TWI238251B

TWI238251B - In-vitro adsorbing device using immunity

Info

Publication number: TWI238251B
Application number: TW89113958A
Authority: TW
Inventors: Shr-Ren Liou; Shr-Liang Shie; Tz-Wen Chiou
Original assignee: Anawrhta Biotech Co Ltd
Priority date: 2000-07-13
Filing date: 2000-07-13
Publication date: 2005-08-21
Also published as: JP2002320671A; JP3719958B2

Description

1238251 —__案號89113958 年月___日倏正_· 五、發明說明（1) 發明領域本發明係有關於一種體外免疫吸附裝置，特別是有關於利用人類乙醯膽鹼受體多胜肽，以專一性吸附自體抗體之體外免疫吸附裝置。發明背景乙醯膽鹼受體（Acetylcholine Receptor ;AChR)是神經肌肉傳導的主要受體，從神經末梢釋放的乙醯膽鹼 (ACh)，與肌肉纖維上的AChR結合，誘發肌細胞膜產生動

作電位（action potential)，而產生肌肉的收縮。重症肌無力（myasthenia gravis ; MG)的主要發生原因，就是肌肉纖維上AChR數量減少或無法行使功能，使得病人的肌肉收縮受到影響，嚴重者影響到呼吸肌而致死（861^〇¥，et al·， 1992，第16 版，Merck & Co·， Inc· Rahway， N.J 1524-1526)。90%的病人企液中會發現自體抗體 (autoantibody)的產生，這些抗體主要是辨識仏肫，其濃度為 1 〜100 nM (Lindstrom et al·，1 976，Neurology， 26:1054^1059 ； Lennon, 1994, Serological diagnosis of myasthenia gravis and the Lambert-Eaton

myasthenia syndromes. New York: Dekker, 149-164 頁），其抗體種類大多為免疫球蛋*IgG。自體抗體除了斷AChR在肌肉膜上的作用，也同時破壞膜上的AChR，顯抗AChR抗體疋造成此類疾病的主要原因。在臨床上，其治療方式包括：⑴以藥物抑制AChR白代謝，以增加ACh的作用時間（AquUi〇nius，et ai.，

1238251 _案號89113958_年月日_修正 _•滅五、發明說明（2) 1 983 J· Neurol. Neurosurg. Psych. 46:929 ) ; (2)以高劑量的皮質類固醇（c o r ΐ i c o s t e r o i d )或免疫抑制劑，減少自體抗體的產生（Pascuzzi et al.，1 984，Ann. Neurol, 43:644-659 ;Goulon et al·， 1988， Results of a one-year open trial of cyclosporin in ten patients with severe myasthenia gravis. In: Kahan， BD， ed. · Cyclosporin: applications in autoimmune disease.

Philadephia: Grune & Stratton, 211 頁；Perez et · al·，1981，Neurology 31:32-38) ; (3)胸腺切除術；以及（4)血漿減除術（plasmapheresis)來移除企液中的自體抗體。總而言之，就是為了減少血液循環中的自體抗體，Φ 以達到治療的目的。因此，陸續有研究者發展體外循環 (extracorporeal )系統，利用免疫吸附 (immuno-adsorption)的原理移除抗體。現有的裝置包括色胺酸固定化載體（ImmusorbaTM)和蛋白質A (protein A) 瓊脂糖（sepharose)。前者是利用電荷吸引的原理（請參見美國專利第4, 627, 91 5及4, 432, 871號），除去特定蛋白質’但對於抗體並無專一性；後者的作用原理是蛋白質A 能結合IgG的固定區片段（Fc)，因此能吸附所有的IgG (請參見美國專利第5, 753, 227號），然而，引起jig的自體抗體只佔全部I gG的萬分之一，以蛋白質a作為吸附劑，不但效果有限’且裝置谷易過量吸附而飽和，需要另外進行脫除 (strip)的步驟或甚至更換裝置，在成本上相當不利。因此’目前仍需要一種專一性吸附自體抗體的裝置，

0643-5413TWF3;s u s anwu.p t c 第5頁 1238251 修正 ,I號 89113958 五、發明說明（3) 、有政地冶療自體免疫疾病，並可大幅降低成本。發明摘述有鑑於此’本發明利用自體抗體所辨識的AChR，以基因工程的方法表現’除了能大量生產外，亦對自體抗體有專性’且不會影響血漿中其他的蛋白質成份，對於mg的、冶療可具有直接的效果。

…因此，本發明的一種形態是提供一種用於專一性吸附特定物質之體外免疫吸附裝置，包括：（a)基質；以及 ()、專性吸附於該特定物質之共軛體，其連結於該基質 f或填充於該基質中；其中，該共軛體包括胜肽、多胜肽 f蛋白質之片段、抗原決定部位、抗體或抗體片段，或其何生物、同源物、類似物、融合物或功能上的相等物。本發明的另一形態是提供一種用於專一性吸附特定物質之體外免疫吸附套組，包括··（ a)血衆分離器，其將血球及血漿自血液中分離；（b)專一性吸附特定物質之體外免疫吸附裝置，其包括：（bl)基質；以及（b2)專一性吸 =於該特定物質之共軛體，其連結於該基質上或填充於該 ^質其中，該共軛體包括胜肽、多胜肽或蛋白質之片段、抗原決定部位、抗體或抗體片段，或其衍生物、同源物、類似物、融合物或功能上的相等物；以及（c)回流裝置’其將所分離的血球及經過免疫吸附裝置吸附的血漿混合並送回體内。 ’ a 為了讓本發明之上述和其他目的 '特徵，及優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例並配合所附圖示，做詳細

