TWI343813B - - Google Patents

Description

1343813 (1) 玖、發明說明 【發明所屬技術領域】 . 本發明係關於將與消化性潰瘍產生相關之幽門桿菌（ 、

Helicobacter pylori)由胃內除去之幽門桿菌黏著阻礙劑， +’ 及其製造方法’並且含有此之使用於預防或治療與幽門桿 菌相關的疾病之醫藥及食品。 【先前技術】 ® 幽門桿菌具有一端數條鞭毛（flagella )，螺旋型之 革氏陰性桿菌，生活於人類的胃黏膜之菌。該菌爲1983 年澳洲Marshall, B.J.與Warren, J.R.報告由胃炎、胃潰瘍 病患之胃部檢體中可高頻率地檢測出，自此後由免疫學硏 究報告出此爲胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍的原因菌，且 陸續報告出更與胃癌等疾病相關。 因此，可想巷道現今於消化性潰瘍的根本治療上幽門 桿菌的除菌爲不可欠缺的。作爲該除菌製造方法，有如下 ® 述說明，抗生素與胃酸分泌抑制劑的並用治療法廣泛地被 提倡。 · 幽門桿菌一旦定著於胃黏膜上時，既使於感染免疫反 . 應非常強（抗體價高）的情況下，該菌可不被除菌而於胃 中繼續生存。因此，不僅經由抗生素的治療無法完全除菌 ，中止投藥後約1個月以內又會回到治療前的感染狀態。 且因胃內鹽酸而使pH保持於非常低的狀態，故多數的抗 · 生素被不活化。該理由下’幽門桿菌的除菌可使用強力抑 .. -6- (2) (2)1343813 制胃酸分泌之質子幫浦抑制劑與除菌藥劑（抗生素）之並 用形式。又，現狀下幽門桿菌的除菌有羥胺苯甲青霉素、 開羅理素及lansoprazole等三劑並用治療法爲日本標準治 療法。然而，抗生素的長期投與，除其副作用以外有著耐 性菌增加的非常嚴重之問題。 作爲解決投與以除菌爲目的的抗生素所產生的副作用 及耐性菌增加等問題之方法，現今雖有經口疫苗之免疫治 療法之途徑，但實際上複雜條件成爲障礙，新預防、治療 法之硏究幾乎無進展。又疫苗僅爲以預防爲目的者，對一 旦感染到幽門桿菌的患者則無效果。 —般而言，細菌的感染要成立時，細菌會黏著於宿主 細胞上，經由增殖而黏著爲感染的第一步。細菌對宿主細 胞的黏著，黏著因子（adhesin)必須與宿主細胞表面受體 (receptor)結合。特開平10· 287 5 8 5中揭示有關幽門桿菌 的黏著機制中，未解明的黏著因子爲該菌產生的尿素酶， 對該尿素酶之雞蛋黃抗體可顯著抑制幽門桿菌之胃內增殖 〇 又，專利第3 2 5 5 1 6 1號中揭示，來自牛乳除去乳脂肪 及酪蛋白所得乳淸之黏蛋白可阻礙幽門桿菌對消化管之黏 著。 然而，幽門桿菌的黏著因子之尿素酶於胃黏膜的黏著 ，可由種種糖與蛋白質的褐變反應生成物而被阻斷未知》 【發明內容】 (3) (3)1343813 本發明的課題爲提供一種可有效率地阻斷與產生消化 性潰瘍相關的幽門桿菌對胃黏膜之黏著，且無過去使用抗 生素所引起的副作用或耐性菌增加等缺點下安全性高之幽 門桿菌黏著阻礙劑。 本發明者對可阻止尿素酶黏著於胃黏膜的物質做重重 檢討結果’發現糖與蛋白質之褐變反應生成物可有效率地 阻止作爲黏著因子的尿素酶對胃黏膜之黏著，而完成本發 明。 即’本發明係關於糖與蛋白質之褐變反應生成物作爲 有效成分之幽門桿菌黏著阻礙劑。其中蛋白質爲包含可經 口攝取的任意蛋白質，糖爲包含可經口攝取的任意還原糖 〇 本發明又關於一種幽門桿菌黏著阻礙劑的製造方法， 其含有水溶液中，使糖與蛋白質進行褐變反應之步驟。 且，本發明更關於一種幽門桿菌黏著阻礙劑的製造方 法，其含有水溶液中，使含有糖與蛋白質的食品引起褐變 反應之步驟。本發明中，褐變反應爲進行至5 %水溶液所 測定之405nm吸光度爲0.01以上者。其中食品爲僅含糖 與蛋白質者即可並無特別限定，較佳爲鮮牛奶、牛奶粉（ 全脂奶粉）'脫脂奶粉、乳淸及煉乳（濃縮牛奶）等。 本發明係關於糖與蛋白質之褐變反應生成物、與胃酸 分泌抑制劑所成之幽門桿菌黏著阻礙劑。本發明又關於糖 與蛋白質之褐變反應生成物、與對幽門桿菌具有除菌作用 之其他物質所成之幽門桿菌黏著阻礙劑。且本發明更係有 -8- (4) (4)1343813 關糖與蛋白質之褐變反應生成物、胃酸分泌抑制劑及對幽 門桿菌具有除菌作用之其他物質所成之幽門桿菌黏著阻礙 劑。且，本發明中的「除菌作用」爲表示於體內及/或體 外，對幽門桿菌之黏著阻礙、增殖抑制或防止、滅菌等之 作用。 本發明又關於一種含有如上述的幽門桿菌黏著阻礙劑 之使用於預防或治療與幽門桿菌相關疾病之醫藥組成物。 且本發明關於一種含有如上述的幽門桿菌黏著阻礙劑之使 用於預防或改善與幽門桿菌相關疾病之食品。 