2)皆為12.3克/升， 條件(7-4)為1〇.〇克/升。 主培養時間 19小時後 __基進料___ 葡萄糖—水合物280千克/460升 u’j、a寸傻 67小時後 1 9Π ,ίν πΐ 軔萄糖一水合物280千克/450升 葡萄糖一水合物280千克/450升 1 ‘ u 、呀俊 一葡萄糖一 j士物336千克/53〇升 15、培養完成後，培養液於12〇t2〇分鐘條件滅菌。然後藉 連續脫水器收集濕細胞。收集所得濕細胞於振搖流化床乾 燥器乾燥至水含董為1%重量比。乾細胞藉空氣運送機轉運 至填充位置，連同氮氣一起填充A容積约i立方米之銘落 ^袋口部經減封。然後容器袋儲存㈣t或以下之冰 35 1352121 乾燥後細胞由容器袋内取出，使用己烷萃取。固體物 質藉過濾由己烷溶液去除。然後濾液於減壓下加熱去除己 烷，獲得含二同·γ-亞麻酸作為成分脂肪酸之未加工油。未 加工油經分析，分析結果顯示於表1〇β至於d/D=〇34之培 5養槽’未加工油具有酯型固醇含量不超過1。/。。至於d/D=〇3 之培養槽，藉S知方法於條件(7-3)進行pH調整，獲得含高 酯型固醇含量之未加工油。於條件(7_2)於pH 4 5滅菌培養 基單元，可降低酯型固醇含量至不高於1%。至於d/D=〇 25 之培養槽，酯型固醇含量超過1〇/。。 10 表10 :含二同个亞麻酸之未加工油之實測值 實施例或對照例 實施例7 條件7-1 實施例7 條件7-2 實施例7 條件7-3 (對照例） 實施例7 條件7*4 (對照例） 培養槽形式，d/D 0.34 0.30 0.30 0.25 培養基A經調整後之pH值(滅菌前） 培養基C之pH值(滅菌後而於接種種子培養 6.1 4.5 6.1 6.1 液之前） 6.1 6.1 6.1 6.1 各分量之wt% 三酸甘油S旨 93.8% 94.1% 93.5% 93.0% 非可皂化物質 2.1% 2.2% 2.9% 2.9% 酯型固醇 0.9% 1.0% 1.2% 1.2% 未加工油之二同-γ-亞麻酸於總脂肪酸，〇/〇 42.2% 41.9% 40.7% 41.7% 复施例8 :二同-γ-亞麻酸之製造；於大豆粉濃廑培卷150/0 提供高山被孢霉（SAM 1960)，種子培養係以實施例1 之相同方式進行。其次，於121t及20分鐘條件下滅菌4500 15 升培養基（培養基A :大豆粉84千克，KH2P04 16.8千克， MgCl2.6H20 2.8千克，CaCl2.2H20 2.8千克，大豆油5.6千 克）。經由將1000升培養基(培養基B :葡萄糖一水合物112 千克）於140°C40秒條件下滅菌，添加滅菌後培養基至前述 36 培養基A’製備培養紅作為另—培養基。培養基c調整至 PH 6.1 ’然後種子培養溶液接種培養基c，於如此製傷的培 養基今積調整為培養液初量56〇〇升(培養槽容積：1〇千升): 主培養始於溫度26t，空氣流速49牛頓立方米/小時及 5内壓200 kPa之條件。主培養係於主培養槽進行，換言之， 於二階段培養槽裝配有(授動葉輪直徑（ = d)對槽内部直 控(=D)之比）=〇 34之六葉片㈤輪，以及二階段培養槽裝配 d/D=0.25之六葉片渦輪。培養期間的發泡係使用消泡偵測 器偵測’大豆油係、自動添加以防止培養液因發泡而由槽中 〇排放出田饋進表“所示培養基時，進行主培養⑹小時。 α養、束時每升培養液製造的二同个亞麻酸濃度對 d/D-0.34之槽為4.8克/升，對趣=〇.25之槽為4.7克/升。 表11 :實施例8之培養基進料 主培養時間 培養基進料 19小時後 葡萄糖一水合物84千克/200升 43小時後 葡萄糖一水合物84千克/200升 67小時後 葡萄糖一水合物56千克/120升 91小時後 葡萄糖一水合物56千克/125升 培養完成後，以實施例7之相同方式，收集乾燥細胞， 接著使用〔烷萃取獲得含二心_亞麻酸作為成分脂肪酸之 未加工油。