0643-5413TWF3;susanwu.ptc 第6頁 1238251

說明如下：圖示之簡單說明第1圖係本發明之體沐备# β ^ 一立卜免疫吸附套組的原理及應用之不忍圖。 ^圖係顯示AChRa 士表現載體的構築流程圖。春弟3圖係顯、示AChR α _ECD的MA及推導的胺基酸序列， :” gGIFc形成融合蛋白時，在68 8一7〇2的處會多出一連接序列（GSREF)。第4圖顯不西方墨潰圖，3種蛋白質AChR a -ECD-Fe、 ^IgG及CTLA4-Fc，其中（A)為非還原態處理，（B)為還原態處理，並以抗AChR α抗體作為探針，測試專一性的認。 ^ 第5圖係以酵素連結免疫吸附分析法確定AChR α -Fc的結構·（A)微定量盤上分別結合AChR α — Fc及CTCA4-Fc (1〇胃微克/毫升），以市售之小鼠抗人…⑽抗體做系列稀釋所得之吸光圖；（B)微定量盤上結合AChR Fc，並分別加入各種稀釋倍數的正常人與病人血清所得之吸光圖。發明詳述乙醯膽鹼受體（AChR)的結構是由α2万r (5的次單元 (subuni t)所形成的複合體膜蛋白，兩個α次單元能結合 ACh或雨傘節神經毒素（α—bungarotoxin ; —種蛇毒蛋白）°在α次單元的細胞外功能部位（extracellular domain ; ECD)共有121個胺基酸，其中67〜76的胺基酸部位最容易誘發抗體和疾病的產生，這個區域稱為主要免疫抗

1238251 _案號89113958_年月日倐正_· 五、發明說明（5)

原區（main immuno-genic region ; MIR)(Tzartos，S· J· et a 1. , 1 988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2899-2903 ； Barkas, T. et al., 1988, J. Biol. Chem· 363: 5916-5920)。在MG的病人身上，所得到的抗 A C h R抗體中’有6 0 %疋辨識在這個區域或附近 (Lindstrom, J· et a 1., 1 988，Adv. Immunol.

42:233-284 ； Schonbeck, S. et al., 1990, Int. Rev. Neurobiol· 32:1 75-200 )，將抗MIR的單株抗體注入老鼠體内，也會誘發肌肉無力的症狀。而且，大多數的抗MIR 抗體只能辨識MIR的立體結構（conformation)，極少數抗體能辨識變性蛋白上的MIR，然而其親和力卻遠低於自然結構的AChR，顯示α次單元的ECD是MG治療的重要關鍵。

本發明將AChR α次單元的ECD，以基因工程的方法，融合在人類IgGl的Fc部位，所形成的融合蛋白質除了增加可溶性外，更能穩定AChR α -ECD的結構，此外，由於Fc的部位保留了雙硫鍵的位置，可形成（AChR a -ECD-Fc)2的二聚體（dimmer)，類似天然存在的α2立體結構，易被自體抗體辨識而增加對自體抗體的結合力。此外，（AChR α -ECD-Fc)2的另一項優點是這種含有fc的融合蛋白，能利用蛋白質A的親合性層析管柱做純化，以得到高純度的融合蛋白。本發明選擇桿狀病毒（bacill〇virus)的蛋白質表現糸統’以表現AChR a -ECD-Fc的融合蛋白。這種系統是一種真核細胞病毒的表現系統，將載有AChR a -ECD-Fc基因之重組桿狀病毒（recomb inant baculovirus)感染昆蟲

0643-5413TWF3;s us anwu.p t c 第8頁 1238251 __案號 8jj展§8___年月日__- 五、發明說明（6) 細胞，就能製造出大量的AChR a -ECD-Fc融合蛋白。這種表現系統具有以下優點：（1 )能產製大量的外來基因；（2) 蛋白質修飾作用類似哺乳動物細胞；（3 )操作病毒具安全性；以及（4)產生的外來基因蛋白，可釋放於培養基中，容易純化。體外循環的免疫吸附裝置，係利用不同的吸附劑，以· 達到免疫吸附的目的。早期以蛋白質A固定在瓊脂糖上 (Terman D.S. et al., J. Immunol., 124:795, ( 1 980 ) ; New England J. Med·，3 05··1 1 95 ( 1 981 ))，能夠專一性地吸附免疫性球蛋白或免疫複合體（immune complex)，但是這種蛋白質a來自於黃色葡萄球菌（yeU〇w · staphylococcus)，對人體具有毒性，在操作過程中，如，剝落而進入人體，容易造成傷害。後來，日本的Kur〇da 專人利用色胺酸或苯丙胺酸鍵結在聚乙稀醇上（美國專利第4, 627, 915號），這種帶負電荷的表面，能吸附免疫複合體，但是對於有害抗體並無專一性，會連帶地把一些有用的蛋白質移除。此外，由於血中抗乙醯膽鹼抗體的濃度低，約^卜1〇〇 nM的範圍，而現在市面上所用的蛋白質A一瓊，，係無專一性地對所有免疫球蛋白（約丨〇毫克/毫升）進仃吸附丄所以管柱易達吸附飽和。臨床上使用時需同時||| 裝上，支管柱，當一個管柱進行吸附時，另一個已吸附飽和的管柱可進行清洗的動作以方便下一次吸附，此反覆進行清洗及吸附並不經濟。