以下對本發明做詳細說明。 本發明的幽門桿菌黏著阻礙劑之有效成分爲，糖與蛋 白質之褐變反應生成物，即，胺-羰基反應之生成物。褐 變反應爲混合各種糖與各種蛋白質於水溶液中經加熱處理 而進行。 有關本發明的蛋白質爲可經口攝取的任意蛋白質，例 如僅爲小麥、大麥、米、玉米、大豆、紅豆的植物性蛋白 質、或來自牛奶、蛋、魚、肉的動物性蛋白質中任一皆可 ，但不限定於此。具體而言，可舉出含於牛奶的酪蛋白、 万-乳球蛋白、α-乳球白蛋白、牛血淸白蛋白、免疫球蛋 白、乳吩嚀等、或含於小麥的麥谷蛋白、白蛋白等、或含 於玉米的玉米蛋白 '含於卵的卵淸蛋白、卵淸轉鐵球蛋白 、卵類黏蛋白、卵黏蛋白、溶菌酶等、含於魚肉或肉類的 肌漿球蛋白、肌動蛋白等。這些各種蛋白質可使用經常法 純化者，或直接使用販賣品亦可。這些蛋白質可單獨或組 -9- (5) (5)1343813 合2種以上使用。或含有這些蛋白質的食品材料，例如含 來自牛奶的蛋白質之鮮奶、牛奶粉、脫脂奶粉、乳淸或煉 乳等作爲蛋白質混合物可直接使用。 作爲使用於製造褐變反應生成物之糖，可舉出D-葡 萄糖' D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯 糖、D-核糖、乳糖等種種還原糖。可使用這些糖的純品， 但使用脫脂奶粉或乳淸等時，如上述因含有蛋白質，來自 牛奶的蛋白質無須另混合而進行褐變反應。 糖與蛋白質的質量比率可爲任意比率，但一般爲1: 100〜10: 1之範圍，較佳爲1: 9〜1: 1之範圍。 本發明中，褐變反應生成物可由，混合糖與蛋白質之 水溶液中進行褐變反應以外，可將含有糖及蛋白質之食品 ，較佳爲含有上述質量比的糖及蛋白質之食品，例如將生 牛奶、牛奶粉、脫脂奶粉、乳淸及揀乳等直接於水溶液中 加熱處理等引起褐變反應所得。 脫脂奶粉爲含有以酪蛋白爲主之各種牛乳蛋白質、及 乳糖等糖。脫脂奶粉可由常法將鮮乳以離心分離法分離除 去脂肪部分，粉末化產生的脫脂乳而得，但亦可使用販賣 品的脫脂奶粉。 乳淸爲將脫脂乳除去酪蛋白者，含有乳糖等糖、及 卢-乳球蛋白、α乳球白蛋白、牛血淸白蛋白、免疫球蛋 白、乳吩嚀等乳淸蛋白質。作爲本發明所使用的乳淸，可 依常法由牛乳中調製出，或直接使用販賣品的乳淸（濃縮 液、粉末等）。 β -10- (6) (6)1343813 本發明中’褐變反應爲中性水溶液或鹼性水溶液中進 行爲佳。作爲鹼性水溶液可使用氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳 酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸氫二鈉等種種鹼性水溶液。所添加 的鹼濃度並無特別限定，但例如可使用〇.〇5〜0.5當量的 氫氧化鈉。水溶液的量爲可充分均句地懸浮糖與蛋白質之 混合物、或含有糖與蛋白質之食品的量即可，例如1〜 100倍量、較佳爲5〜20倍量。 褐變反應爲進行至糖與蛋白質之混合物的5%水溶液 所測定之405 nm吸光度爲〇.〇1以上，較佳爲〇.1以上。 405nm的吸光度爲0.01以上時表示進行褐變反應。吸光度 爲例如將5%水溶液100# 1以microplate reader進行測定 〇 作爲褐變反應的條件，於中性水溶液中進行反應時， 反應溫度爲I〇〇°C以上，特別以120°C以上爲佳。反應時 間一般爲2 0分鐘以上，較佳爲3 0分鐘至10小時。又， 於鹼性水溶液中進行反應時，反應溫度爲室溫至100°C， 特別爲40〜90°C爲佳，反應時間一般爲1〜20小時，較佳 爲2〜8小時。 所得之褐變反應生成物可直接攝取、或以一般方法， 例如使用超濾、離子交換樹脂等將未反應的糖除去、亦可 施予脫鹽。又，亦可以等電點沈澱、鹽析、有機溶劑沈澱 等使用於蛋白質之選擇性沈澱的一般方法進行褐變反應生 成物的沈澱。欲使褐變反應生成物可容易製劑化或添加於 食品等時，可使用一般慣用的方法，例如冷凍乾燥或噴霧 -11 - (7) (7)1343813 乾燥等方法進行乾燥爲佳。褐變反應於中性水溶液中進行 時’可直接乾燥，但經由上述方法除去未反應的糖，脫鹽 後經乾燥再粉末化爲佳。褐變反應於鹼性水溶液中進行時 ’反應溶液可經酸（無機酸及/或有機酸）中和。又，中 和後可直接乾燥，但經由上述方法除去未反應的糖，脫鹽 後經乾燥再粉末化爲佳。 本發明的褐變反應生成物爲，優先與幽門桿菌的黏著 因子之尿素酶結合，可阻止胃黏膜對受體的黏著。因此， 本發明的褐變反應生成物對幽門桿菌具有優良除菌效果， 對幽門桿菌相關之疾病，例如對消化性潰瘍等之預防、改 善有用。又，原料之糖及蛋白質爲可來自食品或食品材料 等可經口攝取者，褐變反應亦爲食品加工之加熱調理過程 經常發生的反應，本發明的褐變反應生成物爲安全性非常 高且無副作用之擔憂。