分析未加工油，未加工油之實測值顯示於表12。 37 1352121 j：12 :實施例8結果(含二同-γ-亞麻酸之未加工油實測值) 培養槽形式，d/D 0.25 0.34 各分量之wt0/〇 二酸甘油醋 非可皂化物質 酯型固醇 93.5% 1.2% 0.4% 93.0% 1.2% 0.4% ^同-γ-亞麻酸於未加工油之總脂肪酸，％ 40.5% 41.3% 實施例9 ··碑德酸之製造；d/D=0·5，大呈粉於接養基丨尊疮 4%

5 發明人破立一種包含ω9咼度不飽和脂肪酸作為成分脂 肪酸之油脂（三酸甘油酯）之製法。該油脂之製法係經由根據 曰本專利公開案第5(1993)-91888號所述製法，培養具有ω9 高度不飽和脂肪酸生產能力的微生物，例如高山被抱霉 (SAM 1861)突變株(FERM Ρ-3590)。 1〇 發明人也確立一種包含梅德酸作為成分脂肪酸之油脂

(三酸甘油酯）之製法。此種油脂之製法係將可製造花生四稀 酸之微生物根據日本專利公開案第10(1998)-57085號所述 方法接受突變處理。油脂之製法係培養突變株，該突變株 具有被降低的或被刪除的Δ12去飽和苷、以及至少一種提升 15 的去飽和活性、Δ6去飽和活性及/或鏈延長活性，例如高 山被孢霉(SAM 2086)(FERM P-15766)。 高山被孢霉(SAM 2086)作為梅德酸生產性微生物。高 山被孢霉之標準菌株接種於2000毫升錐形瓶内之5000毫升 培養基(1%酵母萃取物，2%葡萄糖，pH 6.3)。種子培養（第 2〇 一階段)係始於往復振搖100 rpm及溫度28。(：之條件，種子培 38 1352121 養持續3曰。其次於5〇升容積之通氣-攪動培養槽準備3〇升 培養基(I0/。酵母萃取物，2%葡萄糖，0.1%撖欖油，pH 6.3)。 種子培養（第一階段)溶液接種於培養基。種子培養（第二階 段)係始於下述條件，授動速度300 rpm，溫度28°C及槽内壓 5 2〇〇 kPa ;種子培養持續2日。其次，3200升培養基(培養基 A :大豆粉160千克，橄欖油4千克)於i2lt滅菌2〇分鐘。 培養基c準備作為另一培養基，經由s14〇〇C9〇秒條件 下滅菌700升培養基(培養基B:葡萄糖一水合物肋千克）， 添加滅菌後之培養基至前述培養基A而製備培養基c。培養 1〇基C調整至pH 6.卜然後種子培養（第二階段)溶液接種於培 養基C，容積調整為培養液的初量共4〇〇〇升(培養槽容積： 10千升）。主培養始於下述條件：溫度24t，空氣流速49牛 頓立方米/小時，内壓200 kPa，搜動功率要求2千瓦。於培 養第4日’溫度改成贼。有關培養_式，使用於二祕 15裝配有d/D(搜動葉輪直徑（=d)對槽内部直徑㈣之比卜 之六葉片涡輪之培養槽。當饋進入表13所示之培養基時， 主培養進行456小時。培養結束時，每升培養液製造之梅德 酸濃度為10·1克/升。 表13 :實施例9之培養基谁料 主培養時間 培養基進料 19小時後 葡萄糖一水会物？⑽千$ //]6〇斗 43小時後 络廿上丄 '—--- _^合物280千克/450升 67小時後 91 小 8¾ 144小時後 _合物280千克/450升 -_合物 336 千克/530 升 _合物80千克/140升 39 20 1352121 培養完成後，培養液於120°C20分鐘條件滅菌。然後藉 連續脫水器收集濕細胞。收集所得濕細胞於振搖流化床乾 燥器乾燥至水含量為1%重量比。乾燥後細胞連同氮氣藉空 氣運送機填裝入填裝型容器袋内。