Nakaji，S·等人（ 20 0 0 )提出一種治療重症肌無力的體

1238251 _案號89113958__年月日修正 ^__ 五、發明說明（7) 外免疫吸附管柱，利用合成的太平洋電鳐（Torpedo californica)的乙醯膽鹼受體α次單元（α183-200)共價固定於多孔性纖維素微珠，形成吸附劑填充於吸附管柱中’專一性地移除患者體内抗乙酿膽驗受體抗體中的阻隔抗體（Nakaji et al·，20 00，therapeutic Apheresis， 4(2) ·· 1 2 4-1 26·)。但非源自於天然生成的多孔性纖維素微珠，對於自體抗體的親和性不如來自人體胜肽者為佳。 Sano等人揭示重組人類肌肉乙醯膽驗受體α次單元的細胞外功能部位（ECD)為MG自體抗體的特異連接部位（Sano et

al·, 1991， Int Immunol· 1991 Oct， 3(10):983-9)。因此，本發明以源自人類之乙醯膽鹼受體α次單元-細胞外功能部位-免疫球蛋白固定區片段（AChR α -ECD-Fc)之融合蛋白作為共輛體，採用自然結構之α次單元的ECD，並將之與人類IgGl的Fc部位融合，使所得到的融合蛋白增加可溶性，且更能穩定AChR a -ECD結構，更由於Fc部位保留了雙硫鍵，可形成（AChR α -ECD-Fc)2二聚體，類似天然存在之α 2立體結構，增加對自體抗體之結合力，此外，上述組合可容易地以蛋白質Α親和性層析管柱純化，可得高純度融合蛋白，而具有產業利用價值。

為解決傳統裝置的缺點，本發明提供一種用於專一性吸附特定物質之體外免疫吸附裝置，包括：（a)基質；以及（b )專一性吸附於該特定物質之共軛體，其連結於該基質上或填充於該基質中。根據本發明之體外免疫吸附裝置，其中，共軛體係指

1238251 修正复號89m· 五、發明說明（8) 可互^結合的兩種物質之一，包括胜肽、多胜肽或蛋白質之片段、抗原決定部位（epi t〇pe)、抗體或抗體片段，或其柯生物、同源物（hom〇l〇gue)、類似物（anal〇gue)、融合物或功能上的相等物（equivalent)。上要地與免疫球蛋白的固定區(Fc)片段融合，以後的純化工作。 f n ，一較佳具體實施例中，適合的多胜肽包括任何可被自體抗體專一性辨認之多胜肽、胜肽或蛋白質之片段、抗原決，部位、衍生物、同源物、類似物、融合物或功能上的相等物，這種抗原-抗體的結合、抗原部位的選擇等，為在此技藝中之人士所熟知。在本發明之較佳具體實施例中，多胜肽包括乙醯膽鹼受體，更佳地是乙醯膽鹼受體细胞外的功能部位（ECD)。相同地，上述多胜肽可視需要地與免疫球蛋白的固定區（Fc)片段融合，一方面可增加多胜肽的溶解度，另一方面則具有穩定其立體結構的功效。質根據本發明，可利用此裝置而吸附、移除的特定物質包括抗體（較佳地是自體抗體）、抗原或有害物質丨其中，有害物質一般而言是指對人體當時的健康是有害^物例如，但並不限於，毒性分子、低密度脂蛋白胞非常低密度脂蛋ό (VLDL)、自由基、病毒、癌細脂多糖（LPS )、細菌等。本發明之體外免疫吸附裝置，可根據事實上的攜帶任何可被自體抗體專一性辨認之多胜肽，以移除體内的自體抗體。此處所指的病患，一般而言，係指罹$ $ 11頁 0643 - 5413TWF3; sus anwu. p t c 1238251

自體免疫疾病的患者，句把， » ^ u 仁並不限於’例如重症肌無 f 1、紅班性狼瘡或風濕性關節炎；其他疾病 ’ 症），只要與自體免疫疾病相似地具有因抗體而

引發病症的徵候，亦y I 你甘城册了使用本發明之體外免疫吸附裝置’ 使其攜f相對應之多B+ B —r-. 夕胜肽，即可有效於治療或減缓病症之目的。 ^以重症肌無力為例，病患體内產生自體抗體，例如，抗乙醯膽驗爻體k體（anti_AChR-Ab)，將本發明之體外免疫吸附裝置連接上乙醯膽鹼受體，更佳地是乙醯膽鹼受體

細胞外的功能部位’然後使病患的血液通過此裝置，即可有效地吸附致病的自體抗體。

根據本發明之體外免疫吸附裝置，共軛體可藉由一中間介層或化學反應而連結於基質上或填充於基質中。適合的中間介層包括，但並不限於，纖維素、瓊脂 (agar〇Se)、瓊脂糖（sepharose)、葡聚糖（dextran)、幾丁質（chitin)、幾丁聚醣（chit〇san)及上述物質之衍生物、有機或無機之多孔性材質、磁珠或微珠（micr〇 bead) 等’其他任何習知用於結合多胜肽、抗體或蛋白質的中間介層’包括商業化的產品，均可用於本發明之連接目的。另一方面’也可使用化學反應的方法以結合本發明之共輛體與基質’包括習知的溴化氰（CNBr)反應。此外，除了一般的管柱之外，本發明的裝置亦可包括，例如，中空纖維管束（hoi low fiber) 〇本發明之體外免疫吸附裝置可結合其他組件而形成體