因此，含有本發明的褐變反應生成 物之幽門桿菌黏著阻礙劑，可添加於醫藥或食品中，使用 於與幽門桿菌相關疾病之預防、改善。 本發明的褐變反應生成物所成之黏著阻礙劑，可直接 或同時與適當載體或賦型劑（增量劑、結合劑等）由一般 任意製劑化方法製造。若必要可添加其他添加劑或藥劑， 例如抑酸劑（碳酸氫鈉、碳酸鎂、沈澱碳酸鉀、合成 Hydrotalcite等）' 胃黏膜保護劑（合成矽酸鋁、舒胃泰 '海地特泰德等）或消化酵素（B i 〇 d i a s t a s e、脂肪分解酵 素等）。本發明的黏著阻礙劑之投與可經口進行，投與量 爲一·般成人每天0.0〗〜】0.0 g (乾物量），較佳爲〇 5〜 -12- (8) (8)1343813 5 . Og。 本發明的褐變反應生成物所成的黏著阻礙劑，可並用 胃酸分泌抑制劑而進一步地提高效果。作爲可使用的胃酸 分泌抑制劑，雖然例如可舉出法莫替丁（ f a m 〇 t i d i n e )、 nizatidine、roxatidine ' ranitidine ' cimetidine 等 H2 受體 括抗劑或 omeprazole、 lansoprazol、 rabeprazol 等的質子 幫浦抑制劑，但不限定於此。胃酸分泌抑制劑的投與量爲 依藥劑而不同，一般成人每天】〇〜5〇mg，較佳爲20〜 3 0 m g 〇 又，本發明的黏著阻礙劑因與對幽門桿菌具有除菌作 用的其他物質組合，可更提升幽門桿菌之除菌作用。如此 其他物質包含對例如種種抗生素、聚酚、幽門桿菌之抗體 、與幽門桿菌之黏著因子的尿素酶結合之多醣類及醣類蛋 白質等。且，本發明的黏著阻礙劑可與鉍製劑等胃疾病治 療藥、metronizazole等之驅蟲藥劑組合。 如此聚酚例子，可舉出兒茶酸、掊兒茶酸 '掊酸掊兒 茶酸酯、表兒茶酚、掊酸-1-表兒茶酸酯、表掊兒茶酚、掊 酸表掊兒茶酯、游離型茶黃質、茶黃質單掊酸酯、茶黃質 掊酸酯、白藜蘆醇、前花色素、桷斗皮黃素、花色苷、蘿 蔔硫素、異黃酮等。本發明的黏著阻礙劑可與這些聚酚混 合爲佳，含有這些聚酚的茶、可可、果實等食品材料或這 些萃取物可配合於本發明的黏著阻礙劑中爲佳》 作爲對幽門桿菌的抗體，雖可舉出對全菌體之抗體、 對菌表面分子的抗體，但以容易入手且提高除菌作用等對 -13 - (9) (9)1343813 菌表面分子之雞蛋抗體、特別爲與幽門桿菌的黏著有關之 尿素酶、對鞭毛的雞蛋抗體（特開平10-28758)爲佳。 作爲與幽門桿菌的尿素酶結合之糖蛋白質例子，可舉 出來自哺乳動物的消化管之黏蛋白、來自乳淸的黏蛋白、 來自雞蛋白之黏蛋白等之黏蛋白，構成這些黏蛋白之糖蛋 白質。作爲結合於該尿素酶的多醣類例子，硫酸糊精（ Antimicrobiol Agents and Chemotherapy, Vο 1. 44，No. 9, p p . 2 4 9 2 - 2 4 9 7, 2000 ) ' fucodain ( Ga s t r o e η i e r o 1 i g y, Vol. 119，pp.3 5 8-3 67，2 000年）等《又，作爲抑制該尿素酶的 活性之蜂巢蠟膠萃取物，有報告指出以特超臨界萃取法萃 取之蜂巢蠟膠具有效果（Medical Nutrition，2003年1月 1日號）。 又，作爲抗生素可舉出盤尼西林系、Sefem系、大環 內脂係、新喹啉酮系、四環素系之抗生素，特別爲羥胺节 青霉素及開羅理素較佳。抗生素的投與量，因要繼而相異 ，成人一般每天投與量爲】〇〇〜5000mg，較佳爲500〜 3 0 0 0 m g。 因含有本發明褐變反應生成物的黏著阻礙劑含於食品 中，故更容易攝取。本發明褐變反應生成物對食品的配合 量一般爲0.5〜1〇質量％程度，較佳爲1.0〜3.0質量％。 如此食品型態例如可舉出健康食品 '作爲功能性食品爲細 粒、錠劑、顆粒劑、膠囊劑、流動食品等之各種醫藥型態 ，且可舉出湯類、果汁類、茶類 '乳類、可可飮料、果凍 狀飲料等之液狀食品、布丁、養樂多等半固體食品、麵包 -14 - 1343813 do) '點心、烏龍麵等麵類，餅乾、巧克力、糖果、仙貝等點 心類、拌飯調味料、牛油、果醬等膠類等型態。使用含有 多量對幽門桿菌具有除菌效果的聚酚、多醣類或糖蛋白質 之食品材料的食品爲佳。具體而言，使用含有聚酚的果實 、茶、可可之果汁類、茶類、可可飲料、巧克力等，含有 多醣類或糖蛋白質之乳類、乳發酵飮料等。 又，作爲特定保健用食品，雖無特別限定其型態，但 以可繼續攝取之點心類、粉末湯類、飲料等爲佳。作爲患 者用食品（低納食品、低熱量食品 '低蛋白質食品）等， 可舉出湯 '飮料、流動食品等醫藥用食品。 