袋口部經熱熔封。然後 5 容器袋儲存於10°C或以下之冰箱。 乾燥後細胞由容器袋内取出，接受己烷萃取。固體物 質藉過濾由己烷溶液移出。然後濾液於減壓下加熱去除己 烧，獲得含梅德酸之未加工油。未加工油經分析，結果顯 示於表14。 10 實施例10 :梅德酸之製造，d/D=0.25，大豆粉於培養基濃 廑=4% 種子培養係以實施例9之相同方式進行。主培養係於實 施例9之相同條件下進行，但有關培養槽形式，使用二階段 裝配有d/D=0.25之六葉片渦輪之培養槽。結果培養結束時 15 每升培養液製造的梅德酸濃度為8.0克/升。培養完成後，以 實施例9之相同方式獲得含梅德酸作為成分脂肪酸之未加 工油。 分析含梅德酸之未加工油，未加工油之實測值顯示表14。 表14 :含梅德酸之未加工油之實測值 實施例或對照例 實施例9 實施例10 (對照例） 培養槽形式，d/D 0.5 0.25 各分量之wt% 三酸甘油酯 94.6% 93.0% 非可皂化物質 1.8% 2.8% 酯型固醇 0.6% 1.2% 梅德酸於未加工油之總脂肪酸，％ 35.0% 30.6% 40 1352121 實施例11 :梅德酸之製诰，於大§粉濃度==〗_5〇/。之條件下 培養 提供高山被孢霉（SAM 2086)，種子培養係以實施例9 之相同方式進行。其次於121°C20分鐘條件下滅菌3200升培 5 養基(培養基A :大豆粉60千克，橄欖油4千克）。培養基c準 備作為另一培養基，經由於140eC90秒條件下滅菌700升培 養基(培養基B :葡萄糖一水合物80千克），添加滅菌後之培 養基至前述培養基A而製備培養基C。培養基c調^至pH 6·1，然後種子培養（第二階段)溶液接種於培養基c，容積調 10 整為培養液的初量共4000升(培養槽容積：1〇千升）。主培養 始於下述條件：溫度24°C，空氣流速49牛頓立方米/小時， 内壓200 kPa，攪動功率要求2千瓦。 於培養第4曰，溫度改成2〇。〇。有關培養槽形式，使用 於二階段裝配有d/D(攪動葉輪直徑（=d)對槽内部直徑(=d) 15 之比）=〇·34之六葉片渦輪之培養槽以及使用二階段裝配有 d/D=0.25之六葉片渦輪之培養槽。當饋進入表15所示之培 養基時，主培養進行300小時。培養結束時，每升培養液製 造之梅德酸濃度為，d/D=0.34之培養槽為3.9克/升，而 d/D=0.25之培養槽為3.8克/升。 表15 :實施例11之培養基進料 主培養時間 培養基進料 19小時後 葡萄糖一水合物60千克/12〇升 43小時後 葡萄糖一水合物60千克/12〇升 67小時後 葡萄糖一水合物40千克/8〇并 91小時後 葡萄糖一水合物40千克/8〇弁 41 培養凡成後，以實施例9之相同方式，收集乾燥後之細 胞，接著以己料取而獲得包含梅德酸作為成分脂肪酸之 油未加工油經分析，未加工油之實測值顯示於表16。 s表16.實施例ty果(含梅德酸之未加工油實測值） 培養槽形式，Η/Π

質 [%酯物 wt°油化醇 之甘4'固 量吃可型 分三非II 各 I 梅德酸於未加工油之總脂肪酸，0/〇 34.5% 34.2% 95.0% 1.3% 0.5%

10 15 复遂魁12 :推混包^^生四烯酸作為成分脂肪酸且具有鲂 固醇含量之盤A油脂（三酸甘油酯）之勝囊劑之製備 加水至100份重量比明膠及35份重量比食用甘油，混合 物於50至60°C加熱溶解來製備明膠薄膜。其次提供精煉油 脂5-A(三酸甘油酯）與0 05%維生素e油之混合物作為膠囊 内容物’ 5-A為實施例5製備之具有經降低之酯型固醇含量 且包含花生四烯酸作為成分脂肪酸。膠囊之成形及乾燥係 以習知方法進行’來製備每顆膠囊含18〇毫克内容物之軟膠 囊。也使用實施例5製備之精煉油脂5-B作為原料，以使用 精煉油脂5·Α之製備膠囊劑之相同方式製備軟膠囊。 實施例13 :用於脂質肪幹、;j：事j部丨 400克實施例5製備之具有經降低之酯型固醇含量’且 包含花生四稀酸作為成分脂肪酸之精煉油脂5-A(三酸甘油 酯），48克精製卵黃卵磷脂，2〇克油酸，ι〇〇克甘油及40毫 升0.1N苛性蘇打添加及於均化器内分散。然後添加注射用 42 20 1352121