0643-5413TWF3;s u s anwu.p t c 第12頁 1238251 案號 89113QSR 五、發明說明（10) 外免疫吸附套組。第1圖顧千士的原理及應用之示意圖^V；發;^之體外免疫吸附套組分離器而分成血襞_ ▲球液=流出：…漿 -Fc-瓊脂糖管柱，而將病电血:再流經AChR α ™ ^將士/β將病患血漿中的抗AChR抗體吸附在裝 $中：血漿中的其他抗體與蛋白質，則由d的管路流出， Λ份匯合至6管路’而重回病人體内，可以避免因非專一性地吸附，造成血漿成份的不正常流失。空纖維管束’則因管束空隙較大胞不易堵塞在管束中’料亦可不使用血漿分離器，而直接將血液導入管束中，以減少一個組件的使用。以下將藉由具體實施例而對本發明作更進一步的說明，然而，這些實施例僅是作為舉例說明，並非用以限定本發明之目的。實施例1 :AChRa-ECD - Fc融合蛋白基因之構築參見第2圖，將可大量表現乙醯膽鹼受體的人類橫紋肌肉瘤（rhabmyodosarcoma ;RD)細胞株（CCRC 60113)，培養在含有10 %熱去活化胎牛血清（FBS)、2毫莫耳/公升卜麩胺酸酸胺、100單位/毫升盤尼西林及1〇〇微克/毫升鏈黴素的DMEM培養液，並在37 °C，含5 %二氧化碳的潮濕培養箱中培養。將S f 2 1昆蟲細胞培養在含1 〇 %熱去活化胎牛血 _ 清的TNM-FH培養液（Gibco)中，並在27 °C的培養箱中培養0 直接加入1 毫升UltraspecTMRNA (Biotec Lab)於35 公釐培養皿中溶解已形成單層的RD細胞，並藉由吸量管將細

1238251 ___索號89113958_年月曰修正_ 五、發明說明（11) 胞溶解液充分混合。待均質後’加入0 · 2毫升氯仿’劇烈震盪1 5秒再置於冰上。離心後，小心地將水溶液層移至乾淨管中。加入異丙醇及RNATackTM小珠以沉殿RNA。最後，用焦碳酸二乙酯處理過的水（D E P C _ w a t e r )將純化的R N A析出。

取10微克的總RNA，溶在總體積為38微升的DEPC水中。加入3微升DNA引子（100微克/微升）並混勻。此混合物置於6 5 °C培養5分鐘，之後緩慢降溫至室溫讓引子易附著於RNA上。加1微升Strata Script RNase H-反轉錄酶及其他如操作手冊中提及的藥品至總體積為5 0微升。此混合物於3 7 °C培養1小時，然後90 °C培養5分鐘，以形成第一股產物。使用5微升第一股產物為模板，利用聚合酶鏈鎖反應 (PCR)以放大AChR α細胞外功能部位（ECD)的DNA。此放大反應的引子包括：正向（forward)引子， 5’ -CTCGAGACCACCATGGAGCCCTGGCCTCTC-3’ 以及反向 (reverse)引子，5’-GGATCCCAGGCGCTGCATGACGAAG-3，。 PCR條件如下：第一回，94°C，5分鐘；54°C，30秒；72 °C，2分鐘，之後進行2-30回，條件為94 °C，30秒，54 °C，30秒及72 °C，2分鐘。最後反應在72 °C進行10分鐘。

將PCR片段接入PCRII載體中，並藉由BamHI酵素切割筛選出正確的選殖株，並命名為PCRII/AChR α - ECD。 AChR α片段由PCRII/AChR α-ECD以BamHI限制酵素切割後跑膠純化出AChR α -ECD片段，再接入帶有人類免疫球蛋白IgGIFc區域的改良昆蟲病毒表現載體pBachIgGiFc

0643-5413TWF3;susanwu.ptc 第14頁 1238251 案號 89113958 曰修正五、發明說明（12) 中，以AChR α-ECD的3’ -端與IgGIFc的5，-端接合而產生本發明之pBac-AChR α -ECD-hIgGIFc ( Ana-P3 )載體。此載體已於中華民國89年6月14曰寄存於中華民國食品工業發展研究所菌種中心，寄存號碼：CCRC 940305。實施例2 ··利用桿狀病毒系統表現重組蛋白 (1 )重組病毒的製造將1 06個蛾類幼蟲細胞株S f 2 1細胞置入3 5公釐培養皿中隔夜培養。先輕輕混合〇·5微克含有標的基因之 pBac-AChR α-ECD-hIgGIFc 載體與100 奈克（ng)之BacPAK6 病毒DNA，再加入感染素（Bacfectin)，混合均勻後靜置室溫1 5分鐘。將隔夜培養細胞上含血清的tnM-FH培養液吸去後’加入2毫升不含胎牛血清的培養液清洗兩次，並加入 1. 5毫升不含胎牛血清的培養液，將混合好的Bacfectin試劑及DNA混合液緩慢滴入並輕輕混勻，置於27它培養箱中反應5小時後’加入1 · 5毫升含有胎牛血清的培養基再置於 27 °C培養箱中約72小時。 (2)確定有無重組病毒存在