且，食品中可添加種種食品添加物，例如各種營養素 、種種維他命 '礦物質、食物纖維、多價不飽和脂肪酸、 分散劑及乳化劑等安定劑、甜味劑、呈味成分、風味等。 又，液狀食品可由最先已調製成液狀食品者、或以粉末或 糊狀溶解於所定量之水性液體中所調製者。 【實施方式】 實施例 實施例1酪蛋白與乳糖於鹼性水溶液中的褐變反應 5〇ml的錐形管中的l〇ml之0.：2N NaOH水溶液中，加 入以下表所不量的乳糖與酪蛋白’以試管震邊機震盪至均 勻的懸浮液爲止。5 0 °C水浴下加溫4小時，進行褐變反應 。將0.2N HC1添加於反應液中至pH爲7.0爲止。經中和 的反應液經冷凍乾燥後得到褐色粉末》 -15- (11) 表1 實施例 乳糖 酪蛋白 1-1 1 〇〇mg 9 0 0 m g 1-2 3 OOmg 7 0 0 m g 1-3 4 0 0 m g 600mg 1-4 5 00m g 5 0 0 m g 1343813 實施例2 酪蛋白鈉與乳酸於水溶液中的褐變反應 50ml的錐形管中的l〇ml之蒸餾水中，加入400mg的 乳糖與600mg的酪蛋白鈉，以試管震盪機震盪至溶解爲 止。高壓滅菌器中進120 °C，20分鐘的褐變反應。再經冷 凍乾燥後得到褐色粉末。 實施例3 Θ -乳球蛋白與乳酸的褐變反應 15ml的錐形管中的1.0ml的0.2NNaOH水溶液中， 加入40mg的乳糖與60mg的/3 -乳球蛋白，以試管震盪機 震盪至溶解爲止。5 〇 °C的水浴下加溫4小時，進行褐變反 應。將0.2N HC1添加於反應液中至pH爲7.0爲止。經中 和的反應液使用 Sephadex G-25(Amershem-Pharmacia)經 膠體過濾進行脫鹽，再經冷凍乾燥後得到褐色粉末。 實施例4 α -乳球白蛋白與乳酸的褐變反應 1 5 m 1的錐形管中的1.0 m丨的 0.2 N N a Ο Η水溶液中， -16 - (12) (12)1343813 加入4〇mg的乳糖與60mg的α·乳球白蛋白，以試管震盪 機震盪至溶解爲止。5 0。(：的水浴下加溫4小時，進行褐變 反應。與實施例3相同進行中和、脫鹽，再經冷凍乾燥後 得到褐色粉末。 實施例5 脫脂奶粉的褐變反應 將1 .〇g的奶粉（QproE-22，協同乳業製）添加於 I Om 1的0.2N NaOH水溶液中。攪拌成均勻的懸浮液後， 5 〇 °C的水浴下放置4小時，進行褐變反應。與實施例3相 同進行中和、脫鹽，再經冷凍乾燥後得到褐色粉末。 實施例6乳淸的褐變反應 將 l.Og 的乳淸（SIMPLESSE 100，CPKelco 公司製） 添加於10ml的0.2N NaOH水溶液中。攪拌成均勻的懸浮 液後，5 0 °C的水浴下放置4小時，進行褐變反應。與實施 例3相同進行中和、脫鹽，再經冷凍乾燥後得到褐色粉末 實施例7酪蛋白鈉與葡萄糖的褐變反應 100ml的蒸餾水中添加4g的葡萄糖與6g的酪蛋白鈉 ，攪拌至固體成分溶解爲止。高壓滅菌器中以下述表所示 反應溫度及反應時間進行褐變反應。使用Sephadex G-25(Amershem-Pharmacia)經膠體過爐除去低分子部分後， 再經冷凍乾燥後得到褐色粉末。 -17- 1343813 (13) 表2 實施例 反應溫度 反應時間 7-1 100。。 30分鐘 7-2 120。。 10分鐘 7-3 1 20°C 40分鐘 實施例8酪蛋白鈉與乳糖使用碳酸氫鈉之褐變反應 1.5ml的微量試管中的lml蒸餾水中加入60ml的酪蛋 白鈉與40mg的乳糖與42mg的碳酸氫鈉，攪拌至溶解》 加熱裝置中進行 9 0 °C ，5小時的褐變反應。使用 Sephadex G-25(Amershem-Pharmacia)經膠體過漉進行脫鹽 ，再經冷凍乾燥後得到褐色粉末。 實施例9大豆蛋白質的褐變反應 50ml的錐形管中的10.0ml之0.2N NaOH水溶液中， 加入40 0mg的乳糖與600mg的大豆蛋白粉末（和光純藥 製造），以試管攪拌機震盪成懸浮液。40°C水浴下加溫5 小時，進行褐變反應。將0.6N HC1添加於反應液中至PH 爲7.0爲止。經中和的反應液經冷凍乾燥後得到褐色粉末 實施例〗〇小麥白蛋白的褐變反應 50ml的錐形管中的ίο.〇ml之〇.2N NaOH水溶液中 -18- (14) 1343813 加入4〇Omg的乳糖與600mg的小麥白蛋白（日淸 製造），以試管攪拌機震盪溶解。40°C水浴下加溫ί ，進行褐變反應。反應液與實施例9相同進行中和， 冷凍乾燥後得到褐色粉末。 實施例11卵白蛋白的褐變反應 50ml的錐形管中的i〇.〇ml之0.2NNaOH水溶游 加入400mg的乳糖與600mg的來自卵的白蛋白（和 藥製造），以試管攪拌機震盪成溶解。