蒸館水至分散液，調整分散液容積至4升，接著使用高虔喷 霧乳化劑乳化而製備脂質乳液。-份200毫升脂質乳液分配 入塑膠袋内，錢於121。(:2〇分料行高财蒸氣滅 備脂質輸注製#卜此外，制實施例5t備之精煉油脂5_B 5做原料如脂質輸注製劑’係以使用精煉油脂5·Α製備脂質輸 注製劑之相同方式製備。 實袼例14 :用於畢汁 2克/5-環_添加至戰升寫乙醇水賴。⑽毫克 實施例5製傭之具有經降低之醋型固醇含量、且包含花生四 1〇稀酸作為成分脂肪酸（摻狀05%維生素Ε)之精煉油脂 5-AU酸甘油醋)添加至其中，伴以藉_輯拌，混合物 於5〇C培養2小時。冷卻至室溫（約j小時)後，混合物又以授 拌於4°C培養4小時。 15 20 所得沈澱藉過滤收集，以正己燒洗蘇，然後束乾獲得 1.8克包含含花生四稀酸之三酸甘油㈣環糊精包含體化 合物。1克粉末均勻混合於1G升果汁來製備含有精煉油脂 (三酸甘油醋）之果汁，該油脂具有經降低之醋型固醇含量， 且包含花生四稀酸作為成分脂肪酸。使用實施例5製備之精 煉油脂5·轉為原料之果汁也係以使用精煉油脂Μ製備果 汁之相同方式製備。 實施例ii_:用於奶粉 且 此外，使用實施

=克實施例5製備之具有經降低之輯型固醇含量 包含花生四烯酸作為成分脂肪酸之精煉油脂Μ(三酸甘油 酯）’混合於100克奶粉來製備配方奶粉 43 1352121 例5製備之精煉油脂5-B作為原料之配方奶粉也係以使用精 煉油脂5-A製備配方奶粉之相同方式製備。 實施例16 :使用各種菌株之焙基方法 長形被孢苷（IFO 8570)、喜濕被孢霉(IFO 5941)、橫刺 5 孢囊霉(Echinosporangium transversale) (NRRL 3116)、矮耳 霉(Conidiobolus nanodes) (CBS 154.56)及刺水霉(Saprolegnia lapponica) (CBS 284.38)用作為花生四烯酸之生產性真菌。 此等花生四烯酸生產性真菌之標準菌株接種於培養基（酵 母萃取物1%，葡萄糖2%，pH 6.3)，種子培養於往復振搖1〇〇 10 rpm及溫度28°C條件進行3曰。 其次’於50升容積之通氣-攪動培養槽内準備25升培養 基（葡萄糖5〇0克，大豆粉775克，KH2P04 50克，MgCl2.6H20 7.5克 ’ CaCl2‘2H20 7·5克’及大豆油25克，pH 6.3)。種子 培養液接種於培養基，主培養始於攪動速度2〇〇 rpm，溫度 I5 28 C及槽内壓150 kPa條件。至於培養槽形式，於二階段使 用裝配有d/D-0.42之六葉片渦輪之培養槽。培養進行丨86小 時，同時約24小時間隔添加50%葡萄糖溶液，將葡萄糖濃 度調整至約1%至2%。 培養完成後，培養液於12(rc及2〇分鐘條件滅菌。濕細 20胞於減壓下藉過濾收集，乾燥至水含量為1°/。重量比。乾燥 後細胞以己院萃取。固體物質藉過遽由己燒溶液中移除。 然後濾液於減壓下加熱去除己烧，獲得含花生四稀酸作為 成分脂肪酸之未加工油。分析含花生四稀酸之未加工油。 未加工油之實測值示於表17。 