取1微升重組病毒原液，與丨〇倍清潔劑緩衝液A (detergent buffer A :成份為50 mM KC1、（K45%Tween 20、10 mM Tris-HC1 pH 8. 4、〇· 1 毫克/ 毫升甘胺酸和 0·45%ΝΡ - 40)及10微克蛋白酶κ (Sigma)，並加入去離子水至總體積為1 0 0微升，待所有試劑混合均勻後，置於 C下作用1小時將病毒蛋白變性、切割，再置於1 〇〇艺下作用10分鐘使病毒DNA變性，病毒DNA可放置—^它儲存待用

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第15頁 1238251 _ 案號 89113958 _年月日_修正五、發明說明（13) 或取5微升作PCR分析。 (3)病毒斑分析（plaque assay)

六孔培養盤中每;孔置入1 〇6個蛾類幼蟲細胞株S f 21細胞，隔夜培養。將TNM-FH培養液吸去後，小心地自培養盤中央丨哭滴入2 0 0微升經過培養液稀釋的病毒液 (1 0_4〜1 0~8 )，小心維持細胞完整的單層結構，置於室溫下培養1小時，每1 0 -1 5分鐘搖晃培養盤，使細胞能均勻被病毒液完全覆蓋，感染期間先準備好滅過菌的2 %低熔點洋菜膠溶液與含有1 0 %胎牛企清之培養液，在3 7 °C等體積混合’待病毒液病毒作用完畢後，小心吸取起病毒液並沿培養盤壁加入2毫升洋菜膠混合液。在室溫下待其凝固後，再加入1毫升含有1 〇 %FCS之培養液，將培養盤置於27 °C培養箱中培養5天至病毒斑出現。欲見清楚的病毒斑，可在洋菜膠層加上加入1毫升以磷酸鹽緩衝液（PBS)配製的〇. 25 % (w/v)中性紅（Neutral Red ; Sigma)溶液，在27 °C 避免光照下培養2〜4小時後’吸去上清液，將培養盤倒置陰乾隔夜’此時可見單層活細胞會被染上紅色，易以肉眼"f見病毒斑並計數之。

(4 )放大病毒力價及濃度 (A )低丨辰度病毒液製備在25平方公分的細胞培養瓶中放入ΐχ 1〇6以21細胞株隔夜培養，將培養液吸去後，慢慢滴入〇· 5毫升經過培養液稀釋的病毒液（病毒與細胞比例小於丨），十二均養1小時，每10〜15分鐘搖晃培養盤。吸去病毒液後加入

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5毫升培養液，將培養瓶置於27 °C培養箱中培養5〜7天，待細胞完全受病毒感染並產生細胞病變溶解現象，收集培養液，分裝儲存於4 °C及-70 °C中備用，並以病毒斑分析作病毒定量。 (B )中濃度病毒液製備

在75平方公分的細胞培養瓶中放入5 X 1〇6 Sf21細胞株隔夜培養，將培養液吸去後，慢慢滴入丨毫升低濃度稀釋的病毋液（病毒與細胞比例小於1 ),置於室溫下培養1小日守’每1 0〜1 5分鐘搖晃培養盤數次，吸去病毒液後加入i 〇毫升培養液，將培養瓶置於27 °C培養箱中培養5〜7天，待細胞完全受病毒感染並產生細胞病變溶解現象，收集培養液’分裝儲存於4 °C及- 7 0 °C中備用，並以病毒斑分析作病毒定量。實施例3 ··表現並純化AChRa - ECD-Fc融合蛋白將Sf21細胞株在旋轉式培養瓶（Spinner Hask)中從細胞密度1〜2 X 1 〇V毫升開始培養，約3〜4天後細胞密度為卜2 X 10V毫升，加入蛋白表現量最高的一株病毒（病^與細胞比例為5〜1 0 )感染細胞並繼續置於2 8 °c培養箱中培養 3〜5天’待細胞完全受病毒感染並產生細胞病變溶解現

象，收集培養液，並藉由蛋白質A親和性層析法純化蛋白。經由桿狀病毒系統製造出人類可溶性AChR a -Fc融合蛋白，因具有人類G1型免疫球蛋白Fc部分，所以可利用蛋白質A瓊脂（Pharmacia)管柱作純化。先製備蛋白質A瘦脂

1238251 _案號 89113958 五、發明說明（15) 革月日修正管柱，以蠕動幫浦在4 °C下通入欲純化之蛋白液，使其結合完全，再以10到20倍蛋白質A洋菜膠粒管柱體積之5〇 mM Tris-HC1缓衝液pH 7·0清洗’最後以5倍管柱體積之μ Glycine-HC1緩衝液pH 3.0將蛋白析出。每1毫升收集成一管，且每一微離心管中已含有〇· 1毫升之1 M Tris-HCl緩衝液（pH 9· 0)。將所得之蛋白純化液注入透析膜袋中，以 1倍PBS緩衝液將鹽類析出，以蛋白膠確定蛋白純度，並以蛋白質分析套組（Bio-Rad)定量蛋白質濃度，最後通過 0 · 2 2 // m的纖維過濾膜後即可無菌使用。