4〇°C水浴下加 小時，進行褐變反應。反應液與實施例9相同進行中 再經冷凍乾燥後得到褐色粉末。 實施例12玉米蛋白與乳糖的褐變反應 50ml的錐形管中的l〇ml之0.2N NaOH水溶液中 入400mg的乳糖與600mg的玉米蛋白（和光純藥製 ，以試管攪拌機震盪成溶解。40°C水浴下加溫5小時 行褐變反應。反應液與實施例9相同進行中和，再經 乾燥後得到褐色粉末。 實施例13 酪蛋白與木糖使用磷酸氫二鈉之褐變反 微量離心管中的1.0ml之O.lmol/L磷酸氫二鈉水 中，加入40mg的木糖與60mg的酪蛋白，以試管攪 震盪成懸浮液。8 5 °C的加熱裝置下加溫2小時，進行 反應。使用 Sephadex G-25(Amershem-Pharmacia)經 fa 1 m a 小時 再經 中， 光純 溫5 和， ，加 造） ，進 冷凍 溶液 拌機 褐變 膠體 -19- (15) (15)1343813 過濾除去低分子部分後’再經冷凍乾燥後得到褐色粉末。 試驗例1 褐變反應進行測定 褐變反應的進行由405nm吸光度進行測定。 50mg的實施例1〜13所調製出的褐變反應生成物溶 解於lml的蒸餾水中。以1 0,000G進行5分鐘的離心分離 ，將 100#1澄淸液注入 96孔微量培養皿中（NUNC immunoplate，訂貨號碼 442404)。以 microplate reader (Molecular Device 公司 Versa Max)以 650nm 的吸光度 作爲對照波長而測定405nm的吸光度。如表3所示，實施 例的褐變反應生成物顯示〇. 1以上的吸光度，確認所有實 施例皆顯示充分進行褐變反應。

-20 - (16)1343813 表3 實施例 吸光度（405nm、對照波長650nm) 1-1 0.636 1-2 0.956 1-3 1.017 1 -4 1.03 2 0.128 3 1.761 4 1.911 5 1.431 6 1.302 7-1 0.164 7-2 0.582 7-3 1.219 8 1.893 9 0.601 10 0.561 11 0.455 1 2 0.347 13 0.807 試驗例2 幽門桿菌黏著阻礙活性之測定 對於實施例I〜】3的褐變反應生成物，幽門桿菌之黏 著因子的尿素酶對胃黏膜之黏著阻礙效果，如下於體外實

-21 - (17) (17)1343813 驗系進行調查。且，幽門桿菌之黏著因子的尿素酶與胃黏 膜黏蛋白因成特異性結合，幽門桿菌可定著於宿主的胃上 。因此’該幽門桿菌的尿素酶與胃黏蛋白的黏著可以較低 濃度下阻斷者，具有較強的幽門桿菌黏著阻礙活性。 (實驗材料及方法） 使用於本黏著阻礙試驗的尿素酶及豬胃黏蛋白之調製 ，如下述進行。 (1 )尿素酶的調製 幽門桿菌#130株（由東海大學醫學部感染症學教室 取得）之布氏桿菌培養菌液（3.5x I08CFU/ml )以12,000 X G下進行20分鐘離心後，將菌體溶解於純水中，以螺 旋攪拌機處理60秒。再次離心，得到含有尿素酶之萃取 澄淸液。純化如下方法進行。 以緩衝液（20mM 磷酸鹽，pH6.8，ImM EDTA， ImM 2-氫硫乙醇及】0%PEG 300)平衡化之DEAE-sefasel 管柱中灌入上述萃取液，0.5 ml/分鐘的流速下吸附於膠體 上 > 溶離爲經0〜0.5M KC1的濃度梯度而實施。對於各部 分的液體偵測其尿素酶活性。收集確認爲尿素酶活性的波 峰部分，經濃縮。其次，以緩衝液（20mM磷酸鹽， pH6.8，]50mM NaCl)平衡化之 Cefacurl S-300 管柱中灌 入上述濃縮液體進行溶離。測定各部分液體之尿素酶活性 ，收集各尿素酶活性之波峰部分，以SDS-PAGE進行分析 -22- (18) (18)1343813 時’確認尿素酶A(32kDa)與尿素酶B(60kDa)之蛋白 質所成。尿素酶於使用前分裝保存於-8(TC下。 (2)豬胃黏蛋白的調製 屠殺出生約2個月的健康豬，將胃部取出，內部加入 含有0.1M磷酸鹽+ 〇.15MNaCl+5mM N-乙基馬來酸酐縮 亞胺（NEM) +lmM苯基甲基磺醯氟化物（PMSF) + ImM EDTA的PBS ( pH7.4)進行洗淨。切開胃後刮取出 黏膜，浮游於上述緩衝中。該黏膜浮游液於冰凍狀況化進 行ρ ο I y t r ο η均質機攪拌均勻。將此經1 5 , Ο Ο Ο X G離心得到 澄淸液。該澄淸液再經25，000x G離心，回收澄淸液，以 蒸餾水透析經冷凍乾燥得到粗胃黏蛋白。其次，將該乾燥 粗胃黏蛋白溶解於PBS(pH6.8，6M氯酸脈及蛋白酶抑 制劑（含有 5mM NEM，ImM PMSF, ImM EDTA)中，將 此重疊於氯化鉋梯度溶液（1.5g/ml)，以34,000x G離心 4 8小時。