44 25 1352121 表17 :實施例16結果(含花生四烯酸之未加工油實測值) 菌株 長形被抱霉 IFO 8570 喜濕被抱霉 IF05941 橫刺孢囊霉 NRRL3116 矮耳霉 CBS 154.56 刺水霉 CBS 284.38 各分量之wt% 三酸甘油酯 90.0% 88.1% 86.0% 83.4% 82.6% 非可皂化物質 1.9% 1.9% 2.0% 2.0% 2.0% 酯型固醇 0.8% 0.7% 0.7% 0.8% 0.8% 花生四烯酸於未加工油之 總脂肪酸，％ 30.8% 31.7% 28.6% 26.3% 20.7% I：圖式簡單說明3 (無） 5 【圖式之主要元件代表符號表】 (無) 45

Claims (1)

1352121 i告本 —辦谷.-j 年月日修(更)正本 第—92128123號專利申請咬申锖専刊範圍替愤冰--」100年ό月27日 拾、申請專利範圍： 1. 一種製造未加工油之方法，該未加工油具有經降低之非 可皂化物質含量及/或酯型固醇含量，以及一作為成分 脂肪酸之高度不飽和脂肪酸，該方法包含獲得一可製造 5 包含不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之脂質或油質的微 生物，以及將該微生物培養於裝配有攪動葉輪之培養槽 内之含有2至15%氮源的培養基内，且該裝配有攪動葉 輪之培養槽係滿足下述條件：攪動葉輪直徑（ = d)對培養 槽内部直徑（=D)之比為d/D=0.34至0.6,其中該微生物為 10 南山被抱霉。 2. —種製造未加工油之方法，該未加工油具有經降低之非 可皂化物質含量及/或酯型固醇含量，以及一作為成分 脂肪酸之高度不飽和脂肪酸，該方法包含獲得一可製造 包含不飽和脂肪酸作為成分脂肪酸之脂質或油質的微 15 生物，以及將該微生物培養於裝配有攪動葉輪之培養槽 内之含有2至15%氮源的培養基内，且該裝配有攪動葉 輪之培養槽係滿足下述條件：攪動葉輪直徑（ = d)對培養 槽内部直徑（=D)之比為d/D=0.30至小於0.34，其中該氮 源含有已經於pH不高於5滅菌之氮源，且該微生物為高 20 山被孢霉。 3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其進一步包含精煉該 未加工油之步驟。 4. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中包含該高度不飽 和脂肪酸作為成分脂肪酸之脂質或油質中不低於70% 46 1352121 第92128123號專利申請案申請專利範圍替換本 100年6月27曰 為三酸甘油酯。 5. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該組成該脂質或 油質之高度不飽和脂肪酸為γ-亞麻酸（18:3 ω6)、二同-γ-亞麻酸(20:3 ω6)、花生四烯酸(20:4 ω6)、7,10,13,16-廿 5 二碳四烯酸(22:4 ω6)、4,7,10,13,16-廿二碳五烯酸(22:5 ω6)、（X-亞麻酸（18:3 ω3)、6,9,12,15-十八碳四烯酸（18:4 ω3)、8，11,14,17-廿碳四烯酸(20:4 ω3)、廿碳五烯酸(20:5 ω3)、7,10,13,16,19-廿二碳五烯酸（22:5 ω3)、 4,7,10,13,16,19-廿二碳六烯酸(22:6 ω3)、6,9-十八碳二烯 10 酸（18:2 ω9)、8,11-廿碳二烯酸(20:2 ω9)或5,8,11-廿碳三 烯酸(梅德酸(Mead acid): 20:3 ω9)或其兩種或兩種以上 的組合。 6. 如申請專利範圍第3項之方法，其中包含該高度不飽和 脂肪酸作為成分脂肪酸之脂質或油質中不低於70%為 15 三酸甘油自旨。 47