實施例4 :電泳分離及免疫墨潰分析法

純化後的蛋白質利用含硫酸十二酯鈉（SDS )之1 0 %聚丙烯醯胺膠體（polyacrylamide gel)電泳分離。樣品置於含有（還原組）以及不含（非還原組）0· 1 5 Μ的/3 -巯基乙醇 (/3-meΓcaptoethanol)溶液中，並在加入膠體前於沸騰溫度中素彿5分鐘。電泳完成後利用考馬斯亮藍（Coomassie bri 1 1 iant blue)染色。免疫墨潰分析法則是將所純化的蛋白質，利用上述SDS-PAGE方法分離，再將蛋白質轉染至硝基纖維素（nitrocellulose)膜上。膜以50 mM Tris-HC1，0· 15 M NaCl含5 %脫脂奶粉處理。以1微克/毫升的老鼠抗人類AChR α抗體（Serotec)為探針，於4。(：反應整晚’以含1 %脫脂奶粉的緩衝液清洗四次後，膜以山羊抗鼠免疫球蛋白鍵結肆菜過氧化酶（horseradish peroxidase)反應。結合的抗體利用ECL系統（Amersham)福測。結果如第4圖所示。

0643-5413TWF3;susanwu.ptc 第18頁 1238251 年月曰修正 __案號 89113958 五、發明說明（16) 實施例5 :辨認AChR a-ECD-Fc (1 )抗體辨認AChR a -ECD-Fc

將純化的AChR a - ECD-Fc或人類免疫球蛋白（1 〇微克/ 毫升），在4 °C反應過夜以使吸附於9 6孔微定量盤上。反應盤以PBS含0. 05%Tween 20 (PBST)清洗2次，之後每孔加入含1 0 %胎牛血清的PBS在溫室反應2小時。在第一列微定量盤中加入100倍稀釋的老鼠抗人類AChR α抗體 (Serotec)，用PBS含10%胎牛血清以1 :3稀釋倍率向下稀釋。每孔中總體積為1 0 0微升，置於室溫培養2小時。以嫜菜過氧化酶鍵結的羊抗氣免疫球蛋白（S i gma)债測結合的鼠抗人類AChR α抗體，於37 °C下作用1小時，以PBST洗滌六次，加上100微升ABTS溶液為顯色基質，呈色2〇分鐘後以ELISA判讀機讀取在405 nm的吸光值。ABTS溶液：將 0· 548微克/毫升ABTS溶於擰檬酸緩衝液（ci trie buffer)，再添加0· 002 %H2 02 ;其中，檸檬酸緩衝液係含有 1 · 05 % 檸檬酸，1. 42 % 磷酸氫二鈉（Na2HP04)，pH 4. 0。結果如第5 ( A)圖所示。 (2)血清辨認AChRa-ECD-Fc

微定量盤吸附上10微克/毫升AChR α-ECD-Fc或控制組融合蛋白’在使用前以PBS含10%FBS處理2小時。以PBST 清洗兩次。在微定量盤上，分別加入MG病人和正常人血

清’並以1 0 %FBS/PBS稀釋，於室溫下反應2小時。以pbsT 清洗四次，之後加入50微升的1 : 1 〇〇〇以PBS含10 %FBS的嫜采過乳化酶鍵結羊抗人/c輕鍵。微定量盤持續在室溫反

0643 - 5413TWF3; s u s anwu. p t c 第19頁 1238251 案號 89113958 曰修正五、發明說明（17) 應1小時，之後以PBST清洗，每孔加入1〇〇微升的ABTS顯色基質，顯色後，置於ELISA判讀機讀取在405 nm的吸光值。結果如第5(B)圖所示。實施例6 :AChRa - ECD-Fc的固定化將10毫克由實施例3製備的AChR α -ECD-Fc置於透析袋中，加入偶合緩衝液（coupling buffer ; 0.5 M NaCl，〇·1 M NaHC03，pH 9.0)透析整晚，經由三次置換透析液之後，與4毫升CNBr活化的膠體（sepharose 4B Fast flow，Pharmacia)在旋轉盤上反應2小時，將反應完的膠體靜置數分鐘使其沉澱，取部分上清液並測〇D28()，當0D28Q 接近〇時，表示反應完全。再以20毫升偶合緩衝液清洗膠體’然後加入15毫升1 Μ乙醇胺，在室溫反應2小時，將未反應之活化基封鎖，以過濾器緩慢去除乙醇胺，再分別用〇·5 M NaCl，0.1 Μ醋酸鈉緩衝液，pH 4.0及偶合緩衝液’各1 0倍膠體體積的量，交替清洗膠體三次，每次清洗使膠體與溶液接觸约5至1 0分鐘，如此可使非共價結合的 AChR a -ECD-Fc釋放，以製備完全的AChR a _ECD-Fc-瓊脂糖’保存於20 %酒精，4 °C中備用。 _ 實施例7 : AChR a -ECD-Fc-瓊脂糖與抗體的結合力 (1 )對於抗AChR α抗體的結合力試驗抗AChR α單株抗體，經由細胞培養大量生產後，以蛋白質Α純化，再以蛋白質定量套組（Bio-Rad)定量。取100 微升AChRa-ECD-Fc-瓊脂糠置於1.5毫升離心管中，以PBS 清洗1 0次，再加入200微克的抗AChR α抗體，於室溫下在