含有唾液酸部分的檢測由硝纖維素膜點墨與過 碘酸鹽指示劑進行染色。收集發色部分，再次重疊於氯化 鉋梯度溶液上進行分離。收集陽性部分，經冷凍乾燥。其 次通過以0.1M磷酸緩衝液（含有0.1M NaCl，pH6.8)平 衡化的cefar〇seCL-4B管柱進行膠體過濾分離。收集PAS 染色爲陽性，蛋白質濃度高之部分，以PBS(pH6.8)進 行透析，得到純化豬胃黏蛋白。將此保存於-8 0 °C下直到 使用（純化豬胃黏蛋白）。且，純化豬胃黏蛋白由S D S -PAGE的結果，確認爲66kD的糖蛋白質。 -23- (19)1343813 且，豬純化胃黏蛋白經一般方法使其生物 於分析上。 (3 )幽門桿菌黏著阻礙試驗 96孔微量培養皿中的各孔中重新注入5〇a // g/m丨濃度的幽門桿菌尿素酶之0.05M碳酸 ，經4 °C下靜置一晚，於孔中被尿素酶吸著。 # 1含有0.05%tween20的磷酸緩衝生理食鹽7j 洗淨3次後，加入含有150//1 3%牛血淸白蛋 衝生理食鹽水（PH7.0 )，於37°C下靜置1小 蓋（blocking )。將溶液除去後以1 50 //丨售 tween20的磷酸緩衝生理食鹽水（ρΗ7.0)洗淨 2.5// g/ml的生物素化豬胃黏蛋白、與含 的試驗樣品之含〇.〇5%Tween2〇的磷酸緩衝生 p Η 4.0 )分別以各5 0 // 1加於孔中，於3 7 °C下f ，使尿素酶上黏接生物素化豬胃黏蛋白。由孔 去，以]50//丨含有0.05%tween20的磷酸緩衝 (pH4.0)洗淨3次，於65°C下靜置10分鐘 質。以150//丨含有0.05%tween20的磷酸緩衝 (pH7.0)洗淨3次後，加入50"丨過氧化酶 生素蛋白之含 〇.〇5%tween20的磷酸緩衝生ί ΡΗ7.0 )，室溫下靜置1小時。以]50 μ丨爸 tween20的磷酸緩衝生理食鹽水（ρΗ7.0)洗淨 孔中加入50 ν 1含鄰苯二胺2鹽酸及Η202的 素化再使用 ί 1調製爲5 鈉緩衝溶液 各孔以1 5 0 < (ρΗ7.0 ) 白的磷酸緩 時，進行覆 「有 〇.〇5 % 3次。 有一定濃度 理食鹽水（ 淨置1小時 中將溶液除 生理食鹽水 ，固定蛋白 生理食鹽水 標識鏈黴抗 里食鹽水（ 「有 0.05 % 5次後，各 基質溶液（ -24- (20) (20)1343813 pH4.0 )，引起過氧化酶反應。室溫下經5分鐘反應後， 添加 5 0 //丨的 2N硫酸，停止酵素反應。測定各孔的 490nm吸光度。 黏著阻礙活性（％ ) =〔 1 -(添加樣品的孔之吸收度 /無添加樣品的孔之吸光度）〕X 1 00 (4 )結果 Φ 測定實施例1〜13的褐變反應生成物於100/zg/m丨濃 度之黏著阻礙活性的結果，顯示全部生成物強力阻礙幽門 桿菌的尿素酶與豬胃黏蛋白之結合。這些結果如表4所示 -25- (21) (21)1343813 表4 .褐變反應生成物的結合阻礙活性 實施例 結合阻礙活性（％) 1-1 70 1-2 78 1 -3 84 1-4 8 1 2 60 3 72 4 66 5 82 6 69 7-1 50 7-2 52 7-3 43 8 66 9 63 10 3 8 11 62 12 1 6 13 4 8 試驗例3幽門桿菌除菌體內實驗 (方法） 作爲實驗動物，使用對幽門桿菌感染的高感受性之 -26- (22) 1343813 NS : Hr/ICR系無毛老鼠（財團法人動物繁殖硏究，寄存 號碼 IAR-NHI-9701;ATCC#72024) ( Clin. Diagn. Lab. ·

Immunol. 5; 578-582，1998)。老鼠經 口攝取 NSP335 株 (lx 109CFU/老鼠）後，飼養1星期後，老鼠用飼料中混 合實施例5的褐變反應生成物或實施例8的褐變反應生成 物，經10週的餵食。供給實驗的老鼠數爲各群皆爲6隻 。1 〇週後屠殺各群的老鼠，將胃摘出，將內容物除去後 ’以均質機做成懸浮液。 Φ 幽門桿菌的檢測爲懸浮液接種於幽門桿菌檢測用培養 基（poamedia幽門桿菌分離培養基，榮硏化學）中，以 氣體包的方法於37 °C下進行3天培養，計算菌落數目。 攝取無添加褐變反應生成物的飼料之群作爲對照組，以對 照組的平均菌落數爲1 00計算。所得結果如下述表5所示 表5 幽門桿菌的除菌效果 ♦ 褐變反應 0.0 2 5 % 混 0.2 5 % 混 2.5%混合 生成物 合飼料 合飼料 飼料 實施例5 11 4 12 實施例8 48 18 10 由上述結果可知’投與本發明的褐變反應生成物時， 可大幅度減少老鼠胃內的幽門桿菌菌數。