0643-5413TWF3;susanwu.ptc 第20頁 1238251 案號 89113958 曰修正五、發明說明（18) 旋轉盤上反應3 0分鐘，待瓊脂糖沉降後，取上清液，再用 PBS清洗10次，最後用0.1 Μ檸檬酸（pH 2. 3)將結合的抗 AChR α抗體洗出，並定量每個部分的抗AChR α抗體含量，以評估AChR α -ECD-Fc -瓊脂糖的結合力。 (2 )對於血清中抗AChR α抗體的結合力本實施例係模擬體内自體抗體的環境，而評估本發明之吸附裝置移除抗體的能力。將24 0/3 0 0微克的抗AChR α 抗體分別與20毫升的胎牛血清（實驗組）及Tris緩衝液（對照組）混合後，經由0. 4 5 /z m過滤膜過遽，以螺動幫浦打入 AChRa-ECD-Fc-瓊脂糖管柱（流速1毫升/分鐘），以10倍體積的PBS沖洗，再以0.1 Μ檸檬酸（pH 2.3)，將結合的抗 AChR α抗體洗出，分別檢測各部份蛋白質和抗AChR α抗體的濃度，以測定AChR a -ECD_Fc-瓊脂糖在血清流過時真正的結合能力。結果如表1所示。表1 :抗體吸附力在血清及緩衝液中的比較註·· FBS:胎牛血清；Tris: 羥甲基胺基甲烷緩衝液。 mm 機賴结每㈣删獅 AtfrAChR^S tmi m 74 lffi © 1撇2 m 91 W 62 15&5 ΰ5.5ώ ArtAChRij/Tris tmi 300 23 277 923 tmi 300 54 S20 261t22 87.tt7.3 結果：

0643-5413TWF3;susanwu.ptc 第21頁 1238251 tm 89113958 年月曰五、發明說明（19) RD是人類橫紋肌瘤細胞，能夠表現乙醯膽鹼受體。由基因銀行（Gene Bank)得到的資訊以設計PCR的引子，將 AChR α的細胞外功能部位以TA選殖法（Invi trogen)，選疸進入尸〇1?11載體，人(：}11?〇:-£〇〇的基因為735匕0，從 PCRI I/AChR α -ECD的基因序列分析，得到兩種不同序列的 AChRa-ECD，一種是少掉第43個胺基酸（纈胺酸）（第3 圖）’另一種是在第59個胺基酸的位置插入一段2 5個胺基酸的序列，因考慮保持AChR a的立體結構，所以選擇第一種序列，做為曰後實驗的基礎。之後，將AChR a -ECD選殖進入pBachIgGIFc，產生pBac-AChRa-ECD-hIgGIFc 的質體，此質體可與Bac 6線型病毒DNA進行同源重組作用，以製造出重組病毒。將線形的病毒DNA與pBac-AChR 素（transfectin)的存在下，同時轉殖昆蟲細胞，3天後可見到細胞被病毒感染而產生病變，收集上清液後以蛋白質 A-瓊脂做免疫沉澱，再以SDS-PAGE分析，可在分子量53 kDa的位置看到一條蛋白質帶，推估為AChR α -ECD-Fc。病毒上清液重覆感染可放大病毒濃度，以病毒斑分析病毒效價（titer)，並挑出單一病毒斑，以pcr確認重組病毒。為了得到大量的AChR α -ECD-Fc，本發明以1公升的旋轉培養瓶生產AChRa-ECD-Fc，病毒感染量約5〜10 (Μ·〇· 2 :5〜10)，感染三天後產量約為卜2微克/毫升，將上清液收集後，過濾，再以1毫升/分鐘的流速通入蛋白質Α-瓊脂管柱，以PBS清洗管柱後，用〇· 1 Μ甘胺酸（pH 2· 3)將