又，實施例5及 8的褐變反應生成物投與群中，確認無檢測出具有幽門桿 -27- (23) (23)1343813 菌的老鼠。由此結果可明瞭，本發明的褐變反應生成物對 幽門桿菌具有優良的除菌作用。 試驗例4 幽門桿菌除菌體內實驗 以下爲試驗本發明的褐變反應生成物及胃酸分泌抑制 劑，與對幽門桿菌具有除菌作用的種種物質之組合效果。 與試驗例3相同，實施例5的褐變反應生成物（0.2 5 %混合飼料）、法莫替丁（ 0.0 1 %混合飼料）、對幽門桿 菌的尿素酶之雞蛋抗體（0.25%混合飼料）、來自牛乳淸 的黏蛋白（〇.25%混合飼料）、酪蛋白鈉（0.01%混合飼 料）、兒茶酸（0.25%混合飼料）、穀聚糖甲穀質（0.25 %混合飼料）'omeprazole (0.01%混合飼料）、開羅理 素（〇. 1 %混合飼料）、羥胺苯甲青霉素（〇. 1 %混合飼料 )、糊精（〇.25%混合飼料）、蜂巢蠟膠萃取物（0.25% 混合飼料）、或單獨的超臨界萃取蜂巢蠟膠萃取物（0.25 %混合飼料）、或褐變反應生成物與這些任意組合餵食感 染幽門桿菌之老鼠。經1 0星期後，檢測老鼠胃內的幽門 桿菌。及結果於任意的單獨投與僅本發明褐變反應生成物 做比較時接提高除菌效率。這些結果如下述表6所示。 -28- (24)1343813 表6 試驗試料 除菌作用 褐變反應生成物 + + 法莫替丁 — 雞蛋抗體 + + 來自牛乳淸黏蛋白 + + 酪蛋白鈉 + 兒茶酸 + 殼聚糖甲殻質 + omeprazole — 開羅理素 + + 羥胺苯甲青雷素 + + 糊精硫酸 + + 蜂巢蠟膠 土 超臨界萃取蜂巢蠟膠 + 褐變反應生成物+法莫替丁 + + + 褐變反應生成物+雞蛋抗體 + + + 褐變反應生成物+來自牛乳淸黏蛋白 + + + 褐變反應生成物+酪蛋白鈉 + 十 + 褐變反應生成物+兒茶酸 + + + 褐變反應生成物+殼聚糖甲殻質 + + + 褐變反應生成物+ 〇meprazole + + + 褐變反應生成物+開羅理素 + + + 褐變反應生成物— omeprazole + + + 褐變反應生成物+糊精 + + + 褐變反應生成物+蜂巢蠟膠 + + + 褐變反應生成物+超臨界萃取蜂巢蠟膠 + + + -29- (25) 1343813 以下表示含有本發明褐變反應生成物之醫藥的製劑例 及食品的配合例。 實施例1 4 乾燥湯 以下述的配合如下製造乾燥湯。 加入肉萃取物、洋蔥萃取物、胡蘿蔔泥、海帶萃取物 '食鹽、調味料於攪拌機中攪拌後，加入乳化劑、再次進 行攪拌。再加入均勻溶解褐變反應生成物的雞蛋進行混合 。最後加入香辛料攪拌混合，進行冷凍乾燥得到乾燥湯。 23 26 5 17 2 1

1 2 2 2__ 100 (質量％ ) 本發明的褐變反應生成物 雞蛋 肉萃取物 洋蔥萃取物 胡蘿蔔泥 海帶萃取物 乳化劑 食鹽 香辛料（紅辣椒） 調味料（氨基酸等） 全量 實施例1 5 細粒劑 如下述配合進行濕式造粒法進行造粒，得到細粒。 -30- (26) 1343813 本發明的褐變反應生成物 45 乳糖（賦型劑） 35 玉米澱粉 15 -聚乙烯烷酮PVP ( K-30)_5_ 全量 1〇〇 (質量％ )

實施例1 6醫療用食品流動食物 如下述配合製造醫藥用食品流動食品（200mL/包）。 少量的水中加入礦物類、磷酸鈉、磷酸鉀攪拌後，加 入褐變反應生成物、麥芽糊精、酪蛋白鈉、乳化劑、乳蛋 白質、少量水，加溫攪拌至5 0 °C程度。懸浮後冷卻至室 溫，加入植物油、維他命類、香料、安定劑、殘餘的水’ 得到含有褐變反應生成物之醫療用流動食品。

-31 - (27) (27) 38.0 13.0 12.0 1.0 1.5 0.2 10.3 1.8 1.2 0.5 1〇〇 (質量％ ) 1343813 本發明的褐變反應生成物 麥芽糊精 酪蛋白鈉 植物油 維他命類 礦物類 乳化劑 乳蛋白質 磷酸鈉 磷酸鉀 香料 安定劑（鹿角藻膠） 水乘ί!餘量_ 全量 實施例1 7 錠劑 以一般的濕式顆粒壓縮法得到錠劑。 -32- (28) (28)1343813 本發明的褐變反應生成物 4〇.〇 D-甘露糖醇 20.0 乳糖 20.0 結晶纖維素 10.0 羥基丙基纖維素 5.0 檸檬酸 5.0 100 (質量％ ) 實施例1 8 茶飮料 如以下配合製造如下的茶飮料（綠茶飮料級烏龍茶飲 料）。 對100ml的水、3g的綠茶於85ΐ：下經5分鐘的萃取 後調製出綠茶萃取液。或對l〇〇mi的水’ 4g的烏龍茶於 9 5 °C下經5分鐘萃取後調製出烏龍茶萃取液。褐變反應生 成物加入該5倍量的綠茶萃取液或烏龍茶萃取液中進行攪 拌。懸浮褐變反應生成物後，加入剩餘的茶萃取物，得到 含有褐變反應生成物的茶飮料。 本發明的褐變反應生成物 j 綠茶萃取液___99 全量 100 (質量％ ) 實施例1 9 可可飮料 -33- (29) 1343813 以下述配合製造可可飮料。 褐變反應生成物中加入可可（森永乳業製）後攪拌。 加入5倍量褐變反應生成物的溫水（約8 〇 °c )、携拌、 懸浮。懸浮後加入殘餘的溫水與牛乳得到可可飮料。 本發明的褐變反應生成物 可可 20 70___ 1〇〇 (質量％ ) 牛乳 ___ 全量 實施例2 0 咖啡飮料 如下述配合調製咖啡飮料。 對IOOmL的水而言，將6g磨碎的咖啡豆於95t下萃 取]分鐘’作爲咖啡萃取液。對於褐變反應生成物爲5倍 的咖啡萃取液加入砂糖漏，攪拌使其懸浮。加入殘餘的咖 啡萃取液與牛奶得到含有褐變反應生成物的咖啡飮料。 本發明的褐變反應生成物 2 砂糖 i

牛乳 W 萃取液____67_ ^ * 100 (質量 ％ ) -34- (30)1343813 實施例2 1 香蕉牛奶雪克 以下述配合製造香蕉牛奶雪克。 褐變反應生成物與牛奶使用家庭用攪拌機成懸浮液。 最後加入維他命C得到含有褐變反應生成物的香蕉牛奶飮 料。 本發明的褐變反應生成物 維他命C 牛乳 香蒸___ 全量 實施例22拌飯調味料 如下述配合製造拌飯調味料 本發明的褐變反應生成物 加味柴魚 加味白芝麻 加味海苔 維他命E__ 全量 2 0.5 40 5 7.5 100 (質量％ ) 40 2 5 20 10 5_ 1 〇〇 (質量％ ) 實施例23 發酵乳飮料 5 g的本發明的褐變反 應、生成物中加入 2 5 g的含有乳 -35- (31) (31)1343813 酸菌的發酵乳（養樂多公司製）成爲懸浮液。懸浮後加入 7〇g的含有乳酸俊的發酵乳，得到含有褐變反應生成物的 發酵乳飮料》 實施例24乳飮料 5g的本發明的褐變反應生成物中加入25g的牛乳使 其懸浮。懸浮後加入70g的牛乳，得到含有褐變反應生成 物的乳飮料。 產業上可利用性 本發明係提供一種對幽門桿菌具有除菌作用，且安全 性高、無需擔心副作用等產生之幽門桿菌黏著阻礙劑。本 發明的黏著阻礙劑不會產生如過去所使用的抗生素之菌的 抗藥性問題，可將幽門桿菌特異性地除去。因此，含有本 發明的幽門桿菌黏著阻礙劑之醫藥及食品，可有效地預防 、改善與幽門桿菌關連的疾病，例如消化性潰瘍等。 -36-

Claims (1)

1343813 ,S5.i0.5- •Ί- >\ Η .、； ⑴ _，.厶丨 拾、申請專利範圍 第92 1 01 722號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國95年10月5日修正 1. 一種幽門桿菌黏著阻礙劑，其特徵爲1種以上選自 D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D -核糖及乳糖所成群之糖、與1種以上選自來 自小麥、大麥、米、玉米、大豆、紅豆的植物性蛋白質、 及來自牛奶、蛋、魚、肉的動物性蛋白質所成群之蛋白質 的褐變反應生成物作爲有效成分者。 2. —種幽門桿菌黏著阻礙劑的製造方法，其特徵爲含 有於水溶液中，使1種以上選自 D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-核糖及乳糖 所成群之糖、與1種以上選自來自小麥、大麥、米、玉米 、大豆、紅豆的植物性蛋白質、及來自牛奶、蛋、魚、肉 的動物性蛋白質所成群之蛋白質進行褐變反應之步驟。 3. —種幽門桿菌黏著阻礙劑的製造方法，其特徵爲含 有於水溶液中，使含有糖與蛋白質的食品引起褐變反應之 步驟。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該食品爲生牛 奶、牛奶粉、脫脂奶粉、乳清或煉乳。 5.如申請專利範圍第2項至第4項中任一項之方法， 其中褐變反應爲進行至5%水溶液所測定之4〇 5 nm吸光度 (2) (2)1343813 6 .如申請專利範圍第1項之幽門桿菌黏著阻礙劑，其 特徵爲更含有胃酸分泌抑制劑者。 7 .如申請專利範圍第1項之幽門桿菌黏著阻礙劑，其 特徵爲更含有對幽門桿菌具有除菌效果之其他物質。 8. 如申請專利範圍第7項之黏著阻礙劑，其中該物質 爲1種以上選自於聚酚、抗生素、對幽門桿菌的抗體、與 幽門桿菌的黏著因子之尿素酶結合的多醣類及糖蛋白質所 成群。 9. 一種使用於預防或治療與幽門桿菌相關疾病之醫藥 組成物，其特徵爲含有如申請專利範圍第1項及第6項至 第8項中任一項之幽門桿菌黏著阻礙劑。 10. •種使用於預防或改善與幽門桿菌相關疾病之食 品1其特徵爲含有如申請專利範圍第1項及第6項至第8 項中任一項之幽門桿菌黏著阻礙劑。