0643-5413TWF3;susanwu.ptc 第22頁 1238251 案號 89113958 曰修正五、發明說明（20) AChR a -ECD-Fc析出，經以PBS透析後，濃縮過濾，保存在 - 20 C。純化後之AChRa - ECD-Fc以西方墨潰法確認，在還原和非還原狀態下，用市售的抗AChR抗體偵測，結果在還原狀態下（reduced)為53 kDa，而非還原狀態下 (non-reduced)為100 kDa (參見第4圖），顯示本發明所表現的AChR α-ECD-Fc會形成二聚體（dimmer)，這種結構類似於乙醯膽鹼受體的自然結構（/3 r 5 )，有利於結合抗AChR抗體。分別將AChR a-ECD-Fc和CTLA4-FC ( —種細胞表面抗原）結合在96孔培養盤，再以抗人類AChR抗體偵測。第 5(A)圖顯示，抗人類AChR抗體只能專一性辨識AChR α - ECD-Fc ’而無法辨識不相關的CTLA4-Fc蛋白質，顯示本發明所表現的AChR a-ECD-Fc，仍然保有其自然結構。同樣地，分別用重症肌無力病人和正常人的血清測試，仍可以發現，病人血清有明顯的結合能力，而正常人的血清只有較低的背景值（參見第5(B)圖）。結合上述’以本發明所表現的AChR a -ECD-Fc，可有效結合自體免疫疾病患者體内之抗AChR抗體。利用10毫克的AChR a -ECD-Fc與4毫升CNBr活化的遭脂糖進行偶合反應，製造出AChR a -ECD-Fc-瓊脂糖，經由未偶合的AChR α-ECD-Fc的量，推算其偶合率約為85%。為了评估偶合後AChR a-ECD-Fc對抗體的吸附效率，取出1毫升AChRα-ECD-Fc-瓊脂糖，與3 00 微克抗AChRα抗體混合後’測试其對抗AChR a抗體的結合力，經分析後未結合的 11 11 BH 1 ilii 111 1 ! 1 _ __ 0643-5413TWF3;susanwu.ptc 第23頁 1238251 _案號89113958_年月曰修正_ 五、發明說明（21) 抗體為50微克，顯示1毫升AChRa-ECD_Fc-瓊脂糖的結合力為2 5 0微克。為了檢測AChR a -ECD-Fc-瓊脂糠對於血液中的抗AChR α抗體是否能有吸附作用，所以用固定量的抗AChR α抗體加入胎牛血清中，以模擬此裝置在實際應用的可行性。混合抗AChR α抗體的胎牛血清20毫升，以幫浦打入1毫升 AChR a -ECD-Fc -瓊脂糖管柱。之後用ELISA方法分別檢測通入裝置之前和之後的抗AChR α抗體量。表1顯示，比較通入前後，其中有大約65%的抗體已被吸附在裝置上，顯示此裝置確可應用在血液中抗AChR α抗體的去除。同時比翁較抗AChR α抗體在一般緩衝液中的結合能力，其中有大約 87 %的抗體被吸附，表示即使在血清存在下，AChR α -ECD-Fc-瓊脂糖對抗AChR α抗體的吸附力改變不大，依然保有大約75 %吸附能力，因此，可以應用在重症肌盔、者上，以達到治療的效果。 ~ 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之精神 $範圍内，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍，當視後附之申請專利範圍而所界定者為準。” w 參

Claims

1238251 . . '，丨案號89113958 年月日 ..….修正_ 六、申請專利範圍 1. 一種用於專一性吸附抗體之體外免疫吸附裝置，包括： (a ) 基質；以及 (b ) 專一性吸附於該抗體之共軛體，其連結於該基質上或填充於該基質中；其中，該共軛體係乙醯膽鹼受體α次單位-細胞外功能部位-免疫球蛋白固定區片段（AChRa-ECD-Fc)之融合蛋白。 2. 如申請專利範圍第1項所述之體外免疫吸附裝置，其中該共幸厄體係由pBac-AChR a-ECD-hlgGlFc載體經桿狀病毒表現系統而產生，上述載體已於中華民國89年6月14 曰寄存於中華民國食品工業發展研究所菌種中心，寄存編號CCRC 940305 。 3. 如申請專利範圍第1項所述之體外免疫吸附裝置，其中該抗體為一自體抗體。 4. 如申請專利範圍第3項所述之體外免疫吸附裝置，其中該自體抗體係自體免疫疾病患者所產生之抗體。 5. 如申請專利範圍第4項所述之體外免疫吸附裝置，其中該自體免疫疾病是重症肌無力。 6. 如申請專利範圍第1項所述之體外免疫吸附裝置，其中該共軛體係藉由一中間介層或化學反應而連結於該基質上或填充於該基質中。 7.如申請專利範圍第6項所述之體外免疫吸附裝置，其中該中間介層包括瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、幾丁質、幾丁聚醣及上述物質之衍生物、有機或無機之多孔

0643-5413TWF3;susanwu.ptc 第25頁 1238251 _案號89Π3958_年月日__ 六、申請專利範圍性材質、磁珠或微珠。 8. 如申請專利範圍第6項所述之體外免疫吸附裝置，其中該化學反應包括溴化氰的連結反應。 9. 如申請專利範圍第1項所述之體外免疫吸附裝置，其中該裝置為管柱或中空纖維管束。 1 0 . —種用於專一性吸附抗體之體外免疫吸附套組，包括： (a) 血漿分離器，其將血球及血漿自血液中分離； (b) 專一性吸附抗體之體外免疫吸附裝置，包括： (b 1 ) 基質；以及 (b 2 ) 專一性吸附於該抗體之共軛體，其連結於該基質上或填充於該基質中；其中，該共輛體係乙蕴膽驗受體α次單位-細胞外功能部位-免疫球蛋白固定區片段（AChR α-ECD-Fc)之融合蛋白；以及 (c ) 回流裝置，其將所分離的血球及經過免疫吸附裝置吸附的血漿混合並送回體内。 1 1 .如申請專利範圍第1 0項所述之體外免疫吸附套組，其中該共輛體係由pBac-AChRa-ECD-hIgGIFc載體經桿狀病毒表現系統而產生，上述載體已於中華民國8 9年6 月1 4日寄存於中華民國食品工業發展研究所菌種中心，寄存編號CCRC 940305。 1 2.如申請專利範圍第1 0項所述之體外免疫吸附套組，其中該抗體為一自體抗體。 1 3.如申請專利範圍第1 2項所述之體外免疫吸附套

0643-5413TWF3;susanwu.ptc 第26頁 1238251 案號 89113958 曰修正六、申請專利範圍組，其中該自體抗體係自體免疫疾病患者所產生之抗體 1 4.如申請專利範圍第1 3項所述之體外免疫吸附套組，其中該自體免疫疾病是重症肌無力。

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